INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
D I V I S I Ó N DE BIOTECNOLOGÍA Y A L I M E N T O S P R O G R A M A DE G R A D U A D O S EN BIOTECNOLOGÍA
TECNOLÓGICO DE MONTERREY®
Efecto hipocolesteroiémico del germinado de brócoli (Brassica olerácea var. Itálica) y extractos del mismo
(glucosinolato y sulfurafano) en un modelo animal (hámster)
T E S I S
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA POR:
LAURA NELLY RODRÍGUEZ CANTU
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA
T E C N O L Ó G I C O DE M O N T E R R E Y
Efecto hipocolesterolémico del germinado de brócoli (Brassica oleracea var. Italica) y extractos del mismo (glucosinolato y sulfurafano) en un modelo animal (hámster)
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
LAURA NELLY RODRÍGUEZ CANTU
MONTERREY, N.L. Diciembre 2008
D E D I C A T O R I A
A Dios, por todas las bendiciones recibidas, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y haber puesto en mi camino a las personas que han sido mi soporte y compañía a lo largo de la maestría y por permitirme llegar a feliz termino con esta etapa de mi vida.
Espíritu Santo, gracias por los dones recibidos.
A Marquito, por ser mi compañero en las buenas y en las malas, por su impulso a emprender esta meta al fin lograda, por su fe en mí, por caminar junto a mí hacia una misma dirección y por muchas cosas más.. .gracias mi amor.
A mis padres a quienes agradezco de todo corazón por su amor, cariño, comprensión y apoyo en todo momento. Les agradezco mucho porque de ellos aprendí a salir adelante a pesar de los obstáculos que se presentan en la vida.
A mis hermanos Dany, Vero y Calixto, por la confianza y el apoyo que siempre me han brindado. Sé que cuento con ellos siempre.
A G R A D E C I M I E N T O S
A mis asesores, Dr. Serna que me brindó todo su apoyo y disposición en todo momento e inculcarme el amor a la investigación, Dra. Janet que compartió sus conocimientos y experiencias durante el desarrollo de este estudio, Dra. Rocío por sus comentarios y recomendaciones que sirvieron para el mejoramiento de esta tesis.
Al Dr. José Luis Vázquez y a Santos por el apoyo brindado con el cuidado y en el sacrificio de los hamsters.
Al Dr. Fahey por tener fe en este proyecto y brindarme las facilidades para la obtención de los extractos y análisis requeridos.
Al ITESM y al CONACYT, que proporcionaron la ayuda necesaria para la realización de mis estudios de postgrado.
A M.C. José Rodríguez y al Q.C.B. Benito Martínez por su ayuda con el análisis en el GC/MS. A Lorena, Liz, Abraham, Fany y Raúl por el apoyo en la parte experimental de este proyecto.
A Ana, Mary Carmen y Myri, por todo el apoyo administrativo. A la Bandita: Jane, Jeny, Bertha, Ily, Perla, Daris, Jorge, Pepe, Dany, Alex, Chago y Marcos por todos los momentos compartidos, especialmente por esa noche de niñas en la que festejó mi vesícula. A la Maestra Tere por su amistad y apoyo incondicional a lo largo de la investigación. A la Fam. Sarmiento por permitirme ser parte de su familia, por su apoyo invaluable y cariño. A mis amigos, el camino fue más fácil al compartirlo con ustedes, gracias por compartir los momentos agradables y difíciles: Toño, Fernando, a todos los compañeros del laboratorio, Doña Basi y Don Toño, y los que por ahí se me escapen.
Y a los hamsters, no por últimos menos importantes ya que dieron su vida para la realización de este proyecto.
RESUMEN
E l germinado de brócoli se ha estudiado in vitro y en modelos animales y se ha demostrado que es u n potente inductor de las enzimas de fase I I y un supresor de la carcinogénesis, sin embargo hay poca evidencia de su potencial en el tratamiento para la hipercolesterolemia. E l objetivo de este estudio fue investigar los efectos del germinado de brócoli y sus extractos (glucosinolatos y sulfurafanos) en el desarrollo de la hipercolesterolemia en u n modelo animal.
U n total de 48 hamsters sirianos se dividieron en cuatro bloques de seis unidades experimentales cada uno. Fueron alimentados durante siete semanas con dietas que contenían 0 . 1 % de colesterol y 1 0 % de manteca animal lo cual incrementó 1.5 veces el nivel de colesterol en plasma y 4.5 veces el nivel de colesterol en hígado con respecto al nivel basal. Se dividieron en seis tratamientos, dieta control, dieta con un fármaco hipolipemiante, dieta con germinado de brócoli a dosis alta y baja, dieta con extracto rico en glucosinolato y dieta con extracto rico en sulfurafano.
A l finalizar el estudio de 7 semanas, se analizaron muestras de plasma, hígado y heces. Se encontró que los niveles de triglicéridos en plasma fueron diferentes estadísticamente en el grupo con el tratamiento con extracto rico en sulfurafano comparado con el grupo que consumió la dieta con el fármaco. Los niveles de colesterol total en paslma, H D L y L D L fueron similares entre los tratamientos. Sin embargo, los niveles de colesterol hepático fueron más bajos en los grupos que consumieron una dieta con germinado en dosis alta y con extracto rico en sulfurafanos.
C o n respecto a los niveles de excreción de esteróles, los tratamientos con extracto rico en sulfurafano y el germinado en dosis alta fueron los que presentaron mayor excreción de esteróles neutrales en heces. E l grupo con extracto rico en sulfurafano presentó menor tasa de absorción de colesterol y fue diferente estadísticamente al grupo que consumió el
ABREVIACIONES
Abreviatura Significado
uL Microlitro
°C Grados centrígrados
min Minuto
d.i. Diámetro interior
mg Miligramo
g Gramo
UI Unidades internacionales
ND No detectable
Microgramos
E.U.A Estados Unidos de América
ppm Partes por millón
um Micrómetro
m Metro
mm Milímetros
umol Micromol
mL Mililitros
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
EDTA Acido etilen diamino tetra acético
rpm Revoluciones por minuto
hr Hora
C Carbonos
ÍNDICE
Página
AGRADECIMIENTOS I
RESUMEN II
ABREVIACIONES III
ÍNDICE IV
ÍNDICE DE TABLAS VII
ÍNDICE DE FIGURAS VIII
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3
2.1 Colesterol y fracciones de lipoproteínas 3
2.1.1 Metabolismo del colesterol 4
2.1.1.1 Síntesis de colesterol 4
2.1.1.2 Absorción y transporte de colesterol 6
2.1.2 Enfermedades cardiovasculares 8
2.1.2.1 Ateroesclerosis y estrés oxidativo 9
2.2 Compuestos naturales con actividad hipocolesterolémica 11
2.3 Brócoli y Germinado de Brócoli 15
2.3.1 Composición química del brócoli y germinado de brócoli 15 2.3.2 Compuestos activos del germinado de brócoli: glucosinolatos y
sulfurafanos 16
2.3.3 Bioactividad de los sulfurafanos en la salud 19 2.3.3.1 Actividad anticancerígena y antioxidante 19
2.3.3.2 Actividad bactericida 20
3. MATERIALES Y MÉTODOS 21
3.1 Caracterización del germinado de brócoli y extractos 21 3.1.1 Composición química proximal del germinado de brócoli 21 3.1.2 Extractos del germinado de brócoli enriquecidos con glucosinolato y
sulfurafano 22
3.2.2 Animales experimentales 24
3.2.2.1 Estudio metabólico preliminar 24
3.2.2.2 Estudio metabólico in vivo de colesterol 25 3.2.3 Recolección de muestras al finalizar el estudio in vivo 26
3.3 Análisis de muestras 27
3.3.1 Determinación de colesterol por método enzimático 27 3.3.2 Determinación y cuantificación de colesterol por
cromatografía gaseosa acoplada a un detector de ionización de
flama 27
3.3.2.1 Colesterol total en plasma 30
3.3.2.2 Colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidad (C-
HDL) 27
3.3.2.3 Colesterol total en hígado 28
3.3.2.4 Condiciones cromatográficas para el análisis de
colesterol en plasma e hígado 29
3.3.3 Triglicéridos en plasma 30
3.3.4 Fosfolípidos en hígado y bilis 31
3.3.5 Determinación y cuantificación de esteróles neutrales en heces por cromatografía gaseosa acoplada a un detector de
ionización de flama 32
3.3.5.1 Condiciones cromatográficas para el análisis de
esteróles neutrales en heces 32
3.3 Análisis estadístico 33
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34
4.1 Estudio metabólico preliminar 34
4.2 Estudio metabólico in vivo de colesterol 35
4.3 Análisis bioquímicos en plasma e hígado 36
4.3.1 Colesterol total, % de HDL, LDL y triglicéridos en plasma 36 4.3.2 Colesterol total y fosfolípidos en hígado 39
4.3.3 Esteróles neutrales en heces 40
4.4 Correlaciones entre el método enzimático y por cromatografía de gases 42
4.3 Análisis de función discriminante de colesterol en plasma e hígado 43
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 46
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48
ANEXOS 60
VITA 67
ÍNDICE DE TABLAS
Página Tabla 1. Estudios relacionados en la investigación de la disminución de colesterol 13 Tabla 2. Comparación de la composición nutrimental del brócoli maduro y germinado... 16 Tabla 3. Composición química proximal del germinado de brócoli utilizado durante el
estudio in vivo 21
Tabla 4. Componentes de las dietas utilizadas en el estudio in vivo expresados en
porcentaje 23
Tabla 5. Programa de temperaturas utilizado para el análisis cromatográfico en plasma e
hígado 30
Tabla 6. Soluciones y cantidades utilizadas para la preparación del blanco y el estándar en
la determinación de fosfolípidos 31
Tabla 7. Programa de temperaturas utilizado para el análisis cromatográfico en heces 33 Tabla 8. Excreción urinaria de Ditiocarbamatos en hamsters sometidos a diferentes dosis de
extractos ricos en glucosinolatos y sulfurafanos 35
Tabla 9. Peso y excreción de heces y orina en hamsters sujetos a un estudio metabólico ..36 Tabla 10. Efecto de la suplementación de germinado de brócoli y extractos del mismo en la concentración de lípidos en plasma en hamsters después de 7 semanas de
estudio 38
Tabla 11. Efecto de la suplementación de germinado de brócoli y extractos del mismo en la
concentración de lípidos en hígado 40
Tabla 12. Efecto de la suplementación de germinado de brócoli y extractos del mismo en la
absorción y excreción de esteróles neutrales de heces 41
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructura del colesterol 3
Figura 2. Biosíntesis del colesterol 5
Figura 3. Estructura de una lipoproteína de baja densidad (LDL) y alta densidad
(HDL) 7
Figura 4. Proceso aterogénico 11
Figura 5. Estructura del glucosinolato 17
Figura 6. Metabolismo del sulfurafano 18
Figura 7. Esquema del metabolismo de la glucorafanina 18
Figura 8. Coeficiente de la correlación de Pearson en las variables de colesterol en plasma analizadas por método enzimático y por cromatografía de gases 44 Figura 9. Biplot del comportamiento de las hembras ante los tratamientos estudiados en las
variables de colesterol plasmático y hepático 45
Figura 10. Biplot del comportamiento de los machos ante los tratamientos estudiados en las
variables de colesterol plasmático y hepático 46
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años, las enfermedades del corazón han mostrado un incremento constante, llegando a ser la primera causa de muerte a nivel mundial así como también en México (INEGI, 2006). La Organización Mundial de la Salud tiene registrado en el año 2005 un total de 17.5 millones de muertes, lo cual representa el 30% de todas las defunciones mundiales. Si no se toman las debidas acciones preventivas, se pronostica que para el año 2015 alrededor de 20 millones de personas morirían cada año a causa de enfermedades cardiovasculares, principalmente por infartos y accidentes vasculares cerebrales (OMS, 2007)
La ateroesclerosis es la principal causa para la patogénesis de estas enfermedades y está asociada con el colesterol y el metabolismo de lípidos. El proceso aterogénico inicia cuando el contenido de colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se acumula en la pared íntima produciendo daño en las arterias (Maxfield y Tabas, 2005). La modificación de las LDL es debida principalmente a la oxidación producida por el ataque enzimático y no enzimático. Un ejemplo es la peroxidación lipídica producida por las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Hansson et al, 2006).
Por otra parte, las pautas para el tratamiento de la hipercolesterolemia incluyen el uso de fármacos o el consumo de alimentos que ayuden a disminuir los niveles de lípidos en sangre. Las estatinas son el fármaco de elección más utilizado en la actualidad, actúa como inhibidor de la enzima HMGCoA reductasa, enzima clave para la biosíntesis de colesterol (Glassberg y Arder, 2008). Sin embargo el uso prolongado de este fármaco puede ocasionar daño hepático o en el riñon (Bhardwaj y Chalasani, 2007; Jain et al., 2007). Una de las ventajas que tiene el consumir alimentos para disminuir el colesterol en sangre, es evitar los efectos secundarios que traen consigo el uso de fármacos.
Diversos alimentos o alguno de sus componentes han sido identificados con propiedades anticolesterolémicas, incluyendo champiñones (Pleurotus citrinopileatus) (Hu et al.,
2006), sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) (Carr et al., 2005), zanahorias (Daucus carota) (Nicolle et al., 2004) alga espirulina (Spirulina platenses) (Riss et al., 2007), té verde y negro (Vinson et al., 1998), fibra soluble (Leontowicz et al., 2001). A pesar la diversidad de éstos estudios, aún no está suficientemente claro si los efectos son debidos al compuesto en particular o al estar asociado a la matriz alimenticia.
El germinado de brócoli se ha estudiado in vitro y en modelos animales y se ha demostrado que es un potente inductor de las enzimas de fase II y un supresor de la carcinogénesis (Fahey et al., 1997). Estas acciones son atribuidas al compuesto sulfurafano que por medio de la activación de la enzima glutatión genera los efectos antioxidantes (Wu y Juurlink, 2001). Por esta razón se seleccionó este vegetal para su estudio además de evaluar los efectos hipocolesterolémicos tanto de los extractos ricos en glucosinolatos y sulfurafanos, así como del germinado de brócoli.
El objetivo del presente trabajo es determinar el efecto de una dieta rica en germinado de brócoli y extractos del mismo (glucosinolatos y sulfurafanos) en el desarrollo de hipercolesterolemia en un modelo animal (hámster).
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 C o l e s t e r o l y f r a c c i o n e s d e l i p o p r o t e í n a s
El colesterol es una molécula lipídica que juega un papel muy importante desde el punto de vista estructural y fisiológico, especialmente en la membrana plasmática, donde actúa de manera estructural y regulando los procesos metabólicos en el interior de la célula (Maxfield y Tabas, 2005). Además es precursor de las hormonas esteroideas, ácidos biliares y vitamina D (Chang et al., 2006; Mitchell et al., 1991).
Como se puede observar en la Figura 1, la estructura del colesterol consiste en cuatro anillos (A,B,C,D) condensados, unidos a dos grupos metilo localizados en el CÍO y Cl3.
Esta estructura es característica de los esteroides naturales, sin embargo el colesterol contiene un grupo 3|3-OH unido al anillo A, una doble ligadura entre el C5 y C6 y una cadena alifática ramificada en el C17.
El colesterol y el resto de los lípidos como los triglicéridos y los fosfolípidos circulan en la sangre unidos a proteínas específicas (apolipoproteínas) formando un complejo macromolecular denominado lipoproteínas. Estas se pueden clasificar en quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL).
F i g u r a 1. E s t r u c t u r a del colesterol ( L a g u n a , 2002)
2.1.1 M e t a b o l i s m o D e l Colesterol
2.1.1.1 SÍNTESIS DE COLESTEROL
La mayor parte del colesterol del organismo proviene de síntesis novo aportando diariamente aproximadamente de 800mg a lg y sólo 0.3g proveniente de la dieta. Se encuentra en productos de origen animal, principalmente en la carne, hígado, cerebro y yema de huevo (Omoigui, 2007).
El colesterol es sintetizado por todos los tejidos, siendo el hígado el principal lugar de su biosíntesis (Dietschy et al., 1993). El retículo endoplasmático es el sitio de la síntesis de colesterol. Sin embargo, su concentración es baja (0.5-1%), pero su nivel incrementa a través del aparato de Golgi hasta llegar a la membrana plasmática donde su concentración es mayor (60-80%) (Maxfield y Wünstner, 2002).
El sistema de biosíntesis de colesterol tiene un mecanismo regulador dependiente, en parte, de la cantidad de colesterol absorbida en el intestino. Cuando el colesterol dietético es bajo, su síntesis en el organismo aumenta y lo opuesto sucede en el caso contrario. De esta manera, hay una tendencia a sostener el colesterol corporal a un nivel relativamente constante. (Grundy, 1983).
Como se muestra en la Figura 2, la síntesis de colesterol inicia por la unión de 18 fragmentos de 2C, en forma de Acetil CoA, a través de tres etapas: la primera, hasta el mevalonato; la segunda, del mevalonato al escualeno y la tercera, del escualeno al colesterol. En la primera etapa dos moléculas de acetil CoA se combinan en una reacción catalizada por la tiolasa para formar acetoacetil CoA, de 4C; ésta a su vez, se combina con otra molécula de acetil Co A para formar una unidad de 6C, la 3-hidroxi, 3 metil glutaril CoA. La siguiente etapa en la síntesis de colesterol es la formación de mevalonato a partir de la 3-hidroxi 3-metil glutaril Co A mediante la acción de la 3-hidroxi-3-metil glutaril Co A reductasa (HMG CoA reductasa). Este paso es el principal en la regulación en la biosíntesis de colesterol.
Mediante una serie de fosforilaciones seguidas de la descarboxilación del compuesto fosforilado intermediario se sintetiza la unidad isoprénica activa de pirofosfato de isopentilo. Esta molécula se isomeriza a pirofosfato de dimetil-alilo, el cual a su vez se condensa con pirofosfato isopentenilo. Posteriormente, mediante una nueva reacción de condensación, una segunda molécula de pirofosfato de geranilo se une para formar como producto el pirofosfato de farnesilo. La molécula de pirofosfato de farnesilo, al tener la capacidad de rotación libre, forma anillos básicos A y B del núcleo de los esteroides, de continuar con su proceso se formará un hidrocarburo de cadena larga conformado por dos moléculas de pirofosfato de farnesilo denominado escualeno. Mediante la acción de oxigenasas y la migración de grupos metilo, la estructura de escualeno, forma el primer compuesto esteroideo de esta vía conocido como lanosterol. La última etapa se inicia con la activación del escualeno con O2 y NADPH, para formar el epóxido del escualeno ciclizado o lanosterol, por medio de una ciclasa. En seguida, el lanosterol pierde tres grupos metilo, una de las dobles ligaduras es reducida con NAPDH y la otra doble ligadura emigra, para formar finalmente el colesterol (Laguna, 2002; Omoigui, 2007).
Figura 2. Biosíntesis de colesterol (Lloyd, 2002)
2.1.1.2 ABSORCIÓN Y TRANSPORTE DE COLESTEROL
El colesterol que se encuentra en el intestino proviene de dos fuentes, de la dieta (colesterol exógeno), el cual se encuentra en forma esterificada y el colesterol que proviene de la degradación de las sales biliares y se encuentra en forma libre (colesterol endógeno) (Grundy, 1983).
Antes de su absorción el colesterol tiene que ser emulsificado por las sales biliares que facilitan la hidrólisis de los esteres de colesterol por la enzima colesterol esterasa.
Además de la emulsificación, las sales biliares tienen la propiedad de formar las llamadas micelas (Laguna, 2002). Las micelas transportan colesterol, ácidos grasos, monoglicéridos y lisolecitina desde el lumen del intestino delgado hasta las microvellosidades de las células epiteliales, donde se disocian de las micelas y se difunden a través de la membrana por difusión pasiva hasta el citoplasma celular.
(Grundy 1983; Martini y Pallottini, 2007). Cabe mencionar que alrededor de un 90% de las sales biliares son reabsorbidas en el íleum y transportadas hasta el hígado y el resto son metabolizadas en el intestino y excretadas en las heces.
Una vez dentro de la célula, los ácidos grasos y monoglicéridos son combinados para formar triglicéridos, los cuales se unen junto al colesterol y fosfolípidos para formar una estructura globular llamada quilomicrón y ser transportados a través de la linfa hacia el conducto torácico. Esta estructura globular forma parte de las lipoproteínas, que son el vehículo de transporte del colesterol. La estructura de una lipoproteína consiste en un modelo esférico de radio variable y un núcleo lipídico no polar de esteres de colesterol y triglicéridos rodeado por una capa polar de proteínas (apolipoproteínas) y fosfolípidos, la densidad de la lipoproteína varía con la proporción de proteínas y el tipo de lípido que esté presente, en la Figura 3 se observa un ejemplo de una lipoproteína de baja densidad y de alta densidad.
Figura 3. Estructura de una lipoproteína de baja densidad (LDL) y alta densidad (HDL) (Libby, 2002)
Como se mencionó anteriormente, los quilomicrones llegan a la circulación general a través del conducto torácico y están constituidos principalmente por triglicéridos (85- 90%). Mientras circulan en el torrente sanguíneo, los triglicéridos se van hidrolizando por la acción de la lipasa lipoproteica (LPL) para proporcionar energía a los tejidos o en su caso, almacenarse como reserva en el tejido adiposo. El colesterol no esterificado, los fosfolípidos y una parte de los triglicéridos que permanecen en la molécula llegan al hígado como remanentes de quilomicrones (Grundy 1983; Martini y Pallottini, 2007).
Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), además de formarse a partir de los remanentes de quilomicrones son sintetizadas de manera continua en el hígado y transportan triglicéridos endógenos (60%). Los triglicéridos de las VLDL son hidrolizados por la enzima LPL para proporcionar la energía necesaria para el metabolismo celular. Conforme pierde triglicéridos se forma un remanente de las VLDL llamado lipoproteína de densidad intermedia (IDL) compuesta de fosfolípidos y colesterol no esterificado. Este remanente se va a transformar en lipoproteínas de baja densidad (LDL) que son las encargadas de transportar la mayor cantidad de colesterol en los humanos (las dos terceras partes del colesterol plasmático total) y llevarlo a los tejidos para que sea utilizado o almacenado. Su composición lipídica es de 35% de esteres de colesterol, 12% de colesterol, 8% de triglicéridos y 20% de fosfolípidos; constituyendo
los lípidos un 75% de la lipoproteína. Las LDL se enlazan a los receptores para Apo B- 100 y después de su internalización por endocitosis, la Apo B y los esteres de colesterol se hidrolizan por enzimas lisosomales.
Las lipoproteínas de alta densidad (HDL), son las lipoproteínas más pequeñas, están constituidas en cerca de la mitad de su peso por las apoproteínas A y C, contienen 25% de fosfolípidos, 16% de esteres de colesterol, 5% de colesterol y 4% de triglicéridos. Se forman en el hígado y en el intestino y su función principal es retirar el exceso de colesterol de los tejidos y devolverlo al hígado en donde el colesterol se incorpora para la síntesis de nuevas lipoproteínas o para ser segregado a la bilis para su excreción en heces.
(Grundy 1983; Martini y Pallottini, 2007)
2.1.2 E n f e r m e d a d e s cardiovasculares
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son aquellas en donde existe un daño en el corazón o en vasos sanguíneos ocasionado principalmente por obstrucciones que impiden que la sangre fluya de manera natural. Entre ellas se encuentran las cardiopatías coronarias, reumáticas o congénitas, enfermedades cerebrovasculares, arteriorpatías periféricas y trombosis (OMS, 2007).
Datos de la Organización Mundial de la Salud registraron en el año 2005 un total de 17.5 millones de muertes, lo cual representa el 30% de las muertes registradas en el mundo. Si no se toman las debidas acciones preventivas, se pronostica que para el año 2015 alrededor de 20 millones de personas morirían cada año a causa de ECV, principalmente por infartos y accidentes vasculares cerebrales (OMS, 2007) Esto indica un incremento constante y es en la actualidad la primera causa de muerte a nivel mundial así como también en México. (INEGI, 2006).
2.1.2.1 ATEROESCLEROSIS Y ESTRÉS OXIDATIVO
La ateroesclerosis es la principal causa para la patogénesis de las ECV y esta asociada con el colesterol y el metabolismo de lípidos. La ateroesclerosis se define como cambios degenerativos en donde existe una infiltración de depósitos de grasa en las paredes de las arterias (Jain et al., 2007).
El proceso aterogénico inicia cuando el contenido de colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se acumula en la pared íntima produciendo daño en las arterias.
(Maxfield y Tabas, 2005; Jain et al.,2007). Cuando los niveles de LDL aumentan en plasma, se infiltran en la capa íntima de la pared arterial de tal manera que excede la capacidad de eliminación y son retenidas en la matriz extracelular provocando una respuesta inflamatoria. La modificación de las LDL principalmente debida a la oxidación producida por el ataque enzimático y no enzimático, libera fosfolípidos oxidados que pueden activar las células endoteliales (Hansson et al., 2006). Los macrófagos derivados de los monocitos y linfocitos T ingieren las partículas de LDL oxidadas (LDL-ox). Si el colesterol que proviene de las partículas LDL no puede movilizarse hacia afuera de la célula se acumula como partículas citosólicas lo que le otorga a las células el aspecto espumoso característico de la aterosclerosis (Maxfield y Tabas, 2005). Como se observa en la Figura 4 la primera lesión en la ateroesclerosis son las llamadas estrías de grasa y no producen ninguna obstrucción o síntoma. Sin embargo a la estría grasa le sigue la lesión intermedia, conformada por capas de macrófagos, de células musculares lisas y matriz extracelular y al aumentar de diámetro disminuye el calibre de la arteria e interfiere con el flujo normal de sangre (Jain et al., 2007). Además, las placas ateromatosas pueden sufrir necrosis, calcificación, ulceración y fisuras, lo cual puede resultar en eventos trombóticos y la oclusión parcial o total del vaso sanguíneo (Lusis, 2000).
Por otro lado, existen otros factores tales como la edad, sexo, obesidad, hipertensión arterial, tabaquismo, diabetes mellitus, inactividad física y estrés que pueden alterar la función endotelial (Cheng et al., 2002; Van Gaal et al, 2006). Estos factores están asociados a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés). El desbalance entre la producción de ROS y la defensa antioxidante provoca un
daño orgánico conocido como estrés oxidativo. Las principales especies reactivas del oxígeno son: el radical superóxido (O2"'), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO-). Las ROS están relacionados con el proceso aterogénico al dañar la función vascular por diversos mecanismos. Primero, los radicales hidroxilo dañan directamente el núcleo y la membrana celular. Segundo, los ROS interactúan con los mediadores endógenos formados en las células endoteliales y tercero, provocan la peroxidación en cadena que altera la membrana de las células del endotelio vascular y oxida las lipoproteínas de baja densidad (LDL), uno de los mediadores clave en la aterosclerosis (Bonomini et al., 2008)
Para contrarrestar el daño provocado por las ROS, nuestro organismo posee un sistema enzimático de detoxificación de ROS, como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), sistema glutatión (GSH) y sistema tioredoxin (Nedelijkovic et al., 2003). Estas enzimas actúan específicamente sobre determinadas especies reactivas. Así, la superóxido dismutasa transforma al 02"' a O2 y H2O2, la catalasa transforma al H2O2 en O2 y agua. El GSH interviene en la donación de electrón para eliminar los radicales peróxido incluyendo el peróxido de hidrógeno, esta reacción es catalizada por la GSH-Px generando glutatión oxidado (GSSG), el cual es reducido por la enzima GSH-Red usando NADPH como electrón donador (Wu y Juurlink, 2001; Fahey y Talalay, 1999). Además el glutatión es esencial para la regeneración del radical tocoferoxil a tocoferol, el cual forma parte del sistema de defensa de nuestro organismo. La tioredoxina reductasa participa en la restauración de los niveles de GSH reducido adquiriendo por ello propiedades antioxidantes, además diversos estudios han demostrado el papel cardioprotectivo de la familia tioredoxina (Das, 2004, Malik et al., 2006).
Mukherjee et al., 2008 concluyeron que el selenio y sulfurafano contenidos en el brócoli inducen la activación del ciclo redox de la familia de enzimas tioredoxinas. Existen otras enzimas, tales como las quinonas reductasas y hemo oxigenasa, que pueden prevenir la formación de ROS por ciclado de electrones (Bonomini et al., 2008).
íntima Media
Figura 4. Proceso Aterogénico (Libby, 2002)
2.2 Compuestos naturales con actividad hipocolesterolémica
Diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado eficientemente el uso de compuestos naturales para la prevención o intervención en las enfermedades cardiovasculares, especialmente aquellas relacionadas con la hipercolesterolemia.
En un estudio in vitro realizado por Chang et al., (2001) mostró que algunos derivados de taninos aislados de hierbas tradicionales chinas, inhiben la HMG CoA reductasa, enzima clave en la biosíntesis de colesterol. Existen fármacos que inhiben esta enzima, como las estatinas, sin embargo su uso prolongado puede ocasionar daño hepático o renal (Bhardwaj y Chalasani, 2007; Jain et al., 2007).
Singh et al., (2004) realizaron un estudio in vitro con extractos de ajo (Allium sp) en donde además de la inhibición de la HMG CoA reductasa, se encontró la inhibición de la enzima 4 a-metil oxidasa que cataliza las reacciones entre el paso de lanosterol a colesterol. Si bien se han probado compuestos fenólicos de té verde y negro, vino tinto y jugo de uva, extractos fenólicos de Fagopyrium esculentum Moench para reducir el colesterol en plasma(Vinson et al., 1998, 2001; Lin et al., 2008), también se han estudiado el efecto de la fibra utilizando como mecanismo de acción, la disminución en la absorción de colesterol o interrumpiendo la circulación enterohepática de los ácidos biliares (Hsu et al., 2006; Alien et al., 2004; Nicolle et al., 2003, 2004 ). Los fitoesteroles son otros compuestos naturales con estructura similar al colesterol pero con una absorción intestinal menos eficiente. Al consumir en la dieta éstos compuestos ayudan a disminuir el colesterol plasmático y/o hepático, interviniendo en el desplazamiento del colesterol de las micelas por competición física, provocando una disminución en su absorción y un incremento en la excreción de colesterol (Yokohama 2004; Hayes, 2002, Hu et al., 2006).
En la Tabla 1 se muestran otras investigaciones con el mismo enfoque del presente estudio pero con diversos compuestos activos que han demostrado la disminución de colesterol total y LDL, así como el aumento de las HDL.
Tabla 1. Estudios relacionados en la investigación de la disminución de colesterol.
REFERENCIA COMPUESTO
ACTIVO FUENTE TIPO DE
ESTUDIO
DURACIÓN
ESTUDIO RESULTADO
Lin et al, 2008a Terpenoides y Extractos fenólicos
Semillas de Azucena de porcelana (Alpinia
serumbet)
In vivo con Hámster
sirios 8 semanas
Disminución de colesterol total, C-LDL y triglicéridos en plasma y aumento de C-HDL,
disminución de colesterol total y triglicéridos hepáticos
Lin et al., 2008b Extractos fenólicos Buckwheat (Fagopyrium
esculentum Moench) In vivo con Hámster
sirios 28 días Disminución de colesterol total y triglicéridos en plasma
Wilson et al.,
2007 Orizanol y Acido
ferúlico Aceite de salvado de arroz In vivo con Hámster sirios 10 semanas Disminución de colesterol total, C-LDL y triglicéridos en plasma y aumento de C-HDL
Riss et al., 2007 Ficocianina enriquecida
con selenio Alga Espirulina (Spirulina
platensis) In vivo con Hámster
sirios 12 semanas Disminución de colesterol total, con aumento en la capacidad antioxidante en plasma.
Fki et al., 2007 Extractos fenólicos (hidroxitirosol)
Agua de desecho de la elaboración de aceite de
oliva
In vivo con Ratas
Wistar 16 semanas Disminución de colesterol total, C-LDL, aumento de C-HDL en plasma Cho et al., 2007 Fibra soluble Semillas de cassia tora In vivo con Ratas
Sprague-Dawley 5 semanas Disminución de colesterol total y aumento de C HDL en plasma
Adams et al.,
2006 Mezcla de fitoquímicos Mezcla de vegetales verdes
y amarillos In vivo con Ratón y
ratón transgénico 16 semanas Disminución de colesterol total en plasma Hu et al., 2006 Ergosterol y ácido
nicotínico Champiñones (Pleurotus
citrinopileatus) In vivo con Hámster 49 días Disminución de colesterol total y triglicéridos en plasma
Hsu et al, 2006 Fibra insoluble Zanahoria In vivo con Hámster
sirios 30 días Disminución de colesterol total y triglicéridos en plasma y colesterol total en hígado
Continuación Tabla 1. Estudios relacionados en la investigación de la disminución de colesterol.
REFERENCIA COMPUESTO
ACTIVO FUENTE TIPO DE
ESTUDIO
DURACIÓN
ESTUDIO RESULTADO
Carr et al., 2005
Fitoesteroles y
Policosanoles Sorgo rojo In vivo con Hámster
sirios 4 semanas
Disminución de C- LDL y aumento de C-HDL en plasma, así como disminución de coelsterol
total y triglicéridos hepáticos Ausman et al,
2005.
gama orizanol, tocotrienoles, tocoferoles, fitoesteroles
Aceite de salvado de arroz In vivo con Hámster
sirios 6 semanas Disminución de colesterol total y C-LDL en plasma
Nicolle et al., 2004
Carotenoides, Vitamina
E y Fibra Zanahoria liofílizada In vivo con Ratones
C57BL/6J 4 semanas Disminuyeron el colesterol total y triglicéridos en plasma e hígado
Chau et al.,
2004 Fibra insoluble Piel de Naranja (Citrus
sinensis L. cv.) In vivo con Hámster
sirios 30 días Disminución de colesterol total y triglicéridos en plasma y coelsterol total en hígado Suido et al.,
2002 Mezcla de fitoquímicos Bebida a base de diversas
frutas y verduras In vivo con
Humanos 10 semanas Disminución del colesterol total y del C-LDL plasmático.
Vinson et al.,
2001 Compuestos fenólicos Vino Tinto, Vino tinto sin
alcohol y jugo de uva In vivo con Hámster
sirios 10 semanas Disminución del colesterol total y del C-LDL plasmático.
Leontowicz
et al., 2001 Fibra soluble Betabel y manzana In vivo con Ratas
Wistar 40 días Disminución de colesterol total y C-LDL en plasma y colesterol total en hígado Vinson et al.,
1998 Flavonides y vitamina C Naranjo amargo (Citrus
aurantium) In vivo con Hámster
sirios 4 semanas Disminución de colesterol total y C-LDL en plasma e índice aterogénico
Murashima
etal., 1994 Sulfurafano Germinado de brócoli In vivo con
Humanos 7 días En hombres se presentó una disminución de colesterol total y C-LDL en plasma.
Chang et al.,
2001 Taninos Hierbas chinas In vitro con Células
Vero . . . .
Actividad inhibitoria de HMGCoA reductasa en los compuestos proantrocianidina y 1,2,3,6-
tetra-O-galloil-B-D-glucosa.
2.3 Brócoli y Germinado de Brócoli
2.3.1 Composición química del brócoli y germinado de brócoli.
El brócoli (Brassica olerácea L. variedad Itálica) pertenece a la familia Cruciferae, es originario del Mediterráneo, principalmente de Italia e introducida a Estados Unidos en
1925 por inmigrantes italianos.
El brócoli es uno de los vegetales más ricos en vitamina C (52.9mg/100g), p-caroteno (0.81mg/100g), luteína (0.68mg/100g) y a-tocoferol (0.47mg/100g) y contenido fenólico de (63.4mg/100g) (Singh et al., 2007) También contiene fitoesteroles como el p- sitoesterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol y avenasterol, en concentraciones de 285, 67, 8, 3 y 2 mg/ Kg peso fresco, respectivamente (Piironen et al., 2003). Además de otros minerales como el selenio, el cual se encuentra en mayor proporción en forma de selenio-metil-seleniocisteína (Lyi et al., 2005) y compuestos bioactivos como el sulfurafano.
El germinado de brócoli, son los brotes de semillas en etapa de crecimiento y concentran un valor más elevado de nutrientes, vitaminas y minerales, en especial los glucosinolatos que son de 10 a 100 veces más altos que cuando el vegetal está en su etapa madura (Fahey et al., 1997). En la Tabla 2 se muestra el contenido nutrimental. Además, el germinado de brócoli ha sido utilizado en diferentes estudios clínicos por su alto contenido de glucosinolatos específicamente glucorafanina, y su metabolito secundario el isotiocianato sulfurafano (Shapiro et al., 2001, 2006).
Tabla 2. Comparación de la composición nutrimental del brócoli maduro y germinado.
Marca BroccoSprouts®
(1 porción = -1/2 taza = 28g) Brócoli Crudo*
(1 porción = 1 taza picada
= 88.0g)
*Brócoli Cocido**
(1 porción = 0.5 taza picada
= 78.0g)
Nutriente Valor Unidad Valor Unidad Valor Unidad
Energía 16 Calorías 24.64 Calorías 21.84 Calorías
Proteína 1.4 g 2.622 g 2.324 g
Carbohidrato 1.9 g 4.611 g 3.947 g
Grasa Total 0 g 0.308 g 0.273 g
Grasa Saturada 0 g ND g ND g
Grasa monoinsaturada 0 g ND g ND g
Grasa Poliinsaturada 0 g ND g ND g
Colesterol 0 mg 0 g 0 g
Fibra Dietética 1.1 g 2.64 g 2.262 g
Vitamina A 561 UI 1356.96 UI 1082.64 UI
Carotenos 308 UI ND ND
Tiamina 0.04 mg 0.057 mg 0.043 mg
Riboflavina ND mg 0.105 mg 0.088 mg
Niacina 0.9 mg 0.561 mg 0.448 mg
Vitamina B6 0.07 mg 0.14 mg 0.112 mg
Folatos 0 mcg 62.48 mcg 39 mcg
Vitamina B12 0.1 mcg 0 mcg 0 mcg
Vitamina C 20 mg 82.016 mg 58.188 mg
Vitamina E 3.8 mg 1.461 mg 1.318 mg
Calcio 26 mg 42.24 mg 35.88 mg
Fósforo 39.4 mg 58.08 mg 46.02 mg
Magnesio 16.9 mg 22 mg 18.72 mg
Hierro 0.22 mg 0.774 mg 0.655 mg
Zinc ND mg 0.352 mg 0.296 mg
Cobre ND mg 0.04 mg 0.034 mg
Sodio 2.88 mg 23.76 mg 20.28 mg
Vitamina Kl 37.8 mcg 0.471 mg 0.396 mg
Alcohol 0 g ND ND
Humedad 25 g ND ND
Selenio 14 mcg 2.64 mcg 1.482 mcg
* US Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 2001. USDA Nutrient Datábase for Standard Reference, Reléase 14. Nutrient Data Laboratory Home Page, http://nal.usda.gov/fnic/foodcomp.
** Cocido, escurrido, sin sal.
2.3.2 Compuestos activos del germinado de brócoli: glucosinolatos y sulfurafanos.
Los glucosinolatos son conocidos sólo en pocas especies, se reportan casi exclusivamente en el orden de las Caparales que contienen 15 familias, incluyendo la Brassicaceae, Capparaceae y Caricaceae. Existen aproximadamente 120 glucosinolatos que comparten la misma estructura química. Como se observa en la Figura 5 los glucosinolatos son (3-
aminoácidos y un sulfuro unido a una molécula de P-D-glucopiranosa. (Halkier et al., 2006)
OH o-
OH P~Í^o
h
o
R
Figura 5. Estructura del glucosinolato (Talalay y Fahey, 2001.)
Los glucosinolatos son solubles en agua, amónicos, no volátiles y estables al calor, se considera que los glucosinolatos per se no poseen una actividad biológica significativa (Fahey y Talalay, 1999). Se mantienen químicamente estables hasta que hacen contacto con la enzima mirosinasa (tioglucosidasa glucohidrolasa EC 3:2:2:1) (Rask et al, 2000).
y los principales productos de la hidrólisis de los glucosinolatos son los isotiocianatos.
La glucorafanina (4-metilsulfinilbutil) es el principal glucosinolato presente en el germinado de brócoli (Fahey et al., 1997). Fue inicialmente aislado del rábano (Raphanus sativus) por Ivanovics y Horvath (1947). Posterior a esto, sólo se ha identificado en la familia de las Cruciferas, principalmente en el género Brassica (brócoli, germinado de brócoli, coles de Bruselas, coliflor, repollo, entre otros) (Mithen et al., 2000). La hidrólisis de éste glucosinolato es la aglicona sulfurafano. El sulfurafano es metabolizado en los mamíferos principalmente por la ruta del ácido mercaptúrico. En la Figura 6 se muestra como la mirosinasa cataliza la hidrólisis de glucorafanina a sulfurafano y éste es metabolizado por conjugación con la glutationa (catalizada por la glutationa S- transferasa), para remover los residuos y-glutamil y de glicina actúan las enzimas y- glutamil transferasa y cisteinilglicinasa respectivamente. Finalmente se produce una N- acetilación por la JV-acetiltransferasa para producir JV-acetilcisteína (acido mercaptúrico), todos ellos ditiocarbamatos. (Kensler et al., 2005; Shapiro et al., 2006)
H20 glucosa MVROSIKASA
^..L^ Glucorafanina
. N=C = S Sulfurafano
(Glutatión) Gli>-Cys-Gly R— ^=C = K KH (Sulfurafano)
3lu-Cys-Gly í Acido Müfcapiurico)
Cyj-Gty S Cys S S Cys-MAc H | CJ3SS8 H I _ NA: H I R—N—C = S .-—N - - .' R— K— c. = &
Ditiocarbamatos
y
Figura 6. Metabolismo del Sulfurafano (Adaptado de Kensler, 2005)
Bheemreddy y Jeffery (2007) purificaron glucorafanina de semillas de brócoli y se les proporcionó a ratas F344 en forma oral e intravenosa. Como se observa en la Figura 7 el resultado de esta investigación reveló que la glucorafanina se absorbe de manera intacta, pasa por la circulación enterohepática y se convierte en su forma reducida como glucoerucina en el cuerpo. La cantidad de productos urinarios fue mayor cuando la dosis se administró vía oral en comparación con la dosis vía intravenosa, esto sugiere que en ausencia de mirosinasa la glucorafanina puede ser hidrolizada por la microflora intestinal.
GP.ip HÍGADO
GP po NTESTINO
GP, GR, SF, ER, SF-NAC, ER-NAC en orina
Figura 7. Esquema del Metabolismo de la glucorafanina propuesto por Bheemreddy y Jeffery, 2007.
2.3.3 Bioactividad de los sulfurafanos en la salud 2.3.3.1 Actividad anticancerígena y antioxidante
El sulfurafano es un potente inductor de las enzimas fase II (glutatión peroxidasa GSH- Px, glutatión S-transferasa GST, NAD(P):quinona reductasa y UDP glucoroniltransferasa) sin inducir a las enzimas de fase I (Fahey et al., 1997), activando los elementos de respuesta a antioxidante (ARE) a través de Keap 1 y Nrf2. El sulfurafano interactúa de manera directa con los grupos sulfidrilos de Keap 1, causando que se libere el Nrf2. Además activa la ruta de la proteína quinasa mitogen activada (MAPK), que ocasiona la fosforilación de Keapl y la liberación de Nrf2. Al liberar el Nrf2, entra al núcleo en donde induce la respuesta al gen ARE y por consiguiente la expresión de las enzimas de fase II. (Fahey y Kensler, 2007; Talalay y Fahey, 2001) Existen otros mecanismos por los cuales el sulfurafano es un agente quimioprotector, inhibe la polimerización de tubulina lo cual genera la interrupción del ciclo celular durante la mitosis, además mantiene el check point 2 quinasa e inhibe la actividad de la histona deacetilasa, que están correlacionadas con la inducción de apoptosis (Myzak y Daswood, 2006). Adicionalmente, el sulfurafano previene la tumorogénesis de cáncer de piel interviniendo en la etapa de promoción, debido a la inhibición de la enzima ornitina descarboxilasa (Gills et al., 2006).
Dinkova-Kostova et al., (2006) concluyeron que la aplicación tópica de sulfurafano (1 umol) contenido en extractos de germinado de brócoli, disminuye en un 50% la formación de tumores de piel en ratones.
Por otra parte, al inducir las enzimas de fase II se incrementan los niveles de glutatión (GSH) y éste incremento ayuda a la defensa antioxidante (Fahey y Talalay, 1999). Wu y Juurlink (2001) investigaron en células del músculo liso aórtico de ratas hipertensas, el efecto del sulfurafano sobre el sistema glutatión dañado así como el estrés oxidativo y concluyeron que las alteraciones celulares en éstas células se pueden restaurar con la acción de sulfurafano.
19
Existe otro sistema endógeno antioxidante, la familia de las enzimas tioredoxinas. En un estudio reciente, Mukherjee et al., (2008), concluyeron que el consumo de brócoli mejoró la función ventricular, redujo la apoptosis de las células cardiacas y el tamaño del infarto en ratas que consumieron lml de extracto de brócoli durante 30 días, debido a que el sulfurafano induce una serie de señales celulares de supervivencia y la inducción de genes y proteínas en la familia tioredoxinas, las cuales están involucradas en la protección cardiaca en nuestro organismo (Das, 2004).
Li et al., (2008) investigaron la sinergia entre los extractos de germinado de brócoli ricos en sulfurafanos y el selenio en células hepáticas inmortalizadas (HHL-5), concluyendo, que éstos compuestos por sí solos pueden regular la inducción y la actividad de la enzima tioredoxina reductasa solo 2 veces aproximadamente, sin embargo la sinergia de éstos dos compuestos pueden aumentar la inducción 3.7 veces y la actividad enzimática 5 veces más.
2.3.3.2 Actividad Bactericida
La infección por Helicobacter pylori es un problema de salud mundial, afecta alrededor del 50% de la población humana. La gastritis, úlcera péptica y cáncer gástrico están asociados con la infección de ésta bacteria (Torres et al., 2005). El sulfurafano posee actividad bactericida contra H. pylori in vitro y bloquea la formación de tumores gástricos debido a la inducción de las enzimas de Fase II y enzimas antioxidantes (Fahey et al., 2002) Así también, el consumo de germinado de brócoli, rico en sulfurafano, erradica temporalmente la infección por H. pylori (Galán et al., 2004) (Yanaka et al., 2005).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Caracterización del germinado de brócoli y extractos.
3.1.1 Composición química proximal del germinado de brócoli
El germinado de brócoli utilizado para la presente investigación fue donado por Alimentos Lee® (Monterrey, N.L., México) y la semilla utilizada para la obtención del germinado fue proporcionada por la Marca Broceo Sprouts® (Baltimore, MD., E.U.A).
Los componentes se determinaron en porcentaje base seca y base húmeda. La humedad y cenizas se determinaron utilizando los métodos analíticos No. 925.1 y 923.03, respectivamente (AOAC, 1990). El contenido de proteína se determinó mediante el procedimiento estándar de la AOAC No. 978.02, utilizando el valor de 6.25 como factor de conversión de nitrógeno a proteína (AOAC, 1990). El contenido de grasa total fue determinado mediante la extracción continua utilizando como solvente éter de petróleo por un período de 6 horas en un equipo de extracción Goldfisch Labconco® (AOAC, 1990). El contenido de fibra cruda se determinó de acuerdo al procedimiento establecido por la AOAC (1998) y el contenido de carbohidratos se determinó por método diferencial.
En la Tabla 3 se puede observar los resultados de la composición química proximal, los cuales se utilizaron para ser considerados en la elaboración de las dietas experimentales.
Tabla 3. Composición química proximal del germinado de brócoli utilizado durante el estudio in vivo.
% Base Seca % Base Húmeda Método analítico
Humedad NA 91.85 JAOAC 925.10
Cenizas 26.91 2.67 JAOAC 923.03
Proteínas 15.14 1.13 JAOAC 978.02
Grasas 6.99 0.57 Goldfisch Labconco
Fibra Cruda 18.88 1.54 AOAC (1998)
Carbohidratos 32.88 2.24 Diferencial
3.1.2 Extractos del germinado de brócoli enriquecidos con glucosinolato y sulfurafano.
Los extractos enriquecidos con glucosinolato y con sulfurafano fueron donados por el Dr.
Jed Fahey de la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD, E.U.A). La cantidad de glucosinolato y sulfurafano contenido en el extracto del germinado de brócoli, fue determinada por el Dr. Jed W. Fahey y los resultados fueron de 388 umol de glucosinolato por gramo de extracto y 70 umol de sulfurafano por gramo de extracto.
3.2 Estudio in vivo
3.2.1 Elaboración de dietas experimentales
Como se puede observar en la Tabla 4, se investigaron seis tratamientos que consistieron en un dieta rica en colesterol (0.1%) y manteca animal (10%), el primer tratamiento se consideró control negativo, el segundo tratamiento, consistió en la adición de simvastatina (Marca Zocor®) con una dosis de 15 (xmol/Kg de alimento y se consideró control positivo (Morand et al., 1997). El tercer y cuarto tratamiento consistieron en una dieta con germinado de brócoli en dosis equivalentes a 2 y 20 umol de glucosinolato por día, respectivamente. Las dosis consideradas para los tratamientos con extractos ricos en glucosinolato y sulfurafano fueron equivalentes a 20 umol de sulfurafano por día. Los demás componentes de las dietas se calcularon de manera que fueras isocalóricas, isoproteicas e isofibrosas, tomando como base la dieta semipurificada AIN-93. Para la elaboración de las dietas experimentales, el germinado de brócoli fue congelado a -20 para posteriormente ser liofilizado (Liofüizador Marca VirTis® Freeze mobile SP Industry Inc. Gardiner, N.Y., E.U.A). El germinado de brócoli liofilizado se pulverizó utilizando una licuadora (Marca Osterizer®). La simvastatina (Marca Zocor®) en tabletas de 20mg. se pulverizó utilizando un mortero para posteriormente ser incorporada a la dieta y fue adquirida así como los demás ingredientes de las dietas en tiendas locales.
Tabla 4. Componentes de las dietas utilizadas en el estudio in vivo, expresados en porcentaje.
INGREDIENTE CONTROL
NEGATIVO CONTROL
POSITIVO
DOSIS BAJA GERMINADO EN
DOSIS ALTA GERMINADO EN
EXTRACTO RICO GLUCOSINOLATO EN
EXTRACTO RICO EN SULFURAFANO
CASEÍNA 1 20 20 20 19 20 20
METIONINA2 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20
ACEITE DE MAÍZ 5 5 5 5 5 5
MANTECA
ANIMAL 10 10 10 10 10 10
COLESTEROL3 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
CELULOSA4 3.50 3.49 3.50 2.82 3.50 3.50
SACAROSA 10 10 10 9 10 10
ALMIDÓN5 46.55 46.55 46.19 45.59 46.04 43.69
VITAMINAS6 1 1 1 1 1 1
MINERALES7 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50
PELETIZADOR 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
GERMINADO DE
BRÓCOLI 0 0 0.36 3.60 0 0
GLUCOSINOLATO 0 0 0 0 0.51 0
SULFURAFANO 0 0 0 0 0 2.86
SIMVAST ATINA 0 0.0064 0 0 0 0
AIN Caseína pura alta en nitrógeno. MP Biomedicals, Inc. (Ohio, E.U.A)
2 Metionina
3 Colesterol grado ultrapuro. Amresco® (Ohio, E.U.A)
4 AIN Alphacel Non-Nutritive Bulk. MP Biomedicals, Inc. (Ohio, E.U.A)
5 Fécula de Maíz. Marca MAIZENA®
6 AIN 76 Mezcla de vitaminas. MP Biomedicals, Inc. (Ohio, E.U.A)
7 AIN 76 Mezcla de minerales. MP Biomedicals, Inc. (Ohio, E.U.A)
Los ingredientes secos se pesaron (Báscula EQ-4HP Marca TOR REY®) y se añadieron a un tazón con capacidad de cinco galones, se mezclaron utilizando una mezcladora Hobart® equipada con aditamento tipo paleta a baja velocidad hasta que se integraron los ingredientes. Posteriormente se añadieron el aceite vegetal y la manteca animal previamente derretida a temperatura ambiente. Para incorporar el germinado de brócoli liofilizado, se tomó una porción de la mezcla y se incorporó con el liofilizado, ya integrado se regresó a la mezcladora y se continuó batiendo durante cinco minutos más.
Finalmente se agregó agua para formar una masa uniforme, se tomaron porciones y se extendieron en una mesa de acero inoxidable limpia, se cortaron piezas de 1 cm. de espesor y se colocaron en charolas para ponerlas en el horno (Marca Electrolux®) donde se secaron con aire caliente a 50°C por 15 horas. Los extractos de glucosinolato y sulfurafano se mezclaron con el agua para integrarlos a la mezcla.
El pellet alimenticio se guardó en bolsas de polietileno con cierre hermético (Marca Ziploc®) y se mantuvo en congelación a -4°C. Antes de ser utilizadas se pasaron a un refrigerador ajustado a 4°C para ser proporcionadas a los hamsters.
3.2.2 Animales experimentales
Un total de 48 Hamsters adultos Sirios Dorados, 24 hembras y 24 machos de 16 semanas de edad con un peso aproximado de lOOg fueron adquiridos del bioterio de la Escuela de Medicina del Tecnológico de Monterrey. Los animales se bloquearon por sexo y peso inicial en orden ascendente y se diferenciaron con una muesca en la oreja y se asignaron al azar en cuatro bloques de 6 hamsters cada uno. Los protocolos de experimentación con animales de laboratorio se hicieron según las especificaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio. Además se incluyeron 5 hamsters (3 hembras y 2 machos) que no recibieron una dieta hipercolesterolémica para ser considerados como controles básales.
Las condiciones ambientales dentro del bioterio fueron controladas, la temperatura a 20°C, la humedad relativa a 66% y se aplicaron ciclos de 12 horas luz/oscuridad. El agua y alimento se proporcionaron ad libitum durante 7 semanas.
Al término del Estudio in vivo, los hamsters fueron anestesiados con éter etílico (Desarrollo de Especialidades Químicas, San Nicolás de los Garza, N.L., México) y sacrificados mediante punción intracardiaca.
3.2.2.1 Estudio metabólico prelimiar
Existe poca información sobre la absorción y metabolismo del glucosinolato y sulfurafano en hamsters. Con el fin de investigar si éstos metabolizan los compuestos, se realizó una prueba metabólica durante 3 días, en donde se mantuvieron 20 hamsters, 10 hembras y 10 machos, enjaulas metabólicas de acrílico diseñadas para coleccionar heces y orina y minimizar la pérdida de alimento.
