Estructura genética en la población de ballena gris (Eschrichtius robustus) del Pacífico orientalGENETIC STRUCTURE OF THE NORTHEASTERN PACIFIC GRAY WHALE POPULATION (Eschríchtíus robustus)

/Centro de Investigación Cientifica y de \\

Educación Superior de Ensenada

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Esmicüim išìeneüca en ia Püiaimzinn de Bflliafia

(Esclu-inhøius robuszus) Pacífico Oriental

TESIS

MAESTRIA EN CIENCIAS

LBGEBA DM. 'ii'@R® MUNHZ

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ÉNSÉNRDÄ BAJÄ CFA, MEXICO MARZO DE 2006

en

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Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ

Dr. Axayácat Rocha Olivares Director del Comité

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*~EÍra. Sharon Zinalfi-ierzka Llona

Miembro del Comité

Dra. Maria Teréza Cavazos Péreï

Miembro del Comité

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iores Ramirez

Miembro del Comité

Dr. Horacio Jesús de la Cueva Salcedo

Miembro del Comité

QM1 ca:

I Dr. Juan Ca›|

oordinador del programa de posgrado en Ecologia Marina

Dr. Raúl Ramón Castro Escamilla

Director de Estudios de Posgrado

CICESG

PRQGRAMA DE PoseRAoo EN c|ENc|As

EN Eco|_oGiA |v|AR|NA

EsTRucTuRA GENET|cA EN LA Pos|_Ac|óN DE BALLENA GR|s

(Eschriohtius robustus) DEL PACÍFICO ORIENTAL

TESIS

que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS

Presenta:

LIGEIA DEL TORO MUNOZ

ESTRUCTURA GENÉTICA EN LA POBLACIÓN DE BALLENA GRIS

(Eschrichtius robustus) DEL PACIFICO ORIENTAL

Resumen aprobado por:

Dr. Axay catl Rocha Olivares Director de Tesis

Las hembras de ballena gris (Eschrichtius robustus) de la población del Pacífico oriental poseen una intensa fidelidad hacia las lagunas de crianza (filopatria natal) de acuerdo a estudios de foto-identificación. Para evaluar la influencia de este comportamiento sobre la estructura genética de la población, se analizaron marcadores moleculares tanto del genoma mitocondrial (secuencias de la region control) como del nuclear (cinco loci microsatelltales). Se obtuvieron biopsas de individuos de ambos sexos en tres lagunas de crianza en Baja California Sur, México: Laguna Ojo de Liebre (n=35), Laguna San Ignacio (n=59) y Bahía Magdalena (n=33). Asimismo, se identificó el sexo de los individuos muestreados (con métodos moleculares). Se logró Identificar la presencia de 25 biopsias con genotipos (ambos marcadores) y sexo idénticos, por lo que se consideraron provenientes de ballenas re-muestreadas dentro de la misma o diferentes lagunas. Dichos datos fueron excluidos de analisis posteriores. La proporción de se'x5š'resultó sãada h'a¬ciã hembras en las tres lagunas (4 hembras por macho). Se encontraron 24 haplotipos (498 pb, 35 sitios variables) a partir de los cuales se obtuvieron valores de diversidad haplotlpica y nucleotídica totales relativamente altos (h=0.93 y 1r=O.02, respectivamente). Estos resultados son congruentes con estudios previos sobre la diversidad molecular mitocondrial en esta población, y no reflejan una pérdida drástica de variabilidad genética hipotéticamente debida a la cacería histórica. Las pruebas de diferenciación genética no detectaron valores

significativos de estructura entre lagunas tanto en nivel mitocondrial (AMOVA,

Fs†=-0.002 y <I>s†=0.002, p>0.05, para ambos estimadores) como nuclear (AMOVA, Fs†= 0.0 y R$†=0.009 p>0.05, para ambos estimadores). En contraste

con los resultados de Goerlitz et al., 2003, en este estudio no se detectó la

segregación de ballenas grises en las lagunas de crianza. Los resultados de este trabajo indican que las ballenas grises usan las lagunas independientemente de su linaje genético. La detección de la misma ballena hembra en diferentes lagunas (re-muestreo) apoya esta conclusión.

ABSTRACT of the thesis presented by Ligeia del Toro Muñoz as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in MARINE ECOLOGY.

Ensenada, Baja California, Mexico. March 2006.

GENETIC STRUCTURE OF THE NORTHEASTERN PACIFIC GRAY WHALE

POPULATION (Eschríchtíus robustus)

Female gray whales (Eschrichtius robustus) in the Pacific northeast have a strong philopatry to breedlng grounds evidenced from long-term photo-identification studies. In order to test the influence of this behavior on the population genetic structure of the species, skin biopsies from free-ranging individuals were collected at the major reproductive Iagoons along Baja California Sur, Mexico: Ojo de Liebre (n=35), San Ignacio (n=59) and Bahia Magdalena (n=33). Molecular identification of gender and genotypes of the mitochondrial control region and five microsatellite loci were obtained from each sample. We identified 25 biopsies from re-sampled whales based on identical sex, mitochondrial and nuclear genotypes, these biopsies were excluded from further analyses. Sex ratio was skewed toward

females in all Iagoons (4 females per male). We found 24 haplotypes (498 bp, 35

variable sites), from which overall haplotype and nucleotide diversities were relatively high (h=0.93 and rr=0.02, respectively). These results are congruent with previously reported mitochondrial molecular data for this population, suggesting little loss of genetic variation due to historical whaling. Genetic differentiation tests failed to detect significant mitochondrial (AMOVA, FS†=-0.002 and d>S†=0.0O2, p>0.05 for both) and nuclear (AMOVA, FS†=O.0 and Rs†=0.009 p>0.05, for both) population structure among Iagoons. In contrast to Goerlitz et al., 2003, our analyses do not support the genetic segregation of gray whales in the reproductive grounds. Thus, although photo-recapture studies are suggestive of maternal philopatry, our results indicate that gray whale females use Iagoons indistinctive of their genetic lineage. Moreover, the genetic detection of the same female ln different Iagoons (re-sampling) further supports this conclusion.

Keywords: Gray whale, Eschrichrius robuslus, genetic structure, mitochondrial DNA,

DEDICATORIA

A mis abuelos, Ligeia Balladares y Guillermo Ravest por tanta inspiración, amor y

sabiduría transmitidos constantemente aunque no los vea diario.

A Moria, Ana Lucia, Volga y Valú por ser fuente de admiración y orgullo.

A la ciudad y puerto de Ensenada por albergarme durante tantos años, por tener

unos paisajes preciosos y un clima inigualable.

AGRADECIMIENTOS

A mi director de tesis, Dr. Axayáctl Rocha Olivares, por confiar en mi para llevar a cabo este proyecto a pesar de que mis bases sobre genética eran nulas al principio. Gracias a los cursos impartidos por él dichas bases se crearon y solidificaron. También por todo su apoyo a lo largo de la investigación.

Al comité de tesis: Dr. Sergio Flores Ramírez, proporcionó parte importante de las muestras analizadas y contribuyó sustancialmente con la idea original del proyecto; Dra. Sharon Herzka Llona, porque sus comentarios y sugerencias durante las reuniones del comité contribuyeron a mejorar el trabajo; Dra. Ma. Tereza Cavazos Pérez sus preguntas favorecieron el entendimiento de muchos conceptos básicos, sobre todo me ayudaron a transmitirlos con un lenguaje sencillo; y Dr. Horacio de la Cueva Salcedo, por sus acertados comentarios y sugerencias, y por el apoyo económico para asistir a la 16 Bienal Internacional sobre Mamíferos Marinos en San Diego,

Dr. Lorenzo Rojas Bracho me dio acceso a las muestras custodiadas por el Southwest Fisheries Science Center de San Diego (SWFSC) y confiú en mi para analizarlas. Además proporcionó informacion importante para aclarar aspectos relacionados con la duplicación de muestras.

Dr. Luis Enriquez Paredes por toda su ayuda incondicional sin la cual este trabajo no habria sido igual, por tantas tardes de reflexión y discusiones amenas sobre el proyecto y sobre otras cosas, Por prestarme mucha de su literatura cientifica, pero principalmente por su sincera y valiosa amistad.

M. en C. Nadia Olivares Bañuelos por compartir informacion valiosa sobre las muestras de Bahia Magdalena.

M. en C. Eduardo Morteo Ortiz me recomendó como posible candidata para llevar a cabo la investigación y me asesoró en varias ocasiones sobre análisis estadísticos, además ha sido mi compañero y colega desde hace varios años.

A las instituciones: Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT), por la beca proporcionada para realizar los estudios de maestría; Centro de Investigación Cientifica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE), por la educación impartida y por financiar parte de la investigación; al SWFSC no solo por proporcionar parte de las muestras analizadas en este estudio, sino también porque ahí se llevaron cabo gran parte de los análisis, especificamente la secuenciación del ADN mitocondrial y el genotipificado de los microsatélites.

Amanda Bowmann estuvo a cargo de dichos análisis y su ayuda fue siempre incondicional e imprescindible.

Yadhel Gámez, su estancia en el CICESE favoreció indudablemente a esta investigación, ya que parte de la amplificación y secuenciación del ADN mitocondrial de las muestras custodiadas por el SWFSC corrió a su cargo.

Dra. Yolanda Schramm Urrutia siempre estuvo dispuesta a escucharme y asesorarme sobre aspectos básicos y no tan básicos de la genética poblacional, por compartir sus conocimientos a traves de un sin fin de presentaciones, resúmenes, ensayos, etc. Por publicar una tesis de doctorado tan bien hecha, que estoy segura no sólo a mi me ha servido de guia, y también por su amistad.

A los amigos y compañeros del laboratorio: Iris Segura, Jonathan Sandoval, Melania López, Jorge Dávila, Mónica González, Juan Carlos Pérez, Carina Gutiérrez, Mariana Bobadilla y Nancy Saavedra, a todos por hacer divertida y cordial la estancia en el laboratorio y por su apoyo como compañeros de estudios.

Dr. Oscar Sosa, proporcionó un espacio importante dentro de su laboratorio durante los inicios de la investigación.

A los maestros, Vicente, Axa, Horacio, Oscar, Sharon, Gisela, Yoli y miembros del grupo de ecologia molecular de la UABC, por impartir buenos cursos que me auxiliaron durante la investigación.

A mis amigos:

Fabiola Lafarga, por fungir como mi hermanita mayor en Ensenada, por cuidarme y quererme, y por compartirla hermosa casa donde vivimos.

Adrián Torales, por tantas horas de diversión y optimismo, por ser tan maravilloso y porque se que estemos dónde estemos, siempre vamos a estar cerca.

Oscar Guzón, también por las tantas horas de diversión y porque me ha demostrado a lo largo de muchos años que su amistad es sincera y completamente incondicional.

Rodrigo Gómez, por sobrevivir conmigo.

Vanessa Francisco, por su invaluable ayuda en asuntos de logística, por las saludables caminatas matutinas y por todos los buenos ratos.

Samantha de la Gala, no sólo por su amistad y por las comidas, pachangas y bailongos que compartimos como verdaderas comadres, sino también por su apoyo académico durante la maestria.

Mark Marin, por recordarme a cada rato que la amistad se construye cotidianamente y que siempre puedes contar con un verdadero amigo.

Alejandra Prieto, por prestarme su cómoda y bonita casa.

A mi familia:

A mis papás Consuelo y Chano, por el gran apoyo y la invaluable educación que me han brindado-desde que nací.

A mis hermanas, Moria y Ana, y primas Volga y Valú, porque estoy segura de que me quieren igual de mucho que yo a ellas y porque me encanta verlas como todas unas mujeres emprendedoras, sensibles e inteligentes.

íNoicE DE coNTEN|Do

RESUMEN...-....

Dedicatoria

Pági

Agradec¡m¡ent°s... . . . ...

¡'nd¡ce de come,-¡¡d° . . . ... . .. . . .. . . .. ... . . ..

Lista de figuras ... . . . - . . . ¢ . - - - . . --Lista de tablas .... ..- . . . - . . . - . - - - . . .

.-¡N1-RODUcc¡óN .... ...

Ecologia molecular de mamíferos marinos

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-vi ... ¡X xii

...X¡¡¡

1

Ballena gris (Eschrichtius robustus)

Sistemátìua y evolución uu

Migración Biología

Historia de la cacerla Abundancia

moras

10

Selección de los marcadores moleculares 11

Región control del ADN mitocondrial (ADNmt) Microsatélites

í_í__.___11

13

H¡pÓTES¡s.. . .. . . . .... . . .... . . .... ... .. . . ... .. 14

OBJETH/OS . . . ..

General

...15

Particulares

15

ÍNDICE DE CONTENIDO (continuación)

Página

ÁREA DE Es-¡-UD¡0... ... ... ... .. 16

MA-¡-ER¡ALEg y¡|/¡É-¡-QDQ; ... ... ..

Recolecta de biopsias

18 18 Trabajo de laboratorio

Extracción y purificación de ADN Amplificación

Secuenciación del ADNmt

Genoliplflcado de los microsatélites _

Análisis de datos 22

ADN mitocondrial 22

Alineamiento

_\

'3§2Eâ°°

22 22 23 24

Índices de diversidad genética Demografía histórica

Eslruclura genética

Análisis filogenético y filogeografla 25

Mlcrosatélites ₂₆

Indices de diversidad genética 26

26 27 28

Estructura genética Análisis muliivariado Pruebas de identidad

YDIscUsIÓN...¬... ... ...-...31

Alineación y variación de secuencias 31

Análisis comparativo 34

íND|cE DE coNTEN|Do (continuación)

Página

Diversidad genética 38

ADN mitocondrial 38

Mlcrosatélites 41

Demografía histórica 46

Estructura poblacional 50

ADN Mitocondrial 50

Reanálisis de Goerlitz et al. 2003 52

Microsatélltes 56

Análisis multlvariado 58

Filogenia y filogeogralia 61

coNcLUs¡oNES... ... 65

L¡TERA1'URA C”-ADA ... .. 65

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Esquema de los 3 principales dominios dela región control del ADNmt de mamíferos (modificado de Avise 2000). Por sus siglas en inglés, CSB's se refiere a bloques de secuencias

conservadas dentro del tercer dominio 12

Figura 2. Localización geográfica de las lagunas de crianza de ballena gris analizadas en este

estudio (Tomada de Urban etal., 17

Figura 3. Esquema de la posición y tamaño de las secuencias de ballena gris analizadas en este estudio ypor otros autores, con respecto al genoma mitocondrial completo (el mapa no se

encuentra a escala). 34

Figura 4, Tabla de haplotipos publicados por Goerlitz et al. 37

Figure 5. Histogramas del número de diferencias pareadas (Mismatch distribution) entre las secuencias mitocondriales de ballenas de las diferentes lagunas y de el total de las muestras. Las barras indican las frecuencias observadas y la linea punteada las simuladas. La curva representa

las predicciones del modelo de 48

Figura 6. Gráfica del ana/¡sis canónico discriminante de los genotipos multilocus microsatelitales de las poblaciones de E. robustus, a partir de los factores seleccionados con el análisis de

componentes 60

Figura 7. Árbol consenso de 100 arboles de máxima parsimonía que incluye los 24 haplotipos de E.

rcbustus. Los números en los nodos indican los valores de robustez del rernuestreo. 62

Figura 8. Filograma de las relaciones filogenéticas entre los 24 haplotipos de E. robustus, por medio del método Neighbor-Jcining. La distancia genética se calculó a partir del método Tamura-Nei entre todos los pares de haplotipos. Los valores del rernuestreo, en cada nodo, sun resultado de 1000 réplicas. La longitud de las ramas es proporcional a la distancia genética de acuerdo con

la escala indicada. 63

Figura 9. Red de la minima separación (Minimum Spanning Network), donde se muestran los 24 haplotipos de E. robustus. Cada circulo representa un haplotipo y el área es proporcional a su frecuencia. La longitud de las lineas que unen a los circulos representa el número de mutaciones entre haplotipos. La Ilnea punteada es una conexión alternativa. Los tres principales clados están

LISTA DE TABLAS

Página

Table I. Cebadores utilizados en la amplificación de los microsatélites...,.,,...,.,... 20

Tabla ll. Muestras que lueron tomadas por duplicado, a) dentro de la misma laguna y b) en

diferentes 30

Tabla lll, Sitios segregados entre los 24 haplotipos de ballena gris. El primer nucleótido del alineamiento corresponde al nucleótido 15421 del genoma mitocondrial completo de E. robustus (número de acceso al GenBank AJ554053, Arnason et al., 2004). Frecuencias de ocurrencia en las

lagunas: Ojo de Liebre (LOL), San lgnecio (LSl) yBahla Magdalena (BM). 33

Tabla IV. Cuadro comparativo entre los haplotipos reportados por otros autores y los encontrados

en este 35

Tabla \/, Proporción de sexos en las muestras 38

Tabla VI. Índices de diversidad genetica de las lagunas: Bahia Magdalena, Ojo de Liebre y San

Ignacio. 39

Tabla Vll. Comparación estadistica entre los valores de diversidad haplotlpica encontrados en las

tres lagunas, a través de la prueba tde Hutclleson (1983). 40

Tabla Vlll. Valores de p del análisis de ligamiento entre loci microsatelitales. 42

Tabla IX. Variabilidad genetica microsatelital de E. robuslus por locus y por laguna de crianza. 44

Tabla X. Parámetros del modelo de expansión y prueba de bondad de ajuste al modelo en las tres

lagunas y la población total (se utilizó un remuestreo al azar con 1000 réplicas). 49

Tabla XI. Comparación de las pruebas de ajuste al modelo de expansión a partir de pseudo-replicas tomadas al azar con reemplazo de las lagunas de crianza con respecto a lo obsen/ado a partir de los tamaños de muestre originales (4 simulaciones). 49

Tabla XII, Resultados de los análisis de varianza genética y molecular mitocondrial entre los

individuos de lagunas de crianza de ballena 51

Tabla Xlll. Comparación de los análisis de estructura genetica reportados por Goerlitz et al. (2003) con los corregidos por las secuencias de muestras reanalizadas en este estudio...,...,... 53

Tabla XIV. Resultados de los análisis de varianza genética y molecular entre los haplotipos

LISTA DE TABLAS (continuación)

Página

Tabla XV. Resultados de los análisis de varianza genética y molecular entre las lagunas de crianza de ballena gris a nivel 56

Tabla XVl. Eigenvalores para cada uno de los factores extraídos por medio del análisis de

componentes principales. 58

Tabla XVll. Coelicientes de correlación entre los factores y cada una de las variables (tamaño de

los alelos 59

Tabla XVlll. Resultados del análisis díscriminante. Pasos=2; número de variables en el modelo: 5;

Ecología molecular de mamíferos marinos

Las técnicas moleculares proveen información sobre la variación de

caracteres morfológicos, fisiológicos y de comportamiento, y también pueden

ayudar a responder preguntas sobre la historia natural y la evolución de

organísmos. Estos últimos aspectos son relevantes para poblaciones de cetáceos,

ya que por su gran movilidad y dificultad de muestreo, es difícil conocer los

detalles de su historia natural y evolución (Milinkovitch et al., 2001).

Los mamíferos marinos se han adaptado a la vida acuática mediante

especializaciones anatómicas, fisiológicas y de comportamiento. Estas

adaptaciones son particularmente relevantes para la evolución de la estructura

genética de sus poblaciones, ya que afectan sus patrones de dispersión,

comportamiento reproductivo y demografía (Hoelzel et al., 2002). Por ejemplo,

debido a patrones de distribución estacional y a movimientos migratorios, algunos

mamíferos marinos pueden formar subpoblaciones o “stocks” que no

necesariamente están separados por barreras geográficas (Baker y Palumbi

1996). Dichos stocks, que se utilizan como unidades de manejo, se pueden definir

como fracciones o subunidades de una población relativamente homogéneas que

presentan pérdidas por emigración y ganancias por inmigración (Donovan 1991,

citado por Baker y Palumbi 1996). Diferencias genéticas significativas entre

stocks para los cuales es necesario desarrollar planes de manejo independientes

(Dizon et al., 1992).

En algunas poblaciones naturales, la estrategia reproductiva determina el

nivel de diversidad genetica. Rosenbaum et al. (2002) indican que la estructura

genética de mamíferos longevos puede ser influenciada por interacciones entre el

éxito reproductivo y factores ambientales. Algunas especies de mamíferos

marinos presentan una estrategia reproductiva donde los adultos regresan al sitio

donde nacieron para reproducirse. Dicho comportamiento es conocido como

filopatría natal y tiene un impacto profundo sobre la historia evolutiva de una

especie, ya que puede conllevar a la aparición de subunidades poblacionales

discretas dentro de su área de distribución. Por ejemplo, en la ballena jorobada

(Megaptera novaeangliae), el uso de marcadores moleculares de ADN

mitocondrial (ADNmt) ha hecho evidente una distribución heterogénea de linajes

maternos y cierto grado de estructuración filopátrica asociada a zonas invernales

de reproducción (Baker et al., 1993, Palsbll et al., 1995). La descripción de la

distribución de linajes maternos por medio del ADNmt es útil para entender

procesos evolutivos en poblaciones de mamíferos comúnmente sesgadas

sexualmente, y en las cuales su organización social está estructurada alrededor

de las hembras, como es el caso en muchos cetáceos (Baker y Palumbi, 1996).

En la población de ballena gris (Eschrichtius robustus) del noreste del

Pacífico, sólo las hembras han mostrado fidelidad hacia sus lagunas de crianza

de estructura genética determinada maternalmente y que podría reflejarse en el

ADNmt. Para corroborar esta hipótesis, se analizó el genoma mitocondrial de

muestras de machos y hembras provenientes de las principales lagunas de

crianza en Baja California Sur, México: Ojo de Liebre, San Ignacio y Bahia

Magdalena, y se cuantificó la diversidad genética de la población. Además, para

conocer el nivel de dispersión por parte de los machos también se comparó el

genoma nuclear de las muestras para diferentes loci microsatelitales.

Ballena gris (Eschrichtius robustus)

Sistemática y evolución

La familia Eschrichtiidae es monotipica e incluye un género y una especie, la

ballena gris Eschrichtius robustus. No han sido encontrados fósiles de un ancestro

de la especie (Barnes y McLeod, 1984). El fósil más antiguo correspondiente a

esta especie data del Pleistoceno y fue recuperado de sedimentos dalados entre

los 50 mil y 120 mil años. Existen teorias que proponen la evolución de la ballena

gris a partir de la familia de ballenas Cetotheridae, extinta hace 38 millones de

años (Jones y Swartz, 2002); sin embargo, la ausencia de evidencias fósiles que

reafirmen este linaje obliga a los taxónomos a asociarlas con las ballenas

actuales. Actualmente la mayoría de los investigadores consideran que la ballena

gris está más estrechamente relacionada con los rorcuales (familia

1994; May-Collado y Agnarsson, en prensa). Estudios anteriores las colocan entre

ambas familias (Ellis, 1988) o incluso las consideran más cercanas a las ballenas

francas. Tal es el caso de análisis basados en datos morfológicos, los cuales

incluyen datos provenientes de fósiles (Barnes y McLeod, 1984). Sin embargo,

estudios moleculares recientes basados en secuencias de la región de control del

ADNmt, relacionan de manera más cercana a la ballena gris con los rorcuales y la

colocan junto a la ballena azul (Ba/aenoptera musculus) y por lo tanto como parte

de la familia Balaenopteridae (Milinkovitch el al., 1994; Baker y Palumbi, 1996).

Se sabe por evidencias fósiles (Mead y Mitchel, 1984) que hasta finales del

siglo XVll 0 principios del ><Vll| otra población de ballena gris habitaba en ambas

costas del Atlántico norte, pero fue exterminada por la actividad ballenera. Existen

dudas sobre si era una especie distinta a la del Pacifico, aunque actualmente se le

considera como la misma especie (Adams, 1969; Darling, 1999).

Migración

La ballena gris se distribuye desde el norte del Océano Pacifico hasta el

océano Ártico. A lo largo de su distribución, presenta dos poblaciones aisladas: la

población del noroeste (de Corea al mar de Okhotskj que migra a lo largo de la

costa asiatica, y la población del noreste (de California al Mar de Chukchi), la cual

migra a lo largo de la costa de Norteamérica. Diversos estudios genéticos han

reportado

diferencias

pronunciadas

entre

ambas

poblaciones y

niveles

insignificantes de flujo genético (Jones y Swartz 2002; LeDuc et al., 2002). Estos

ADNmt en la población del noroeste del Pacifico (h=0.70) que en la población del

noreste (h=O.95).

La población de E. robustus del Pacífico oriental realiza la migración más

larga de cualquier mamífero (16,000 km), (Sumich, 1983; Ellis, 1988, Darling,

1999). Migra desde las zonas de alimentación (entre Alaska y Siberia), las cuales

ocupa durante el verano, hasta las zonas de reproducción en las lagunas costeras

mexicanas de Baja California Sur durante el invierno. Sin embargo, se ha

reportado que existe un pequeño grupo de ballenas que gradualmente está

aumentando en tamaño y que no migra la distancia completa. Aparentemente este

grupo permanece en las costas de Baja California y Columbia Británica, Canadá

(Jones y Swartz 2002; Steeves et al., 2001). Steeves et al. (2001), compararon la

variabilidad del ADNmt de un grupo de ballenas grises residentes de Clayoquot

Sound, Columbia Británica con la población total, y demostraron que no difieren

significativamente de la población completa. Concluyeron que al parecer la

fidelidad a esta zona no esta dirigida matrilinealmente.

Biología

El comportamiento reproductivo de esta población, es altamente estacional.

La especie es considerada promiscua, ya que durante una misma temporada

reproductiva individuos de ambos sexos pueden tener varias parejas (Ellis 1988) y

debido a que los machos presentan competencia de esperma (Rail y Brownell Jr.

1988). En virtud de la existencia de inseminación múltiple, es probable que exista

observar grupos de apareamiento de dos o tres individuos (generalmente dos

machos y una hembra), pero también se han observado grupos más grandes con

altos niveles de actividad reproductiva.

El ciclo reproductivo de la hembra dura dos años (mientras que los machos

se pueden reproducir anualmente), las hembras se aparean y tienen a sus crias

en años alternos. La vida reproductiva de estos animales se extiende a edades

avanzadas. Jones y Swartz (2002) indican que la concepción ocurre

principalmente a finales de noviembre y principios de diciembre durante la

migracion hacia el sur. Un examen de los ovarios de hembras varadas apoya

dicha suposición (Darling, 1999), y le atribuye a la actividad en las lagunas, una

naturaleza secundaria en la reproducción, es decir que involucra la concepción en

hembras con periodos de estro secundarios. Sin embargo, Adams (1969) afirma

que los apareamientos en tránsito son raros y que la mayor parte se realiza en las

áreas de reproducción, dentro o cerca de la boca de las lagunas de Baja California

Sur, o incluso durante su migración hacia las areas de alimentación norteñas.

Aunque algunas hembras paren durante la migración hacia el sur, mas del

85% de las crias nacen en lagunas de crianza en Baja California Sur: Laguna Ojo

de Liebre (53%), Guerrero Negro (9%), Laguna San Ignacio (11%), Boca de la

Soledad/Estero de Santo Domingo (12%) y Bahia Magdalena (<6%), (Rice et al.,

1984). Por otro lado, el reavistamiento de madres mediante la foto-identificación

ha demostrado que la mayoria de las hembras paren a sus crias en las mismas

caracteristica es conocida como filopatria reproductiva. A excepción de las madres

con cria, la mayoría de las ballenas grises en Baja California permanecen fuera de

las lagunas. Los grupos de reproducción no visitan las lagunas por periodos

largos, ocasionalmente frecuentan las partes externas tanto dentro como fuera de

la entrada (Adams 1969).

Gardner y Chavez-Rosales (2000) sugieren que la fidelidad a los sitios de

reproducción no está necesariamente controlada por via materna, sino por

condiciones ambientales como las fluctuaciones en la temperatura del agua. Esta

suposición se basa en que durante el evento El Niño de 1998 la abundancia

relativa de ballenas observadas en Bahia Magdalena estuvo inversamente

relacionada con la temperatura, en comparación con 1997 y durante el evento La

Niña en 1999. En 1998 la temperatura promedio de Bahía Magdalena fue 5.8°C

mayor que en 1999, y la abundancia relativa de ballenas 15 veces menor.

Dada la existencia de cópulas fuera de las lagunas y debido a la supuesta

competencia de esperma por la fertilización, la presencia o ausencia de

subpoblaciones dificilmente puede evaluarse con métodos tradicionales. Sin

embargo, el uso de herramientas moleculares puede contribuir al entendimiento

de la estrategia reproductiva de esta especie. Específicamente, se puede evaluar

el grado de diferenciación genética entre organismos que se encuentran en las

distintas lagunas de crianza. Recientemente Goerlitz et al. (2003) evaluaron el rol

de la filopatria en E. robustus con muestras de las lagunas de San ignacio y Ojo

en nivel molecular entre madres con cria obsen/adas dentro de Laguna San

Ignacio y hembras muestreadas al azar fuera de esta laguna (FS†=0.064, p<0.01 y

¢S†=0.041, p=0.043, respectivamente) y entre madres con cría y hembras

solitarias (Fs†=0.027, p=0.044 y <DS†=0.044, p=0.034, respectivamente). Para

individuos muestreados en Laguna Ojo de Liebre, Goerlitz et al. (2003)

encontraron valores significativos de Fs† únicamente al comparar madres con cría

y hembras solitarias fuera de las lagunas (Fs†=0.074, p<0.01). Estos valores

confirman la existencia de cierto nivel de fidelidad a lagunas de crianza, por lo que

la población podría estar estructurada. Sin embargo, la investigación de estos

autores se basó exclusivamente en el ADN mitocondrial y en la comparación entre

hembras residentes dentro de las lagunas contra las hembras solitarias fuera de

estas. No hicieron comparaciones entre los individuos observados en las

diferentes lagunas. La utilización simultánea de marcadores mendelianos

(nucleares) y matrilineales (mitocondriales) es particularmente importante para

especies que presentan filopatria dirigida maternalmente, como sucede con los

mamiferos marinos (Palumbi y Baker 1994). Este trabajo incluye el análisis del

genoma nuclear y mitocondrial de muestras provenientes de tres de las principales

lagunas de crianza: Laguna Ojo de Liebre, Laguna San ignacio y Bahía

Magdalena.

Historia de la cacería

Es importante considerar que en poblaciones que han sido sujetas a la

variabilidad genética (Hoelzel 2002). En la ballena gris, la actividad de caza se

realizó durante los siglos XIX y XX. Dada la alta abundancia de ballenas y la

facilidad de cazarlas en aguas someras, la cacería ocurrió principalmente en

lagunas de crianza. La caza se concentró sobre hembras preñadas, por lo que la

capacidad de crecimiento de la población se vió reducida. La industria ballenera

internacional operó en México desde principios de 1800 hasta 1976, cuando

México estableció su Zona Económica Exclusiva hasta 200 millas de la costa

(Dedina Young, 1995). En 1983 el gobierno federal mexicano fijó una multa por la

captura de ballena gris. Actualmente, el turismo de avistamiento de ballenas ha

tomado gran importancia para la economía local de estas regiones de la peninsula

de Baja California.

Se estima que en 1885 la ballena gris estuvo a punto de extinguirse (Adams

1969). En 1938, diversos paises firmaron un tratado para controlar la explotación

de las ballenas y se le otorgó protección completa a esta especie a excepción de

la cacería aborigen. En 1994, se evaluó la población y se consideró recuperada.

Para estas fechas, su abundancia probablemente excedió los niveles

pre-explotación (Small y DeMaster, 1995), por lo que fue eliminada de la lista de

especies en peligro de extinción. Esta es la única especie de misticetos fuera de la

lista y permanece como especie protegida (Rugh et al., 1999). Actualmente, los

incrementos en la mortalidad natural de todos los grupos de edad y sexo sugieren

que la población probablemente ha excedido su capacidad de carga y que esta

esperaría que el aumento en el tamaño de la población se detenga o bien que

comience a declinar.

Es importante mencionar que durante los siglos XIX y XX el principal foco de

la cacería comercial en México fue el complejo lagunar de Bahía Magdalena de

donde provinieron aproximadamente 65% de los individuos cazados en la zona, y

en donde se sostuvo la cacería por un periodo mucho mayor que en las lagunas

Ojo de Liebre y San Ignacio (Urban-Ramírez et al., 2003). Aunque Bahía

Magdalena sigue siendo una de las lagunas de crianza de mayor importancia, es

interesante notar que actualmente llegan mas ballenas a la Laguna Ojo de Liebre

que a Bahia Magdalena y Laguna San Ignacio (Urban-Ramírez et al., 2003).

Abundancia

El estatus poblacional de la ballena gris ha sido ampliamente documentado.

Adams (1969) reporta los primeros esfuerzos del Scripps lnsitute of Oceanography

por hacer conteos de la población de ballena gris del noreste del Paclfico. Desde

1950 hasta 1967, se contaron entre 3,000 y 18,000 individuos. Buckland et al.

(1993) reportan estimaciones de abundancia a partir de censos anuales hechos en

la Bahía de Monterey, California durante la migración hacia el sur (de 12,821 a

20,867 individuos entre 1967 y 1988). En un memorando técnico de la NOAA

(Oficina Nacional de Océanos y Atmósfera por sus siglas en Inglés) que incluye la

revisión del estatus de la población de ballena gris del noreste del Pacífico (1999),

se mencionan diversos reportes sobre la abundancia de esta población entre 1992

Buckland et al. (1993) obtuvieron con sus datos una tasa anual de

incremento de la población del 2.52%. Wade (1999) utiliza diferentes parametros 0

modelos para estimar la capacidad de carga de la población a partir de datos de

abundancia. Encontró que existe una probabilidad de 0.21 de que dicha capacidad

de carga esté por debajo de la mitad y una probabilidad de 0.28 de que la

poblacion se encuentre por debajo del nivel máximo de sustentabilidad. Estos

datos contradicen otros modelos de capacidad de carga de la especie.

Selección de los marcadores moleculares

Región control del ADN mitocondrial (ADNmt)

El genoma mitocondrial animal es una molécula de ADN circular de doble

cadena relativamente pequeña, de alrededor de 16,000 pares de bases (pb). Es

haploide y en general se hereda sin recombinación, asexualmente por vía

materna. Contiene una secuencia regulatoria conocida como región control (en

mamíferos -1000 pb) que no codifica proteinas ni ARN ribosomal o de

transferencia. Esta región del genoma se ha utilizado para estudios de genética

poblacional debido a que es una zona hipervariable del ADNmt, en otras palabras,

presenta una alta tasa de mutación. Por esto provee información útil para

diferenciar organismos cercanamente emparentados de otros grupos (Fig. 1). Esta

secuencias en este genoma se deben a sustituciones. Dichas características

hacen de la secuenciación del ADNmt una herramienta útil para determinar

filogenias y factores que influyen sobre la dinamica y estructura de poblaciones

silvestres, tales como el nivel de dispersión, hábitos reproductivos, historia

reciente y relaciones filogenéticas (Avise 1994; Avise 2000).

_ á región control ì

(-1 kilubasej

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a D-loop -al

Figura 1. Esquema de los 3 principales dominios de la region control del ADNmt

Microsatélites

Los microsatéiites son segmentos de ADN nuclear distribuidos ampliamente

en ei genoma eucarionte. Forman parte del grupo de los loci STR (Short Tandem

Repeats, repeticiones cortas en tandem por sus siglas en inglés), contienen entre

10 y 50 copias de un motivo corto de entre una y diez pares de bases. Los

microsatéiites tienen tasas mutacionaies altas que causan la pérdida 0 ganancia

de unidades de repetición; a esta pérdida 0 ganancia de unidades se les conoce

como “indeis" (insertions/deietions, inserciones/pérdidas por sus siglas en inglés).

Los microsatélites son altamente polimórfícos y exhiben una variación alelica

amplia. Se heredan de forma Mendeliana y son codominantes, lo cual permite la

distinción entre homocigotos y heterocigotos (Tautz 1989). Actualmente, se les

considera como marcadores evolutivos neutrales; es decir, que no están sujetos a

selección (Li et al., 2002). Debido a estas características genéticas, estos loci son

usados comúnmente en el análisis de identificación individual y poblacional, para

detectar estructura poblacional, patrones de subdivisión geográfica y estimar

H|PóTEs|s

1. Ya que se ha obsen/ado fidelidad por parte de las hembras hacia las

lagunas de crianza, se hípotetiza la existencia de estructura genética influenciada

por vla materna y detectable en el genoma mitocondrial.

2. Por otro lado, debido a que esta fidelidad no ha sido observada por parte

de los machos, no se espera encontrar estructura genética detectable en el

OBJETIVOS

General

Evaluar la estructura genética de la población de E. robustus en el Pacífico

oriental en tres lagunas de crianza en Baja California Sur: Laguna Ojo de Liebre,

Laguna San ignacio y Bahía Magdalena.

Particulares

1 Caracterizar los genotipos individuales utilizando marcadores

mitocondriales y nucleares.

2. Analizar la diversidad genética encontrada entre los individuos.

3. identificar el sexo de los organismos muestreados con métodos

moleculares.

4 Estimar niveles de flujo genético entre los organismos de las diferentes

lagunas.

ÁREA DE EsTuD|o

La zona de estudio comprendió tres lagunas costeras del estado de Baja

California Sur, Mexico: Laguna Ojo de Liebre, Laguna San Ignacio y Bahia

Magdalena (Fig. 2). Las dos primeras forman parte de la reserva de la biosfera del

Vizcaíno, B. C. S. (SEDUE, 1989). Ambas lagunas están situadas sobre la costa

oeste de la peninsula; Laguna Ojo de Liebre (27°23'-27“59' N, 114°30'-114°55' W)

está conectada a la Bahía Sebastián Vizcaíno, mientras que la Laguna San

Ignacio (26°25'-27°13' N, 112°48'-113°17' W) se localiza al este del pueblo Punta

Abreojos. Laguna Ojo de Liebre es la más grande de las dos lagunas (227,994

hectáreas), con 9 km de ancho y 48 km de largo. Tiene entre 5 y 12 m de

profundidad. Laguna San ignacio (142,956 ha) tiene 6 km de ancho y 35 km de

largo y profundidad de 2 a 4 m (SEDUE, 1989). Ambas zonas presentan climas

áridos. La temperatura media anual oscila entre 18°C y 22°C, lo cual genera una

tasa de evaporación del 98%. La precipitación pluvial anual fluctúa entre 0 y 200

mm.

Bahia Magdalena (24°15'-25°20' N y 111°30'-112°15' W) es el mayor

cuerpo de aguas profundas en la peninsula, con 170,000 hectáreas de superficie

(Hastings, 1999). Está protegida por dos islas: Isla Magdalena al norte e Isla

Margarita al sur. La Bahia es hipersalina con valores de salinidad y temperatura

comúnmente mayores a los encontrados en el Océano Pacífico (Álvarez-Borrego

Magdalena-Almejas esta comúnmente dividido en cuatro zonas principales: norte, central, sur

y periférica (Fig. 2).

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MATERIALES Y MÉTODOS

Recolecta de biopsias

Durante enero y febrero de 1997 y 1998 se recolectaron biopsias de piel

de E. robustus con el método de ballesta en Laguna Ojo de Liebre (LOL, n=28),

Laguna San Ignacio (LSI, n=20) y Bahia Magdalena (BM, n=33). Dichas biopsias

fueron tomadas bajo permisos especiales de colecta cientifica (CITES, # 04396 y

USA CITES # 800965), preservadas con DMSO (Dimetil sulfoxido) y congeladas

para su analisis posterior (como en Dessauer et al., 1996). Adicionalmente, se

agregaron 46 biopsias (LOL n=7 y LSI n=39) custodiadas por el grupo de Ecologia

Molecular del SWFSC (Southwest Fisheries Science Center, Centro de Ciencias

de la Pesqueria del Suroeste por sus siglas en Inglés, localizado en La Jolla,

California). Dichas biopsias fueron almacenadas en 10 M NaCl y 20% DMSO.

Trabajo de laboratorio

Extracción y purificación de ADN

La extraccion del ADN se realizó a partir de alrededor de 50 mg de tejido con

el método de cloruro de litio (LiCl) por saturación de sales (Aljanabi y Martinez

1997; Apéndice 1). Para estimar la calidad y cantidad de ADN se llevaron a cabo

electroforesis en geles de agarosa al 1%. El tamaño del DNA obtenido se estimó

Amplificación

Se llevaron a cabo amplificaciones (de tres genes de interés) mediante la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) con un

termociclador Thermohybaid PXE (Thermo Hybaid, Massachussets):

1. Región control del ADN mitocondrial. Se amplificó el fragmento que

comprende la región hipen/ariable I de la región control del ADNmt con los

cebadores: TRO: 5' CCT CCC TAA GAC TCA AGG AAG 3' y D: 5' GG ACT TCA

TTC TTG GTC TAC 3' (Rosel et al., 1994; Escorza-Treviño et al., en prensa). Se

realizaron reacciones en 25 pL con las siguientes condiciones de PCR: 12.38 pL

de mQH2O, Buffer (Tris 10mM, KCL 50 mM y 20 mM MQCI2), dNTPs 0.6 mM,

cebadores (0.3 pM cada uno), 0.625 U Taq y 1.0 pL de ADN. Se utilizó el siguiente

perfil de termocicladot 2.5 min de precalentamiento a 90°C, 35 ciclos de 45 seg a

94°C para la desnaturalización, 1 min a 48°C de anillamiento y 1.5 min a 72°C

durante la polimerización seguidos por 5 min a 72°C. Las reacciones de PCR de la

región control del ADNmt se verificaron mediante electroforesis en geles de

agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (0.5 pg/ml).

2. Microsafélifes. Se amplificaron 6 loci microsatelitales con cebadores

especificos (Tabla I). Se realizaron reacciones de 25 pL con las siguientes

concentraciones de reactivos: 12.38 pL de mQH2O, Buffer (Tris 10 mM, KCI 50

mM y 20 mM MgCl2), dNTPs 0.6 mM, cebadores (0.3 ¡JM cada uno), 0.625 U Taq

y 1.0 pL de ADN. Las condiciones de PCR utilizadas para cada locus fueron muy

Tabla l. El perfil de termociclado general consistió de 10 segundos para la

desnaturalización a 94°C, 20 segundos de anillamiento y 20 segundos de

polimerización a 72°C. Todas las reacciones constaron de 45 ciclos. Los

fragmentos amplificados fueron probados mediante electroforesis en geles de

agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio (0.5 pg/ml).

Tabla I. Cebadores utilizados en la amplificación de los microsatélites.

Locus Illgggyígigã Secuenciaãeloš Išïebadores Tac Refl

F; AAA GAc TGA GAT cTA TAG TTA

GATA°2”

GATA

R: cec TGA TAG ATT AGT cTA GG

54

2

F; Acc TTG ATT TGG AAG TcA TGA

EV"

AG

R; TAG TAG AGc cGT GAT AAA GTG c

54

1

F; cAT TTc cTA occ Acc TGT cAT

GW”

GT

R; GTT ccc AGG cTc Tec AcT cTG

54

3

F: ATC GTA TTG GTG cTr TTG TGo

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(TG)('")(AG> R: AAT AGA TAG TGA TGA TGA TTc AcA cc

49

1

F; TGT Acc GTG GAT GGA TAG ATT

GATA°9°

GATA

R: TcA ccT TAT TTT GTc TGT GTG

49

2

F; cTG AGA TAG cAG TTA cAT GGG

GATA4"

GATA

R: TcT GcT CAG GAA ATT TTc AAG

46

2

T”C: Temperatura de anillamiento.

Ref: Referencias: 1) Valsecchi yAmos (1996). 2) Palsbøll et al, (1997) y 3) Bérubé et al. (2000).

3. Identificación del sexo. El sexo de los especímenes muestreados se

identificó con el uso de cebadores diseñados para amplificar los genes ZFYIX de

los cromosomas sexuales X y Y. A partir de dichos cebadores, se obtienen dos

reacciones de 25 pL con las siguientes condiciones de PCR: 12,38 pL de mQH2O,

Buffer (Tris 10 mM, KCL 50 mM y 20 nM MgCl2), dNTPs 0.6 mM, cebadores (0.3

pM cada uno), 0.625 U Taq y 1.0 uL de ADN. Con el siguiente perfil de

termocícladoz 4 min de precalentamiento a 94°C, 35 ciclos de 45 seg a 95°C para

la desnaturalización, imin a 55°C de anillamiento y 1.5 min a 70°C durante la

polimerización seguidos por 7 min a 70°C (Bérubé y Palsbøll 1996). Las

reacciones de PCR de sexado se verificaron mediante electroforesis en geles de

agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (0.5 pglml).

Secuenciación del ADNmt

Los productos de PCR se purificaron empleando exonucleasa y fosfatasa

alcalina de camarón (ExoSAP-ITG, USB, OH). Para esto, se agregaron 2 pL de

ExoSAP-IT@ a 6 pL de producto de PCR para después someterlos a un periodo de

incubación de 15 minutos a 37°C, seguido de 15 minutos a 80°C para inactivar las

enzimas. Se secuenciaron ambas hebras del ADNmt por separado en una

reacción de secuenciación en ciclo por medio de marcadores fluorescentes de

ABI-PRISMG Dye-DeoxyTerminator Big Dye†"' v 3.1 (Applied Biosystems, CA). Los

fragmentos secuenciados fueron detectados en un secuenciador automático Gene

Analizer ABI 3100 (Applied Biosystems, California).

Genotipificado de los microsatélites

Los productos del PCR se sometieron a una electroforesis en capilares con

Analyzer ABI 3100. Los tamaños alélicos se determinaron con el programa

GeneMapper†M.

Análisis de datos

ADN mitocondrial

Alineamiento

Las secuencias nucleotidicas obtenidas fueron verificadas por medio del

programa de cómputo Sequencher 3.0. A través de la alineación de los

cromatogramas de las cadenas complementarias de cada muestra, se obtuvo una

secuencia consenso para cada organismo. Las secuencias individuales fueron

alineadas para detectar sustituciones, inserciones o ausencias de bases por

medio del programa Clustal X (Thompson et al., 1997). La identificación de los

sitios variables entre secuencias se realizó por medio del programa MEGA,

versión 2.1 (Kumar et el., 2000). Para identificar los haplotipos distintos se

construyó una matriz de distancia considerando el número total de diferencias

entre haplotipos con el programa PAUP v. 4 (Swofford, 1989).

Índices de diversidad genética

Con el programa Arlequín v.2 (Schneider et al., 2000) se obtuvo la diversidad

haplotipica y nucleotidica, asi como el número de sitios segregados para cada

laguna y para todas las muestras (Ojo de Liebre, San Ignacio y Bahia Magdalena).

elegidos al azar sean diferentes en una muestra o población (Nei 1987). La

diversidad nucleotidica es equivalente a la diversidad haplotipica en nivel

nucleotidìco, es la probabilidad de que dos nucleótidos homólogos elegidos al azar

sean diferentes. Los valores de diversidad haplotipica encontrados en las

diferentes lagunas se compararon estadísticamente a traves de una prueba tde

Hutcheson (Zar, 1984).

Demografía histórica

Dado que la ballena gris fue sujeto de una cacería intensa y en consecuencia

la especie estuvo en supuesto peligro de extinción durante el siglo pasado, resulta

relevante estudiar su demografía histórica a partir de datos moleculares. Para ello,

se realizó un analisis sobre la distribución de las diferencias pareadas entre

haplotipos (mismatch distribution), ya que los procesos demográficos que ocurren

a lo largo de la historia evolutiva de una población dejan señales sobre la

distribución de distancias genéticas (Rogers y Harpending, 1992). Se ha

observado que poblaciones que han permanecido bajo equilibrio demográfico

estable por mucho tiempo presentan distribuciones multimodales, caóticas o

disparejas, mientras que aquellas que han sufrido expansiones repentinas

recientes o cuellos de botella presentan distribuciones unimodales y suaves

(Harpending, 1994; Rogers y Harpening, 1992).

Para este análisis, se tabuló la distribución de distancias genéticas entre

individuos muestreados en cada laguna y en las tres lagunas bajo el modelo de

bondad de ajuste del modelo a las distribuciones observadas. Ambos análisis se

llevaron a cabo con el programa Arlequin v.2 (Schneider et al., 2000).

Estructura genética

Para evaluar el grado de subdivisión poblacional se analizó y comparó la

varianza molecular (AMOVA) de las secuencias de ADNmt, utilizando el programa

Arlequin v.2 (Schneider et al., 2000). Este análisis prueba la hipótesis nula de

panmixia (apareamiento equiprobable al azar) entre los individuos muestreados en

las tres lagunas de crianza. Para esto primero fue necesario seleccionar el modelo

evolutivo de sustitución nucleotidica que explica con mayor precisión el patrón de

sustitución de las secuencias de ADNmt incluidas en el analisis, para alimentar

con este modelo las rutinas de cálculo de las varianzas moleculares. La selección

de tal modelo se efectuó utilizando pruebas de razones de verosimilitud (likeiihood

ratio tests) entre pares de modelos alternativos y conforme al Criterio Informativo

de Akaike (AIC) utilizando las rutinas del programa Modeltest v. 3.7 (Posada y

Crandall, 1998). Asi se contrastaron 56 modelos evolutivos diferentes, entre los

que se selecciono el modelo de mejor ajuste para construir la matriz de distancias

genéticas. Esta matriz fue utilizada para estimar el índice de fijación <Ds†, el cual

representa la estructura genética considerando tanto la frecuencia haplotipica,

como la información del número de mutaciones entre haplotipos (Excoffier et al.,

1992). Tambien se calculó su análogo, el índice de fijación FST, que considera

nivel de significancia de u=0.05 para evaluar la varianza asociada a los diferentes

niveles de estructura genética.

Análisis filogenético y filogeografía

Con el fin de esclarecer si la estructura poblacional observada ha sido el

resultado de la segregación geográfica de linajes evolutivos y su divergencia a lo

largo del tiempo geológico, se condujeron análisis filogenéticos y filogeográficos.

Estos comprendieron la reconstrucción de las relaciones filogenéticas entre los

haplotipos mitocondriales con el uso de dos métodos distintos: parsimonia máxima

y Neighbor-.Joining (N-J). En ambos métodos se incluyeron dos grupos externos

para la construcción de los árboles: la ballena azul (Balaenoptera musculus) y la

ballena jorobada (Megaptera novaeanglie) que fueron utilizados para enraizar los

árboles. Las secuencias de los grupos externos se obtuvieron de la base de datos

del Genebank con números de acceso X72204 para ballena azul (Arnason et al.,

1993) y DQ145099 para ballena jorobada (Backer y Medrano, 2005).

Se reconstruyó un árbol filogenético con el método de parsimonia máxima

(heuristico) aplicando las rutinas del programa PAUP versión 4 (Swofford, 2002).

Se calculó un arbol consenso a partir de los árboles más parsimónicos. El método

de N-J utiliza una matriz de distancias para la construcción de árboles

filogenéticos; en este estudio se usó la matriz de distancias generada con el

modelo de mejor ajuste. El arbol se construyó con un remuestreo (bootstrap) no

paramétrico de 1000 pseudoréplicas para evaluar la topología del árbol resultante

construyó un árbol de minima separación (MSN, por sus siglas en ingles)

utilizando el programa Arlequin v. 2. Éste calcula las conexiones entre haplotipos

a partir del número de mutaciones entre secuencias así como la frecuencia de los

haplotipos en cada laguna de crianza.

Microsatélites

Índices de diversidad genética

Antes de estimar los valores de diversidad genética a partir de los

microsatelites, se realizó una prueba de ligamiento de alelos para cada par de loci

bajo la hipótesis nula de que los alelos se segregan independientemente y que los

genotipos de cada locus es independiente de otro. Utilizando el programa de

cómputo GENEPOP se estimaron los valores de p mediante pruebas exactas de

Fisher con el método de la cadena de Markov (Guo y Thompson, 1992).

Posteriormente, se obtuvieron las frecuencias genotlpicas y aleiicas por locus en

cada laguna por medio del programa de cómputo Arlequin v. 2. Se evalúo si los

diferentes loci están o no en equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W), y se calculó la

heterocigocidad observada (H,,)y esperada (Hg) bajo H-W.

Estructura genética

Se calculó el índice de fijación Fsry se hizo un analisis anidado de variancia

molecular RST que incorpora como componente de la varianza molecular la

diferencia cuadrática del tamaño de los alelos como distancias euclidianas

calcularon por medio de permutaciones de cada componente de la varianza de

manera no parametrica según lo descrito por Excoffier et al. (1992). Estas pruebas

se realizaron con el programa ARLEQUIN v. 2.0 (Schneider et al., 2000). Una vez

obtenidos los valores de significancia de las pruebas múltiples, éstos se

corrigieron con la prueba secuencial de Bonferronl (Rice 1989).

Análisis multivariado

Para medir la diferenciación genética entre lagunas se realizó un análisis de

componentes principales y posteriormente un análisis canónico discriminante. El

análisis de componentes principales considera n variables (en este caso, el

tamaño de los alelos microsatelitales) y calcula combinaciones de éstas para

producir factores no correlacicnados (StalSoft, 2002). Los factores resultantes

fueron utilizados como variables para ser sometidos a un analisis canónico

discriminante por pasos para grupos múltiples por medio del programa Statistica v.

6 (StatSoft, 2002).

El numero de factores se determinó bajo el criterio de Kaiser. Dicho criterio

establece que los factores a retener son aquellos con un eigenvaior mayor a 1, ya

que representan al menos el equivalente de una variable original (StatSoft, 2002).

Para evaluar la significancia del poder discriminante del modelo, se estimó el

estadístico estándar Lambda de l/l/ilks, cuyo inten/alo de valores va de 0 a 1, 0

tiene un poder discriminante total y 1 un poder nulo. Para cuantificar la

contribución particular de cada factor a la discriminación entre grupos, se

un intervalo de valores de 0 a 1. Las funciones discriminantes fueron calculadas

por medio de un análisis canónico. El número máximo de funciones discriminantes

que se puede estimar es igual al número de grupos menos uno (en este caso

3-1=2). Además, se estimó la significancia de las funciones discriminantes mediante

una prueba Chi-cuadrada.

Se construyeron distancias de Mahalanobis a partir de la media de las

variables. Dichas distancias representan la distancia (genética, en este caso),

como distancias geométricas en un espacio multivariado. A partir del análisis de

función discriminante es posible distinguir loci que discriminan mejor entre

lagunas. Es decir que, de acuerdo con la hipótesis nula del modelo de no

discriminación entre grupos, si la media de una variable es significativamente

diferente entre grupos (ballenas de distintas lagunas), entonces será tomada para

discriminar entre éstos. Los supuestos del modelo incluyen la distribución normal

de los datos y la homogeneidad de las varianzas y covarianzas (StatSoft, 2002).

Pruebas de identidad

En este trabajo no se tuvo acceso a datos de campo tales como

foto-identiflcación 0 posición geográfica de los organismos muestreados, Esta

limitación pudo haber causado que se obtuvieran muestras duplicadas de

individuos, lo que no permite una corroboración independiente de los resultados.

El Apéndice 2 contiene los datos de las muestras a los cuales se tuvo acceso:

aquellas muestras que fueron tomadas por duplicado dentro de cada laguna

utilizando el haplotipo mitocondrial, el genotipo microsatelital y el sexo de cada

individuo. A partir de las frecuencias alélicas microsatelitales se calculó la

probabilidad de que muestras con estos caracteres iguales fueran distintas. Estas

probabilidades resultaron muy pequeñas (2.9x10`5 en promedio), por lo tanto las

muestras con genotipos iguales se consideraron como provenientes de un mismo

organismo y se eliminaron de análisis posteriores. Se encontraron seis muestras

duplicadas en LOL, tres en LSI y diez en BM (Tabla ll a).

Otro hallazgo importante fue la identificación de la recolección de muestras

de un mismo individuo en diferentes lagunas durante enero de 1997,

especificamente en Laguna Ojo de Liebre y Laguna San Ignacio (Tabla ll b). La

distancia aproximada entre LOL y LSI a lo largo de la linea de costa es de 350 km

y que la velocidad crucero promedio de la ballena gris durante la migración hacia

el sur es de 2 m/s (7.2 km/h Sumich, 1983). El re-muestreo entre ambas lagunas

en un lapso de tres dias en enero de 1997 (Tabla llb) resulta probable ya que para

recorrer esa distancia a la velocidad crucero, deberian tardar aproximadamente

dos días, suponiendo nado constante a la velocidad de crucero promedio. Es

probable que estas muestras fueran tomadas cerca de la boca y que pertenezcan

a ballenas transeúntes que sólo visitaron la laguna por un periodo corto para

después continuar su migración al sur. Las muestras duplicadas en LOL (Tabla

lllb) se excluyeron de análisis posteriores. Se decidió asignar las muestras a LSI,

migración hacia el sur, y de las dos lagunas con muestras repetidas LSI es la más

sureña.

Tabla II. Muestras que fueron tomadas por duplicado, a) dentro de la misma

laguna y b) en diferentes lagunas.

al

..| O .J

Muestras repetidas

dentro de las lagunas __

No se Se

LOL03 LOL06 LOL10 LOL13 LOL17 LOL18 LOL28 LOL27 LOL26 LOL24 LOL 19

LOL23 +0-\\O+O+O+O+O

_U)

E ..| LSI02 LS |05 LSI07 BM03 BM04 BM05 BM07 BM08 BM2 1 LS/03 LSI 1 4 LS/06

BM1 7 BM 1 3 BM24 BM09, BM1 B,

BM22 y

BM28 BM1 1 y

BM1 9 BM30

42

|.oL

9

Loma

6

Lo|.o4

9

|.oLo7

Loma

9

LOL12

LoL14

9

1.01.20

S?

Fecha de o muestre 10/01/97 10/01/97 10/01/97 10/01/97 11/01/97 11/01/97 17/01/98 LSI LS/05 LS|15 LSI17 LSI16 LSIO1 LSI07 LSIO4 Fecha de muestreo 14/01/97 15/01/98 15/01/98 15/01/98 14/01/97 14/01/97 14/O1/97

cg Muestras repetidas entre lagunas

9

Sexo

O=\<lO\'O+O0§+O+O

REsu|.†Aoos Y Discusión

Para un análisis certero de genética de mamiferos marinos es imprescindible

la foto~identificación de los individuos muestreados, asi como la toma de datos de

campo (posición geográfica, condiciones ambientales y otras observaciones)

porque disminuyen la posibilidad de re-muestrear y por ende el gasto innecesario

de recursos para su analisis, Además, es importante hacer notar que no siempre

se puede verificar la presencia de muestras duplicadas (por ejemplo, estudios

donde se analiza exclusivamente el ADNmt), lo cual puede tener un efecto

negativo sobre la interpretación de los resultados. Este efecto se puede manifestar

en sesgos artificiales en las frecuencias haplotipicas que producen artefactos en

los modelos estadísticos para inferir la demografía histórica 0 la abundancia de las

poblaciones a partir de datos genéticos. En este trabajo se evalúa dicho efecto

parcialmente, al comparar los resultados obtenidos en ausencia y en presencia de

las muestras repetidas.

Alineación y variación de secuencias

Se obtuvieron 127 secuencias individuales de 498 pares de bases (pb). Una

vez descartadas las secuencias de muestras repetidas dentro y entre lagunas

(Tabla ll a y b), este número se redujo a 102 muestras, entre las cuales se

encontraron 24 haplotipos diferentes definidos por 35 sitios variables (Tabla lll).

ballena gris. Steeves et al. (2001), LeDuc et al. (2002) y Goerltz et al. (2003)

reportan 24, 33 y 28 haplotipos respectivamente (Tabla lV). Todas excepto una de

las sustituciones fueron transiciones y sólo se detectó un “indeI".

La frecuencia haplotipica fue heterogénea. Cuatro de los haplotipos (hA, hB,

hC y hN) representan ~50% de los individuos muestreados y otros cuatro

haplotipos (hAE, hK, hT y hV) estuvieron representados por un solo individuo cada

uno (Tabla lll). LSI fue el único sistema en presentar ballenas con haplotipos

exclusivos (10); sin embargo, su frecuencia es de sólo un individuo en la mayoria

de los casos. Los haplotipos más abundantes registrados por LeDuc et al. (2002;

A, B y C) se detectaron en las tres lagunas de este estudio (excepto C en LOL) y

fueron también los más abundantes (Tabla lll), El haplotipo hN presentó una

Tabla III. Sitios segregados entre los 24 haplotipos de ballena gris. El primer nucleótido del alineamiento corresponde al nucleótido 15421 del genoma

mitocondrial completo de E. robustus (número de acceso al GenBank AJ554053, Arnason et al., 2004). Frecuencias de ocurrencia en las lagunas: Ojo de Liebre (LOL), San Ignacio (LSI) y Bahía Magdalena (BM).

PO

HAPLOT

SITIOS SEGREGADOS FRECUENCIA

11111111l112333333333333333344 23566244445566682022224444566678926 2623455678591231851238l567647B78594

LOL LSI BM TOTAL

hC hV hK hT hAE hD hG hQ hM H1 hAA hAB hU hR hL hAG hY hX hH hAD hZ hN hA hB GGT›TTCTTGTTCTTGCTGTGCCGTTCCTTTAATG ...›... . . . . ..T...A.T.CC...CA ...-...C . . . ...

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-....CA...T... .. -...C...C....T.A.ATT.CC...G.C. .. - . . . .. ...A ...- _ ...A.TA.C...G.C. ...- . . . ..C.T . . . .. ..C-... .... . ...A.TA.C...G.C. ...-. ... ..C.T...CC...A

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ààààwwwwNNNNNNwAAHA

10 11 17

Análisis comparativo

Para facilitar el análisis de los datos, los haplotipos encontrados en este

estudio fueron comparados (por medio de la función BLAST, NCBI

hl:tp:¿¿WWw.ncbi.nlm.nih.gov), con todos los haplotipos publicados hasta la

fecha para la región de control de ballena gris. Específicamente, se comparó con

los haplotipos reportados en los trabajos de Steeves et al., 2001 (número de

acceso al Genebank AF369785-AF369762), LeDuc et al., 2002 (AF326789~

AF326824) y Goerlitz et al., 2003 (AY514484-AY514458). La comparación se hizo

exclusivamente sobre la zona de traslape entre las secuencias de los haplotipos

(Fig. 3).

Region eampmaa

cnocmms b 'mr ¦Pro l Región wnnml Pm 12s rARN |í_*ïHïH1;'J< .Í , ' " ".;ìl4ïH. ,E ':'.Íl

mm ,i .i.. zm rm as)

<-la-al-í› sm un-in me pm

sim.. -1 si.. mi mi ps)

La en-mii; si ni, zoo: (sus pu)

Figura 3. Esquema de la posición y tamaño de las secuencias de ballena gris

analizadas en este estudio y por otros autores, con respecto al

genoma mitocondrial completo (el mapa no se encuentra a escala).

Debido a que todos los haplotipos encontrados en este trabajo (excepto uno,

“h1") corresponden a alguno de los publicados por LeDuc et al.. 2002 (Tabla IV),

se les nombró con la misma letra pero con una “h” distintiva ya que el tamaño de

las secuencias analizadas en ambos trabajos difiere por 25 nucleótidos, entre los

erai.,zoo1

eia¡.,2ooz

erai.,2uoa

5°

al

1

A

1a

hA

12 AA 19 AC 9

Ao,i.yu

11

AE

_

AF

5 24 14 13 17 15 7 6 3 18 2 10 8 16 4 22 23

zo y 21

Aa y Ac

AH

AI AJ B

f-Q

N-<><ã<-iman-<'1¦< zš¡~.:'I1mc›o

ø

o

7 20

25

21;

21 24

iv

15 13 25 19 12 6 26 11 16 22 a.uN~tmm¿'^§ 5 27

hAA

i¬Ao, nt y nu

hAE

nAB y hAG

ha

nc

ho

HH

hi<

nivi

hn

ne

no

i¬R

hr

hv

nx

hv

nz

ni

Tanto letras como números corresponden al nombre del haplotipo asignado por cada autor

Los haplotipos que se presentan en cursivas y negritas fueron encontrados únicamente en uno de /os cuatro estudios.

Veintidós de las muestras custodíadas por el SWFSC ya fueron analizadas

en nivel mitocondrial y publicadas por Goerlitz et al. (2003). Entre las secuencias

reportadas por estos autores se detectó la presencia de 9 haplotipos que no

habían sido encontrados por otros autores. Estos haplotipos se presentaron

únicamente en LSI, por lo que pueden considerarse privados a esta laguna.

Debido a que cinco de esos haplotipos aparecen cercanamente emparentados al

haplotipo “B” (haplotipos 1 a 5, Fig. 4), que hasta entonces había sido el único

sobreviviente de ese linaje divergente, se llevó a cabo la amplificación y

secuenciación de ADNmt de las veintidós muestras compartidas para verificar la

existencia de dichos haplotipos.

La mitad (11) de las secuencias no fueron reproducibles, es decir contenían

errores de secuenciación (Apéndice 3). De las once muestras erróneamente

secuenciadas, tres corresponden a haplotipos privados reportados en dicha

publicación. Debido a que estos haplotipos (2, 3 y 4) ocurrieron sólo en uno o dos

organismos (Fig. 4), concluimos que realmente no existen en la población ya que

es concebible que se haya cometido un error en la secuenciación de dos

individuos. Por otra parte, las ocho secuencias restantes se encontraron en

haplotipos no privados, por lo que resulta muy difícil establecer cuál proporción de

secuencias es incorrecta. Por lo tanto, los resultados de este trabajo no incluyen

ninguna de las secuencias publicadas por Goerlitz et al. (2003). La figura 4

contiene la tabla de haplotipos publicada por estos autores, donde se indican

reanalizadas y de éstas, cuáles están secuenciadas erróneamente. Los haplotipos

corregidos correspondientes a esas muestras y los cromatogramas resultantes de

la secuenciación de las mismas (donde se pudo verificar la calidad de la

secuenciación) están contenidos, respectivamente, en los apéndices 3 y 4.

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Figura 4. Tabla de haplotipos publicados por Goerlitz etal. (2003).