micotoxinas en silo bolsa RAM 2015

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www.elsevier.es/ram

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A

D

E

MICROBIOLOGÍA

ORIGINAL

Factores

extrínsecos

e

intrínsecos

asociados

a

poblaciones

fúngicas

micotoxigénicas

de

granos

de

maíz

(

Zea

mays

L.)

almacenados

en

silos

bolsa

en

Argentina

Claudia

C.

Castellari

a,∗

,

María

G.

Cendoya

a

,

Facundo

J.

Marcos

Valle

a

,

Viviana

Barrera

b

y

Ana

M.

Pacin

c

aFacultaddeCienciasAgrarias,UniversidadNacionaldeMardelPlata,Balcarce,BuenosAires,Argentina

bInstitutodeMicrobiologíayZoologíaAgrícola,CentroNacionaldeInvestigacionesAgropecuarias,InstitutoNacionalde

TecnologíaAgropecuaria(INTA),Castelar,BuenosAires,Argentina

cFundacióndeInvestigacionesCientíficasTeresaBenedictadelaCruz,Luján,BuenosAires,Argentina

Recibidoel6deenerode2015;aceptadoel17deagostode2015 DisponibleenInternetel24deoctubrede2015

PALABRASCLAVE

Silobolsa;

Maíz(ZeamaysL.); Micobiotatoxigénica; Fumonisinas;

pHdegranos; Atmósfera autorregulada

Resumen Conelobjetodecaracterizarlaspoblacionesfúngicas,enparticularlasespecies potencialmentemicotoxigénicas,quepuedencontaminarlosgranosdemaízalmacenadosen silosbolsaconuncontenidodehumedadsuperioralrecomendadocomoseguro,seevaluaron 270muestrasextraídasalinicio,alos90díasyalfinaldeunperíododealmacenamientode5 meses.Endichasmuestrassecuantificóeidentificólabiotafúngicaysedeterminóla conta-minaciónconfumonisinasyaflatoxinas.Asimismo,seevaluóelefectodefactoresextrínsecos (ambiente),intrínsecos (granos)y tecnológicos(ubicacióndelosgranos enelperfildelsilo bolsa)sobrelaspoblacionestotalesymicotoxigénicas.ElpHdelosgranosyelniveldeO2se

redujeronsignificativamentealos5meses,mientrasquelaconcentracióndeCO2seincrementó

enigualperíodo.Losrecuentostotalesdelamicobiotafueronsignificativamentemayoresenlos granosubicadosenelestratosuperiordelsilobolsa.Seidentificaronespeciesmicotoxigénicas deFusarium,Aspergillus,PenicilliumyEurotium.LafrecuenciadeaislamientodeFusarium verticillioidesseredujoalfinaldelalmacenamientoyAspergillusflavussoloseaislóenelinicio delalmacenamiento.LosrecuentosdePenicilliumspp.yEurotiumspp.seincrementaronal finaldelalmacenamiento.El100%delasmuestraspresentaroncontaminacióncon fumonisi-nas,connivelesmáximosde5,707mg/kg,mientrasquelasaflatoxinascontaminaronel40%de lasmuestrasconnivelesmáximosde0,0008mg/kg.Lascondicionesambientalesydesustrato generadasduranteelalmacenamientoprodujeroncambiosenlacomposicióndelaspoblaciones fúngicasylimitaroneldesarrollodehongosmicotoxigénicosylaproduccióndemicotoxinas. ©2015AsociaciónArgentinadeMicrobiología.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.U.Estees unartículoOpenAccessbajolalicenciaCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/ by-nc-nd/4.0/).

Autorparacorrespondencia.

Correoselectrónicos:claudiacastellari@yahoo.com.ar,castellari.claudia@inta.gob.ar(C.C.Castellari). http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2015.08.003

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KEYWORDS

Silobag;

Maize(ZeamaysL.); Toxigenicmycobiota; Fumonisin;

pHgrains; Self-regulated atmospheres

Extrinsicandintrinsicfactorsassociatedwithmycotoxigenicfungipopulations ofmaizegrains(ZeamaysL.)storedinsilobagsinArgentina

Abstract Inordertodeterminethebehaviorofmycotoxin-producingfungalpopulations lin-kedwithsilobagsstoredcorngrainswithamoisturecontentgreaterattherecommendedas safe,270samples takeninthreetimes(beginning, 90days,final) overafivemonthperiod ofstoragewereevaluated.The fungalbiotawasquantifiedandidentifiedandthe contami-nationwithfumonisinandaflatoxinwasdetermined.Extrinsicfactors(environment),intrinsic factors(grains)andtechnologicalfactors(locationofthegrainsintheprofileofsilobag)were takeninto accounttoevaluatethepresenceandquantityoftotalandmycotoxigenicfungal populations.ThepHofgrainsandO2levelsweresignificantlyreducedafterfivemonths,while

CO2concentrationincreasedinthesameperiod.Thetotalcountsofmycobiotawere

signifi-cantlyhigheringrainslocatedinthetoplayerofsilobag.MycotoxigenicspeciesofFusarium,

Aspergillus,PenicilliumandEurotiumwereidentified.ThefrequencyofisolationofFusarium verticillioidesdecreasedattheendofstorageandAspergillusflavuswasisolatedonlyatthe beginningofstorage.ThecountsofthePenicilliumspp.andEurotiumspp.wereincreasedat theendofstorage.Fumonisincontaminationwasfoundinallthesamples(100%)with maxi-mumlevelsof5.707mg/kgwhereasaflatoxincontaminatedonly40%withmaximumlevelsof 0.0008mg/kg.Theenvironmentalandsubstrateconditionsgeneratedduringthestoragelimited thedevelopmentofmycotoxigenicfungiandmycotoxinproduction.

© 2015Asociación Argentina deMicrobiología. Published by Elsevier España, S.L.U. This is anopenaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/ by-nc-nd/4.0/).

Introducción

La tecnología de silos bolsa para almacenar granos secos se ha convertido enuna herramienta importante paralos agricultoresdelaArgentinayotrospaísesdelmundo (Bar-tosik, comunicación personal). Los silos bolsa con mayor capacidaddealmacenajepresentandimensionesque alcan-zan 100m de largo y 4,3m de diámetro, y poseen una capacidad de500 toneladas de granos, aunquela capaci-dad más común es de 200 toneladas. Los silos bolsa son relativamenteimpermeablesalaguaytienenunaltonivel de hermeticidad al oxígeno (O2) y al dióxido de carbono (CO2).Larespiración deloscomponentesdel granel (gra-nos,insectosyhongos,entreotros)consumeelO2ygenera CO225.Estocreacondicionesdesfavorablesparala supervi-vencia deloshongos ylosinsectos,lo que evitapérdidas decalidaddelosgranos36.Sinembargo,cuandolosgranos

se almacenan con niveles dehumedad por encima delos recomendadoscomoseguros(paramaíz,trigoysoja:14%; para girasol: 11%) (http://www.cosechaypostcosecha.org, consultado en abril del 2015), existe alta probabilidad de que se desarrollen, además de los microorganismos aerobios estrictos, algunos anaerobios facultativos como bacterias y levaduras. Incluso algunas especies fúngicas,

como Fusarium oxysporum, son capaces de cambiar su

metabolismo y se adaptan a condiciones de ausencia deO242.

Numerosas especies de Fusarium, Aspergillus y

Penicillium yde otros géneroscolonizan los granos en el

campoypuedencontinuarsudesarrollobajolascondiciones del almacenamiento.Dado que algunas deellas tienenla potencialidad deproducirmicotoxinas,ademásde alterar laspropiedadesfísicasdelosgranos,estosagentespueden causar inconvenientes a la salud humana y animal. Las

manifestaciones de la toxicidad en los animales son tan diversas como las especies dehongos que producen estos metabolitos, aspectoque ha provocado una preocupación mundialsobrelaalimentaciónylaseguridadalimentaria.El consumorepetidodedosisbajasdeaflatoxinas,producidas

porAspergillus flavus,tiene unefecto mutagénicoy

can-cerígenoenanimales,ademásdeserletalesadosis altas. Lasfumonisinas,producidasporespeciesdeFusarium,han sido relacionadas con algunas enfermedades específicas, como la leucoencefalomalacia equina y el síndrome de edema pulmonar en porcinos7. Si bien es conocido que

las especiesdeAspergillus yPenicillium presentanmayor competitividadduranteelalmacenamientodegranossecos respectode las especiesdeFusarium22,33,las especies de

este género pueden crecer durante el almacenamiento cuandolosgranosestánhúmedos.

El deterioro producido por hongos en los granos almacenadosdepende deunaserie de factores, que pue-den clasificarse como extrínsecos, intrínsecos y de tipo tecnológicos40.Losfactoresextrínsecosseasocianalas

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La información recopilada podrá ser utilizada para dise˜narestrategias yaplicarprácticascorrectivasdurante el cultivo o en el almacenamiento, y evitar pérdidas de calidaddelosgranos,principalmenteporlaproducciónde micotoxinas.

El objetivo de este estudio fue caracterizar las pobla-ciones de hongos, en particular las micotoxigénicas, que colonizan los granos de maíz almacenados en silos bolsa con humedades superiores alas recomendadasy también evaluarlosfactores extrínsecos,intrínsecosydetipo tec-nológicoquepodríaninfluirsobredichaspoblaciones.

Materiales

y

métodos

Silosbolsa

Lasmuestrasdemaízseobtuvieronapartirde5silosbolsa ubicados en el sudeste de la provincia de Buenos Aires, Argentina (37◦ 45’ S, 58◦ 18’ O; 130m sobre el nivel del mar).Lossilosbolsa(depolietilenode250␮mdeespesor) tenían 60m de largo, 2,5m de diámetro, 1,7m de altura yuna capacidadde almacenamientode 180 toneladas de granos cada uno. El contenidode humedad de losgranos registrado para cada uno de los 5 silos bolsa durante la cosechafuesuperioral14,5%.Lossilosbolsaidentificados como 1, 2, 3, 4 y 5 presentaron valores de humedad del 16,8%,el16,9%,el15,7%,el15,4yel17,4%, respectiva-mente.Laconfección delossilosbolsaserealizóenjulio (silosbolsa1 y2)yagosto(silosbolsa 3,4y5)del2010, yestosseextrajeronendiciembre del2010 (silosbolsa1 y 2) y enero del 2011 (silos bolsa 3, 4 y 5). En total, se analizaron270muestrasdegranosdemaíz,extraídasa par-tir de 3 estratos del perfil vertical de los silos bolsa. El estrato superior abarcóuna profundidad de 0 a 0,2m, el estratomediode0,2a0,6myelestratoinferiorde0,6a 1,8m.Además, apartir delpuntodecierredelas bolsas, seestablecierondiferenteszonasparalaextraccióndelas muestras, ubicadas en 6sectores equidistantesa lo largo de lossilos bolsa: a los10m (zona 1), los20m (zona 2), los30m(zona3),los40m(zona4),los50m(zona5)ylos 60m (zona6). Las muestras serecogieron con uncalador paragranosde1,8mdelargo,en3tiemposdel almacena-miento:alcierredelossilosbolsa(tiempo1),luegode90 días(tiempo2)yantesdelaaperturadelossilosbolsaofinal delperíodo(tiempo3).Encadaestratoyzonaserecogieron 3muestrasdeaproximadamente1,5kgparaconformaruna muestracompuestade4,5a5kg.Losgranosrecolectadosse colocaronenbolsasdepapelysealmacenarona4◦Chasta suanálisis.

Análisisfísicosyquímicos

Enelinterior delossilosbolsa seregistróla temperatura delperfildelgranelenlos3tiemposdemuestreo.Paraello seutilizóunasondaportátil detemperaturaequipadacon sensoresen3puntos,queseinsertóenelcentrodecada silobolsaa30mdelcierredecadauno(entrelaszonas3y 4).Laubicacióndecadasensorcoincidióconlos3estratos delperfilverticaldelsilobolsa.

Laconcentración deO2 yde CO2dela atmósfera inte-riordelossilosbolsasedeterminóenlostrestiemposdel

almacenamientoyparalas6zonas,aunqueúnicamentese consideróelestratomediodelperfilvertical,debidoaque losgasesdifundenenformavertical.Paraestamediciónse empleóunmedidordegasesportátil(CheckPoint,PBI,Dan Sensor,Dinamarca).

El contenido de humedad de los granos se midió con unmedidordehumedad(Dickey-John,GAC2100,EE.UU.). TambiénseregistróelpHdelosgranosensoluciónacuosa, en una relación de 2:1 (20ml de agua destilada: 10g de granos molidos), con el empleo de un peachímetro digital y portátil (Oakton modelo PH11, N◦ serie 203852, Singapur).

Cuantificación,aislamientoeidentificacióndela micobiota

El recuentode hongos filamentososy levadurasserealizó mediantelatécnicadedilucionesdecimalesentuboy siem-bra(porduplicado)enplacasdePetriconagarextractode levadura cloranfenicolglucosa(YGCA,Merck®,EE. UU.)29.

Paraello,yapartirdecadamuestra,seconfeccionaron sus-pensionescon10gdegranosen90mldesolucióndiluyente (0,1%) de peptona de caseína (Britania®, Argentina). Las placasseincubarona25◦C(enoscuridad)durante7díasy sedeterminóelnúmerodeunidadesformadorasdecolonias (UFC/g)totales,comoasítambiéndecadagénerooespecie identificada. LosvaloresdeUFC/gfueron transformadosa log10 UFC/gpararealizarlosanálisisestadísticos.

Paraobtenerlosaislamientosparasuidentificación,cada colonia con característicasmorfológicasdiferentesse cul-tivónuevamenteenplacasdePetriconYGCAdurante7días a25◦Cyenoscuridad.Lascepaspurasseconservaronauna temperaturade---20◦Cengliceroldealtapureza(Biopack®, Argentina)enunaconcentraciónal35%v/venagua.

Los aislamientos de las especies de Penicillium,

Aspergillus, Eurotium, Eupenicillium, Wallemia,

Cladosporium, Epiccocum, Acremonium y las levaduras

seidentificaronconclavestaxonómicas29.Losaislamientos

de las especies de Fusarium se identificaron a partir de claves específicas15,26,38,41. Para la denominación de las

especies se consultó la última actualización de nomen-clatura del International Code of Nomenclature (ICN)20,30

y el Index Fungorum (http://www.speciesfungorum.org,

consultadoenabrildel2015).

Las identificacionesde las especiesde Fusarium yuna especiedeAspergillusfueronconfirmadasporanálisis filo-genéticodelfactordeelongacióndelatranscripción1alfa (TEF1)conloscebadoresEf-728m/EF239,conla

metodolo-gía propuesta porChaverri ySamuels8. Las reacciones de

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Tabla1 EvolucióndelasconcentracionesdeCO2yO2enlaatmósferadegranosdemaízalmacenadosensilosbolsa

Zonasa ConcentracióndeCO

2(%) ConcentracióndeO2(%)

Tiempo1 Tiempo2 Tiempo3 Tiempo1 Tiempo2 Tiempo3

1 0,78±0,5aB 9,50±5,1aA 12,57±4,4bA 19,58±0,7aA 10,54±5,1aB 7,80±4,1aB 2 1,30±1,2aB 11,24±4,4aA 14,68±4,3bA 19,20±0,9aA 7,70±5,4aB 5,72±3,3aB 3 0,90±0,5aB 10,80±4,0aA 14,44±6,5bA 19,30±0,8aA 7,38±4,6aB 6,68±4,3aB 4 0,84±0,5aB 12,06±3,3aA 17,72±4,7abA 19,40±0,4aA 6,62±5,3aB 3,12±1,5aB 5 0,76±0,2aC 12,34±4,1aB 19,00±4,5abA 19,46±0,4aA 6,16±5,1aB 2,86±2,3abB 6 0,81±0,5aC 12,12±5,5aB 21,44±3,9aA 19,66±0,6aA 7,50±5,7aB 1,14±0,4bC Losvalorescorrespondenalasmedias±DEdelos5silosbolsa.Letrasminúsculasdistintasdentrounamismacolumnaindicandiferencias significativas(p<0,05)entrelasdiferenteszonasevaluadas.Letrasmayúsculasdiferentesdentrodeunamismafilaindicandiferencias significativas(p<0,05)entrelosdistintostiempos.

a Zonas1,2,3,4,5y6:10,20,30,40,50y60mdesdeelpuntodecierredelossilosbolsa,respectivamente.Tiempo1:cierredelos silosbolsa;tiempo2:90díasdealmacenamiento;tiempo3:5mesesdealmacenamiento.

Determinacióndemicotoxinas

Seconformaronmuestrascompuestasdegranosde5kgpor cada estrato, incluyendo las 6 zonas de cada uno de los 5silosbolsa,yseremitieronalaFundaciónde Investigacio-nesCientíficasTeresaBenedictadelaCruz,Luján(provincia deBuenos Aires),dondefueron evaluadas. Seinvestigóla presenciadeaflatoxinas(AFLA:B1,B2,G1,G2),zearalenona (ZEA)ydeoxinivalenol(DON),deacuerdoconelmétodode RomerN.◦ MY8402s,versión94.237,ydefumonisinas(FB1,

FB2,FB3)seinvestigóconelprotocolodelaAOAC,método oficial 995.152. Para las mencionadas cuantificaciones se

empleólatécnicadecromatografíalíquidadealta resolu-ción(HPLC).ElsistemaHPLCutilizadofuedelaserieAgilent 1100(Alemania),queincluyóundesgasificadorG1322A,un muestreadorautomáticoG1313A,undetectorde fluorescen-ciaG1321A,unabombacuaternariaG1311Ayuncontrolador detemperaturaG1316A.

Análisisestadístico

Debido a que las observaciones realizadas dentro de un mismo silo bolsa no podrían asumirse como estadística-mente independientes, se recurrió al uso de modelos linealesmixtosquepermitieronestudiarlosefectosdelos factores de interésyal mismotiempo modelar la posible estructura de correlación entre las observaciones. Los modelos lineales mixtos seajustaron con el fin de deter-minarel efecto fijodel estrato,la zonadel silo bolsa, el tiempodelalmacenamientoysusinteraccionessobreelpH, lahumedaddelosgranos,elnúmerototaldeUFCdehongos ylevadurasyelnúmerototaldeUFCdeFusariumspp.yde

A. flavus.Estosmodelosincorporaron tambiénlosefectos

aleatoriosdelsilobolsa,elestrato,lazonayeltiempo,para incorporar una correlación positiva entre observaciones realizadas dentro del mismonivel de cualquiera de estos factores.Porotrolado,losmodelosajustadosparaanalizar las concentracionesdeO2yCO2noconsideraronelefecto fijo delestrato,yparala temperaturanoconsideraron el efectofijodelazonadelsilobolsa.Seutilizólafunciónlme

del paquete «nlme» del lenguaje R34. Cuandose detectó

efectosignificativodelosfactores(p<0,05),serealizaron las comparaciones múltiples simultáneas de las medias estimadas por el modelo, utilizando la función «glht»

del paquete «multcomp» del R19. Esta función utiliza la

distribuciónt conjuntadetodaslasdiferenciasdemedias estimadasacomparar,sincorregirelniveldesignificación por las múltiples comparaciones, en modo similar a una pruebadediferenciamínimasignificativa.

Resultados

Análisisfísicosyquímicos

Enel momentodelembolsadodelosgranos,el contenido de humedad promedio considerando los 5 silos bolsa fue de16,4±0,7%,mientrasquealfinaldelperíodoanalizado losvaloresseincrementaronsignificativamente(p=0,005) a16,7± 1,11%enelestrato superior.Latemperatura de losgranos seincrementó de8,6◦Cal comienzo del alma-cenamiento a 22,8◦C a los 5 meses de almacenamiento. Enesetiempo,latemperaturafuesignificativamente dife-rente en los 3 estratos analizados: esta fue mayor en el estrato superior respecto del estrato medio (p=0,029) e inferior(p<0,001).LasconcentracionesdeO2yCO2durante el almacenamiento pueden observarse en la tabla 1. Al comienzodelalmacenamiento,losnivelesdeO2oscilaron entre el 19,20 y el 19,66%, y los niveles de CO2 entre el 0,76 y el 1,30%. Al transcurrir el tiempo, los niveles deO2 se redujeron progresivamente,mientras quelos de CO2 se incrementaron. Se detectó un efecto de interac-ción significativaentre la zona del silo bolsa y el tiempo de almacenamiento para el nivel de O2 (p=0,0054) y de CO2 (p=0,0226). La concentración de CO2 se incrementó haciaeltercermuestreoyfuesignificativamentediferente

(p=0,0091)entrelaszonas.LaconcentracióndeO2 dismi-nuyósignificativamentehaciaelfinaldelperíodoanalizado ytambiénsedetectaronconcentracionessignificativamente diferentes(p=0,0003)entrelaszonasdelossilosbolsa.El pH de losgranos varió significativamente entre los estra-tos(p<0,001)ylostiempos(p=0,0036):lamayoracidezse registróenelestratosuperioryhaciaelfinaldelperíodode almacenamiento(tabla2).

Composicióndelamicobiota

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Tabla2 EvolucióndelpHdegranosdemaízalmacenadosensilosbolsa

pH

Tiempo ES EM EI Media

1 6,12±0,1 6,14±0,0 6,16±0,1 6,14±0,1a

2 6,13±0,1 6,15±0,1 6,17±0,2 6,15±0,1a

3 5,88±0,0 5,90±0,0 5,93±0,1 5,90±0,1b

Media 6,04±0,1c 6,06±0,1b 6,09±0,1a

---Losvalorescorrespondenalasmedias±DEparalos5silosbolsa.

Tiempo1:cierredelossilosbolsa;tiempo2:90díasdealmacenamiento;tiempo3:cincomesesdealmacenamiento. Letrasdiferentesindicandiferenciassignificativas(p<0,05)entreestratosotiempos.

ES:estratosuperior;EM:estratomedio;EI:estratoinferior.

bolsasfuede4,42±1,0)(tabla3).Sibiennoseregistraron diferenciassignificativasenlosrecuentostotalesentrelos tiempos(p>0,05)ylaszonasdelossilosbolsa(p>0,05),se determinóunefectosignificativodelestrato(p=0,0314),en elqueelestratosuperiorregistrómayornúmerodeUFC/g respectodelestratoinferior.

La población fúngica total hallada en las muestras de granos de maíz almacenados durante 5 meses se constituyó por 35 especies pertenecientes a 10 géneros de hongos filamentosos y 3 géneros de levaduras (tabla 4). Se identificaron 18 especies de Penicillium, clasifica-das en 4 subgéneros, según se describe a continuación. Subgénero Aspergilloides: Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma, Penicillium implicatum Biourge, Penicillium

oxa-licum (syn. P. decumbens Currie & Thom), Penicillium

restrictumJ.C. Gilman & EV.Abbott;subgénero Bivertici-llium: Talaromyces funiculosus (syn. Penicillium funiculo-sumThom),Talaromycesvariabilis(syn.P.variabileSopp), Talaromycesislandicus(syn.P.islandicumSopp),

Talaromy-ces pinophilus (syn P. pinophilum Hedgcock); subgénero

Furcatum: P. oxalicum Currie & Thom, Penicillium

cory-lophilum Dierckx, Penicillium citrinum Thom; subgénero

Penicillium: Penicillium brevicompactum Dierckx, Penici-llium solitum Westling,Penicillium aurantiogriseum (syn.

Penicilliumviridicatum Westling),Penicilliumverrocusum

Dierckx, Penicillium rubens Biourge (syn. spp., illus

P.chrysogenumThom),PenicilliumgriseofulvumDierckx,y

PenicilliumolsoniiBainier&Sartory.Engeneral,lasespecies dePenicilliumseencontraronconaltafrecuencia(51%)en el totalde muestras analizadas.Sinembargo, la frecuen-cia de aparición (%) de cada una de estas y su recuento

(log10UFC/g) fue variable durante el período analizado.

T.funiculosusfuelaespeciepredominanteenlos3tiempos de muestreo. Al comienzo del almacenamiento,el 75,5% delas muestraspresentóT.funiculosus(3,37± 0,71log10 UFC/g). Eneltiempo2,elporcentajedelasmuestrascon

T. funiculosus se incrementó al 76,6% (3,25 ± 0,79 log10 UFC/g) y al final del período considerado el porcentaje se redujo al 69%, aunque sin variación en los recuentos (3,28±0,71log10UFC/g).

Las especies de Fusarium fueron aisladas en el 82,3% del total de las muestras analizadas durante los 5 meses del almacenamiento. Sobre la base de las característi-cas macroscópicas de las colonias y microscópicas de las estructuras reproductivas y el estudio filogenético con el marcador TEF1,seidentificaronlas siguientesespeciesde

Fusarium: Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg,

Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg, Fusarium

subglutinans (Wollenw and Reinking) Nelson, Toussoun

and Marasas y F. oxysporum Schlecht. EMEND. Snyd. yHans.

Respecto de Aspergillus spp., a partir de la caracte-rización morfológica delos aislamientos y del estudio de las secuencias ITSseidentificaron2 especiesenel primer tiempodealmacenamiento,entodoslossilosbolsa.Dichas especies pertenecieron al subgénero Circumdati, Section Flavi, A.flavusLinkya laSecciónNigri, Aspergillusniger

Tiegh.

La presencia de Eurotium spp. fue observada en el segundoyeneltercermuestreoenel10%yel37,8%delas muestras, respectivamente. La especie predominante fue

EurotiumamstelodamiL.Margin.

Tabla3 Evolucióndelrecuentototaldelamicobiotaengranosdemaízalmacenadosensilosbolsa

Recuentototal(log10UFC/g)

Tiempo ES EM EI Media

1 4,21±0,3 4,04±0,3 4,07±0,6 4,11±0,5a

2 4,22±0,7 4,28±0,7 4,05±0,8 4,18±0,7a

3 4,64±1,0 4,46±1,0 4,15±0,9 4,42±1,0a

Media 4,36±0,7a 4,26±0,7a 4,09±0,8b

---Losvalorescorrespondenalasmedias±DEparalos5silosbolsa.

Tiempo1:cierredelossilosbolsa;tiempo2:90díasdealmacenamiento;tiempo3:5mesesdealmacenamiento. Letrasdiferentesindicandiferenciassignificativas(p<0,05)entreestratosotiempos.

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Tabla4 Composicióndelaspoblacionesfúngicasasociadasagranosdemaízalmacenadosensilosbolsa

Género %a Númerodeespecies

T1 T2 T3b

Penicilliumspp.Link 51,40 7 10 11

Aspergillusspp.Fr.:Fr. 5,71 2 0 0

Fusariumspp.Link 11,40 4 4 4

Eupenicilliumspp.F.Ludw. 2,85 1 0 1

Cladosporiumsp.Link 2,85 1 0 0

Epicocumsp.Link 2,85 0 1 0

Wallemiasp.(Fr.)Arx 2,85 0 1 0

Eurotiumspp.Link:Fr. 5,71 0 1 2

Moniliellasp.Stolk&Dakin 2,85 0 0 1

Acremoniumspp.Link 2,85 1 1 1

Hyphopichiaspp.(Boidinetal.)Arx&VanderWalt 2,85 1 1 1

Candidaspp.Berkhout 2,85 0 1 1

Debaryomycesspp.Lodder&KregerexKreger 2,85 0 1 1

a Proporcióndeespeciesdecadagénerorespectodeltotaldeespeciesidentificadas.

b T1:tiempo1,cierredelossilosbolsa;T2:tiempo2,90díasdealmacenamiento;T3:tiempo3,5mesesdealmacenamiento.

Respectodelas levaduras,el27,8%delas muestrasde maízrecolectadasaliniciodelalmacenamientopresentaron contaminaciónconestegrupomicrobiano,mientrasqueal final delperíodoseaislaronenel 58%delas mismas.Los recuentosmediosfueronde3,3±0,70log10UFC/gyde4,62 (±0,74)log10UFC/galinicioyalfinaldelalmacenamiento, respectivamente. La especie dominante fue Hyphopichia burtonii (Boidin etal.)Arx & Van der Walt, aisladaen el 91,9% de las muestras de granos. Las especies restantes fueronclasificadascomopertenecientesalgéneroCandida.

Especiesfúngicasconcapacidadpotencial deproducirmicotoxinas

F. verticillioides, F. proliferatum, A. flavus, P. citrinum, P.verrucosumyE.amstelodamifueronespeciesaisladasde muestras degranosdetodoslossilosbolsa.Lafrecuencia deaislamientoylosrecuentosdelasespeciesdeFusarium

se redujeron al final del período analizado y Aspergillus

nofueencontrado enesetiempo. A.flavusse aislóenel 11,44%delas muestrasdeltiempo 1,conunrecuentode 2,73±0,71log10 UFC/g.Elporcentajedemuestras conta-minadasconespeciesdeFusariumseredujoalos5mesesa unvalordel54,4%,apesardequelosrecuentosno presen-taronvariacionessignificativas(p=0,0552)entreelprimer (2,83 ± 0,92 log10 UFC/g) y el tercer tiempo de mues-treo(3,18±0,77log10 UFC/g).Encambio,lasespeciesde

PenicilliumyEurotiumincrementaronsufrecuenciade ais-lamiento yabundanciahaciael finaldelalmacenamiento.

P.citrinumfueaisladaenel3,30%lasmuestrasdegranos delsegundotiempoyconunrecuentode3,53±0,60log10 UFC/g,mientrasqueP.verrucosumfueaisladademuestras degranosrecolectadosenelsegundo(0,55%delasmuestras yrecuentosde2,3±0,00log10UFC/g)yeneltercertiempo delalmacenamiento(3,88%delasmuestrasyrecuentosde 2,98 ± 1,00 log10 UFC/g). El recuento delas poblaciones

deEurotiumspp. seincrementóentreelsegundoyel

ter-cer tiempo del almacenamiento, y fue de 2,08 ± 0,49 y 2,57±0,49log10UFC/g,respectivamente.

Micotoxinas

Eltotaldelasmuestrasanalizadaspresentócontaminación confumonisinas,mientrasqueel40%revelólapresenciade aflatoxinas.SedetectaronfumonisinasFB1enel100%delas muestras,fumonisinasFB2enel86%yfumonisinasFB3enel 53%.Porotrolado,el18,4%delasmuestraspresentó sola-menteFB1;el18,4%,FB1+FB2,yel47,3%,FB1+FB2+FB3 (tabla5).

Cuando se analizaron las aflatoxinas solo se detectó la presencia de AFLA B1 en concentraciones mínimas de 0,0003mg/kgymáximasde0,0008mg/kg.

Los valores de micotoxinas determinados al final del almacenamientonoregistraronincrementosrespectodelos nivelesdetectadosalos90días(Cardoso,comunicación per-sonal).LasmicotoxinasZEAyDONnofuerondetectadaspor lastécnicasempleadas.

Discusión

La temperatura, la actividad agua (aw) y la humedad de los granos son factores condicionantes dela colonización fúngicaydelaproduccióndemicotoxinasduranteel alma-cenamientodelosgranos23.Sinembargo,hastaelpresente

noserealizaronestudiossobrelacomposicióndegasesde laatmósferaintergranariaydelaacidezdelosgranos, fac-toresquepodríancontribuiraexplicar elcomportamiento delaspoblacionesfúngicasensistemasdealmacenamiento comolossilosbolsa.

El incremento de la humedad registrado hacia el final delalmacenamientoenelestratosuperiordelossilosbolsa estudiadospodríaserexplicadoporlaexistenciade estra-tificaciónde la humedad delos granos ubicadosenáreas decontactoconlacubiertaplástica,causadoposiblemente porciclosrepetidosdecondensaciónyadsorcióndeagua, como consecuencia de la variación diariade la tempera-tura ambiente. Casini et al.5 comunicaron estratificación

(7)

Tabla5 Concentracióndefumonisinas(mg/kg)engranosdemaízalmacenadosenloscincosilosbolsaalos90días

Fumonisinas Valormínimo Valormáximo Media Mediana

Totales 0,120 5,707 1,708 0,479

FB1 0,116 4,166 1,190 0,299

FB2 0,067 1,217 0,446 0,196

FB3 0,049 0,317 0,176 0,171

disminucióndelatemperaturanocturna, queprovocóuna condensacióndelasuperficiedelosgranosydelacubierta plástica.

LoscambiosenlacomposicióndeO2ydeCO2duranteel períododealmacenamientoreflejaronlaactividad metabó-licaenelinteriordelossilosbolsa.Esasíquelarespiración delosgranosydelamicrobiotaasociadaredujoelnivelde O2eincrementóelniveldeCO2,generandounaatmósfera anaerobia.Estosresultadoscoincidenconlosreportadosen Italiaparaelalmacenamientodegranosdemaízydetrigo ensilos bolsa18. Por otro lado, enla zona 1(cierre dela

bolsa) delos 5 silos bolsa alfinal del almacenamiento se determinólamayorconcentracióndeO2,loquepodría indi-caruncierreinadecuadodeaquellas;enconsecuencia,se favoreceríalaproducción demicroambientes para el des-arrollo de la micobiota aeróbica. Respecto del pH de los granos,sedeterminósudisminuciónenlosgranosubicados enel estrato superior haciael tercer tiempo del almace-namiento.Esteresultado podríaserexplicadoapartir del registrodeunmayornúmerodeUFC/gtotalesenlos gra-nos dispuestos endicho estrato,ocasionado porla mayor actividad metabólica.Elcomportamientodeesta variable encondicionesdealmacenamientohermético nofue estu-diadohastaelpresente.Porello,elmonitoreodelaacidez delosgranosduranteelalmacenamientopuedecontribuir acomprenderyexplicarladinámicadelaspoblaciones fún-gicas,yenparticularladelasmicotoxigénicasasociadasa ellos.

El recuentototaldela micobiotaquecolonizó los gra-nosde maíz nopresentóvariaciones através deltiempo, coincidiendocon loinformadopor otrosinvestigadores en Argentina28. Estos resultados podrían estar determinados

porel incrementodela concentracióndeCO2yla acidez delosgranos,yporlareduccióndelniveldeO2,que afec-taronlaactividadmetabólica.Porelcontrario,enItalialos reportesindicaronunareducciónenelrecuentodehongos totalesduranteelalmacenamientodemaízensilosbolsa18.

Otroaspectorelevantedeesteestudiodeterminóquelos recuentosfúngicostotalesfueronafectadosporel estrato (posicióndelosgranosenelperfilverticaldelsilobolsa): seencontraron losmayores valores enel estratosuperior y losmenores enel inferior. Este hallazgo diferencial en el recuento poblacional influenciado por la ubicación de los granos nunca fue reportado; esto pudo debersea los 3 factores extrínsecos explicados precedentemente: a) el incremento de la temperatura en la capa superior de la bolsa, en respuesta a las variaciones diarias de tempera-turaambiente;b)laexistenciadevariacióndelahumedad en los granos individuales situados en el estrato superior de la bolsa, ocasionada por variaciones diurnas y noctur-nasdelatemperatura,loqueprovoca lacondensaciónen

la superficie delosgranos,yc) lainfluenciade unmayor intercambio de gases entre el medio ambiente y el inte-rior de la bolsa sobre los granos ubicados en el estrato superior35.Enelestratoinferiorposiblementesegeneraron

microambientesdondelamenortemperaturayhumedady elmenorintercambiogaseosoinfluyeronnegativamenteen elmetabolismorespiratorio,loquepudohaberafectadola supervivenciadediferentesespeciesfúngicas,entreellaslas micotoxigénicas.

Respecto de la composición de las poblaciones fúngi-cas,seobservóquelapresenciadediferentesespeciesfue influenciadaporlascondicionesambientalesdinámicasque dominaronel interiordelsilo bolsa.Eneliniciodel alma-cenamiento,seaislaronespeciesdeFusariumyAspergillus

juntoconotrasespeciesasociadasalosgranos.Sinembargo, la generación de unambiente anaerobio y el incremento de la temperatura yde laacidez de losgranos conforme avanzó el tiempo de almacenamiento favorecieron a una micobiotadominadaporespeciesdePenicillium,Eurotium

ylevaduras.Elincrementodelnúmerodemuestras

positi-vas con Eurotiumhacia el final delalmacenamiento pudo

deberseaqueestegéneroestolerantealestrés,sus espo-rasgerminanaunatemperaturaóptimacercanaalos30◦C y escapaz de adaptarsemás apH ácidos16. Asimismo, la

frecuenciadeaislamientoylosrecuentosdelas levaduras se incrementaron hacia el final del período considerado. Si bien estos resultados no coincidieron con los reporta-dos porotros investigadoresencondiciones similares28,el

incremento pudo ser explicado porla dominancia de una atmósferaanaerobia.

La frecuencia de aislamiento de especies potencial-menteproductorasdeaflatoxinas(A.flavus)yfumonisinas (F. verticillioides y F. proliferatum) se redujo hacia el final del almacenamiento. Algunos investigadores repor-taron que las especies de Aspergillus estarían mejor adaptadas al crecimiento en sustratos con pH alcalino43,

por lo que la reducción del pH de los granos podría haber afectado la supervivencia de tales especies. Por otro lado, podría inferirse que si bien A. flavus es con-siderada una especie favorecida por las condiciones del almacenamiento4, tendría probablemente inconvenientes

para adaptarsealas condiciones ambientales del almace-namiento ensilos bolsa,con importantes restriccionesen laconcentracióndeO2eincrementodelaacidez.La iden-tificación de A. flavusen maíz en diferentes condiciones de almacenamiento coincidió con lo informado por otros investigadores endiferentesregionesagroecológicas dela Argentina10,17,32.

(8)

concuerdanconloscomunicadosporotrosinvestigadoresen laArgentina6,14 yotrospaíses13,31.

Adiferenciadeloqueocurrióconelrecuentototaldelas poblacionesfúngicas, quefueafectadoporelestrato gra-nario,nosedetectóefectodelaposicióndelosgranosen elsilobolsasobreelrecuentodelasespeciesdeFusarium.

Porprimeravezsecomunicaquelaposicióndelosgranosen elinteriordelsilobolsanoafectóelrecuentopoblacional; posiblementeestosedebaaquelasespeciesdeestegénero estánasociadasconelsustratomaízysonmenos influencia-das porlas condicionesambientales enel interiordelsilo bolsa21,33.

LacapacidaddeespeciesdeFusariumydeA.flavuspara producirfumonisinasyaflatoxinasenmaízfuedemostrada en diferentes investigaciones realizadas ennuestro país3.

Sin embargo, en la Argentina solo existe legislación para las aflatoxinas totales y esta especifica los límites máxi-mospara maní,maíz ysus derivados,yparalaaflatoxina M1enlechefluida yenpolvo (http://www.anmat.gov.ar/ alimentos/codigoa,consultadoenabrildel2015).Paralas restantesmicotoxinas,laArgentinaconsideraloslímitesde toleranciaindicadosporlalegislaciónvigenteenla Comu-nidadEuropea12.

Losnivelesdefumonisinastotalessuperaronlosvalores máximospermitidosde4mg/kg11en3delasmuestras

ana-lizadas, correspondienteslas 3 aunmismosilo bolsa(silo bolsa 3). Los granosde este silo bolsa fueron embolsados enel mesdeagosto, porloque las altasconcentraciones determinadaspodríanestarexplicadasporunamayor per-manenciadelosgranosenelcultivo,dondelasespeciesde

Fusariumposeenmayoresventajasadaptativaspara

coloni-zar los granos y producirla micotoxina9. Este aspecto es

relevante, ya que se podría inferir que un retraso en la cosechaocasionaríaunaacumulacióndefumonisinasenlos granosenelcampo.Aquellosinvestigadoresqueanalizaron fumonisinastotalesenmaíz endiferenteszonas producto-rasdelaArgentinadeterminaronnivelesquefuerondesde 2,525mg/kghasta11,528mg/kg14ydesde0,01mg/kghasta

31,108mg/kg28,datosquemanifiestanunamarcada

varia-bilidad.

Respectodelasaflatoxinas,losnivelesregistrados fue-roninferioresaloslímitesestablecidosennuestropaíspara granosdemaíz(0,020mg/kg),loquepodríaestar relacio-nadoconlamenoradaptacióndeA.flavusalascondiciones ambientalesdescriptasparalazonadeestudio.Estaespecie escomúnmenteaisladaenmaícescultivadosenlasregiones central y norte de la Argentina, donde esfavorecida por temperaturassuperioresa30◦C24.

EntrelasmicotoxinasproducidasporPenicilliumspp.se destacanlaocratoxinaA(OTA),lapatulinaycitrinina27.En

esteestudio,P.citrinumyP.verrucosum,potenciales pro-ductores de citrinina yOTA, respectivamente,se aislaron conbajafrecuencia.Posiblemente,lacomposicióndegases delaatmósferayelincrementodelaacideznofavorecieron sudesarrollo.

Con referencia al incremento de E. amstelodami, en la actualidadnoseconoceninformesdelaproducción de OTAporestaespecieenmaícesalmacenadosensilosbolsa. Sin embargo, se comunicó que esta especie produjo OTA engranos decereales en el almacenamiento1,por lo que

serían necesariosestudiossobrela produccióndeOTApor

Eurotiumspp.engranosdemaízalmacenadosensilosbolsa

dadoqueestamicotoxina,aligualquelasyamencionadas, representa un riesgo potencial para la salud humana y animal.

Sibienelalmacenamientodegranosensilosbolsa cons-tituye un sistema de almacenamiento sencillo y con un bajocostodeinversión paraconservar granos,es necesa-rio supervisar el estado de losgranos antes de que estos seanembolsadosyperiódicamenteenel almacenamiento, con elfin dedetectar precozmentesueventual deterioro poreldesarrollodehongos.Losdatossobreladinámicade laspoblacionesmicotoxigénicasylosfactoresque condicio-nansuapariciónyproliferaciónaportadosporesteestudio podríancontribuiradise˜narestrategiastendientesaevitar laalteracióndelacalidaddelosgranosduranteel almace-namiento.Unadeellaspodríaestarrelacionadaconeluso dediferentesmezclasdegases(conaltocontenidodeCO2), considerandolacaracterísticadelabajapermeabilidaddel plásticodelsilo bolsa.Deesta forma,secontaríaconuna alternativaválidaparareducirlaspérdidasdecalidaddelos granosdestinadosalconsumohumanoyanimalocasionadas porlaproduccióndemetabolitostóxicos, cuandoaquellos sonalmacenadosporperíodossuperioresalos5meses.

Respecto dela legislación queestablece loslímites de toleranciaparadiferentesmicotoxinasenmateriasprimasy alimentoselaborados,seríarelevanteestablecervaloresde toleranciamáximosparalasfumonisinas,yaquesu presen-ciahasidodetectadaenunaltoporcentajedemuestrasde granosdemaízanalizadasenlosúltimosa˜nosenla Argen-tina,situaciónquepodríaconstituirunaproblemáticapara lacomercializacióneindustrializacióndelosgranos,yasea paraconsumohumanooanimal.

Responsabilidades

éticas

Proteccióndepersonasy animales.Los autoresdeclaran queparaestainvestigaciónnosehanrealizado experimen-tosensereshumanosnienanimales.

Confidencialidaddelosdatos.Losautoresdeclaranqueen esteartículonoaparecendatosdepacientes.

Derechoalaprivacidadyconsentimientoinformado.Los autoresdeclaranqueenesteartículonoaparecendatosde pacientes.

Financiación

El presente trabajo fue financiado por la Universidad Nacionalde Mardel Plata (Proyecto AGR375/12) yel Ins-titutoNacionaldeTecnologíaAgropecuaria(Proyecto AEAI 274.420,ÁreaEstratégicaAgroindustria),yfuepresentado porClaudiaC.Castellaricomorequisitoparcial para obte-nerelgradoacadémicodeDoctorenCienciasAgrariasdela UniversidadNacionaldeMardelPlata,Argentina.

Conflicto

de

intereses

(9)

Agradecimientos

AlgrupodePoscosechadegranosdelaUnidadIntegrada Bal-carce,EstaciónExperimentalAgropecuariaINTABalcarce.

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