Evaluación de desnaturalización,

(1)

Dr. Jorge R. Wagner

Laboratorio de Investigación en Funcionalidad y Tecnología de Alimentos (LIFTA)

Departamento de Ciencia y Tecnología Universidad Nacional de Quilmes – CONICET

Evaluación de desnaturalización,

inactivación y cambios nutricionales en

proteínas de soja durante el proceso de

obtención de harina desgrasada de soja.

(2)

Objetivos

Evaluar cambios en las distintas etapas del proceso de obtención industrial de HARINA DESGRASADA DE SOJA.

Comparar la información aportada por técnicas instrumentales (Calorimetría diferencial de barrido modulado, MDSC) y Espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier, FTIR)

Convenio específico UNQ-ASAGA (2010-2011)

Dirección: Dr. Jorge R. Wagner

Investigadores: Dr. Pablo A. Sobral, Dr. Gonzalo G. Palazolo

(3)

INTRODUCCION. PROTEINAS DE SOJA

El grano de soja entero, expeller o

harinas de soja (enteros o desgrasados) y texturizados contiene dos grupos de proteínas:

 Proteínas de reserva

 Proteínas biológicamente activas o

del metabolismo celular

(4)

 Mayoritarias en grano maduro

Localizadas en cuerpos proteicos

Alta hidrofobicidad superficial

Precipitables a pH 4,5

GLICININA (globulina 11S)

 -CONGLICININA (globulina 7S)

PROTEINAS DE RESERVA

(5)

 Fundamentalmente Enzimas e Inhibidores enzimáticos

 Se localizan en el resto de la célula

 Tienen un alto contenido en metionina y cisteína

 Tienen baja hidrofobicidad superficial

 Muy solubles en todo el rango de pH

PROTEÍNAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS O DEL METABOLISMO CELULAR

También denominadas PROTEINAS DE SUERO

DE SOJA

(6)

FRACCION %

(sobre P total) Especies proteicas MM (Kda)

2S 20

Inhibidores de tripsina

Citocromo c

-conglicinina Proteasas

8-21,5

7S 35

Lectina o hemaglutinina

Lipoxigenasas Amilasas

-Conglicinina

- Conglicinina

67-210

11S 35 Glicinina 320-360

15S 10 Polímeros de glicinina >600

(7)

Aas azufrados LIMITANTES

Composición aminoacídica de 11S y 7S de soja

Aminoácido Glicinina β-conglicinina (g/100 g)

Alanina 6.7 3.7

Arginina 5.9 8.8

Aspártico 11.8 14.1

Glicina 7.8 2.8

Glutámico 18.8 20.5

Histidina 1.8 1.7

Prolina 6.3 4.3

Serina 6.6 6.8

Valina 5.6 5.1

Cisteína 1.1 0.3

Met 1.0 0.2

Fenilalanina 3.9 7.4

Tirosina 2.5 3.6

Lisina 4.1 7.0

Leucina 7.2 10.2

Isoleucina 4.6 6.4

Treonina 4.2 2.8

Triptofano 0.75 0.3

Aa marcador de

sobrecalentamiento

(8)

Ureasa

La actividad ureásica en grano y harinas activas de soja es inferior al de algunas semillas o granos de otras plantas.

No se detecta en electroforesis por su bajo contenido, sin embargo es

detectada por su actividad (hidrólisis de la urea, aumento del pH,  pH).

La actividad ureásica es mayormente localizada en el hipocotilo, el cual tiene cerca de dos veces la actividad encontrada en los cotiledones.

La cáscara tiene un muy bajo nivel de actividad ureásica.

Los granos de soja contienen una ureasa termolábil, cuyo grado de inactivación es fácil de medir (  pH) y sirve de indicador de la destrucción de inhibidores de proteasas durante el tratamiento térmico de los pellets de soja destinados a la alimentación animal o humana.

Actividad ureásica de grano de soja fresco,  pH= 2,1-2,3

(9)

Inhibidores de proteasas

Conocidos como inhibidores de tripsina o factores antitrípticos

Inhiben una amplia variedad de proteasas además de la tripsina y quimotripsina intestinal

Se encuentran en la fracción 2S de extractos

acuosos de soja.

(10)

Tipos de inhibidores antitrípticos

De Kunitz (KTI )

Proteína globular, MM 20.1 kDa, alta contribución de zonas  plegada y 2 puentes disulfuro, uno de ellos localizado en una zona polar y superficial, no indispensable para la actividad antitríptico.

Es lábil al tratamiento hidro-térmico y estable en el rango de pH 3 a 10.

De Bowman-Kirk (BBTI)

Proteína globular, MM 7.861 y 7 uniones disulfuro.

Estas uniones confieren simetría a la molécula y alta resistencia al calor, al medio ácido y a la acción de proteasas

 más resistente que KTI.

Es capaz de inhibir simultáneamente la tripsina y la

quimotripsina.

(11)

Inactivación de factores antinutricionales

Tratamiento térmico de la soja y sus productos

(tostado, cocción, extrusión, sulfitación, acidez, fermentación)



Aumento del aprovechamiento nutricional de proteínas en animales y en el hombre.

Aumento de digestibilidad de las proteínas de soja es atribuible a:

 Inactivación de antiproteasas y otros antinutrientes termolábiles

 Desnaturalización de las proteínas 7S y 11S que se hacen mas

susceptibles a la acción de proteasas digestivas.

(12)

Por ser una desnaturalización proteica, la inactivación es mas efectiva en presencia de agua o vapor.

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

0 20 40 60 80 100

0 5 10 15 20

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Protein Efficeincy Ratio (PER)

PER

minutos de tratamiento con vapor a 100°C

T ry p s in I n h ib it o r A c ti v ( T IU /m g )

TIA

U re a s e A c ti v it y (  p H )

UA

Inactivación térmica de harina de soja

(13)

INTRODUCCION

Comportamiento térmico de proteínas de soja

Estudio por DSC (calorimetría diferencial de barrido) Dispersiones acuosas al 20-30% peso seco

Cápsulas herméticas; velocidad de calentamiento 5-10 ^o C/min.

• Resultado: Termogramas con endotermas de desnaturalización

• Parámetros medidos:

Temperatura de endoterma (Tmax o Tp) Entalpía de desnaturalización (H, J/g)

Sorgentini y Wagner, 1999. Journal of Food Biochemistry 23, 489-507

(14)

Desnaturalización de proteínas de soja purificadas en dispersiones acuosas

-1,3 -1,2 -1,1 -1,0 -0,9 -0,8

50 60 70 80 90 100 110 120

11S (Glicinina)

90-92 7S

(conglicinina)

Flujo de calor (mcal/seg)

Temperature (^oC)

79-81

Proteínas de Reserva

50 60 70 80 90 100 110 120

-1,2 -1,1 -1,0 -0,9 -0,8

60 80 100 120

-0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3

Lectina

75ºC 93ºC

Temperature (o C)

Flujo de calor (mcal/seg)

KTI

Proteínas de Suero

50 60 70 80 90 100 110 120

F lujo d e ca lor ( m ca l/se g )

11S + Lectina

90-93

7S + KTI

Temperature (

^o

C)

79-81

Termograma integral de proteínas de soja

DSC en agua de una muestra con todas las proteínas de soja activas daría solo dos picos:

Pico 1: 7S + KTI

Pico 2: 11S + lectina

(15)

Efecto del NaCl

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 70

75 80 85 90 95 100 105 110 115

U (1)

Ureasa

KTI Lectina

7S 11S

P e a k t e m p e ra tu re , T p ( C )

NaCl concentration (M) BBTI (2)

U (2) L

DSC en 1M NaCl de una muestra con todas las proteínas de soja activas daría tres picos:

Pico 1: KTI-ureasa

Pico 2: 7S + lectina

Pico 3: 11S

(16)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

60 80 100 120 140 160 180 200 220

T e mp e ra tu ra d e sn a tu ra liza ci ó n , T p ico (

o

C)

contenido de agua % 11S 7S KTI

Sessa, 1992. LWT 25, 365-370

Efecto del contenido de agua sobre la desnaturalización de proteínas de soja

100-105ºC / ~20% humedad

Desnaturalización selectiva de KTI

(17)

Flow-sheet. Producción de harina de soja desgrasada inactivada

Harinas y sémolas enteras activas

(active full-fat flours and grits)

Altos valores TIU y pH Alto PDI.

Harinas y sémolas desgrasadas activas

(white deffated flours, flakes) Altos valores TIU y pH

Alto PDI (>50%)

Harinas o sémolas

desgrasadas inactivas o tostadas

(toasted deffated flours, meals) TIU<10, pH<0,3

PDI < 30%

(18)

105-110 °C

 20% humedad Etapa de desolventización - inactivación

Mustakas et al. 1981. JAOCS 58 (3) 300-305

(19)

Etapas en el proceso de obtención de harina desgrasada de soja a partir de grano entero de soja

Micela (Hexano +

aceite)

Granos de soja

 Limpieza



Descascarado

  Expandido Laminado

 Extracción con Hexano



Desolventización-tostado (INACTIVACIÓN)

 Secado

 Molienda

Cáscara

Etapas que Incluyen calentamiento

Aceite

(20)

Muestras Proceso 1 (Crown)

Proceso 2

(De Smet Ballestra)

Granos de soja de partida S-1 S-2

Granos acondicionados SA-1 ---

Granos quebrados-descascarados SQ-1 SQ-2

Granos laminados SL-1 SL-2

Granos laminados y expandidos ---- SE-2

Harina salida del extractor

(desgrasada con n-hexano) HSE-1 HSE-2

Harina Salida del Toaster (desgrasada-desolventizada-

inactivada)

HST-1 HST-2

Harina de soja desgrasada y secada HDS-1 HDS-2

(21)

Toma de muestras

~ 500 g a la salida de cada etapa del proceso. Grano de partida hasta harina salida del desolventizador-tostador (DT).

Preparación de muestras

•Molienda en molino a cuchillas y tamizadas con tamiz 20 Mesh

•Harinas salidas del toaster tienen >15% humedad. Fueron

refrigeradas hasta el momento del análisis. Secadas en vacio y

molidas.

(22)

Análisis realizados sobre muestras seleccionadas:

 MDSC. Equipo Q200 (TA). Dispersión 30% p/p en agua y en 1M NaCl en cápsula hermética. Vel: 5°C/min, modulación 1°C cada 60 seg.

 Actividad antitríptica. Método de González y Carrillo (1987), con leves modificaciones (Sobral y Wagner, 2009)

 Actividad ureásica. Unidades de pH según el método Ba-9-58 (AOCS 1997)

 Espectros FTIR (con ATR SeZn). Equipo Shimatzu modelo IR Affinity –1 desde 750 a 4000 cm-1. 100 l de dispersión 10% en agua sobre ATR y secados por aire caliente.

 Lisina reactiva. reacción del o-ftalaldehido (OFA) y el -mercaptoetanol (- ME) con aminas primarias en medio alcalino (Church et al., 1983)

 Solubilidad proteica en 0,036M KOH (KOHPS) Norma ISOCD 14244 (2011)

(23)

MDSC de dispersiones en agua

Muestras Proceso 2

área I

(<70ºC) área II

pico 2 S-

2 HSE-2

HST-2

(24)

99.39°C

92.78°C 4.415J/g 99.41°C

92.57°C 5.227J/g

99.20°C

92.33°C 5.307J/g

99.47°C

93.16°C 4.739J/g

-1.05 -1.00 -0.95 -0.90 -0.85 -0.80 -0.75

H e a t F lo w ( W /g )

40 60 80 100 120

Temperature (°C)

H2B E2.001 (7.2 mg) –––––––

H3B E3.001 (7.0 mg) – – – –

H4B E4.001 (7.5 mg) ––––– ·

H5B E5.001 (8.5mg) ––– – –

Exo Up Universal V4.5A TA Instruments

área I (<70ºC) despreciable

Harinas finales Proceso 2

(25)

área I (<70ºC) MDSC EN AGUA

Proceso 1

área II

Pico 2 S-1

HSE-1

HST-1

(26)

98.14°C 91.65°C 6.373J/g

99.45°C

92.88°C 4.938J/g

100.94°C 94.08°C

6.126J/g

-1.15 -1.05 -0.95 -0.85

H e a t F lo w ( W /g )

30 50 70 90 110

Temperature (°C)

6T Poroto Salida Toster (Mod).001 (4.8 mg) –––––––

10T dupli Harina 2 (6.2 mg) – – – –

11T Harina 3 (Modul.) (5.0 mg) ––––– ·

HST-1

HDS-2b

MDSC EN AGUA Proceso 1

área I (<70ºC) despreciable

HDS-2a

(27)

A. Ensayos en agua

Muestras

H (J/g proteína seca)

Pico 1

Pico 2 H Total

Área I Área II

S-1 S-2

1,73  0,24 â 1,12  0,06 â 4,56  0,23 â 3,06  0,21 â 7,78  0,40 â 6,34  0,31 â 13,97  0,70 â 10,52  0,83â,b

SA-1 ----

1,37  0,15 â --- 3,57  0,30 ^b ---- 6,93  0,50 â ---- 11,66  0,93 â ----

SQ-1 SQ-2

0,94  0,10 ^b 1,03  0,05 â 2,74  0,11 ^c 2,79  0,15 â 6,92  0,33 â 5,53  0,24 ^b 10,15  0,41 ^b 9,35  0,56 â

SL-1 SL-2

0,61  0,08 ^c 0,67  0,06 ^b 2,49  0,17 ^c 2,41  0,16 ^b 6,80  0,63 ^{a, b} 6,18  0,45 ^a 10,32  0,93 ^b 9,25  0,74 ^a

---- SE-2

^---- 0,40  0,05 ^c ---- 1,91  0,30 ^b ---- 7,06  0,40 ^c ---- 9,38  0,81 ^a

HSE-1 HSE-2

0,54  0,10 ^c 0,22  0,08 ^d 2,62  0,15 ^c 1,93  0,18 ^b 6,30  0,37 ^b 7,85  0,63 ^c 9,46  0,38 ^b 10,00  0,85 ^a

HST-1 HST-2

^0,000^d 0,034  0,021 ^e 2,57  0,10 ^c 2,25  0,21 ^b 9,73  0,80 ^c 8,95  0,47 ^d 12,3  1,07 ^a 11,24  0,82 ^b

HDS-1 HDS-2

^0,000^d 0,040  0,026 ê 1,86  0,52 ^d 2,03  0,24 ^b 7,70  1,10 â 8,08  0,57 ^c,d 9,55 ± 1,60 ^b 10,07  0,70 â

(28)

98.25°C 91.69°C 3.975J/g

108.27°C 103.02°C 2.928J/g 76.45°C

0.3915J/g

-0.90 -0.85 -0.80 -0.75 -0.70

H e a t F lo w ( W /g )

20 40 60 80 100 120 140

Temperature (°C)

1B Poroto Bunge Linea 2.001 (5.3 mg) –––––––

1B Poroto intact (NaCl 1M) (8.1 mg) – – – –

MDSC Harina de soja activa (grano molido)

Comparación termogramas AGUA vs 1M NaCl

(29)

MDSC muestras Proceso 2 Dispersiones 1M NaCl

76.21°C 0.4869J/g

108.27°C 103.01°C

2.950J/g

76.29°C 67.90°C

0.2134J/g

109.01°C 103.37°C

4.365J/g

75.68°C 71.16°C

0.05155J/g

109.64°C 103.68°C

6.953J/g

77.66°C 74.40°C

0.01114J/g

109.86°C 104.43°C

4.497J/g

-6.25 -5.25 -4.25 -3.25

Heat Flow (mW)

30 50 70 90 110 130 150

Temperature (°C)

1B Poroto intact (NaCl 1M) (8.1 mg) –––––––

6B Salida Extractor (NaCl 1M).001 (4.9 mg) – – – –

7B Salida toster Bunge (NaCl 1M) (m=5.75 mg).001 ––––– ·

8B Harina Final High Pro Bunge (NaCl 1M) (m=7.79 mg).001 ––– – –

Pico 1

Pico 2

Pico 3 S-2

HSE-2

HST-2

HDS-2

(30)

MDSC muestras Proceso 1 Dispersiones 1M NaCl

77.49°C 69.98°C

0.2445J/g

83.60°C 72.18°C

0.009432J/g

-0.65 -0.55 -0.45

Heat Flow (W/g)

30 50 70 90 110 130

Temperature (°C)

1T Poroto tal cual (NaCl 1M) (7.2 mg) –––––––

6T (dupli) Poroto Salida Toster (NaCl 1M) (6.9 mg) – – – –

19) Harina T6 (NaCl 1M) (7.55).001 ––––– ·

13) Laminado T6 (NaCl 1M) (8.26).001 ––– – –

Pico 1

Pico 1 reducido o nulo

Poroto

Laminado toaster

Harina final

Pico 3 aumenta

(31)

Pico I

(32)

Pico I S-2

HSE-2

HST-2

HDS-2

(33)

76.08°C 56.10°C

0.6501J/g

73.60°C 65.91°C

0.3548J/g

75.68°C 71.08°C

0.05509J/g 63.57°C

56.52°C 0.05417J/g

-0.57 -0.56 -0.55 -0.54 -0.53 -0.52 -0.51

H e a t F lo w ( W /g )

20 30 40 50 60 70 80 90

Temperature (°C)

1B Poroto intact (NaCl 1M) (8.1 mg) –––––––

6B Salida Extractor (NaCl 1M).001 (4.9 mg) – – – –

7B Salida toster Bunge (NaCl 1M) (m=5.75 mg).001 ––––– ·

Soja quebrada

Harina salida extractor

Harina salida toster

Pico I

(34)

B. Ensayos en NaCl 1M

Muestras

H (J/g proteína seca)

Pico 1 Pico 2 Pico 3 H Total

S-1 S-2

1,03 ± 0,35 â 1,61 ± 0,23 â 2,39 ± 0,36 ^{a, b} 1,46 ± 0,19 â 6,62 ± 0,12 â 5,51 ± 0,10 â 10,04 ± 0,40 ^{a, d} 8,57 ± 0,15 â

SQ-1 SQ-2

0,94 ± 0,23 ^a 1,212 ± 0,16

a 2,75 ± 0,29 â 1,86 ± 0,22 â 6,60 ± 0,10 â 5,23 ± 0,90 â 9,63 ± 0,18 â 8,49 ± 0,60 â

SL-1 SL-2

0,85 ± 0,12â 1,03 ± 0,14 â 2,01 ± 0,15 â 1,54 ± 0,05 â 5,86 ± 0,26 ^b 5,37 ± 0,31 â 8,72 ± 0,50 ^b 7,94 ± 0,30 ^b

HSE-1 HSE-2

0,40 ± 0,14 ^b 0,65 ± 0,23 ^b 1,85 ± 0,08 â 1,60 ± 0,09 â 5,32 ± 0,22 ^c 6,68 ± 0,36 ^b 7,57 ± 0,11 ^c 8,93 ± 0,47 â

HST-1 HST-2

0,076 ± 0,060 ^c 0,12 ± 0,21 ^c 1,76 ± 0,18 ^a 3,63 ± 0,10 ^b 8,11 ± 1,32^d 10,25 ± 0,50 ^c 11,06 ± 1,04 ^d 14,16 ± 0,60 ^c

HDS-1 HDS-2

0,020 ± 0,034 ^c 0,07 ± 0,05 ^c 2,62 ± 1,38 ^a 1,96 ± 0,55 ^a 9,50 ± 2,34 ^d 8,29 ± 1,51 ^c 11,84 ± 1,63 ^{a, d} 11,31 ± 1,21 ^d

(35)

S -2

S Q- 2

S L- 2

S E -2

H S E -2

H S T- 2

H D S -2

0

20 40 60 80 100 120

S -1

S A -1

S Q- 1

S L- 1

H S E -1

H S T- 1

H D S -1

0

20 40 60 80 100 120

% r e s id u a l

Pico 1 DSC NaCl

Pico 1- I DSC agua Actividad antitríptica Actividad ureásica

% r e s id u a l

(36)

Muestras proceso 1

Lisina reactiva Proteína soluble en KOH

Contenido

(g/16 g N) Pérdida (%) KOH PS (%) Pérdida (%)

SL-1 nd nd 94,9 ± 1,3 ---

HSE-1 6,30 ± 0,04 0 97,8 ± 0,4 0

HST-1 6,16 ± 0,03 3,25 83,6 ± 1,4 14,5

Muestras

proceso 2

SE-2 nd nd 92,3 ± 0,7 ----

HSE-2 6,73 ± 0,05 0 97,1 ± 1,2 0

HST-2 6,50 ± 0,01 3,42 79,1 ± 1,4 18,5

HDS-2 6,42 ± 0,08 4,53 75,4 ± 1,0 22,3

(37)

Espectroscopía Infrarroja

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Abs orbanc ia

Número de onda (cm

^-1

)

I II III IV A

B

Zonas características de proteína: Amidas

(38)

Zonas amidas I, II, III

2000 1800 1600 1400 1200 1000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

2000 1800 1600 1400 1200 1000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

2000 1800 1600 1400 1200 1000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

2000 1800 1600 1400 1200 1000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Número de onda (cm

^-1

)

S-2 SL-2 SE-2

A

A b s o rb a n c ia

HSE-2 HST-2 HDS-2a HDS-2b

a c

b d

S-1 SQ-1 SL-1 1

2

3

Número de onda (cm

^-1

)

A b s o rb a n c ia

HSE-1 HST-1 HDS-1

Picos

L (1745 cm

^-1

) Desaparece en H desgrasadas

1 (1632-1635 cm

^-1

)

2 (1539 cm

^-1

) disminuyen con tostado 3 (1392-1396 cm

^-1

)

 (1446-1454 cm

^-1

) desaparece con tostado

(39)

S SQ SL SE HSE HST HDS 0,0

0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

A b so rb a n ci a

-1

Número de onda (cm^-1) Número de onda (cm^-1)

pico 3 pico 1 Proceso 1

S SQ SL SE HSE HST HDS

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

A b so rb a n ci a

pico 3 (1392 cm^-1) pico 1 (1630 cm^-1)

Proceso 2

S SQ SL SE HSE HST HDS

0 20 40 60 80 100

Residual relación pico 1/pico 3 (%) _{proceso 1}

proceso 2

(40)

Muestra

TIA AU Lisina reactiva KOH PS MDSC

Pico 1 (NaCl)

FTIR Pico 1 (1635)

% Pérdida

(%) pH Pérdida

(%)

Contenido (g/16 g N)

Pérdida

(%) (%) Pérdida

(%) (%) Pérdida (%) Abs Pérdida (%)

HSE-1 90 ± 5 ---- 2,23 ±

0,01 --- 6,30 ---- 97,8 ---- 29,1 ---- 1,13 ----

HST-1 ^{21,0 ±}

7 76,7 0,026 ±

0,01 98,8 6,16 3,25 83,6 14,5 7,4 74,7 0,86 23,4

HSE-2 ^{95 ± 5} ---- 2,20 ±

0,01 --- 6,73 ---- 97,1 ---- 40,4 ---- 1,37 0

HST-2 ^{17,1 ±} ₆ ^82,0 ^{0,026 ±} _0,006 ^98,8 ^6,50 ^3,42 ^79,1 ^18,5 ^9,9 ^75,4 ^0,97 ^29,2

(41)

Conclusiones

Los cambios detectados con la técnica MSDC aplicada sobre dispersiones en 1M NaCl, reflejan los procesos de desnaturalización sufridos por las proteínas y permite detectar la inactivación de KTI e inactivación de la enzima ureasa. También permite evaluar el estado de las proteínas de reserva 7S y 11S y su posible glicosilación.