CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
EFECTO DEL QUITOSANO SOBRE LA MEMBRANA CELULAR DE
Rhizopus stolonifer
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS
YAUTEPEC, MORELOS. 2008 DIRECTORES DE TESIS:
DR. MIGUEL G. VELÁZQUEZ DEL VALLE DRA. MARÍA G. GUERRA SÁNCHEZ
P R E S E N T A :
JUAN GARCÍA RINCÓN
El presente trabajo fue realizado bajo la dirección del Dr. Miguel G. Velázquez del Valle y la Dra. Maria G. Guerra Sánchez, en el departamento de Fitopatología del Centro de Desarrollo del Productos Bióticos y en el departamento de Bioquímica Microbiana de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, ambos pertenecientes al Instituto Politécnico Nacional.
i Reconocimiento
Al apoyo recibido por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a través de una beca de Maestría. A través de la Secretaria de Investigación y Posgrado, la beca otorgada por el Programa Institucional de Formación de Investigadores, durante la realización de este trabajo.
A los honorables miembros del Comité Tutoral:
Dr. Miguel G. Velázquez del Valle.
Dra. Maria G. Guerra Sánchez.
Dra. Silvia Bautista Baños.
Dra. Laura L. Barrera Necha.
Dra. Kalina Bermúdez Torres.
Dr. Jorge Martínez Herrera.
ii
Con mucho cariño:
Para mi esposa Alejandrina Barcenas y mi hijo Juan Manuel García Barcenas por la fortaleza que me brindaron a lo largo del presente trabajo.
A mis padres:
Anselma Rincón y Pablo García.
Por su apoyo incondicional y a quienes sin su apoyo no estaría escribiendo esta tesis.
A mis hermanas:
María Teresa y María de la Luz.
Por enseñarme el valor de las cosas, por compartir los momentos más tristes y felices de mi vida.
A mis abuelitos:
Andrés García †, Sidronio Rincón y Barbara Giles.
Por darme un poco de su tiempo y compartir sus historias conmigo.
A mi sobrina:
Mitzi Alondra Vázquez García.
Por haberme dado alegría con sus travesuras.
iii Agradecimientos
Al Dr. Miguel G. Velázquez del Valle y a la Dra. Maria G. Guerra Sánchez, por brindarme fundamentos básicos en la micología, su paciencia por enseñarme y su asesoría para la realización de este trabajo.
A la Dra. Silvia Bautista Baños por comprenderme en los momentos más difíciles, por sus consejos optimistas y por todo el apoyo que recibí, Gracias Dra. Silvia.
Al Dr. Antonio Peña Díaz, por facilitarme las instalaciones de su laboratorio en el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM y por las discusiones que teníamos todas las tardes a cerca del Rhizopus y del quitosano.
Martha Calahorra y Gloria Rosas por ayudarme en los protocolos experimentales y por contagiarme su entusiasmo todos los días.
Al Dr. René Arzuffi por su apoyo ético, académico y laboral, y por su tasita de café que me invitaba todos los días.
A mi comité revisor de tesis: Dra. Silvia Bautista Baños, Dra. Laura L. Barrera Necha, Dra.
Kalina Bermúdez Torres y Dr. Jorge Martínez Herrera, por sus contribuciones experimentales y gramaticales para la buena redacción del presente trabajo y por su disposición de ayudarme siempre.
A mis amigos: Margarito Herrera, Ángel Romero, Rodolfo Figueroa, Maria Luisa, Rita, Elizabet Flores, Delfines, Humberto Flores, Emmanuel Salazar, Julio Chávez, Miguel A. Rojas, Leo Martínez y Mónica Valdez, por su disposición de ayudarme en cualquier momento.
A CONACYT, PIFI y Beca Tesis, por la beca otorgada durante la Maestría.
iv
“Si he podido ver a lo lejos es por que me he apoyado en los hombros de unos gigantes.”
I. Newton.
I ÍNDICE
TEMA PÁGINA
ÍNDICE DE FIGURAS 1
ÍNDICE DE CUADROS 1 RESUMEN 2
ABSTRACT 3
INTRODUCCIÓN I.- ANTECEDENTES 1.1.- Importancia nutritiva de los productos hortofrutícolas 4
1.2.- Pérdidas de los productos hortofrutícolas 5
1.3.- Enfermedades de los productos hortofrutícolas 6 1.4.-Rhizopus stolonifer agente causal de pudriciones postcosecha 7 1.5.- Estrategias generales de control de R. stolonifer 9
1.6.-Quitosano, compuesto natural con potencial para controlar a R. stolonifer 10
1.7.- Mecanismos de acción del quitosano 12
1.8.- Estructuras celulares externas de los hongos 13
1.8.1.- Pared celular 13
1.8.2.- Membrana celular 14
1.8.2.1.- Permeabilidad y transporte 15
1.8.2.2.- Enzima H+-ATPasa 17
II.- JUSTIFICACIÓN 20
III.- OBJETIVOS 3.1.- OBJETIVO GENERAL 21
3.2.- OBJETIVOS PARTICULARES 21
IV.- HIPÓTESIS 21
V.- MATERIALES Y MÉTODOS 5.1.-Diagrama general de trabajo 22
5.2.-Material biológico 23
5.3.- Medios de cultivo sin y con quitosano 23
5.4.- Selección de las condiciones de crecimiento 23
II
5.5.- Determinación de las características morfológicas de R. stolonifer 24
5.6.- Cinéticas de crecimiento 24
5.7.- Evaluación de los cambios de pH en el medio de cultivo 24
5.8.- Determinación de la salida de K+ de las células de R. stolonifer 24
5.9.- Evaluación de la permeabilidad de la membrana celular 25
5.10.- H+-ATPasa 26
5.10.1.- Obtención de membranas celulares por centrifugación diferencial 26 5.10.2.- Cuantificación de las proteínas totales en la fracción membranosa 26 5.10.3.- Identificación y determinación del peso molecular de la enzima H+-ATPasa por Western blot 27
5.10.4.- Actividad de la enzima H+-ATPasa 29
VI.- RESULTADOS 6.1.- Características morfológicas de R. stolonifer 30
6.2.- Cinéticas de crecimiento 33
6.3.- Cambios de pH en el medio de cultivo 34
6.4.- Salida de K+ de las células de R. stolonifer 35
6.5.- Permeabilidad de la membrana celular 36
6.6.- H+-ATPasa 36
6.6.1.- Identificación y determinación del peso molecular de la enzima H+-ATPasa por Western blot 36
6.6.2.- Actividad de la enzima H+-ATPasa 39
VII.- DISCUSIÓN 41
VIII.- CONCLUSIONES 48
IX.- PERSPECTIVAS 49
X.- BIBLIOGRAFÍA 50
APÉNDICE 59
1 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.- Estructuras anatómicas de R. stolonifer. 8
Figura 2.- Ciclo biológico de R. stolonifer. 9
Figura 3.- Estructura de las macromoléculas, a) Quitina, b) Quitosano. 11
Figura 4.- Tipos de H+-ATPasa en diferentes compartimentos celulares. 18
Figura 5.- Esquema general del trabajo experimental. 22
Figura 6.- Microfotografías de R. stolonifer (40X), a 72 h de incubación a 28ºC. 31
Figura 7.- Fotografías de medios de cultivos de R. stolonifer a 72 h de incubación a 28ºC. 32
Figura 8.- Cinética de crecimiento de R. stolonifer, incubado sin y con quitosano. 33
Figura 9.- Cambios de pH en el medio de cultivo de R. stolonifer, incubado sin y con quitosano. 34
Figura 10.- Salida de K+ de las células de R. stolonifer en presencia de quitosano. 35
Figura 11.-Curva estándar de K+. 35
Figura 12.- Microfotografía de R. stolonifer a 40X. Adsorción de la piranina por la matriz extracelular del micelio. 36
Figura 13.- Perfil electroforético de proteínas de membrana de R. stolonifer sin y con quitosano. 37
Figura 14.- Inmunodetección de los polipéptidos de la H+-ATPasa de R. stolonifer. 38
Figura 15.- Determinación del peso molecular de los polipéptidos de la H+-ATPasa de R. stolonifer. 39
ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1.- Enfermedades poscosecha ocasionadas por hongos. 6
Cuadro 2.- Proteína total, actividad enzimática total y específica de la H+-ATPasa de R. stolonifer. 40
2 RESUMEN
Los hongos fitopatógenos generan pérdidas económicas, son controlados frecuentemente por fungicidas sintéticos, los cuales presentan un efecto negativo en la biosfera y provoca el desarrollo de cepas fúngicas resistentes. Actualmente, se buscan alternativas ecológicas para el control de plagas y enfermedades. El quitosano constituye una alternativa para controlar enfermedades poscosecha. El mecanismo de acción de esta molécula no esta totalmente elucidado. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del quitosano sobre la membrana celular de Rhizopus stolonifer.
Se inocularon cultivos en medio líquido papa-dextrosa a una concentración de 1X105 esporas·mL-1 de R. stolonifer, después se adicionó quitosano a las concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1. Los matraces fueron incubados a 28ºC a 200 rpm. Las muestras se colectaron a 0, 24, 48 y 72 h. Se realizaron las siguientes determinaciones: morfología, cinéticas de crecimiento, evaluación del pH, salida de K+, permeabilidad de la membrana e identificación y actividad de la enzima H+-ATPasa.
En presencia de quitosano se observaron deformaciones de las hifas del hongo, inhibición del crecimiento micelial, incremento del pH medio de cultivo, salida de K+, sin embargo con el fluoróforo empleado no se logró evidenciar alteraciones de la permeabilidad de la membrana celular. En los tratamientos sin y con quitosano, se evidenciaron dos bandas polipeptídicas de la H+-ATPasa de 117 y 109 KDa. El quitosano (0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1) afectó la cantidad de proteína total, perdiendo el 42% y ocasionó la disminución de la actividad total de la enzima H+- ATPasa. Sin embargo, incrementó la actividad específica de esta enzima.
Es muy importante profundizar en los estudios para determinar con precisión el origen del incremento del pH de los medios de cultivo por R. stolonifer en presencia de quitosano, investigar el fenómeno y la importancia de la salida de los K+ en respuesta a la adición de quitosano y finalmente el mecanismo por el cual el quitosano altera la concentración y la actividad de la enzima H+-ATPasa así como las consecuencias bioquímicas de esta alteración.
3 ABSTRACT
Phytopathogenic fungi generate economic losses, often controlled by synthetic fungicides, which have a negative impact on the biosphere and leads the development of fungal resistant strains. To date ecological alternatives are seek for the control of pests and diseases. Chitosan is an ecological alternative to control postharvest diseases. The mechanism of action of this molecule is not fully elucidated. The objective of this study was to evaluate the effect of chitosan on the cell membrane of Rhizopus stolonifer.
Culture in potato-dextrose broth were inoculated with R. stolonifer at concentration of 1X105 spores·mL-1, in the absence and presence of chitosan at 0.5, 1.0 and 2.0 mg·mL-1. The culture flasks were incubated at 200 rpm at 28°C and were collected at 0, 24, 48 and 72 h. The following determinations were evaluated: morphology, growth kinetics, pH, release of K+, membrane permeability and identification and activity of the enzyme H+-ATPase.
In the presence of chitosan deformities of the hyphae of the fungus were observeted, mycelial growth inhibition, increment pH and release of K+. Pyranine, a fluorescence track used communly to probe permeability, did not show effect on the fungus. In the treatments with and without chitosan observed two bands polypeptide of H+-ATPase of 117 and 109 KDa. Chitosan at 0.5, 1.0 and 2.0 mg·mL-1 affected the amount total of protein, losing 42% and decrease the total activity of the enzyme H+-ATPase. However, increased the specific activity of this enzyme.
It is very important to realize deeper studies about the following issues to determine the precise origin of the pH modification by R. stolonifer in the presence of chitosan, to investigate the phenomenon and the importance of the output of K+ in response at the addition of chitosan and finally the mechanism by which the chitosan alters the concentration and activity of the enzyme H+-ATPase and the consequences of this biochemical change.
4 INTRODUCCIÓN
I.- ANTECEDENTES
1.1.- Importancia nutritiva de los productos hortofrutícolas
Las hortalizas son muy importantes para la dieta humana ya que aportan nutrientes esenciales tales como vitaminas, minerales y antioxidantes, estos últimos juegan un papel protector contra ciertas enfermedades (González-Aguilar et al., 2005). Muchas hortalizas son consideradas alimento básico debido a las propiedades nutrimentales que presentan. Estudios recientes han demostrado que un mejor consumo de frutas y verduras frescas contribuye a un buen estado de salud, reforzando el sistema inmunológico, reduciendo el daño celular por efecto de radicales libres e inhibiendo el desarrollo del cáncer (Zhuang y Barth, 2003). Adicionalmente, algunos estudios epidemiológicos sugieren que las personas de bajo consumo de frutas y verduras tienen doble riesgo de padecer alguna infección o enfermedad crónica que las personas que tienen consumos más altos (González-Aguilar et al., 2005).
Las hortalizas tienen un aroma y un color característicos, todas presentan en común un elevado aporte de agua, alrededor de 75 a 95% del peso total. Debido a su bajo aporte de carbohidratos (1 - 8%) y aún menor de proteínas (1 - 5%) y de grasas (0,1 al 0,3%), su aporte calórico se ubica entre 20 y 40 calorías por cada 100 gramos. Lo importante de estos alimentos es su riqueza en micronutrientes (vitaminas y minerales), así como en fibra y sustancias antioxidantes que ayudan en la reducción de riesgo de múltiples enfermedades (Anaya y Romero, 1999). Las vitaminas contenidas en las hortalizas pueden ser de carácter hidrosoluble y/o liposoluble.
Las vitaminas hidrosolubles son la vitamina C y las vitaminas del complejo B. La vitamina C tiene acción antioxidante e interviene en la formación de colágeno. Contribuye a reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de cáncer (Hafez y Dyer, 2000). Las vitaminas del grupo B, confieren estabilidad del sistema nervioso, participan en la producción de anticuerpos y glóbulos rojos, colaboran en la obtención de energía, participan en la producción de hormonas sexuales, en la síntesis de glucógeno, síntesis de colesterol, producción de corticosteroides y estimulan el crecimiento (Guyton y Hall, 2001; Hafez y Dyer, 2000). Así mismo intervienen en la síntesis de material genético y en el metabolismo de grasas y proteínas (Nelson y Cox, 2005).
Las vitaminas liposolubles son la vitamina A, D, E y K. Son necesarias para el correcto desarrollo del sistema nervioso e intervienen en el crecimiento óseo. Participan en la síntesis de factores de coagulación de la sangre y colaboran en la fertilidad sexual (Hafez y Dyer, 2000).
5 Protegen a las membranas celulares, lo que contribuye a impedir el inicio de la carcinogénesis, además los compuestos fenólicos también previenen procesos cancerosos al inhibir la formación de nitrosaminas (compuestos cancerígenos que derivan de nitratos y nitritos) (Buchanan et al., 2002; Nelson y Cox, 2005).
Los minerales como: el potasio, sodio, magnesio, calcio y hierro. Intervienen en la transmisión del impulso nervioso y colaboran en el equilibrio de la homeostasis (Guyton y Hall, 2001).
Asimismo están presentes otros minerales como fósforo, yodo, cromo y selenio (Agustí, 2004), entre otros.
Sin embargo, estos productos hortofrutícolas pueden ser dañados por diversos factores ambientales, genéticos y biológicos. Dentro de este último rubro se encuentran aquellos microorganismos que son capaces de crecer sobre la planta, alterando los procesos de desarrollo de la misma, lo cual trae como consecuencia cambios en el contenido de vitaminas, proteínas, carbohidratos, minerales y antioxidantes. Por lo tanto, es de vital importancia que se empleen medidas de control para estos microorganismos.
1.2.- Pérdidas de los productos hortofrutícolas
En las ultimas dos décadas el comercio de frutas y hortalizas ha crecido de manera sistemática y para muchos países en desarrollo representa el principal producto de exportación y fuente de divisas. La pérdida de valor del producto y de su calidad puede darse durante el manejo pre y poscosecha, almacenamiento y distribución. En estas etapas se dan las perdidas económicas más importantes para los países productores, debido el uso de plaguicidas no permitidos o al uso excesivo de los permitidos o a la presencia de contaminantes o por el deterioro poscosecha debido a factores tanto fisiológicos como patológicos, lo cual han producido numerosos casos de rechazo (González-Aguilar et al., 2005).
Las principales pérdidas de los productos hortofrutícolas son producidas por: a) daños mecánicos causados por una mala manipulación a lo largo de la cadena del suministro, b) pérdida de humedad por evaporación y transpiración, c) envejecimiento prematuro y muerte del tejido por interrupción de la tasa metabólica en un almacenamiento a temperatura superior a la óptima o muy baja, d) corta vida en almacén debido a la biosíntesis de etileno, y e) enfermedades ocasionadas por pudriciones, causadas por la invasión de microorganismos patógenos, principalmente por hongos (Tripathi y Dubey, 2004; Van Alfen, 2002).
6 Las enfermedades poscosecha en los productos hortofrutícolas trae como consecuencia graves pérdidas económicas. Se sabe que en países desarrollados, del 100% total de pérdidas poscosecha, el 30 o 40% se debe a pudriciones causadas por microorganismos, mientras que en países subdesarrollados la invasión de patógenos puede ocasionar la pérdida total de producto hortofrutícola. Según estimaciones realizadas en USA estas pérdidas se sitúan en aproximadamente el 24% de las frutas y hortalizas cosechadas, mientras que en países subdesarrollados alcanzan valores muy superiores (Wilson et al., 1994).
1.3.- Enfermedades de los productos hortofrutícolas
Los frutos y vegetales contienen varios nutrientes que pueden ser utilizados por microorganismos patógenos y degradadores (Herrera y Ulloa, 1998). Al ser cosechados estos productos hortofrutícolas pierden su resistencia intrínseca al ya no depender de la planta y ocasiona que durante la etapa poscosecha sean susceptibles de ser invadidos por microorganismos patógenos, principalmente por hongos (Bautista-Baños y Barrera-Necha, 2001). Estos microorganismos son los principales agentes etiológicos de diversas enfermedades poscosecha en productos hortofrutícolas (Cuadro 1) (Agrios, 2002).
Enfermedad Especie
Verruga negra de los tubérculos de la papa
Tizón del follaje y de los frutos de diversas variedades de chiles
Pudrición suave de las raíces del camote
Pudrición húmeda de los frutos de la fresa, del plátano y de otras frutas, y de las raíces del camote.
Pudrición de los frutos de la vid, de la fresa y de muchas otras plantas, y pudrición de las flores de cientos de plantas ornamentales
Pudrición suave de frutos cítricos
Antracnosis del naranjo, del limonero, del aguacatero y de cientos de plantas más
Synchytrium endobioticum Phytophthora capsici Mucor racemosus Rhizopus stolonifer
Botrytis cinerea
Penicillium italicum
Colletotrichum gloeosporioides * Fuente: Herrera y Ulloa, 1998.
Cuadro 1.- Enfermedades poscosecha ocasionadas por hongos.
7 Cabe aclarar que la mayor destrucción producida por hongos se inicia durante la poscosecha, invadiendo las áreas con abolladuras o golpes y algunas especies penetran las estructuras del vegetal para producir la pudrición de frutas y verduras (González-Aguilar et al., 2005).
En el caso de la papaya, algunos autores reportan que las pérdidas ocasionadas por el ataque de hongos puede variar desde un 40 hasta un 100%, y durante el almacenamiento de esta fruta se pierde aproximadamente el 33% de la producción, debido a pudriciones causadas por R.
stolonifer (Bautista-Baños y Barrera-Necha, 2001). En otros estudios, se colectaron jitomates de 15 localidades diferentes del estado de Morelos, México, y que R. stolonifer fue el hongo predominante aislándose del 50% de las muestras. Adicionalmente se reportó en USA que hasta el 35.9% de los frutos de jitomate estaba presente R. stolonifer (Bautista-Baños et al., 2008).
Entre los productos hortofrutícolas que ataca este fitopatógeno se encuentran: el tomate, jitomate, camote, durazno, melón, fresa, papaya. Adicionalmente afecta cultivos de plantas como:
cacahuates, gladíolos, tulipanes, todas las cucurbitáceas, betabel, brócoli, col china, coliflor, zanahoria, melón, sandía, fríjol, chícharo, cebolla, chirivía, berenjena, chile piquín y yam (Agrios, 2002; Herrera y Ulloa, 1998; Korsten y Wehner, 2003).
1.4.- Rhizopus stolonifer agente causal de pudriciones poscosecha
Rhizopus stolonifer, es un hongo fitopatógeno versátil que pertenece al reino Fungi, división Eumycota, clase Zygomycetes, orden Mucorales, familia Mucoraceae, género Rhizopus y especie R. stolonifer (Agrios, 2002). Entre sus características particulares se encuentran la formación de micelio aéreo carente de septos y la producción de esporangióforos que presentan en sus puntas esporangios esféricos donde se alojan las esporangiosporas (Figura 1), las cuales muestran diferentes formas: globosas, elipsoidales y angulares con superficies lisas o estrías distintivas (Hernández-Lauzardo et al., 2006).
8 Las esporas de R. stolonifer pueden sobrevivir largos periodos sin agua y soportar temperaturas elevadas, germinando sobre tejidos vegetales dañados y su rápida velocidad de crecimiento le permite colonizar la superficie de los productos agrícolas y causar la enfermedad conocida como pudrición blanda (Agrios, 2002). Este proceso se desarrolla mediante la excreción de enzimas pécticas del hongo que degradan y disuelven las pectinas de la lámina media de las células vegetales, influyendo tres factores de manera importante en el desarrollo de la enfermedad: el hospedero, el patógeno y el medio ambiente de tal forma que el ambiente debe ser el óptimo para permitir el crecimiento del patógeno sobre el hospedero hortofrutícola susceptible (Adaskaveg et al., 2002).
El ciclo biológico comprende dos fases: la reproducción asexual y sexual. La reproducción asexual ocurre por la formación de esporangióforos, cuyos esporangios producen esporangiosporas. A medida que los esporangios maduran, se ennegrecen dando al moho su color característico. Cuando los esporangios maduran sus paredes se rompen, liberando esporas que pueden germinar y producir un nuevo micelio (Figura 2a). La reproducción sexual ocurre cuando las hifas especializadas de dos cepas compatibles se encuentran y se fusionan formando gametangios. Los dos gametangios se fusionan y la célula multinucleada se transforma en un zigosporangio que contiene una única zigospora. Cuando las condiciones ambientales son favorables, ocurre la germinación rompiéndose la pared del zigosporangio y emerge el
Figura 1.- Estructuras anatómicas de R. stolonifer, a) Esporas, b) esporangióforo, c) esporangio, d) esporangiosporas, e) micelio carente de septos y f) ramificaciones hifales. Fuente: <http://www.biologie.uni- hamburg.de/b-online/ibc99/botanica/botanica/zygomyce.htm >, 2007.
e
f b
c d
9 esporangióforo el cual porta un esporangio que generará esporangiosporas (Figura 2b).
(<http://www.educa.aragob.es>, 2007); y nuevamente el ciclo se repite ya sea de forma sexual o asexual.
1.5.- Estrategias generales de control de R. stolonifer
Durante varios años se han empleado compuestos químicos para controlar las pudriciones poscosecha causadas por este fitopatógeno. Entre los principales fungicidas sintéticos que se han utilizado para controlar la pudrición blanda se encuentran el dicloran, iprodione, fludioxonil y tebuconazole (Adaskaveg et al., 2002).
El dicloran en estudios in situ realizados en duraznos (Prunus persica Batsch) redujo la pudrición del 87 al 100% (Northover y Zhou, 2002). El Iprodione generó una reducción del 59% en la pudrición del jitomate (Abdel-Mallek et al., 1995). Sin embargo, en 1996 fue cancelada la producción del mismo de manera voluntaria por sus fabricantes debido a su poca efectividad, por
Figura 2.- Ciclo biológico de R. stolonifer, a) Reproducción asexual, y b) Reproducción sexual. Fuente: <http://www.educa.aragob.es>, 2007.
10 lo que algunos investigadores han desarrollado otros fungicidas como el fludioxonil y tebuconazole (Adaskaveg et al., 2002). Algunos resultados demostraron que el fludioxonil redujo en un 90, 95.2 y 75% la incidencia de R. stolonifer en duraznos, nectarinas (Prunus persica L.
var. nectarina) y ciruelas (Spondias purpurea L.), respectivamente y el tebuconazole controló la pudrición en estos frutos en un 81, 69 y 79.2% (Förster et al., 2007). Sin embargo, en diversos estudios se ha demostrado que estos compuestos han causado cepas resistentes y además representan un riesgo potencial para la seguridad del medio ambiente y la salud humana (Tripahi y Dubey, 2004), por lo que se han valorado otras opciones, entre ellas podemos mencionar cambios físicos mediante el empleo de atmósferas controladas y modificadas, radiaciones gamma (γ) y luz ultravioleta (UV) (Brecht et al., 2003; Lydakis y Aked, 2003; Bustos y Luna, 1996).
Recientemente, se ha incursionado en la búsqueda de alternativas naturales para controlar las pudriciones ocasionadas por R. stolonifer estas prácticas han cobrado auge debido a los efectos nocivos que han causado los métodos tradicionales en el control de las enfermedades poscosecha.
Entre las más importantes se encuentran el uso de antagonistas microbianos, empleo de productos vegetales y aplicación de quitosano (Tripahi y Dubey, 2004).
Los antagonistas microbianos, han sido preferidos para controlar enfermedades poscosecha, porque colonizan rápidamente compitiendo por nutrientes con los patógenos potenciales (Spadaro y Lodovica, 2004), además de que seguramente no afectan a los productos hortofrutícolas.
Las investigaciones realizadas para evaluar los efectos de productos vegetales en el control de R.
stolonifer son escasas e incipientes, pero algunos extractos vegetales presentan un efecto fungicida sobre el crecimiento micelial, afectando la germinación y la formación de sus esporas (Plotto et al., 2003; Velázquez-Gurrola et al., 2005).
Recientemente, se ha estudiado el efecto del quitosano sobre la inhibición del crecimiento de R.
stolonifer y en general el uso de este polímero como alternativa para conservar productos agrícolas durante la fase poscosecha (Bautista-Baños et al., 2006).
1.6.-Quitosano, compuesto natural con potencial para controlar a R. stolonifer
La quitina es el segundo compuesto orgánico más abundante en la naturaleza (Figura 3a). Este compuesto está restringido al mundo eucariótico, especialmente en Arthropoda (Crustáceos, Arácnidos e insectos). En hongos, la quitina es el componente estructural más importante de la
11 pared celular, ya que es la responsable de mantener la forma, resistencia e integridad celular.
Estructuralmente la quitina esta compuesta de glucosa y N-acetilglucosamina unidos por enlace β-1,4 (Martínez y Gozalbo, 2001).
El quitosano es un derivado de la quitina, se produce por desacetilación alcalina o enzimática; es un biopolímero no tóxico constituido por β-(1,4)-2-acetoamido-D-glucosa y β-(1,4)-2-amino-D- glucosa (Figura 3b) (Je y Kim, 2006a; Je y Kim, 2006b). La diferencia estructural entre la quitina y el quitosano radica en el carbono -2- donde el grupo acetilo de la quitina se encuentra remplazado por un grupo amino, dando lugar al quitosano, el cual es biodegradable, de alto peso molecular y no es alergénico (Bautista-Baños et al., 2006; Kim y Rajapakse, 2005; Rabea et al., 2003). El quitosano es un compuesto interesante debido a su contenido de nitrógeno, cuyas características pueden variar según el grado de desacetilación, peso molecular y de polimerización (Helander et al., 2001; Rabea et al., 2003). Esta molécula presenta propiedades distintas a la quitina que la hacen funcionalmente importante para un gran número de aplicaciones en diversas áreas biotecnológicas, además de que presenta diferentes actividades biológicas (Bautista-Baños et al., 2006; Hirano, 1999).
El quitosano posee propiedades fisicoquímicas muy particulares que lo hacen útil en un gran número de áreas, por ejemplo, en la cosmetología es utilizado como aditivo para el cabello,
a)
b) a)
b)
Figura 3.- Estructura de las macromoléculas, a) Quitina, b) Quitosano. Su diferencia estructural radica en el carbono -2- (encerrado en un círculo), con su grupo acetilo y amino, respectivamente. Fuente: Martínez y Gozalbo, 2001.
12 cremas faciales y cremas para el cuerpo. En la industria alimenticia como preservante de productos alimenticios, antioxidante y películas de empaque antimicrobianas (Bautista-Baños et al., 2006; Liu et al., 2004; Pavinatto et al., 2007). En biotecnología es usado como agente quelante, emulsificador y floculante (Bautista-Baños et al., 2006). En farmacología y medicina, es utilizado para producir fibras, telas, drogas, membranas, órganos artificiales y reducción del colesterol (Je y Kim, 2006b; Mishra, 2001; Rana et al., 2005). En la agricultura es empleado para la modificación de suelos, producción de películas biodegradables, agente fungicida y fungistático, actividad antimicrobiana, y como elicitor de respuesta de defensa en plantas (Liu et al., 2007; Martínez y Gozalbo, 2001; Rabea et al., 2005).
El quitosano ha mostrado ser un agente fungicida y fungistático para el control de Botrytis cinerea, Pyricularia grisea, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Drechstera sorokiana, Fusarium acuminatum, Fusarium graminearum, Micronectriella nivalis, Rhizoctonia solani, Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Penicillum spp., Fusarium oxysporum y Rhizopus stolonifer, entre otros microorganismos (Bautista-Baños et al., 2004a; Hernández- Lauzardo et al., 2005; Rabea et al., 2005).
El efecto del quitosano en la inhibición del crecimiento micelial de R. stolonifer ha sido analizado en varias investigaciones (El Ghaouth et al., 1992a). En algunos estudios, se ha evidenciado que presenta efecto fungicida asociado al grado de desacetilación de la molécula (El Ghaouth et al., 1992b). Por otra parte, se ha analizado su efecto en el control de la pudrición blanda y se observó que el quitosano retrasó el desarrollo de R. stolonifer en jitomates almacenados a 14°C durante 48, 72 y 96 h (Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004b). Asimismo, el recubrimiento con quitosano en fresas y cerezas, durante su almacenamiento, mostró no sólo reducción en la enfermedad, sino que provocó un incremento en la actividad de algunas enzimas relacionadas con la inducción de resistencia al ataque de patógenos (quitinasas y β 1-3 glucanasas) (Zhang y Quantick, 1998).
1.7.- Mecanismos de acción del quitosano
Los mecanismos de acción del quitosano no han sido del todo establecidos, aunque existen algunas hipótesis al respecto. En general, las diversas propuestas para explicar la actividad antimicrobiana del quitosano consideran como característica fundamental la naturaleza policatiónica de la molécula, la cual esta dada por los grupos NH3+
de la glucosamina, que le
13 confiere importantes propiedades biológicas y fisiológicas (Hernández-Lauzardo et al., 2005; Je y Kim, 2006a; Liu et al., 2004).
En condiciones de pH ácido, el quitosano se comporta como un polielectrolito lineal, con un pK alrededor de 6.5, por lo tanto a pH bajos los residuos de glucosamina están cargados positivamente debido a la protonación de sus residuos aminos, conteniendo una alta densidad de cargas positivas, lo que le permite unirse fuertemente a superficies cargadas negativamente (Kim y Rajapakse, 2005; Zakrzewska et al., 2007).
Se ha propuesto que las cargas positivas del quitosano interaccionan con las cargas negativas de las membranas celulares de microorganismos generando cambios en la permeabilidad de las mismas y salida de constituyentes intracelulares (Rabea et al., 2003)
Estudios realizados en la levadura Saccharomyces cerevisiae, reportaron que la parte externa de la membrana plasmática esta enriquecida por los lípidos fosfatidilcolina, ergosterol y esfingolípidos, estos últimos son el principal lípido de membrana plasmática y están cargados negativamente, constituyendo la mayor parte de las cargas negativas de la membrana celular (Zakrwzewska et al., 2005). El más abundante de los esfingolípidos es el manosil- diinositolfosfato-ceramida (M(IP2)C), el cual presenta dos cargas negativas. Sitios donde el quitosano podría unirse utilizando sus grupos amino de los residuos de glucosamina, los cuales son capaces de interactuar con los componentes negativos del M(IP2)C de la membrana plasmática. En otros estudios se ha observado, que el quitosano forma canales de transporte de moléculas en bicapas lipídicas artificiales, lo que provee evidencia de que el quitosano puede desorganizar a la membrana celular (Zakrzewska et al., 2007).
Es importante resaltar que los esfingolípidos de las células de mamífero no poseen carga negativa y eso podría explicar el porque son pocos sensibles al quitosano (Zakrzewska et al., 2005). Sin embargo, aun se conoce muy poco sobre los mecanismos de acción del quitosano. Ante este panorama, es necesario realizar mayores estudios para conocer con mayor precisión los mecanismos de acción del quitosano en hongos, específicamente sobre R. stolonifer.
1.8.- Estructuras celulares externas de los hongos 1.8.1.- Pared celular
La pared celular fúngica es un organelo dinámico que participa en numerosos procesos, provee suficiente fuerza dinámica para resistir cambios de presión osmótica impuestos por el ambiente al
14 mismo tiempo presenta adecuada plasticidad para permitir el crecimiento y la división celular. La pared celular mantiene la forma y la integridad de la célula frente al estrés ambiental, es permeable a solutos menores de 600 Da, permite interactuar a las células con su entorno y media la adhesión a un sustrato apropiado. Participa en el reconocimiento entre células y funciona como un centro de señalización para activar rutas de transducción de señales de las células (Bowman y Free, 2006; Ross, 2001; Van Der Rest et al., 1995).
La pared celular fúngica está compuesta de glicoproteínas y polisacáridos, principalmente de glucano y quitina. Otro componente estructural de la pared celular de los hongos son los pigmentos, los cuales proporcionan a la pared mayor resistencia a la lisis enzimática, incrementan la fuerza mecánica, la protege de radiaciones y ayuda a resistir el ataque por el sistema inmunitario humano. La composición de la pared está sujeta a cambios y puede variar de una célula a otra dependiendo de las condiciones y etapa de crecimiento. También cambia de acuerdo con la función que presenta la hifa en un tiempo y espacio particular, por lo que el desarrollo de las hifas está definido en función de la estructura de la pared celular (Bowman y Free, 2006; Ross, 2001). Por tales motivos la pared celular fúngica es un organelo necesario para la mayoría de los procesos fisiológicos y de desarrollo del hongo.
1.8.2.- Membrana celular
La membrana celular de S. cerevisiae esta compuesta por una bicapa lipídica de aproximadamente 7.5 nm de grosor, conteniendo una mezcla de lípidos polares y proteínas que por sus interacciones gobiernan la estructura de la membrana. Las membranas difieren en las proporciones relativas de proteínas y lípidos, lo que refleja la diversidad en su papel biológico.
La composición lipídica de la membrana es característica de cada reino, especie, tejido y órgano, dentro de un tipo determinado de células, estos lípidos presentan una alta diversidad en tamaño y composición. El contenido de lípidos de la membrana plasmática es compleja y altamente regulada, sugiriendo que estos juegan una función en la actividad de proteínas de la membrana plasmática (Nelson y Cox, 2005; Van Der Rest et al., 1995; Voet et al., 2002). Los lípidos anulares están en contacto directo con las proteínas, las cuales estabilizan una conformación funcional, existiendo evidencias directas de la función de estos lípidos anulares en S. cerevisiae sobre dos proteínas principales de membrana, la quitina sintasa y la ATPasa de membrana plasmática (Kühlbrandt et al., 2002).
15 El modelo clásico de la membrana de Singer y Nicholson, describe a la membrana como un flujo continuo de lípidos dotados con proteínas globulares, que son capaces de moverse sin restricciones en el plano de la membrana. En este modelo los lípidos además de difundir libremente en el plano se mueven rotacional y transversalmente (flip-flop). Sin embargo, las proteínas de membrana frecuentemente dificultan el movimiento lateral debido a la asociación con otras proteínas o elementos del citoesqueleto o matrix extracelular. Otra característica importante de la membrana es la localización asimétrica de las proteínas y lípidos. La composición proteica de las membranas es variable lo que refleja su especialización funcional.
Las proteínas de membrana pueden ser extrínsecas, intrínsecas o integrales de membrana. La membrana plasmática contiene proteínas involucradas en el transporte de solutos, traducción de señal, anclaje al citoesqueleto y síntesis de componentes de membrana externa. Así pues, las membranas biológicas son cruciales para la vida, definen los límites celulares, dividen las células en compartimientos, organizan secuencias complejas de reacciones y actúan en la recepción de señales y en las transformaciones energéticas (Nelson y Cox, 2005; Van Der Rest et al., 1995;
Voet et al., 2002).
1.8.2.1.- Permeabilidad y transporte
En la mayoría de los organismos, los nutrientes que entran o salen de la célula deben atravesar la membrana celular, ésta membrana posee la propiedad de permitir que determinados compuestos puedan atravesarla. Sin embargo, la mayoría de las moléculas que atraviesan la membrana no lo hacen de forma pasiva, ya que ésta presenta una permeabilidad selectiva por lo que requieren de un transporte activo, esencial para paso de moléculas cargadas a través de la membrana (Nelson y Cox, 2005; Voet et al., 2002).
Las características hidrofóbicas de la membrana plasmática le permiten funcionar como una barrera estricta impidiendo el paso libre de los compuestos polares. Algunos compuestos pequeños no polares y sustancias solubles en fases hidrofóbicas, como ácidos grasos, alcoholes y benceno, son capaces de atravesar la membrana libremente gracias a su solubilidad en la fase lipídica. Sin embargo, las moléculas cargadas como los ácidos orgánicos, aminoácidos y sales inorgánicas, que son hidrofílicas, no pueden atravesar la membrana, por lo que deben ser transportadas de forma específica (Nelson y Cox, 2005; Voet et al., 2002).
16 En la mayoría de los organismos estudiados, se han identificado tres tipos de transportadores de membrana: uniportadores, simportadores y antiportadores. Las proteínas de transporte son generalmente proteínas integrales de membrana y poseen dominios tanto en el interior como en el exterior de la membrana celular. Este tipo de conformación permite que los solutos captados en el exterior sean transportados al interior con un cambio conformacional de la proteína transportadora (Nelson y Cox, 2005; Van Der Rest et al., 1995).
La mayoría de los procesos de transporte en S. cerevisiae están acoplados al consumo de energía, lo que hace posible una acumulación de solutos en el interior a concentraciones mucho mayores de las que se encuentran en el exterior de la célula, la cual se utiliza en los procesos dependientes de energía, para bombear el soluto en contra de un gradiente de concentración (Nelson y Cox, 2005). La energía puede proceder de compuestos fosforilados de alta energía, como la adenosina trifosfato (ATP) o del consumo de un gradiente de protones o de sodio. Los gradientes de iones se forman mediante reacciones celulares que liberan energía y pueden usarse como energía potencial que facilita el transporte de solutos en contra de gradientes de concentración (Burghoorn et al., 2002). A medida que se va transportando el sustrato, va disminuyendo progresivamente el gradiente de protones. Los cationes como el K+, pueden ser transportados activamente al citoplasma por uniportador como consecuencia de la fuerza motriz de protones, dado que el interior de la célula se encuentra cargado negativamente cuando la membrana establece el gradiente de protones (Enríquez-Freire et al., 1999).
En hongos filamentosos como Neurospora crassa, se ha descrito que moléculas policationicas como las defensinas ocasionan flujo de iones, esta es una de las estrategias de defensa por parte de las plantas contra hongos fitopatógenos. Las defensinas presentan un amplio espectro de actividad, son pequeños péptidos (45 - 54 aminoácidos), ricos en cisteína (formando cuatro puentes de disulfuro) y básicas, pueden inhibir el crecimiento de hongos en concentraciones micromolares, pero no son tóxicas para las células de mamífero. En algunos tejidos vegetales la expresión de defensinas es inducida en respuesta a la infección por hongos, mientras que en otros son expresadas constitutivamente. Estos péptidos inducen flujos iónicos, tales como la salida de K+ y la entrada de Ca+2 a través de la membrana plasmática de las hifas y alteran la permeabilidad de la membrana debido a la interacción específica con la membrana tendiendo a alcalinizar el medio de cultivo. Esto sugiere, que el flujo de iones es el resultado de la interacción de las defensinas con sitios específicos de la membrana, alterando las funciones membranales
17 tales como la permeabilidad y el transporte de iones mediado por proteínas, lo cual produce una inhibición del crecimiento fúngico. También pueden insertarse en la membrana celular causando la ruptura de esta, alterando la permeabilidad de iones tales como el calcio, potasio y otras moléculas orgánicas, además de que despolariza a la membrana. Esto sugiere, que la interacción es específica entre las defensinas y los fosfolípidos de la membrana plasmática del hongo (Spelbrink et al., 2004; Thevissen et al., 2004; Thevissen et al., 1999). Las defensinas han mostrado tener una interacción con los componentes de la membrana plasmática del hongo y esta podría ser la base de la actividad antifúngica del quitosano. Sin embargo, aun no se conocen en detalle los mecanismos de acción de estos péptidos (Thevissen et al., 2004; Thevissen et al., 2003).
1.8.2.2.- Enzima H+-ATPasa
La membrana plasmática de S. cerevisiae puede contener de 105 a 106 moléculas transportadoras, de las cuales el 50% son proteínas. La ATPasa es la principal proteína de membrana y está involucrada en varios procesos, principalmente en el transporte primario, en el cual interviene la hidrólisis del ATP (Van Der Rest et al., 1995).
Los sistemas de transporte de tipo primario derivan de la energía del ATP, la hidrólisis de ésta molécula es llevado cabo por la ATPasa, ubicada en la membrana plasmática de hongos. El resultado de la actividad de esta enzima es la generación del gradiente electroquímico de protones (Van Der Rest et al., 1995). Las ATPasas intercambian cationes (Na+ o K+) por protones (H+) a través de la membrana. Los sistemas intercambiadores desempeñan un papel fundamental en la regulación del pH y en la concentración de cationes monovalentes en el interior celular (Ramírez y Peña, 2000).
Existen tres clases de H+-ATPasas (Figura 4), la H+-ATPasa tipo P, se nombró así, debido a que es fosforilada de manera reversible, todas las enzimas tipo P son integrales de membrana. La H+- ATPasa tipo V, es la responsable de la acidificación de compartimientos intracelulares u organelos como: lisosomas, endosomas, complejo de Golgi y vesículas secretoras; a diferencia de la anterior esta no experimenta fosforilación ni desfosforilación cíclica; sin embargo, no se conoce aún el mecanismo de acción por el que se acopla la hidrólisis del ATP al transporte de protones. Finalmente, la H+-ATPasa tipo F, juega un papel central en las reacciones de conservación de energía en las bacterias, mitocondrias y cloroplastos, cuyo proceso está
18 acompañado de la síntesis de ATP a partir del ADP y Pi, en este sentido se denomina más correctamente ATP sintasa (Van Der Rest et al., 1995).
La H+-ATPasa tipo P (ATPasa dependiente de protones) de S. cerevisiae constituye del 7 al 10%
de la proteína total de la membrana plasmática y puede hidrolizar hasta el 25% del ATP producido por la célula. La principal función de la H+-ATPasa es expulsar activamente protones y generar el gradiente electroquímico de protones que suministra la energía para la captación de nutrientes (Serrano, 1998).
En general, se han logrado establecer algunas funciones de la H+-ATPasa tipo P: a) participación en la respuesta al estrés salino, b) regulación del contenido de iones, c) regulación del pH intracelular y d) posiblemente participar en la regulación del ciclo celular (Ramírez y Peña, 2000).
Estructuralmente, la enzima H+-ATPasa tipo P de S. cerevisiae consiste de una cadena polipeptídica de 100 KDa, similar al tamaño de los polipéptidos catalíticos de enzimas H+- ATPasas de otros hongos (Burghoorn et al., 2002)
La expresión y la actividad de la H+-ATPasa tipo P son reguladas durante el ciclo celular. En levaduras, al final de la fase exponencial de la curva de crecimiento, la actividad y la concentración de la H+-ATPasa disminuye. Posteriormente, en la fase estacionaria, la actividad de la H+-ATPasa retorna a su nivel original (Goffeau y Slayman, 1981)
Subunidad periférica
Subunidad integral
H+-ATPasa tipo F H+-ATPasa tipo V
H+-ATPasa tipo P
Membrana interna mitocondial Membrana plasmática Membrana vacuolar
a) b) c)
Subunidad periférica
Subunidad integral
H+-ATPasa tipo F H+-ATPasa tipo V
H+-ATPasa tipo P
Membrana interna mitocondial Membrana plasmática Membrana vacuolar
a) b) c)
Figura 4.- Tipos de H+-ATPasa en diferentes compartimentos celulares. a) En membrana plasmática, b) membrana vacuolar y c) membrana mitocondrial interna. Fuente: Van Der Rest et al., 1995.
19 Rao y Slayman (1996), reportaron la presencia de una cantidad constante de H+-ATPasa tipo P en la membrana de levaduras que fueron sometidas a diferentes condiciones de cultivo y adicionalmente concluyeron que el gen PMA1 fue expresado constitutivamente.
Por otra parte, se ha reportado que la actividad de la H+-ATPasa tipo P se afecta por diferentes estímulos fisiológicos, activándose por fosforilación (Yanagita et al., 1987) y que la desfosforilación produce la desactivación de la enzima (Kolarov et al., 1988).
20 II.- JUSTIFICACIÓN
Los productos hortofrutícolas son afectados por diversas enfermedades poscosecha, tradicionalmente se han controlado mediante el empleo de fungicidas sintéticos con los beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos. La aplicación de alternativas naturales como el quitosano, ha resultado beneficiosa para controlar estas enfermedades y puede representar una excelente alternativa natural para el control de hongos poscosecha en substitución de los agroquímicos sintéticos. Para explicar la actividad antimicrobiana del quitosano existen hipótesis sugiriendo que las cargas positivas del quitosano pueden interaccionar con las cargas negativas de la superficie de la membrana celular alterando su permeabilidad y funcionalidad. Actualmente, el modo de acción del quitosano no ha sido totalmente establecido, por lo que resulta importante realizar esfuerzos adicionales en la investigación básica para comprender con mayor precisión los mecanismos de acción de este biopolímero y de esta manera poder contribuir de forma significativa en la utilización más eficiente de esta macromolécula. Adicionalmente el conocimiento generado podría utilizarse para diseñar fungicidas efectivos, específicos y biodegradables que contribuyan a la conservación del medio ambiente y a la salud humana.
21 III.- OBJETIVOS
3.1.- OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto del quitosano sobre la membrana celular de Rhizopus stolonifer.
3.2.- OBJETIVOS PARTICULARES
Evaluar en la cepa R3 de R. stolonifer el efecto del quitosano sobre los parámetros:
a) Morfología microscópica.
b) Cinéticas de crecimiento.
c) Cambios de pH en el medio de cultivo.
d) Salida de K+ de las células.
e) Permeabilidad de la membrana celular.
f) Identificación y determinación del peso molecular de la enzima H+-ATPasa.
g) Actividad de la enzima H+-ATPasa.
IV.- HIPÓTESIS
El quitosano afecta procesos en los que participa la membrana celular como morfología, crecimiento y permeabilidad de la membrana, así como la disminución en cantidad y actividad de la enzima H+-ATPasa de R. stolonifer.
22 V.- MATERIALES Y MÉTODOS
5.1.-Diagrama general de trabajo
Se utilizó la cepa R3 de R. stolonifer, esta fue cultivada en cajas petri con medio sólido agar- papa-dextrosa (PDA), al terminó de tres días las esporas fueron extraídas con agua destilada. Se tomaron dos gotas de la solución de esporas y fueron colocadas en una cámara de Neubauer y se procedió al conteo de esporas, se obtuvo el promedio de esporas y se multiplicó por el factor de conversión de la cámara (50’000) que da como resultado la concentración de esporas·mL-1 de la solución original, esta suspensión se llevó a una concentración final de 1X105 esporas·mL-1. De esta solución de esporas se inocularon medios líquidos papa-dextrosa (PDB) a una razón de 0.5 mL de la solución de esporas por 50 mL de medio de cultivo con las diferentes concentraciones de quitosano. Los matraces fueron incubados a 28ºC a 200 rpm durante 0, 24, 48 y 72 h.
Transcurrido el tiempo se extrajeron los micelios y se procedió a realizar las siguientes determinaciones: morfología, cinéticas de crecimiento, cambios de pH en el medio de cultivo, salida de K+ de las células, permeabilidad de la membrana celular, presencia, peso molecular y actividad de la enzima H+-ATPasa (Figura 5).
Figura 5.- Esquema general del trabajo experimental. Se utilizó la cepa R3 de R. stolonifer. Se inocularon medios líquidos Papa-Dextrosa a las diferentes concentraciones de quitosano e incubados a 28ºC a 200 rpm.
Transcurridos el tiempo se extrajeron los micelios y se determinó: morfología, cinéticas de crecimiento, pH del medio de cultivo, salida de K+, permeabilidad de la membrana celular; presencia, peso molecular y actividad de la H+-ATPasa.
II) Cinéticas de crecimiento Rhizopus
stolonifer (R3) 3 días
Lavado con agua destilada
PDA Cámara de
Neubauer
0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1 de quitosano a 200 rpm, 28°C;
4 Tiempos
Medio PDB
V) Efecto del quitosano sobre la permeabilidad
VII) Actividad enzimática VI) Identificación y determinación del peso molecular
Efecto del quitosano sobre la H+-ATPasa I) Morfología
III) Evaluación del pH del medio de cultivo
IV) Determinación de la salida de K+
1X105 esporas·mL-1
II) Cinéticas de crecimiento Rhizopus
stolonifer (R3) 3 días
Lavado con agua destilada PDA
PDA Cámara de
Neubauer
0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1 de quitosano a 200 rpm, 28°C;
4 Tiempos
Medio PDB
V) Efecto del quitosano sobre la permeabilidad
VII) Actividad enzimática VI) Identificación y determinación del peso molecular
Efecto del quitosano sobre la H+-ATPasa I) Morfología
III) Evaluación del pH del medio de cultivo
IV) Determinación de la salida de K+
1X105 esporas·mL-1
23 5.2.-Material biológico
Se utilizó la cepa R3 de R. stolonifer la cual fue aislada de frutos de jitomate del tipo “Saladette”
infectados naturalmente y cosechados en el municipio de Yautepec, Morelos. Las condiciones de aislamiento e identificación de la cepa fueron descritas por Hernández-Lauzardo et al., (2006).
5.3.- Medios de cultivo sin y con quitosano
Se utilizaron los medios PDA y PDB marca Bioxon. Para preparar un litro de caldo papa- dextrosa, se pesaron 24 g del medio nutritivo los cuales se disolvieron en agua caliente y con agitación. El medio disuelto se dejó reposar a temperatura ambiente y se ajustó el pH a 5.5 con NaOH 1N. Posteriormente el medio se distribuyó en matraces de 125 y 500 mL, para ser esterilizados por autoclave.
En el caso de los medios de cultivo adicionados con quitosano, después de ser esterilizados (matraces de 125 mL de capacidad con 47.5, 45 y 40 mL de medio de cultivo) se les adicionó en condiciones controladas el quitosano estéril de una solución stock de 10.0 mg·mL-1 (2.5, 5 y 10 mL respectivamente) para obtener una concentración final en el medio de 0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1, (0.05, 0.1 y 0.2% de quitosano, respectivamente) en un volumen final de 50 mL.
Se utilizó quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Chemical Co. St. Louis, MI, USA) con un grado de desacetilación de 75-85%. Para preparar la solución stock de quitosano de 10 mg·mL-1, se pesó 1 g, se disolvió en 1 mL de ácido acético al 1% y se aforó a 100 mL con agua destilada.
Esta solución se dejó en agitación constante durante 24 h, se ajustó a un pH final de 5.5 con NaOH 1N y se esterilizó en autoclave (Bautista-Baños et al., 2004a; Rabea et al., 2005).
5.4.- Selección de las condiciones de crecimiento
Los matraces con 50 mL de caldo PDB sin y con quitosano (0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1) se inocularon con 0.5 mL de la suspensión 1X105 esporas·mL-1 de R. stolonifer y se incubaron a 28ºC a 200 rpm. Después de 0, 24, 48, 72 y 96 h, se extrajeron las muestras determinándose la morfología del micelio del hongo con un microscopio óptico 10X de aumento y cambios de pH mediante un potenciómetro convencional (Accumet pH meter 910®). Con los datos obtenidos se determinaron las condiciones y los tiempos de incubación que se utilizaron en los experimentos posteriores, seleccionando 0, 24, 48 y 72 h, a 28ºC a 200 rpm.
24 5.5.- Determinación de las características morfológicas de R. stolonifer
Cinco microlitros de la suspensión de esporas de R. stolonifer antes mencionado se colocaron en matraces con 50 mL de PDB sin y con quitosano a las concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1. Los matraces se incubaron a 28ºC a 200 rpm. Después de 24, 48 y 72 h se separó el micelio del medio de cultivo mediante centrifugación a 5000 rpm. Se tomaron muestras de los micelios, se colocaron sobre un portaobjetos y se observaron a 4, 10 y 40X en un microscopio Nikon Alphaphot-2 YS2, acoplado una cámara (DL 330 DAGE-MTI). Seleccionándose las imágenes de 72 h de incubación del hongo y aumento de 40X, debido a la claridad con que se observaron las deformaciones miceliales. Se realizaron cuatro observaciones por duplicado de cada tratamiento.
5.6.- Cinéticas de crecimiento
Se emplearon los mismos tratamientos antes mencionados en cajas petri con PDA a la concentración de 0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1. Mediante un horadador se tomaron fragmentos de 5 mm de diámetro del inóculo de R. stolonifer y se sembraron individualmente en el centro de las cajas petri con los tratamientos mencionados anteriormente. Las cajas se incubaron a 28°C, durante 0, 6, 12, 24, 48 y 72 h, midiéndose el diámetro (mm) del halo de crecimiento del micelio con un vernier digital. Se establecieron tres réplicas por tratamiento y el experimento se repitió dos veces. Se obtuvo el promedio y el error estándar de cada tratamiento.
5.7.- Evaluación de los cambios de pH en el medio de cultivo
Los matraces de los cuatro tratamientos antes mencionados, fueron inoculados con R. stolonifer y se agregó un tratamiento testigo el cual consistió de medio PDB con quitosano a las diferentes concentraciones pero sin inocular con el hongo. Los cinco tratamientos fueron incubados a 28°C con agitación constante a 200 rpm. Después de 0, 24, 48 y 72 h, se evaluó el pH del medio del cultivo con un potenciómetro (Accumet pH meter 910®). Este experimento se repitió dos veces por duplicado y dos veces más por triplicado. Se obtuvo el promedio y el error estándar de cada tratamiento.
5.8.- Determinación de la salida de K+ de las células de R. stolonifer
Los medios de cultivo PDB fueron inoculados con R. stolonifer e incubados a 200 rpm, a 30ºC, durante 16 h. Transcurrido este tiempo se centrifugaron las muestras a 5000 rpm, para separar el
25 micelio del medio, se lavó el micelio 2 veces con agua destilada a 5000 rpm y finalmente el micelio se resuspendió en agua destilada a una proporción de 1:1.
La salida de K+ fue medida con un electrodo específico de potasio, a base de valinomicina, el cual registra continuamente la concentración externa del ion. Los datos fueron capturados usando un software diseñado por el grupo del Dr. Antonio Peña del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. Las determinaciones fueron hechas en 10 mL del medio de incubación (método modificado, Enríquez-Freire et al., 1999; ver apéndice). Este medio de incubación contenía 8.5 mL de agua destilada, 0.5 mL del regulador MES-TEA pH 6.0 (ver apéndice), 0.5 mL de glucosa 1M (ver apéndice), 0.5 mL del micelio y las diferentes concentraciones de quitosano (0.5, 1.0 y 2.0 mg·mL-1), con agitación continua a 28ºC. En paralelo se realizó una cuerva estándar de K+ sobre la cual se extrapolaron los datos de la salida intracelular de K+ ocasionada por el quitosano.
El experimento se repitió cuatro veces, se obtuvo el promedio y el error estándar. Sin embargo, no se graficó el error estándar, debido a que el intervalo del error era muy grande y no permitió observar diferencias significativas entre los tratamientos. Pero las gráficas de cada uno de los experimentos mostraron la misma tendencia a la salida de potasio, por lo que se eligió una de ellas.
5.9.- Evaluación de la permeabilidad de la membrana celular
Los medios de cultivo PDB sin y con quitosano a una concentración de 2.0 mg·mL-1 se inocularon con R. stolonifer y se incubaron a 30ºC, a 200 rpm, durante 24 h, las muestras se centrifugaron a 5000 rpm para separar el micelio del medio, se lavó el micelio 2 veces con agua destilada a la misma velocidad de centrifugación anterior y se resuspendieron las células en una proporción de 1:10 obteniéndose un volumen final de 0.7 mL, se le adicionaron 20 µL de piranina 100 mM, se agitó durante 30 min, se centrifugó el micelio nuevamente a 5000 rpm y se lavó 2 veces con agua destilada a la misma velocidad de centrifugación (para desechar el exceso de piranina). Se tomó una muestra y se observó al microscopio Nikon Diaphot con UV-F a diferentes objetivos (4, 10 y 40X), este microscopio está acoplado a un accesorio epifluorescente y a una cámara digital (MCD-1000, SpectraSource Inst., CA). Las imágenes fueron procesadas y analizadas en el programa Image-Pro Pluc (método modificado, Calahorra et al., 1998). Este experimento se repitió tres veces y se tomaron dos fotos por cada aumento por cada tratamiento,
