Fundamentos de la espectroscopía UV-visible moderna

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Conceptos básicos

Fundamentos de la espectroscopía

UV-visible moderna

Tony Owen

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 Copyright Agilent Technologies 2000

Impreso en Alemania 06/00 Número de publicación 5980-1397ES

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Prólogo

Prólogo

En 1988 publicamos un libro titulado “The Diode-Array Advantage in UV/Visible Spectroscopy”. En ese momento, aunque los detectores de diodos estaban en el mercado desde 1979, sus características y sus ventajas comparados con los espectrómetros convencionales de barrido, no eran demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar aquella situación. El libro fue bien recibido y se distribuyeron varios miles de copias.

Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos que este es un momento adecuado para otra publicación.

Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluación de datos; las Buenas Prácticas de Laboratorio tienen ahora gran importancia; y la nueva generación de espectrofotó- metros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento.

Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los aspectos de importancia de la espectroscopía UV-visible, para la obtención de resultados. El control por microproce- sador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes de instrumentos, nos gustaría creer que los equipos son ahora más fáciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el conocimiento de los fundamentos de la espectroscopía UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los peligros del tratamiento y la química de muestras, sigue siendo esencial para obtener buenos resultados.

Además, quisieramos demostrar que la idea de “una medida a una sola longitud de onda” es insuficiente para obtener resultados óptimos. Múltiples medidas a múltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan lugar a la mejor exactitud y precisión de resultados y

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Contenidos

capítulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible

Principios básicos... 2

El espectro electromagnético... 2

Longitud de onda y frecuencia ... 3

Origen de los espectros UV-visible ... 3

Transmitancia y absorbancia... 6

Derivadas de espectros ... 6

Obtener las derivadas de los espectros ... 8

Aplicaciones ... 9

Señal/ruido ... 9

Consideraciones instrumentales ... 10

Análisis cualitativo ... 10

Identificación: espectros y estructura ... 10

Confirmación de la identidad ... 11

Color ... 13

Otra información cualitativa... 14

Temperatura de fusión de las proteínas y los ácidos nucléicos . 14 Actividad enzimática ... 15

Consideraciones instrumentales ... 16

Análisis cuantitativo... 16

Ley de Beer ... 16

Requisitos de la muestra... 20

Análisis multicomponente ... 21

Principio de aditividad ... 21

Método de ecuaciones simultáneas simples ... 21

Método de mínimos cuadrados... 24

Otros métodos... 26

Requisitos de la muestra... 27

Requisitos instrumentales... 27

Cuantificación indirecta ... 28

Derivatización química ... 28

Valoraciones espectrofotométricas ... 28

Ensayos cinéticos enzimáticos... 28

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Contenidos

Dispositivos de dispersión ... 34

Detectores ... 35

Optica ... 38

El espectrofotómetro convencional ... 38

El espectrofotómetro de diodos... 39

Configuración ... 41

Diseño de haz simple ... 41

Diseño de doble haz ... 42

Diseño con división de haz... 44

Diseño de doble longitud de onda ... 45

Medida de un espectro ... 45

Parámetros instrumentales clave ... 46

Resolución espectral ... 46

Exactitud y precisión de longitud de onda ... 50

Exactitud y precisión fotométrica ... 51

Luz dispersa... 51

Ruido ... 52

Rango dinámico lineal ... 53

Deriva ... 55

capítulo 3 Tratamiento y medida de muestra Muestras líquidas ... 58

Cubetas... 58

Material ... 58

Tipos de cubeta ... 59

Fuentes de error ... 60

Cuidado de las cubetas ... 61

Elección de disolvente ... 61

Efecto del disolvente, concentración, pH y temperatura ... 62

Muestras sólidas ... 64

Sin referencia... 64

Indice de refracción ... 65

Geometría de la muestra ... 65

Absorbancia débil... 66

Cambiar la anchura de rendija... 66

Promedio de tiempo ... 67

Promedio de longitud de onda ... 67

Absorbancia fuerte ... 68

Interferencia... 69

Tipos de interferencia... 69

Otros compuestos absorbentes ... 70

Dispersión... 70

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Contenidos

Isoabsorbancia... 72

Análisis multicomponente... 72

Modelar el fondo... 73

Referencia interna ... 74

Corrección de tres puntos ... 74

Espectroscopía derivada ... 75

Problemas fotoquímicos ... 79

Fluorescencia ... 79

Descomposición de la muestra ... 80

capítulo 4 Desarrollo y validación del método Desarrollo del método ... 82

Linealidad... 83

Exactitud ... 87

Precisión... 88

Sensibilidad... 89

Rango ... 91

Selectividad... 91

Robustez... 93

Requisitos instrumentales... 94

Validación del método... 94

capítulo 5 Operación de rutina Verificación del rendimiento del instrumento ... 96

Parámetros de test ... 96

Exactitud y precisión de longitud de onda... 97

Exactitud y precisión fotométrica... 98

Luz dispersa... 98

Resolución ... 99

Ruido ... 99

LLanura de la línea de base ... 100

Estabilidad... 100

Linealidad ... 100

Patrones ... 101

Patrones de emisión ... 101

Patrones sólidos de absorción ... 101

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Contenidos

Recomendaciones ... 109

Autotest del instrumento ... 114

Idoneidad del sistema ... 115

Operación apropiada... 115

Almacén electrónico ... 116

Procedimientos estándar de operación... 116

Datos colaterales ... 116

Longitudes de onda de confirmación ... 117

Espectros completos ... 117

Estadísticas ... 119

apéndice A Exactitud y precisión Definición de los términos ... 122

apéndice B Características de los espectrofotómetros de diodos Ventajas de la espectroscopía de diodos ... 124

Rápida adquisición espectral... 124

Medida multilongitud de onda simultánea... 125

Reselección de longitud de onda ... 126

Sensibilidad... 127

Estadísticas de las medidas ... 127

Robustez y fiabilidad... 127

Area abierta de muestra ... 128

Desventajas de la espectroscopía de diodos... 128

Resolución ... 128

Luz dispersa ... 129

Descomposición de la muestra... 129

Complejidad... 130

Errores en la medida de muestras fluorescentes... 130

apéndice C Referencias

indice

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capítulo 1

capítulo 1 Principios y

aplicaciones de

espectroscopía

UV-visible

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Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible

Este capítulo presenta la teoría básica y los principios de la espectroscopía UV-visible, proporcionando una valiosa visión de los usos y limitaciones de esta técnica para el análisis químico. También se revisan, brevemente, las aplicaciones principales de la espectroscopía UV-visible.

Principios básicos

El espectro electromagnético

La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende sólo una pequeña parte del espectro electromagnético, que incluye otras formas de radiación como radio, infrarrojo (IR), cósmica y rayos X (Figura 1).

Frecuencia [Hz]

Longitud de onda [m]

Infrarrojo Visible

Ultravioleta

Rayos cósmicos Rayos gamma Rayos X Radio

NMR

Televisión

Rádar

Infrarrojo Microondas

Ultravioleta visible

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La energía asociada con la radiación electromagnética se define por la siguiente ecuación:

donde E es la energía (en julios), h es la constante de Planck (6.62 × 10^-34Js) y ν es la frecuencia (en segundos).

Longitud de onda y frecuencia

La radiación electromagnética puede considerarse una combinación de campos eléctricos y magnéticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiación actúa como una onda, puede clasificarse según la longitud de ésta o la frecuencia, relacionadas por:

donde ν es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 × 10⁸ms^-1) y λ es la longitud de onda (en metros).

En espectroscopía UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10^-9m).

De las ecuaciones anteriores se deduce que radiación con longitud de onda más corta tiene mayor energía. En espec- troscopía UV-visible, la luz UV de longitud de onda más pequeña tiene la energía más alta. En algunos casos, esta energía es suficiente para causar reacciones fotoquímicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).

Origen de los espectros UV-visible

Cuando la radiación interacciona con la materia, pueden ocurrir varios procesos como reflexión, dispersión, absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorción y reemisión) y una reacción fotoquímica (absorbancia y

E = h ν

ν = c ⁄ λ

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una molécula, generalmente se representa como la suma de sus energías electrónica, vibracional y rotacional:

La cantidad de energía que una molécula posee en cada forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados discretos. La diferencias de energía entre los diferentes estados siguen el orden:

En algunas moléculas y átomos, los fotones de luz UV y visible tienen suficiente energía para causar transiciones entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz absorbida es aquella que tiene la energía requerida para mover un electrón desde un nivel de energía inferior a uno superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones electrónicas en el formaldehído y las longitudes de onda de la luz que las causan.

Figura 2

Transiciones electrónicas en el formaldehído

E

_total

= E

electronica

+ E

vibracional

+ E

_rotacional

E

electronica

> E

vibracional

> E

_rotacional

transición

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Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia muy estrechas, a longitudes de onda características de la diferencia entre los niveles de energía de las especies absorbentes. Esto es cierto para los átomos, como se muestra en la Figura 3.

Figura 3

Transiciones electrónicas y espectros de los átomos

Sin embargo en las moléculas, los niveles de energía vibracional y rotacional están superpuestos sobre los niveles de energía electrónica. Como pueden ocurrir muchas transiciones con diferentes energías, las bandas se ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor en las disoluciones, debido a las interacciones

disolvente-soluto.

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Figura 4

Transiciones electrónicas y espectros UV-visible en moléculas

Transmitancia y absorbancia

Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación incidente (I_o) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en términos de una fracción de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuación:

o % La absorbancia se define:

Para la mayoría de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya que la relación entre ésta y tanto la

concentración como el paso óptico es, normalmente, lineal.

Derivadas de espectros

Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

niveles de energía electrónica niveles de energía vibracional niveles de energía rotacional transición electrónica

T = I I ⁄

_o

T = ( I I ⁄

_o

) 100 ×

A = – log T

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Orden cero:

Primer orden:

Segundo orden:

La Figura 5 de la página siguiente muestra los efectos de la derivación en una banda gaussiana simple. Las derivadas de los espectros son siempre más complejos que el espectro de orden cero.

La primera derivada es la velocidad de cambio de la absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que la λmax de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una banda positiva y una negativa con un máximo y un mínimo a las mismas longitudes de onda que las de los puntos de inflexión de la banda de absorbancia. Este función bipolar es característica de todas las derivadas de orden impar.

La característica más significativa de la derivada de segundo orden es una banda negativa con un mínimo a la misma longitud de onda que la del máximo de la banda de orden cero. Esta derivada también muestra dos bandas satélite positivas, a cada lado de la banda principal. La cuarta derivada muestra una banda positiva con un máximo a la misma longitud de onda que el máximo de la banda de orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda

A = f ( ) λ dA d λ

--- = f ′ λ ( )

d

²

A d λ

²

--- = f ″ λ ( )

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Figura 5

Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia

Obtener las derivadas de los espectros

Pueden utilizarse métodos ópticos, electrónicos y

matemáticos, para generar las derivadas de los espectros.

Aunque las técnicas ópticas y electrónicas fueron la base de la primitiva espectroscopía UV-visible, han sido muy superadas por los métodos matemáticos.

Para calcular la derivada a una longitud de onda

determinada (λ), se selecciona una ventana de ± n puntos y se ajusta un polinomio por el método de mínimos

Absorbancia Absorbancia

1ª derivada 2ª derivada

3ª derivada 4ª derivada

A

_λ

= a

₀

+ a

₁

λ … a + +

_l

λ

^l

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cuadrados. Los coeficientes a₀… a_l a cada longitud de onda son los valores derivados, donde a₁ es la primera derivada, a₂ es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un método muy eficaz para realizar los cálculos, que son la base del algoritmo de derivación en la mayoría de los instrumentos comerciales. Este método también suaviza los datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el número de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por mínimos cuadrados da lugar a una aproximación suavizada a los puntos originales de los datos.

Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil más complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no aumenta la información intrínseca contenida. De hecho, disminuye debido a la pérdida de datos, como los factores de desplazamiento (offset) constantes.

Aplicaciones Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas solapadas para el análisis cualitativo (vea “Confirmación de la identidad” en la página 11) y, más importante, reducir los efectos de interferencias debidas a dispersión, matriz u otros compuestos absorbentes para el análisis cuantitativo (vea “Espectroscopía derivada” en la página 75).

Señal/ruido Un efecto no deseado de la derivación es la disminución de la relación S/N en las derivadas de orden superior. Esta disminución se debe a la discriminación (“Espectroscopía derivada” en la página 75) y al hecho de que el ruido siempre muestra las señales más agudas del espectro. Por tanto, si los datos espectrales utilizados en el cálculo de

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debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de suavizado distorsiona el espectro derivado.

Consideraciones instrumentales

Para que la resolución de las derivadas aumente, es necesario un incremento de la reproducibilidad de longitud de onda del espectrofotómetro. Pequeños errores de λ pueden resultar en errores de señal mucho mayores en el modo derivada que en el modo de absorbancia.

El efecto negativo de la derivación sobre S/N también demanda un aumento de las características de bajo ruido del espectrofotómetro. Si éste puede barrer y promediar múltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la derivación.

Análisis cualitativo

Identificación:

espectros y estructura

Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas bandas anchas. Comparada con técnicas como infrarrojo, que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopía UV-visible proporciona información cualitativa limitada. La mayor parte de la absorción de los compuestos orgánicos resulta de la presencia de enlaces π (es decir, insaturados).

Un cromóforo es un grupo molecular que, normalmente, contiene un enlace π. Cuando se inserta en un hidrocarburo saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia UV-visible), se forma un compuesto con una absorción entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromóforos y las longitudes de onda de sus máximos de absorbancia.

Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia

Cromóforo Fórmula Ejemplo λmax (nm)

Carbonilo (cetona) RR’C=O Acetona 271

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La presencia de una banda de absorbancia a una

determinada longitud de onda es una buena indicación de la presencia de un cromóforo. Sin embargo, la posición del máximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno molecular del cromóforo y del disolvente en el que pueda disolverse la muestra. Otros parámetros, como pH y temperatura, también pueden causar cambios tanto en la intensidad como en la longitud de onda de los máximos de absorbancia.

Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces, aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las bandas de absorción. Para algunos sistemas moleculares, como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relación entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada sistemáticamente.

Los iones de los metales de trasición también tienen niveles de energía electrónica que causan absorción de 400–700 nm en la región visible.

Confirmación de la

Aunque los espectros UV-visible no permiten una

Carboxilo RCOOH Acido acético 204

Amida RCONH₂ Acetamida 208

Etileno RCH=CHR Etileno 193

Acetileno RC=CR Acetileno 173

Nitrilo RC=N Acetonitrilo < 160

Nitro RNO₂ Nitrometano 271

Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia

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número de bandas aumenta con el orden de derivada. Este aumento de complejidad de los espectros derivados puede ser útil en el análisis cualitativo, para caracterizar materia- les o para identificación. Por ejemplo, el espectro del esteroide testosterona muestra una única banda ancha, sin estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la segunda derivada muestra seis picos distintos.

El efecto de mejora de resolución puede utilizarse también en la identificación. La Figura 6 muestra una simulación por ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por 30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una banda con un máximo entre los dos componentes, es decir, no están resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas son claramente visibles, con máximos centrados cerca de la λmax de las bandas de los componentes.

Figura 6

Absorbancia

4ª derivada

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Color

El color es una propiedad importante de una sustancia. El color de la materia está relacionado con su absortividad o reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.

Figura 7

Transmisión y color

Color complementario Color absorbido

Long. de onda [nm]

rojo naranja amarillo-verde

verde verde azulado

azul verdoso azul

verde azulado azul verdoso púrpura rojo-púrpura rojo naranja amarillo

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En la práctica, tanto la generación como la sensación de color son muy complejas y dependen de muchos factores, como el espectro del iluminante y, en el caso de sólidos, de la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentación para medida de color. Cuando están equipados con el software apropiado, la mayoría de los espectrofotómetros pueden utilizarse para medir el color. Una discusión a fondo sobre este tema está fuera del objetivo de este libro. Varias publicaciones^2,3 discuten en detalle el color y su medida, muy correctamente.

Otra información cualitativa

La espectroscopía UV-visible puede utilizarse para determinar muchas características físico-químicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar información como la identidad. A continuación se presentan dos ejemplos.

Temperatura de fusión de las proteínas y los ácidos nucléicos

Los espectros de absorbancia de las proteínas resultan principalmente de la presencia de los aminoácidos

aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. Una proteína a temperatura ambiente tiene una estructura o

conformación terciaria específica que crea un entorno electrónico determinado para los aminoácidos aromáticos.

Si se calienta la proteína, a una cierta temperatura, se desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el entorno electrónico de los aminoácidos aromáticos cambia, lo que resulta en cambios o variaciones espectrales.

Puede utilizarse análisis multicomponente (vea “Análisis multicomponente” en la página 21) para determinar la cantidad de cada aminoácido aromático que está presente en una proteína intacta.⁴

El ácido desoxirribonucléico (DNA) en su estado nativo, consta de dos cadenas de moléculas de desoxirribosa enlazadas helicoidalmente. Las cadenas están unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases purina y pirimidina (la adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina

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absorbancia UV del DNA, con un máximo a 260 nm. Como en un sistema multicomponente, la absorción observada de una molécula de DNA debe ser igual a la suma de las absorbancias individuales:

Sin embargo, la absorbancia observada es siempre significativamente menor que la esperada debido a que el enlace de hidrógeno entre las bases cambia su entorno electrónico. Cuando se calienta una molécula, el enlace de hidrógeno se rompe, la doble hélice se desenrosca y la absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de desnaturalización también se conoce como fusión. En un experimento de fusión de DNA, se aumenta paso a paso la temperatura de una disolución de DNA y se mide la

absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representándose como una curva de fusión.

El punto medio del rango de temperatura sobre el que ocurre la fusión, es el valor T_m. El T_m de una muestra particular de DNA depende principalmente del porcentaje de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales contiene tres enlaces de hidrógeno (en contraste, cada pareja A-T contiene dos enlaces de hidrógeno). Cuanto mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor es el T_m observado.

Actividad enzimática La actividad de una enzima es una medida de su eficacia como catalizador. La concentración de enzima en una preparación impura puede expresarse en términos de unidades por mililitro y la actividad específica de la

A

_DNA

= A

_adenina

+ A

_guanina

+ A

_cito_sin_a

+ A

_timina

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temperatura, las condiciones bajo las que se determina la actividad deben estar definidas con precisión. Estas condiciones son, normalmente, las óptimas de ensayo a una temperatura fija (25, 30 o 37 °C), con todos los sustratos presentes en condiciones de saturación. Para determinar la actividad, se prepara un sistema con concentraciones conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se añade un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad de reacción. Las medidas de actividad se realizan

principalmente en el campo de la investigación donde se aislan y purifican enzimas, así como para la fabricación de kits de ensayos enzimáticos, en los que la actividad de la enzima debe ser igual en todos los lotes.

Consideraciones instrumentales

La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud fotométrica absoluta son muy importantes para el análisis cualitativo, particularmente para la identificación y confirmación de compuestos desconocidos. A menudo, se comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden haber sido medidos a una resolución instrumental definida.

Análisis cuantitativo

Ley de Beer

Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y sólo 50 salen por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos 50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idéntica, sólo saldrán 25, etc. La Figura 9 muestra la representación de la transmitancia frente a la concentración.

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Figura 9

Transmitancia y concentración: la ley de Bouguer-Lambert

Generalmente se piensa que Lambert (1760) formuló la primera ecuación matemática sobre este efecto, aunque ahora parece que se le adelantó Bouguer en 1729. La expresión matemática es:

donde I_o es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso óptico (normalmente en centímetros).

La ley de Beer es idéntica a la ley de Bouguer, excepto porque está expresada en términos de la concentración. La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10 muestra una representación de la transmitancia frente al

Paso óptico

Transmisión

T = I I ⁄

_o

= e

^–^kb

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Figura 10

Transmitancia y paso óptico: ley de Beer

Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:

donde c es la concentración de las especies absorbentes (normalmente expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuación puede transformarse en una expresión lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se expresa en la forma decádica:

donde ε es la absorción molar o coeficiente de extinción.

Esta expresión se conoce como ley de Beer. La Figura 11 muestra una representación de la absorbancia frente a la concentración.

Paso óptico

Transmisión

T = I I ⁄

_o

= e

^–^kbc

A = – log T = – log ( I I ⁄

_o

) = log ( I

_o

⁄ I ) = εbc

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Figura 11

La ley de Beer–Bouguer-Lambert

El coeficiente de extinción (ε) es característico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, disolvente y temperatura. En la práctica, el coeficiente de extinción medido también depende de las características del instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se

construye una curva de calibración o curva de trabajo para la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones patrón con concentraciones conocidas del analito.

Para transiciones electrónicas, la diferencia de energía entre los estados fundamental y excitados, es relativamente grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable que todas las moléculas estén en estado electrónico

Concentración

Absorbancia [UA]

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de la espectroscopía UV-visible la base de miles de métodos analíticos cuantitativos.

Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de Beer, existe una relación lineal similar entre la

concentración y la amplitud, para todos los órdenes de espectros derivados:

Orden cero:

Primera derivada:

n derivada:

a λ, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, b es el paso óptico y c la concentración.

Para cuantificar un solo componente, la selección de longitudes de onda es más difícil con espectros derivados que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par tienen un máximo o un mínimo a la misma λmax que el espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden impar esta longitud de onda es un punto de corte con el cero. Tomando la diferencia entre el máximo más alto y el mínimo más bajo se obtiene la mejor S/N pero puede resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias de otros componentes.

Requisitos de la muestra Para resultados exactos, la muestra a analizar debe contener sólo el componente absorbente para el que se ha realizado la calibración. Si la muestra es una disolución, debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que sea posible corregir una interferencia con una segunda longitud de onda.

A = εbc dA d λ --- d ε

d λ ---bc

=

d

ⁿ

A d λ′

--- d

ⁿ

ε d λ′

--- bc

=

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Análisis multicomponente

Se han realizado casi tantos análisis multicomponente con espectros UV-visible como de un solo componente, pero debido a que las técnicas usadas en análisis multicomponente a menudo producían resultados incorrectos (como se detalla a continuación), no eran muy aplicados. Sin

embargo, los instrumentos modernos producen datos más precisos y las modernas técnicas de ajuste de curvas dan lugar a resultados más exactos y, quizás más importante, indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas razones, los análisis multicomponente UV-visible se han hecho más populares.

Principio de aditividad Según la ley de Beer (“Ley de Beer” en la página 16), la absorbancia es proporcional al número de moléculas que absorben radiación a la λ especificada. Este principio es cierto si hay presente más de una especie absorbente.

Todos los métodos cuantitativos multicomponente están basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa λ.

Método de ecuaciones simultáneas simples

El método simple de análisis multicomponente se basa en medidas a un número de longitudes de onda igual al número de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda elegidas normalmente son aquellas del máximo de absorbancia de cada componente. Para la calibración, se mide la absorbancia de patrones puros de concentración conocida, para determinar el coeficiente de extinción de cada componente a cada longitud de onda seleccionada.

La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de

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donde A′ es la absorbancia a longitud de onda ′, A′′ es la absorbancia a longitud de onda ′′, e′ es la absortividad molar a longitud de onda ′, e′′ es la absortividad molar a longitud de onda ′′, c es concentración y b es el paso óptico.

Estas ecuaciones se resuelven fácilmente para determinar la concentración de cada componente. Si las medidas siempre fueran perfectas, podrían obtenerse resultados exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros están muy solapados.

La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los máximos.

Figura 12

Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral

En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de dos componentes con un solapamiento significativo de los

A ″

₍_x₊_y₎

= A ″

_x

+ A ″

_y

= e ″

_x

bc

_x

+ e ″

_y

bc

_y

Longitud de onda [nm]

Absorbancia [UA]

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Figura 13

Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral significativo

Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberían ser:

Si ocurre un error del 10 % en la medida de A′(x + y) y A′′(x + y), es decir, A′(x + y)= 0.99 (- 10 %) y A′′(x + y)= 0.99

Absorbancia [UA]

Con poco solapamiento espectral Con solapamiento espectral

A’_{(x + y)} = 1.1 + 0.0 = 1.1 A’_{(x + y)} = 0.6 + 0.5 = 1.1

A’’_{(x + y)} = 0.0 + 0.9 = 0.9 A’’_{(x + y)} = 0.4 + 0.5 = 0.9

(34)

(+ 10 %), el cálculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2:

Método de mínimos cuadrados

Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el uso de información espectral adicional, es decir puede utilizarse una serie de datos para cuantificación, en lugar de sólo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un ajuste por mínimos cuadrados de los espectros patrón al espectro de la muestra medida, da lugar a resultados cuantitativos.^5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.

Tabla 2 Comparación de los resultados de análisis multicomponente para ejemplos con poco y sustancial solapamiento espectral

Poco solapamiento Mucho solapamiento

Componente

Concentración nominal

Concentración calculada % error

x 1 0.9 - 10 % 0 - 100 %

y 1 1.1 + 10 % 1.98 + 98 %

(35)

Figura 14

Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada longitud de onda

Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200–240 nm), los resultados cuantitativos del método de mínimos cuadrados tienen un error < 1 % comparados con un error de

aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.

Real Medido

Absorbancia [UA]

Tabla 3 Comparación de los resultados de análisis multicomponente de los métodos de ecuaciones simultáneas simples y mínimos cuadrados

Usando sólo 210 y

230 nm Usando 200–240 nm

Componente

Concentración nominal

Concentración calculada % error

(36)

Este método permite el análisis de las mezclas más complejas y de mezclas simples de componentes con espectros similares.

El residual del cálculo de mínimos cuadrados es un buen indicador de lo bien que los espectros patrón ajustan en los espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador de la probable exactitud de los resultados.

Un ejemplo de análisis multicomponente es la cuantificación de cinco hemoglobinas en sangre, con mínima preparación de la muestra.⁷ La Figura 15 muestra los espectros de absorción de los derivados de

hemoglobina. Este análisis se realizaba anteriormente utilizando varias técnicas analíticas, incluyendo espectroscopía y valoraciones.

Figura 15

Espectros de absorción de derivados de hemoglobina

Otros métodos Otros métodos estadísticos de análisis multicomponente incluyen mínimos cuadrados parcial (PLS), regresión del componente principal (PCR) y mínimos cuadrados múltiple (MLS). En teoría, estos métodos ofrecen algunas ventajas

Sulfhemoglobina Oxihemoglobina Carboxihemoglobina Hemoglobina (pH 7.0–7.4) Desoxihemoglobina

Absorbancia [UA]

(37)

sobre los descritos anteriormente, pero en la práctica el proceso de calibración es mucho más complejo.

Requisitos de la muestra Los métodos de ecuaciones simultáneas simples y mínimos cuadrados dan lugar a resultados exactos sólo si se realiza calibración utilizando patrones puros o mezclas de patrones, para cada componente de la muestra que

contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe tener ninguna capacidad adicional de absorción.

Requisitos instrumentales

La cuantificación de un componente normalmente se realiza midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de patrones y a continuación, el desconocido. Esta calibración debería eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la exactitud de longitud de onda y fotométrica absolutas, fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la reproducibilidad fotométrica es esencial para resultados precisos. Si se mide sólo en el máximo de absorbancia, la reproducibilidad de λ es también de poca importancia debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con λ es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del lateral de la banda, la reproducibilidad será muy

importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es crítico, ya que la calibración supone una relación lineal.

Un análisis multicomponente exacto requiere una S/N excelente, especialmente si se utiliza el método de ecuaciones simultáneas simples. En mínimos cuadrados, los datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incor- poran al cálculo, haciendo que la reproducibilidad de λ sea también esencial. Además, como se necesitan más datos, es necesario un barrido rápido para buena productividad.

(38)

Cuantificación indirecta

Derivatización química

Debido a que muchos compuestos exhiben débil o ninguna absorbancia en las regiones UV o visible, se han

desarrollado varios métodos con derivatización química.

Tales métodos, normalmente implican el añadir un reactivo orgánico, que forma un complejo con fuerte absortividad.

La etapa final de medida es prácticamente igual que la de los métodos directos. Con esta técnica, la elección apropiada del reactivo puede mejorar significativamente tanto la sensibilidad como la selectividad.

Valoraciones espectrofotométricas

En análisis volumétricos, el cambio de color que señala el final de una valoración normalmente se detecta

visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y puede ser una fuente de error. El uso de un

espectrofotómetro para detectar el final, introduce la objetividad y la automatización en el análisis.

Ensayos cinéticos enzimáticos

El análisis UV-visible directo de un componente en matrices biológicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difícil. Las interferencias de otros componentes a menudo

imposibilitan la medida directa de una propiedad específica, como la absorbancia. La separación del compuesto de interés puede ser costosa y pesada y por tanto, impracticable en el análisis de rutina.

Pueden utilizarse ensayos enzimáticos en el análisis indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en una matriz compleja. Si se selecciona la enzima

cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior a la adición de la enzima, será el resultado sólo de la reacción del compuesto o compuestos específicos. Esta selectividad es la base de los ensayos enzimáticos.

(39)

Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos tipos:

ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen temperatura, pH, actividad enzimática, concentración de la enzima y concentración del sustrato. Sin embargo, si todos los parámetros están controlados a un nivel constante, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato. Con los ensayos de punto final, se seleccionan las condiciones de manera que la conversión del sustrato a producto se complete dentro de un periodo razonable de tiempo (5–20 min). La diferencia entre la absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la cantidad de sustrato.

(40)

(41)

capítulo 2

capítulo 2 Instrumentación

(42)

Instrumentación

Idealmente, los instrumentos analíticos siempre dan lugar a medidas correctas de un parámetro químico o físico-químico, pero en la práctica todos los equipos están sujetos a error. En este capítulo se revisan los componentes básicos de un espectrofotómetro y las distintas configuraciones instrumentales posibles. Se discuten también los parámetros instrumentales clave y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.

Diseño instrumental

Componentes

Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Los componentes clave de un espectrofotómetro, son:⁸ • una fuente que genera una banda ancha de radiación

electromagnética

• un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular (o más correctamente, una banda de ondas) de la radiación de la fuente

• un área de muestra

• uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación

(43)

Instrumentación

Otros componentes ópticos, como lentes o espejos, transmiten la luz a través del instrumento.

Fuentes La fuente ideal de luz sería aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Dos son las fuentes utilizadas, comúnmente, en los espectrofotómetros UV-visible.

La primera fuente, la lámpara de arco de deuterio, produce un buen continuo de intensidad en la región UV y ofrece una intensidad útil en la región visible (Figura 16). Aunque las modernas lámparas de arco de deuterio tienen bajo ruido, éste, a menudo, es un factor limitante en el ruido general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz de una lámpara de arco de deuterio disminuye de modo homogéneo. Estas lámparas tienen una vida media (el tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.

La segunda fuente, la lámpara halógena de wolframio (Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lámpara tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, típicamente, una vida útil de 10000 h.

La mayoría de los espectrofotómetros utilizados para medir el rango UV-visible contienen ambos tipos de lámparas. En estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para cambiar de lámpara según corresponda, o se mezcla la luz procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola

Figura 16a Espectro intensidad de la lámpara de arco de deuterio Longitud de onda [nm]

Irradiación espectral

Figura 17 Espectro intensidad de la lámpara

Irradiación espectral

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Instrumentación

Una fuente alternativa de luz es la lámpara de xenon (Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido de las lámparas actuales de xenon es significativamente peor que el de las lámparas de deuterio o wolframio, las lámparas de xenon se utilizan sólo para aplicaciones como medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal en una intensidad elevada.

Dispositivos de dispersión

Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda de luz sean dispersadas con ángulos distintos. Cuando se combinan con una rendija adecuada de salida, pueden utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, más exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una fuente continua. Comúnmente, se utilizan dos dispositivos de dispersión, prismas y redes holográficas de difracción, en los espectrofotómetros UV-visible.

Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotómetros.

Los prismas son simples y baratos, pero la dispersión resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Además, el ángulo de dispersión depende de la temperatura.

Por esto, la mayoría de los espectrofotómetros modernos contienen redes holográficas en lugar de prismas. Estos dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecáni- camente, pero actualmente se utiliza un proceso óptico holográfico. Las dimensiones de las hendiduras son del mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va

Figura 18 Espectro intensidad de la lámpara de xenon Longitud de onda [nm]

Irradiación espectral

Figura 19 Dispositivos de dispersión

Prisma

Red de difracción

1^er orden

2º orden (a)

(b)

(45)

Instrumentación

dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que incide sobre la red se refleja con diferentes ángulos, dependiendo de λ. Las redes holográficas producen una dispersión angular lineal con la longitud de onda y son insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de diferentes órdenes, que se solapan (Figura 19b). Como resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que sólo la luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cóncava dispersa y enfoca la luz, simultáneamente.

Un monocromador consta de una rendija de entrada, un dispositivo de dispersión y una rendija de salida. Idealmen- te, lo que sale es luz monocromática. En la práctica, sin embargo, es una banda, óptimamente, simétrica. La anchura de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda instrumental (IBW).

Detectores Un detector convierte una señal de luz en una señal eléctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad.

Normalmente, los espectrofotómetros contienen un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.

El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conver- sión de la señal con varias etapas de amplificación, dentro del cuerpo del tubo. El material del cátodo determina la sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo.

Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles de luz. Sin embargo, en aplicaciones analíticas espectroscó- picas, una alta sensibilidad está asociada con bajas

concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo

Figura 20 Anodo Cátodo

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Instrumentación

Cada vez más, los fotodiodos se utilizan como detectores en espectrofotómetros (Figura 21). Tienen un rango dinámico más ancho y son más robustos que los fotomultiplicadores.

En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material semiconductor permite que los electrones fluyan a su través, reduciendo la carga en un condensador conectado a él. La carga necesaria para recargar el condensador, a intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la luz. Los primeros fotodiodos tenían baja sensibilidad en el rango UV, pero este problema se ha corregido en los detectores modernos. Los límites de detección son, aproximadamente, 170–1100 nm para detectores de silicio.

Figura 21

El detector de fotodiodos

Algunos espectrofotómetros modernos contienen una matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodiodos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada diodo tiene un condensador dedicado y está conectado, por un interruptor, a una línea común de salida. Los interrup- tores se controlan por un registro de cambio (Figura 22).

Inicialmente, los condensadores están cargados. Cuando

Fotón

Región capa n

capa p

Contacto metálico

intrínseca Bloque de oro

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Instrumentación

carga eléctrica libres que descargan los condensadores.

Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el periodo de medida para cada ciclo de barrido.

Figura 22

Diagrama esquemático de una matriz de fotodiodos

La cantidad de carga necesaria para recargar los condensadores es proporcional al número de fotones detectados por cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la variación de intensidad de luz sobre el rango completo de longitud de onda. La matriz, típicamente, comprende entre 200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la aplicación. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofo- tómetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el área fotosensible mide, aproximadamente 25 × 0.5 mm. El ciclo de lectura, que corresponde al tiempo de iluminación, es

Luz

Fotodiodo Condensador Registro de cambio

Interruptor transistor

Línea de vídeo

Ciclo de lectura

(48)

Instrumentación

Optica Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se utilizan lentes o espejos cóncavos. Las lentes son baratas pero sufren de aberración cromática, es decir, luz de diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseño cuidadoso, la aberración cromática de las lentes

individuales de un sistema óptico, puede utilizarse para cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema óptico eficaz con estos componentes simples y baratos.

Las lentes acromáticas combinan múltiples lentes de diferentes cristales con distintos índices de refracción, en una lente bastante libre de aberración cromática. Estas lentes se utilizan en las cámaras. Ofrecen un buen rendimiento, pero a un coste relativamente alto.

Los espejos cóncavos son menos costosos de fabricar que las lentes acromáticas, completamente libres de aberración.

Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fácilmente, resultando en una pérdida de eficacia.

En cada superficie óptica, incluyendo las interfases entre los componentes de una lente acromática, el 5–10 % de la luz se pierde por absorbancia o reflexión. Por lo tanto, idealmente, los espectrofotómetros deberían estar diseñados con un mínimo número de superficies ópticas.

El espectrofotómetro convencional

La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple. La luz policromática de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un

monocromador, que transmite selectivamente una estrecha banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el área de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco) y

comparándola con la intensidad de la luz que alcanza el detector después de atravesar la muestra. Como se indica anteriormente, la mayoría de los espectrofotómetros contienen dos lámparas, de deuterio y de wolframio y

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Instrumentación

utilizan tubos fotomultiplicadores o, más recientemente, fotodiodos, como detectores.

Figura 23

Esquema de un espectrofotómetro convencional

Este diseño es el adecuado para medir la absorbancia en un solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo, para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar estas tareas con un espectrofotómetro convencional, deben rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el problema de irreproducibilidad mecánica en las medidas.

Además, la adquisición de datos en serie es un proceso inherentemente lento.

El espectrofotómetro de diodos

La Figura 24 muestra un diagrama esquemático de un espectrofotómetro de diodos. La luz policromática de una

Monocromador

Rendija de salida Detector

Dispositivo de dispersión Rendija de

entrada

Muestra

Fuente

(50)

Instrumentación

rendija de entrada del policromador y con el tamaño del diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma función que la rendija de salida de un monocromador.

Figura 24

Esquema de un espectrofotómetro de diodos

El policromador (rendija de entrada más dispositivo de dispersión) y la matriz de diodos están contenidos en una unidad conocida como espectrógrafo. Como las posiciones relativas de la muestra y el elemento dispersivo están invertidas respecto a un instrumento convencional, esta configuración, a menudo, se denomina óptica inversa.

Para minimizar posibles reacciones fotoquímicas, se utiliza un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el obturador se abre automáticamente y la luz pasa a través de la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y sin muestra, según se describe en “El espectrofotómetro convencional” en la página 38. Un espectrofotómetro de diodos es, inherentemente, muy rápido debido a su

Matriz

Muestra

Fuente

Dispositivo de dispersión Rendija de

entrada Policromador

de diodos

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Instrumentación

electrónico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de onda y es de elevada fiabilidad.

Configuración

Comercialmente, existen varias configuraciones de espectrofotómetros. Cada una de ellas tiene ventajas y desventajas.

Diseño de haz simple Tanto los espectrofotómetros convencionales como los de diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple son de bajo coste y el sencillo sistema óptico ofrece alto rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los espectrofotómetros de referencia utilizados por

instituciones como el National Institute of Standards and Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz simple.

Los espectrofotómetros de matriz de diodos son

particularmente adecuados para la configuración de haz simple, ya que se adquieren espectros muy rápidamente y porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y muestra es mínimo. Además, pueden utilizarse referencias internas para reducir aún más los efectos de deriva de la lámpara (consulte “Referencia interna” en la página 74).

La Figura 25 muestra el sistema óptico de un moderno espectrofotómetro de diodos, el Agilent 8453. Esta configuración de haz simple tiene un número mínimo de componentes ópticos, obteniéndose la eficacia más elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolución.

(52)

Instrumentación

Figura 25

Diagrama óptico del espectrofotómetro de diodos Agilent 8453

Diseño de doble haz En un espectrofotómetro convencional de haz simple, el blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un intervalo de varios segundos para una medida a una longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida de un espectro completo. Las variaciones de la lámpara pueden dar lugar a errores significativos en intervalos largos de tiempo.

El espectrofotómetro de doble haz fue desarrollado para compensar los cambios de intensidad de la lámpara entre las medidas de blanco y muestra. En esta configuración, se coloca un chópper en el paso óptico, cercano a la fuente. El chópper hace que al detector llegue intermitentemente la luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad de la lámpara (deriva).

La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotómetro

Lámpara de

Lámpara de deuterio Lente

Obturador

Muestra

Lente Rendija

Matriz de 1024 diodos Red

wolframio