FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular.
Trabajo Fin de Máster
Estudio del papel de las cisteínas del regulador transcripcional FurB de cianobacterias.
“Role of cysteines in the transcriptional regulator FurB from cyanobacteria.”
Directores: Emma Sevilla Miguel y Andrés González Rodríguez.
Ponente: María F. Fillat Castejón.
Isabel Valero Rubira
Curso 2016/2017
Abreviaturas ……… 1
1.- Resumen/ Abstract ………. 2
2.- Introducción y Antecedentes ……….. 4
2.1.- Las cianobacterias ………..
4
2.1.1.- Características generales ………
4
2.1.2.- Anabaena sp. PCC 7120 ………..
4
2.2.- Metabolismo del hierro y del zinc en cianobacterias ……….
5
2.2.1.- Importancia del hierro y el zinc ……….
5
2.2.2.- Regulación del metabolismo de metales por proteínas de la familia FUR (Ferric Uptake Regulator) ………
6
2.3.- Proteínas de la familia FUR en Anabaena sp. PCC 7120 ………7
2.3.1.- FurA ………
7
2.3.2.- FurB ………
8
2.3.3.- FurC ………
12
3.- Objetivos ……… 14
4.- Materiales y Métodos ……….. 15
4.1.- Cepas bacterianas y condiciones de cultivo ……….
15
4.2.- Obtención de células competentes y transformación por choque térmico ………..
15
4.2.1.- Generación de E.coli quimiocompetentes ……….
15
4.2.2.- Transformación de cepas de E.coli con plásmidos mediante choque térmico ……….
16
4.3.- Preparación de plásmidos liofilizados ……….
16
4.4.- Sobreexpresión de las proteínas recombinantes ………..
16
4.4.1.- Prueba de expresión ………..
16
4.4.2.- Generación de biomasa e inducción ………..
17
4.4.3.- Electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE ……….
18
4.5.- Purificación de las proteínas recombinantes ………
18
4.5.1.- Lisis celular ………
18
4.5.2.- Empaquetado y equilibrado de la columna IMAC (Ion Metal Affinity Chromatography) ………..
18
4.5.3.- Purificación mediante IMAC-Zn2+ ……….19
4.5.4.- Precipitación con TCA (ácido tricarboxílico) ……….
19
4.5.5.- Diálisis, cuantificación y concentración ………
20
4.6.- Caracterización bioquímica y actividad biológica de las proteínas recombinantes ……….
20
4.6.1.- Determinación de la presencia de Zn2+ por ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry) ………20
4.6.2.- Ensayos de retardo en gel (EMSA) ………20
4.6.3.- Dicroísmo circular ………
21
4.6.4.- Ensayo de oligomerización ………
21
4.6.5.- Ensayo de unión al grupo hemo ………
22
4.7.- Obtención de DNA genómico de Anabaena sp. y promotores …………
22
4.7.1.- Extracción de DNA genómico de Anabaena sp ………
22
4.7.2.- Amplificación de promotores mediante PCR ………
23
5.- Resultados ……… 24
C124A ……….
5.3.- Caracterización bioquímica y actividad biológica de las proteínas
mutantes ………..
26
5.3.1- Determinación de la presencia de Zn2+ por ICP ……….
26
5.3.2- Determinación de la actividad biológica de las proteínas mutantes por EMSA ………
27
5.3.3.- Determinación de la estructura secundaria de las proteínas mutantes por dicroísmo circular ………
28
5.3.4.- Estudios de oligomerización de las proteínas mutantes con DTT y H2O2 ……….29
5.3.5.- Ensayos de unión al grupo hemo ……….31
6.- Discusión ……… 35
6.1.- Purificación de las proteínas mutantes ………
35
6.2.- Caracterización bioquímica y actividad biológica de las proteínas mutantes ………..
35
6.2.1.- Contenido en zinc de las proteínas FurB mutantes ……….
35
6.2.2.- Actividad biológica in vitro de las proteínas FurB mutantes ……….
36
6.2.3.- Oligomerización de las proteínas FurB mutantes ……….
37
6.2.4.- Unión de las proteínas FurB mutantes al grupo hemo ………..
37
7.- Conclusiones/ Conclusions ……… 39
8.- Bibliografía ……… 41
1 ABREVIATURAS.
Abs Absorbancia
Ala, A Alanina
AMS 4-acetamido-4’-maleimidylstilbene-2,2’-disulfonic acid Cys, C Cisteína
DO Densidad óptica
DNA Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico) DTNB 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
DTT Dithiothreitol (Ditiotreitol)
EMSA Electrophoretic mobility shift assay (ensayo de retardo en gel)
Fur Ferric uptake regulator (Proteína reguladora de la captación de hierro) g Fuerza centrífuga relativa (gravedad)
h Hora
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
Km Kanamicina
kDa Kilo Dalton
L Litro
LB Luria Bertani (medio de cultivo)
mA Miliamperios
mg Miligramos
min Minutos
mL Mililitro
mM Concentración milimolar
ng Nanogramos
nm Nanometro
nM Concentración nanomolar O/N Overnight (toda la noche) PCC Pasteur Culture Colection
PCR Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) Pro, P Prolina
PSA Persulfato amónico
p/v Relación peso/volumen
RNA Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico) rpm Revolución por minuto
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico)
TCA Ácido tricarboxílico
TEMED N,N,N’,N’-tetra-metil-etilendiamina TRIS Tris-hidroximetil-aminometano
V Voltio
Val Valina
v/v Relación volumen/volumen WT Wild Type (proteína silvestre)
X Cualquier aminoácido distinto a cisteína Zur Zinc Uptake Regulator
ε Coeficiente de extinción molar
oC Grado centígrado
µg Microgramos
µL Microlitro
µM Concentración micromolar
2 1.- RESUMEN.
Las proteínas FUR (Ferric Uptake Regulator) pertenecen a una superfamilia de reguladores transcripcionales metalodependientes. Estas proteínas tienen una amplia distribución en el mundo procariota y juegan un papel clave en la regulación de la homeostasis del hierro y, otros metales como son el zinc, el manganeso o el níquel. Además, también, intervienen en la regulación de otros procesos celulares como son la defensa frente a estrés oxidativo, el metabolismo del nitrógeno, la diferenciación a heterocistos (en cianobacterias) o la virulencia de algunos microorganismos patógenos.
En la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 existen tres parálogos de la familia Fur: FurA encargada de la regulación y homeostasis del hierro; FurB o Zur responsable de la homeostasis del zinc y de la defensa frente al estrés oxidativo; FurC descrita, recientemente, como el regulador PerR de Anabaena sp. PCC 7120 implicado en la regulación de la respuesta a estrés oxidativo.
Estudios previos de caracterización bioquímica de la proteína FurB/Zur han sugerido que los residuos de cisteína que forman parte de los motivos C-X-X-C (Cys81, Cys84, Cys121 y Cys124) estarían implicados en la coordinación de un átomo de zinc estructural. Por otra parte, estudios previos realizados en el grupo de investigación sugieren que en esta familia de proteínas los residuos de cisteína juegan un papel crucial en la actividad y como posibles sensores redox o de hemo en las mismas. Por ello, y dado que no se ha resuelto la estructura de esta proteína, el objetivo principal de este trabajo es aportar nueva información al respecto a través de la caracterización de proteínas mutantes en los residuos de cisteína mencionados.
Los resultados obtenidos sugieren que los residuos de cisteína 81 y 84 (pertenecientes al primer motivo C-X-X-C) tienen una mayor probabilidad de estar implicados en la coordinación del zinc estructural, mientras que, los residuos 121 y 124 (del segundo motivo C-X-X-C) estarían formando un puente disulfuro intracatenario esencial para mantener la estructura secundaria de la proteína. Además, la mutación de cualquiera de los cuatro residuos de cisteína provoca una pérdida de la actividad biológica de las proteínas in vitro, pero no altera la capacidad que tienen estas proteínas para unirse al grupo hemo.
3 ABSTRACT.
FUR (Ferric Uptake Regulator) proteins are a superfamily of transcriptional regulators. These proteins are present in most of prokaryotic organisms and play a key role in the regualtion of iron homeostais and other metals such as zinc, manganese or nickel. FUR proteins also participate in the regulation of other cellular processes such as the defense against oxidative stress, nitrogen metabolism, the differentiation of heterocysts (in cyanobacteria) or the virulence of many pathogens.
The cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 has three Fur paralogues: FurA which is involved in the regulation of iron homeostasis; FurB or Zur is responsible of keeping zinc homeostasis and the defense against oxidative stress; FurC has been recently described as a PerR regulator in Anabaena sp. PCC 7120 involved in the regulation of peroxide stress response.
Previous studies of biochemical characterization of FurB/Zur have suggested that cysteine residues 81, 84, 121 and 124, that are part of the motif C-X-X-C, would be involved in the coordination of structural zinc. Since crystal structure of FurB is not available, the goal of this work is to provide new information about zinc coordination through the biochemical characterization of mutant proteins in the cysteine residues 81, 84, 121 and 124.
The results suggest that the residues of cysteine 81 and 84 (first motif C-X-X-C) would participate in the coordination of the structural zinc, while residues 121 and 124 (second motif C-X-X-C) would be involved in the formation of a disulfide bridge, essential to maintain the secondary structure of proteins. Besides, the mutation of any of the four residues of cysteine causes the loss of biological activity of the proteins in vitro, but do not change their ability to interact with heme group.
4 2.- INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES.
2.1.- Las cianobacterias.
2.1.1.- Características generales.
Las cianobacterias son organismos procariotas que pertenecen al dominio Bacteria y, cuya principal característica es que son organismos capaces de llevar a cabo la fotosíntesis oxigénica (Herrero, A. et al., 2001). Debido a esta característica, las cianobacterias fueron los primeros organismos responsables del aumento del oxígeno en la atmósfera, teniendo una gran importancia en la evolución del planeta Tierra y la vida que se desarrolla en él. Posteriormente con el paso del tiempo y la evolución, además de la contribución de las cianobacterias, la aparición de algas y plantas hizo que se aumentarán los niveles de oxígeno atmosférico hasta los actuales, gracias al proceso de la fotosíntesis (Xiong et al., 2002).
Actualmente las cianobacterias tienen una amplia distribución ecológica, pudiéndose encontrar en diferentes hábitats terrestres y marinos, incluyendo ambientes extremos como los desiertos, los lagos helados o las aguas termales. La morfología de éstas es muy variada, pudiendo ser unicelulares o filamentosas (Herrero, A. et al., 2001). Además de todo esto, las cianobacterias son organismos capaces de fijar el nitrógeno atmosférico, gracias a procesos de diferenciación y especialización celular (Herrero, A. et al., 2001) (Xiong et al., 2002).
A pesar de que existe una gran variedad morfológica en las cianobacterias, en general, todas poseen una pared celular (muy similar a la de los microorganismos Gram negativos) que define su tamaño y forma, y que, ayuda a controlar el tráfico de sustancias entre el exterior y el interior celular. Esta pared está compuesta por peptidoglicanos que envuelven la membrana plasmática (Drews and Weckesser, 1982). Recubriendo la capa de peptidoglicanos, hay una membrana externa compuesta por lipopolisacáridos y lipoproteínas, y, sobre esta membrana aparece la cubierta externa S que protege a la célula de las condiciones ambientales adversas (van de Meene et al., 2006).
Además, las cianobacterias tienen una gran cantidad de inclusiones intracelulares en su citoplasma como: gránulos de cianoficina, carboxisomas, gránulos de poliglucosa y poli-β- hidroxibutirato, gránulos de glucógeno, gránulos de polifosfato, gránulos lipídicos, vesículas gaseosas y ficobilisomas. La principal función de estas inclusiones es de almacenamiento de nutrientes, aunque, algunas de ellas pueden tener otro tipo de funciones (Stanier, 1988;
Adams and Duggan, 1999).
2.2.2.- Anabaena sp. PCC 7120.
La cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 es una cianobacteria filamentosa si se atiende a su morfología (Figura 1). Las cianobacterias filamentosas tienen la capacidad de generar células diferenciadas y especializadas (supervivencia, reproducción o metabolismo) a partir del tipo celular básico o célula vegetativa. (Flores, E. and Herrero, A., 2010). En el caso de Anabaena sp. PCC 7120 se pueden encontrar tres tipos diferentes de células especializadas por diferenciación: hormigonios, acinetos y heterocistos (responsables de la fijación del nitrógeno).
5
2.2.- Metabolismo del hierro y el zinc en cianobacterias.
2.2.1.- Importancia del hierro y el zinc.
El hierro y el zinc son dos metales de vital importancia para la mayoría de los microorganismos, puesto que intervienen en numerosos procesos biológicos.
El hierro es un metal que se encuentran entre los cuatro elementos más abundantes de la Tierra. En los microorganismos el hierro forma parte de una gran cantidad de proteínas implicadas en los procesos de fotosíntesis, respiración celular, metabolismo del nitrógeno, defensa contra el estrés oxidativo, biosíntesis de DNA y regulación de genes entre otros (Andrews et al., 2003).
A pesar de ser uno de los elementos más abundantes en la corteza terrestre, la gran reactividad del hierro con el oxígeno hace que sea un nutriente poco biodisponible, ya que, se generan óxidos e hidróxidos insolubles que no pueden ser metabolizados por los seres vivos (Andrews et al., 2003). Por otra parte, la presencia de oxígeno en la atmósfera convierte al hierro en una especie potencialmente nociva para las células, puesto que, durante su catálisis se produce la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante la reacción de Fenton.
Al contrario que el hierro, el zinc apenas está presente en la Tierra (es un metal traza); sin embargo, el zinc está implicado en numerosos procesos biológicos y su deficiencia puede causar alteraciones metabólicas considerables. Sus propiedades químicas lo convierten en un metal idóneo para formar parte de muchas proteínas y enzimas, en las cuáles juega un papel estructural, catalítico o regulador. Si la función del zinc es meramente estructural, éste se suele encontrar tetracoordinado por residuos de histidina, glutamato, aspartato o cisteína, en cambio, en las enzimas se suele encontrar en el centro catalítico coordinado por tres residuos (principalmente por cisteínas) y comportándose como un ácido de Lewis fuerte (Auld, 2001).
Figura 1. Filamentos de Anabena sp. PCC 7120. La flecha blanca señala un heterocisto terminal y la negra uno intercalado entre células vegetativas. La escala se indica sobre la barra blanca. (Flores, E. and Herrero, A., 2010).
6 Aunque en condiciones fisiológicas el zinc no es un metal redox activo, su capacidad para unirse y proteger grupos sulfhidrilo en las proteínas, así como, su participación en la biosíntesis de tioles de bajo peso molecular hacen que la homeostasis del zinc esté estrechamente relacionada con el mantenimiento de las condiciones redox en el interior celular (Sein- Echaluce et al., 2015).
2.2.2.- Regulación del metabolismo de metales por proteínas de la familia FUR (Ferric Uptake Regulator).
El hierro y el zinc son dos nutrientes esenciales para una gran mayoría de microorganismos, como ya se ha mencionado, por ello la regulación de su homeostasis es de vital importancia en función de la disponibilidad de los mismos. Esta regulación suele estar mediada, en numerosos organismos procariotas, por una familia de proteínas que se consideran reguladores transcripcionales metalodependientes (Lee and Helmann, 2007).
Los miembros de la familia FUR tienen una gran diversidad de funciones y, según el metal regulador que poseen, las proteínas de esta familia se pueden clasificar en distintas subfamilias (Lee and Helmann, 2007):
• Fur (Ferric uptake regulator): han dado nombre a la familia y regulan la homeostasis del hierro utilizando la molécula de hierro como metal regulador.
• Zur (Zinc uptake regulator): contienen zinc como metal regulador y se encargan de su homeostasis.
• Nur (Nickel Uptake ragulator): contienen níquel como metal regulador.
• Mur (Manganese uptake regulator): el manganeso es el metal regulador.
• PerR (Peroxide stress response regulator): contienen hierro como metal regulador, y, lo usan para catalizar reacciones de oxidación y detectar el estrés oxidativo.
• Irr (Iron response regulator): el hierro-hemínico es el cofactor, de modo, que se encargan de la detección de los niveles de hemo intracelular.
A pesar de la gran diversidad de proteínas que pertenecen a esta familia, las proteínas FUR, tienen una serie de características comunes. Las proteínas FUR se caracterizan por tener un bajo peso molecular (13-20 kDa) y por poseer en su estructura primaria un motivo rico en histidinas (HHXHX2CX2C) altamente conservado y otro motivo C-X-X-C, aunque menos conservado que el anterior, en el extremo C-terminal (ambos motivos constituyen sitios potenciales para la unión de algún metal). Además, estas proteínas pueden unirse al DNA gracias al dominio de reconocimiento y unión N-terminal. El dominio C-terminal es el encargado de la dimerización, generando así la forma activa de las proteínas. En términos generales, las proteínas FUR, tienen un átomo de zinc denominado como “estructural”, existiendo algunas excepciones como es el caso de la proteína FurA de Anabaena sp. PCC 7120 (Hernández et al., 2002; Fillat, 2014).
7 Las proteínas FUR al tener la capacidad de unirse al DNA funcionan como reguladores transcripcionales, más concretamente como represores clásicos de genes. Ante una situación en la que hay una alta concentración de metal, las proteínas FUR reprimen la transcripción de los genes encargados de captar dicho metal mediante la interacción con el co-represor metálico. Como ya se ha comentado, esta represión génica se puede llevar a cabo gracias a la unión de un dímero de FUR (forma activa) a los promotores de los genes que se necesitan silenciar. De esta forma se impide que la RNA polimerasa tenga acceso al DNA. Por el contrario, si la concentración de metal es baja, las proteínas FUR se encuentran en su forma apo (no tienen metal), y por tanto, no son activas. En esta última situación las proteínas FUR no son capaces de unirse al DNA, de modo que, permiten la transcripción de los genes diana (Andrews et al., 2003). Más recientemente, se ha encontrado que algunos miembros de esta familia pueden actuar también como aporreguladores y, que tanto el holo como el apo regualdor, también, pueden activar ciertos grupos de genes (González et al., 2012).
2.3.- Proteínas de la familia FUR en Anabaena sp. PCC 7120.
A través del análisis del genoma de Anabaena sp. PCC 7120 en busca del motivo rico en histidinas se pudieron encontrar tres parálogos FUR en esta especie, que se denominaron:
FurA (all169), FurB (all2473) y FurC (alr0957) (Hernández et al., 2004). A continuación se describen algunas de las características de estas proteínas, centrándose especialmente en FurB por ser la proteína objeto de estudio en el presente trabajo.
2.3.1.- FurA.
FurA es una proteína de 151 aminoácidos que contiene el motivo rico en histidinas propio de las proteínas FUR en su secuencia. Tiene un total de cinco residuos de cisteína cuatro de los cuales se encuentran formando parte de dos motivos C-X-X-C, quedando el último aislado.
Este motivo C-X-X-C se encuentra altamente conservado entre las distintas proteínas Fur de cianobacterias, por este motivo el papel que juegan estos residuos de cisteína ha sido ampliamente estudiado en el grupo de investigación (Tesis doctorales de Laura Botello-Morte y Silvia Pellicer). Además, recientemente se ha visto la implicación que tienen dichos residuos
Figura 2. Mecanismo clásico de regulación transcripcional mediada por Fur. A alta concentración de metal Fur se encuentran en su forma activa (dímeros) y se une a los promotores de los genes diana impidiendo su transcripción. A baja concentración del metal Fur no es activa, por tanto, no se une a los promotores permitiendo la expresión de los genes diana (Andrews et al., 2003).
8 en la actividad disulfuro reductasa de FurA (Botello-Morte et al., 2014; Botello-Morte et al., 2016).
MTVYTNTSLKAELNERGWRLTPQRETILHIFQELPQGEHLSAEDLYHRLEADGEGISLST 60 IYRTLKLMARMGILRELELGEGHKHYEINQPYPHHHHHLICVKCNSTIEFKNDSILKIGA 120 KTAQKEGFHLLDCQMTIHAVCPKCQRALMPL--- 151
FurA es el miembro de la familia Fur más abundante en Anabaena sp. PCC 7120, y, parece que es esencial para las cianobacterias, pues los intentos llevados a cabo para inactivar su gen han resultado en estirpes no viables. Participa en el control de la homeostasis del hierro mediante la regulación transcripcional de genes que codifican para proteínas de captación y almacenamiento del metal (González et al., 2012) (López-Gomollón et al., 2007). Además, en condiciones reductoras y en presencia del co-represor, FurA es capaz de unirse a su propio promotor, y, a los promotores de FurB, FurC y de todos los genes diana que regula (Hernández et al, 2006).
Cabe destacar que FurA también es capaz de interaccionar con el grupo hemo a través del motivo de unión Cys-Pro que posee. Esa interacción de la proteína con el grupo hemo impide que se una al DNA y, por lo tanto, su funcionamiento como represor transcripcional. De esta forma el grupo hemo estaría actuando como una molécula capaz de modular la actividad de FurA (Hernández et al., 2004).
2.3.2.- FurB.
2.3.2.1.- Aspectos generales.
La proteína FurB tiene un total de 132 aminoácidos, siendo cinco de ellos residuos de cisteína.
Como ocurre con FurA, uno de los residuos de cisteína (C93) queda aislado, mientras que, los cuatro restantes están formando parte de dos motivos C-X-X-C (C81-L-Q-C84; C121-G-K-C124).
MRAIRTRSQERILNLLQTIKQGISAQDIYVELRNRNQSMGLATVYRSLEALKLEGLVQVR 60 TLPNGEALYSLAQQDKHHLTCLQCGVSIPIHQCPVHNLEEQLQTAHKFKIFYHTLEFFGL 120 CGKCQMNHASEI--- 132
FurB se encarga de modular la homeostasis del zinc en Anabaena sp. PCC 7120, actuando como una proteína Zur. Esto implica que FurB/Zur se une a los promotores de los genes que regula de forma dependiente a la concentración de zinc, controlando, así, la captación y almacenamiento del metal en la cianobacteria. Si existe la presencia de un quelante de zinc, la afinidad de la proteína por el DNA se ve disminuida (Napolitano et al., 2012).
Además de regular transcripcionalmente genes del metabolismo del zinc, se ha visto que FurB también está implicado en la regulación de la respuesta a estrés oxidativo (Sein-Echaluce et al.,
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de FurA de Anabaena sp. PCC 7120. En rojo se resaltan los residuos de cisteína, y, en azul los residuos de histidina que forman parte del motivo H5X2CX2C.
Figura 4. Secuencia de aminoácidos de FurB de Anabaena sp. PCC 7120. En rojo se resaltan los residuos de cisteína, y, en azul los residuos de histidina que forman parte del motivo H2X2CX2C.
9 2015). Estudios de caracterización fenotípica de un mutante de sobreexpresión de la proteína FurB/Zur y, de otro mutante de delección del gen de la proteína FurB/Zur permitieron, en primer lugar, comprobar que la proteína FurB/Zur no era esencial para el crecimiento de Anabaena sp. PCC7120, ya que, aunque la tasa de crecimiento fotoautotrófico era menor en el mutante de delección respecto a la estirpe silvestre y de sobreexpresión, éste se podía mantener bajo las condiciones estándar de cultivo (Sein-Echaluce et al., 2015), cosa que no ocurre, por ejemplo, al tratar de obtener un mutante de delección para la proteína FurA.
Por otra parte, estudios realizados sobre los mutantes de sobreexpresión y delección de FurB/Zur mediante diversas técnicas de microscopia, han permitido conocer que se mantiene una uniformidad en el tamaño de las células, a pesar de la introducción de las mutaciones.
Además, la capacidad de autofluorescencia que poseen las cianobacterias debido a la presencia de la ficocianina (una ficobiliproteína que emite fluorescencia entorno a los 650 nm), no se vió alterada en los mutantes respecto a la proteína nativa. Una diferencia que se encontró entre los mutantes y la proteína nativa fue que el mutante de sobreexpresión tenía una mayor rugosidad en su superficie celular, mientras que, el mutante de delección poseía un septo más estrecho. Estas diferencias son debidas a la alteración de la expresión de genes que codifican proteínas de membrana y, cuya expresión está regulada por FurB (Sein-Echaluce et al., 2015) (Napolitano et al., 2012).
2.3.2.2.- Papel de FurB/Zur en la tolerancia a estrés oxidativo.
La delección del gen de la proteína FurB/Zur incrementa la sensibilidad al peróxido de hidrógeno (H2O2), mientras que, el exceso de expresión de la proteína provoca un aumento en la tolerancia al estrés oxidativo (Sein-Echaluce et al., 2015). Los niveles de actividad catalasa (una de las principales enzimas implicadas en la defensa frente a estrés oxidativo) son inversamente proporcionales a la cantidad de FurB/Zur intracelular, es decir, el mutante de delección presentaba una actividad catalasa superior en comparación con las estirpes nativa y
Figura 5. Fotografías de microscopia de barrido de los mutantes de delección (∆zur) y sobreexpresión (VCS2770), y de la estirpe nativa (PCC 7120). Análisis de la superficie de las diferentes estirpes en cultivos en fase exponencial. La barra blanca indica la escala (Sein-Echaluce et al., 2015).
10 de sobreexpresión, lo cual concuerda con el hecho de que en este mutante de delección los niveles de peróxido de hidrógeno endógenos se encontraran disminuidos respecto a la estirpe nativa. Sin embargo, en el caso del mutante de sobreexpresión los niveles de H2O2 endógenos, sorprendentemente, tenían el mismo orden de magnitud que aquellos encontrados en el mutante de delección. Esto sugiere que la sobreexpresión de la proteína FurB en cianobacterias conduce, de alguna forma, a una situación de menor estrés oxidativo (Sein- Echaluce et al., 2015). Por tanto, con todos los datos anteriores, se puede concluir que un nivel de expresión adecuado de FurB/Zur es necesario para un correcto control de la respuesta frente al estrés oxidativo (Sein-Echaluce et al., 2015), tal y como se pude observar en la figura 6 que se presenta a continuación:
Al igual que FurA, se ha descrito que FurB tiene la capacidad de unirse al resto de promotores de las proteínas Fur presentes en Anabaena sp. PCC 7120 (incluyendo el suyo propio). Además, se observó que ante una situación de ausencia de estrés oxidativo, los niveles de transcripción de la proteína FurB/Zur eran bajos, sin embargo, en condiciones de estrés oxidativo su transcripción aumentaba uniéndose de forma inespecífica al DNA y protegiéndolo, así, de la degradación provocada por radicales hidroxilo, o, acción de la enzima DNasaI. Debido a esto, se puede concluir que FurB/Zur actúa como un regulador génico, o bien, como protector del DNA en función de los niveles de expresión en las cianobacterias (López-Gomollón et al., 2009).
2.3.2.3.- Características estructurales de FurB/Zur.
La proteína FurB/Zur de Anabaena sp. PCC 7120 todavía no ha sido cristalizada, por tanto, toda la información conocida respecto a su estructura está basada en modelos estructurales construidos a partir de las estructuras de proteínas FurB de otros organismos, como Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, o, Sterptomyces coelicolor, que sí se han conseguido cristalizar. Además, un estudio del alineamiento de secuencias de algunas de las proteínas Zur conocidas hasta la fecha, ha permitido saber que existen cuatro residuos de cisteína altamente conservados entre las diferentes proteínas Zur que están formado parte de dos motivos C-X-X-C (Fillat, 2014). En el caso de la proteína FurB/Zur de Anabaena sp. PCC 7120, estos cuatro residuos se corresponderían con las cisteínas 81, 84, 121 y 124 (Tesis
Figura 6. Tolerancia al peróxido de hidrógeno de los mutantes de delección (∆zur) y sobreexpresión (VCS2770). Fotografía de la placa con los distintos cultivos y concentraciones de H2O2. Se muestran duplicados por cada cultivo y condición (Sein-Echaluce et al., 2015).
11 Doctoral Violeta Calvo Sein-Echaluce, 2016). La proximidad y disposición de estos residuos de cisteína en el modelo estructural de FurB/Zur, sugieren que éstos estarían participando en la coordinación del átomo de zinc estructural, característico de las proteínas de la familia FUR (Tesis Doctoral Violeta Calvo Sein-Echaluce, 2016). Esto último, además, estaría en concordancia con estudios que se han llevado a cabo con otras proteínas Zur en las que el zinc estructural suele encontrarse en un entorno tetraédrico, coordinado por cuatro residuos de cisteína (Fillat, 2014).
Un estudio de ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry) realizado sobre la proteína FurB/Zur de Anabaena sp. PCC 7120 confirmó la existencia de un átomo de zinc estructural en la proteína, ya que este metal se encontraba en una proporción de un mol por mol de proteína en su forma monomérica (Tesis Doctoral Violeta Calvo Sein-Echaluce, 2016).
Posteriormente, estudios de ITC (Isothermal Tritation Colorimetry), en presencia de un agente reductor, revelaron que aparte del sitio de unión estructural del zinc existían otros dos sitios de unión al metal, denominados como sitios reguladores; aunque todavía se desconoce la función de los mismos en el mecanismo de regulación transcripcional mediado por la proteína FurB/Zur. Puesto que el modelo estructural de FurB/Zur permitía pensar, casi con total seguridad, que los residuos de cisteína 81, 84, 121 y 124 estaban implicados en la coordinación del zinc estructural, se sugirió que la cisteína 93, que era el residuo que quedaba aislado (no formaba parte de ninguno de los motivos C-X-X-C), era la responsable de la unión del zinc en uno de los dos sitios reguladores, aunque no se podía descartar la participación de otros residuos tales como Asp75, His77, His96 e His133 que ocupan lugares equivalentes a los residuos encontrados en la coordinación del zinc regulador en las proteínas FurB/Zur de M.tuberculosis y S.coelicolor. Por otra parte y al igual que en el caso anterior, gracias a la equivalencia de residuos con estructuras de la proteína FurB/Zur ya resueltas, se pudo determinar que los residuos con más probabilidad de estar implicados en la coordinación del zinc en el tercer sitio de unión regulador son: Gln21, Gln 58, Gln73, Asp75 e His78 (Tesis Doctoral Violeta Calvo Sein-Echaluce, 2016).
Figura 7. Modelo tridimensional de FurB de Anabaena sp. PCC 7120. Modelo realizado con SWISS- MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) y editado con Swiss-PdbViewer v4.1 (http://spdbv.vital- it.ch/). Se muestran en rojo las hélices α y en amarillo las láminas β. Los residuos de cisteína de la proteína se encuentran señalados con el círculo y la flecha verdes (Tesis Doctoral Violeta Calvo Sein- Echaluce, 216).
12 Por último, cabe mencionar que FurB/Zur, también, puede unirse al grupo hemo a través del motivo de unión Cys (93)-Pro-Val. Esta interacción se ha descrito como una interacción que inhibe por completo la posibilidad de unión de la proteína al DNA, por ello se piensa que este motivo y el motivo Cys-Pro de FurA, son motivos reguladores que moderan la unión no covalente de proteínas al grupo hemo (López-Gomollón et al., 2009).
2.3.3.- FurC.
FurC consta de 149 aminoácidos. En este caso sólo tres de los residuos son de cisteína y ninguno de ellos forma parte del motivo C-X-X-C como ocurría con FurA y FurB.
MQQQAISTKPIRSLEDALERCQLLGMRVSRQRRFILELLWQANEHLSAREIYDRLNQQGK 60 DIGHTSVYQNLEALSTQGIIESIERCDGRLYGNISDSHSHVNCLDTNQILDVHIQLPEAF 120 IQEVEQRTGVKITDYSINFYGYRHPQDEE--- 149
A diferencia de las anteriores, FurC no es capaz de unirse a ninguno de los promotores de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120 en las condiciones determinadas para el resto de los parálogos (presencia de metal divalente y condiciones reductoras). Sin embargo, estudios de retardo en gel sugieren que la presencia de FurC sería necesaria para modular la actividad de FurA y FurB, aumentando la capacidad de FurA para unirse al DNA y, disminuyendo la de FurB (Hernández et al., 2004).
Figura 9. Secuencia de aminoácidos de FurC de Anabaena sp. PCC 7120. En rojo se resaltan los residuos de cisteína, y, en azul los residuos de histidina que forman parte del motivo HXHX2C X2T.
Figura 8. Esquema mostrando los sitios de unión a zinc propuestos. Se muestra el modelo de FurB realizado en base a la estructura de FurB de M.tuberculosis. Se muestran los residuos de cisteína de la proteína y la posible localización de los átomos de zinc (esferas azules). En verde se encuentra rodeado el sitio de unión al zinc estructural y en naranja se señalan los sitios reguladores. Además se muestran los residuos que probablemente estén implicados en la coordinación del metal en cada uno de los tres sitios de unión (Tesis Doctoral Violeta Calvo Sein-Echaluce, 2016).
13 Recientemente se ha propuesto que FurC actuaría como el regulador PerR de Anabaena sp.
PCC 7120, implicado en la regulación de la respuesta a estrés oxidativo por peróxido debido a la alta respuesta de este gen frente a dicha situación (Yingping et al, 2011).
La proteína FurC carece de un motivo Cys-Pro, o, Cys-Pro-Val en su secuencia, por tanto, y al contrario que FurA y FurB no es capaz de interaccionar con el grupo hemo (López-Gomollón et al., 2009).
Tabla 1: Propiedades bioquímicas de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120.
Proteína Gen PM (Da) ε 280
(M-1 cm-1) pI Cys Motivos
C-X-X-C His Motivo rico His
Unión hemo FurA all1691 17259 13760 6.8 5 2 12 H5X2CX2C + FurB all2473 15116 5720 8.7 5 2 7 H2X2CX2C + FurC alr0957 17328 13490 5.3 3 0 6 HXHX2CX2T -
14 3.- OBJETIVOS.
Este trabajo tiene como objetivo principal estudiar el papel que juegan los residuos de cisteína que forman parte de los motivos C-X-X-C en el funcionamiento y bioquímica del regulador transcripcional FurB de Anabaena sp. PCC 7120, incluyendo la coordinación del metal zinc, su actividad y su unión al grupo hemo. Para alcanzar dicho objetivo se han planteado los siguientes objetivos específicos:
Expresión recombinante y purificación de las proteínas simples mutantes para los motivos C-X-X-C.
Caracterización bioquímica de dichas proteínas mutantes.
Análisis funcional de las proteínas mutantes respecto a su unión a Zn2+ y a DNA.
15 4.- MATERIALES Y MÉTODOS.
4.1.- Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
Las cepas bacterianas que se utilizaron para la realización de este trabajo se recogen en la tabla 2.
Tabla 2: Cepas bacterianas usadas en el trabajo.
Cepa Bacteriana Principal Uso
E.coli DH5-α Replicación y mantenimiento del plásmido E.coli BL 21 Sobreexpresión proteína mutante
Para el cultivo de las cepas bacterianas nombradas anteriormente, se utilizó medio de cultivo Luria Bertani, LB (triptona 10 g/L; extracto de levadura 5 g/L; cloruro sódico 5 g/L). En caso de que éste se necesitase en su forma sólida lo que se hizo fue añadir agar 1.5 %. La mayoría de los cultivos líquidos se incubaron a 37 oC y con agitación a 200 rpm, a excepción de, los cultivos que se usaron para la expresión recombinante de las proteínas mutantes que fueron inducidos con IPTG e incubados a 15 oC y 200 rpm. En todos los casos los medios de cultivo fueron suplementados con el antibiótico kanamicina a una concentración final de 50 µg/mL.
4.2.- Obtención de células competentes y transformación por choque térmico.
Para utilizar la bacteria E. coli como herramienta de trabajo en biología molecular, ya sea para la multiplicación y purificación de vectores plasmídicos, o, para la sobreexpresión de proteínas recombinantes, es necesario que las células se encuentren en un estado de “competencia”, es decir, que sean capaces de incorporar, con relativa facilidad, DNA exógeno. En nuestro caso se trabajó con células quimiocompetentes, que, posteriormente fueron transformadas mediante choque térmico.
4.2.1.- Generación de E.coli quimiocompetentes.
A partir de un cultivo de E.coli DH5-α, o, BL 21 crecido en 10 mL de medio LB a 37 oC y 200 rpm durante toda la noche (O/N), se realizaron los siguientes pasos para conseguir células quimiocompetentes:
1. Se inocularon 200 mL de medio LB con 1 % del cultivo O/N y se incubó a 37 oC y 200 rpm hasta alcanzar una DO600= 0.35-0.45.
2. Alcanzada esa DO600, se incubó el cultivo en hielo durante 20 min.
3. Se centrifugó 15 min, 4000 rpm y 4 oC.
4. Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1-2 mL de buffer 1 (CaCl2
0.13M + MgCl2 0.15 M + NaAC 0.04 M) estéril y frío. Se completó hasta un volumen final de 40 mL.
5. Se centrifugó 15 min, 4000 rpm y 4 oC. Se desechó el sobrenandante.
6. Se resuspendió el precipitado en 4 mL de buffer 2 (CaCl2 0.13M + 15 % glicerol) estéril y frío.
7. Se hicieron alícuotas de 200 µL en tubos eppendorf estériles. Se guardaron dichas alícuotas a -80 oC.
16 4.2.2.- Transformación de cepas de E.coli con plásmidos mediante choque térmico.
Las células quimiocompetentes son capaces de internalizar en su interior DNA exógeno, y, así replicar el plásmido (DH5-α), o, expresar una proteína recombinante de interés (BL 21). Para transformar dichas células se siguieron los siguientes pasos:
1. Se descongeló la cantidad necesaria de stock de células quimiocompetentes en baño de hielo.
2. Se añadió sobre las células descongeladas 1 µL del plásmido de interés, se mezcló suavemente y se incubó 30 minutos en hielo.
3. Pasado el tiempo de incubación, se les aplica a las células el choque térmico a 42 oC durante 90 segundos.
4. Se transfirieron las células inmediatamente a hielo y se mantuvieron allí durante 90 segundos.
5. Se añadieron 800 µL de medio LB (sin antibiótico) sobre las células y se incubaron durante 1 hora a 37 oC y con agitación suave.
6. Transcurrido este tiempo de incubación se transfirió el cultivo a una placa de LB agar con antibiótico, se sembró el inóculo con ayuda de un asa de siembra y se incubó a 37 oC O/N.
4.3.- Preparación de plásmidos liofilizados.
En el presente trabajo se han analizado cuatro proteínas mutantes simples para los residuos de cisteína que forman parte de los motivos C-X-X-C (Cys81, Cys84, Cys121 y Cys124) del regulador transcripcional FurB de Anabaena sp. PCC 7120. Cada una de las versiones del gen de la proteína FurB mutado fue clonada en el vector pET28a (ANEXO Figura 1), de forma que, la proteína recombinante tuviera una cola de histidinas en el extremo N-terminal para facilitar su posterior purificación. Los plásmidos pET28a con el gen de FurB mutado se nos suministraron en forma de liofilizado. Estos plásmidos se utilizaron para la transformación de las cepas bacterianas de interés, por tanto, antes de usarlos hubo que reconstituirlos. Para llevar a cabo este proceso se realizaron las siguientes acciones:
1. El liofilizado se centrifugó durante un minuto, 6000 rpm, 4 oC.
2. Se añadieron 20 µL de agua MQ estéril para disolver el liofilizado.
3. Se agitó en vórtex durante un minuto.
4. Se dejó la mezcla 5 minutos a temperatura ambiente y se volvió a agitar un minuto en vórtex.
5. El plásmido ya está listo para su uso.
4.4.- Sobreexpresión de las proteínas recombinantes.
Una vez transformada la cepa de E.coli BL21 con el plásmido pET28a correspondiente, lo primero que hay que hacer es obtener la cantidad de biomasa suficiente e inducir la expresión de la proteína de interés de forma adecuada.
4.4.1.- Prueba de expresión.
La expresión de las proteínas recombinantes, que se encuentran en el plásmido pET28a, está bajo el control del promotor lac, el cual es inducible en presencia de isopropil-β-D-
17 tiogalactopiranósido,IPTG (ANEXO Figura 2). Antes de proceder a la producción de biomasa, se realizó una prueba de expresión a pequeña escala. Para ello se llevaron a cabo los siguientes pasos:
1. Se inocularon 10 mL de medio LB (con el antibiótico correspondiente) con una colonia de E.coli recién transformada. En total se inocularon 4 tubos Falcon de 10 mL de medio LB, cada uno con una de las colonias seleccionadas para analizar.
2. Se incubaron los 4 cultivos a 37 oC, 200 rpm, O/N. Hay que tener una réplica de cada una de las colonias seleccionadas para el análisis en una placa de LB/antibiótico (así se puede disponer de la que exprese más cuando sea necesario).
3. Se refrescaron los cultivos añadiendo 100 µL del cultivo O/N a 10 mL de medio LB (con el antibiótico correspondiente).
4. Se incubaron a 37 oC, 200 rpm hasta que la DO600= 0.5 (aprox. 2-3 horas).
5. Una vez alcanzada la DO600 (0.5), se traspasaron 5 mL de cada cultivo a un Falcon nuevo que se indujeron con 0.8 mM de IPTG (5 µL IPTG 0.8 M).
6. Se incubaron 8 Falcon (4 inducidos y 4 sin inducir) a 15 oC, 200 rpm, O/N.
7. Se comprobó por SDS-PAGE cuál de los cultivos sobreexpresa más cantidad de proteína, para lo que se prepararon las muestras de la siguiente forma:
Se añadió 1 mL de cada cultivo a un eppendorf y se centrifugó 5 minutos a velocidad máxima, eliminando el sobrenadante.
Se resuspendió el precipitado en 40 µL de agua MQ y 40 µL de tampón de carga, SB, 2X (10 mM Tris-HCl pH 6.8, SDS 1.6 %, glicerol 7 %, azul de bromofenol 0.01 % y β- mercaptoetanol 5 %).
Se hirvieron las muestras 5 minutos a 97 oC.
Se centrifugaron 5 minutos a velocidad máxima.
Se aplicaron 10 µL del sobrenadante en el pocillo del gel SDS-PAGE.
Se realizó la electroforesis a 35 mA/gel.
4.4.2.- Generación de biomasa e inducción.
Una vez se ha llevado a cabo la prueba de expresión y se ha comprobado que las células sobreexpresan de forma correcta la proteína recombinante de interés, se pasa a generar biomasa mediante el proceso que se describe a continuación:
1. Se seleccionó la colonia de mayor expresión y se inocularon 10 mL de medio LB (con antibiótico) con la réplica de esa colonia que se tiene en la placa de LB agar.
2. Se incubó a 37 oC, 200 rpm, O/N.
3. Se inocularon 10 mL del cultivo O/N en Erlenmeyers con 1 L de medio LB (con antibiótico) cada uno.
4. Se incubaron a 37 oC, 200 rpm hasta que la DO600= 0.5, cuando se alcanzó esa densidad óptica se indujo con IPTG 0.8 mM (1000 µL IPTG 0.8 M).
5. Se incubaron a 15 oC, 200 rpm, O/N.
6. Se recogieron las células por centrifugación a 8000 rpm, 10 min, 4 oC 7. Las células se congelaron a -20 oC hasta su uso.
18 4.4.3.- Electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE.
La electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) se utilizó para analizar el nivel de expresión de las proteínas mutantes en cada uno de los cultivos. Las muestras que se cargaron en un gel de poliacrilamida al 17 % (Tabla 3), y, se realizó la electroforesis a 35 mA/gel durante, aproximadamente, 45 min. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie durante 30 min en agitación, y, se destiñeron con una solución de decoloración.
Tabla 3: Composición de los geles de SDS-PAGE.
Componentes Gel separador 17 % Gel concentrador 5 %
Agua MQ 0.36 mL 1.4mL
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2.24 mL --
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 -- 0.25 mL
Bisacrilamida 30 % 3 mL 0.33 mL
SDS 10 % 30 µL 10 µL
PSA 10 % 20 µL 10 µL
TEMED 10 µL 10 µL
4.5- Purificación de las proteínas recombinantes.
4.5.1.- Lisis celular.
Antes de purificar la proteína es necesario lisar la biomasa. En este caso se va a hacer uso del proceso de sonicación. El protocolo de sonicación consta de los siguientes pasos:
1. Se descongeló la biomasa que se resuspendió en tampón de purificación (2 M cloruro de guanidinio, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, pH 8). Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo, PMSF, (inhibidor de serín-proteasas) a una concentración final de 1 mM.
2. Se sometió la suspensión celular a 10 ciclos de 45 segundos de sonicación con 30 segundos de reposo entre cada ciclo, empleando una amplitud del 90 % y ciclo 0.5.
3. Se centrifugó a 18000 rpm, 30 minutos, 4 oC.
4. Se filtró el extracto con un filtro de 0.22 µm. Se conservó el lisado en frío hasta su purificación.
4.5.2.- Empaquetado y equilibrado de la columna IMAC (Ion Metal Affinity Chromatography).
Para purificar la proteína FurB mutante, con cola de histidinas en el extremo N-terminal, del extracto proteico correspondiente se utilizó una columna de afinidad a un ión metálico empleando la matriz Chelating Sepharose Fast Flow. La preparación de la columna de afinidad incluye los siguientes pasos:
1. Se aplicó la matriz sobre la columna hasta conseguir unos 10 mL de resina empaquetada.
2. Se lavó con 10 volúmenes de agua MQ a 3 mL/min para eliminar el etanol en el que se preserva la matriz utilizada. La velocidad de flujo indicada anteriormente es que la se empleó durante todo el proceso de purificación.
3. Se aplicaron 3 volúmenes de ZnSO4 0.25 M para cargar la columna con el metal.
19 4. Se aplicaron 5 volúmenes de agua MQ para eliminar el exceso de metal no adherido.
5. Se aplicaron 5 volúmenes de tampón de purificación (2 M cloruro de guanidinio, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, pH 8) para equilibrar la columna.
4.5.3.- Purificación mediante IMAC-Zn2+.
Una vez preparada la columna con el metal al que se va a unir la proteína de interés, se procedió a cargar el extracto proteico:
1. Se aplicó el extracto a la columna con una velocidad de 3 mL/min. Es importante colectar y guardar la totalidad del volumen muerto para verificar que la proteína no se encuentra en esta fracción.
2. Se aplicó el tampón de lavado (35 mM de glicina en tampón de purificación) hasta que la DO280 del eluido tenga un valor menor a 0.1. La glicina provoca la elución de las proteínas unidas a la columna con baja afinidad por competición con éstas por los iones metálicos.
3. Se eluyó la proteína de interés usando un gradiente creciente de imidazol (0-1 M). El eluido se recogió en alícuotas de 1 mL aproximadamente que posteriormente se analizaron por electroforesis SDS-PAGE. Esto va a permitir ver qué alícuotas contienen la proteína de interés en mayor cantidad y si ésta está acompañada de alguna proteína no deseada. Las alícuotas con mayor cantidad de proteína se combinaron, dializaron y concentraron.
4. Se regeneró la columna pasando 5 volúmenes de agua MQ, 0.5 volúmenes de Strip Buffer (50 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 8), 3 volúmenes de NaCl 0.5 M, 5 volúmenes de agua MQ y 5 volúmenes de etanol al 20 %.
4.5.4.-Precipitación con TCA (ácido tricarboxílico).
Este procedimiento de precipitación con TCA 10 % es un paso previo que debe realizarse antes de cargar una muestra de proteína recién purificada en un gel de SDS-PAGE. Este requerimiento se debe al uso de cloruro de guanidinio en el tampón de purificación, dicho compuesto debe eliminarse para que no interfiera durante el proceso de electroforesis y se obtengan, así, resultados óptimos. Para ello se realizaron los siguientes pasos:
1. Se mezcló en un tubo eppendorf 15 µL de la muestra a analizar, 85 µL de agua MQ y 100 µL de TCA 10 %. Se dejó la mezcla incubando en hielo durante 15 minutos.
2. Transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugó a velocidad máxima, 10 min, 4 oC.
3. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron sobre el precipitado 200 µL de acetona fría.
4. Se centrifugó a velocidad máxima, 10 min, 4 oC.
5. Se eliminó el sobrenadante y se dejó secar el precipitado a temperatura ambiente (10 minutos aproximadamente para eliminar los restos de acetona).
6. Se resuspendió el precipitado en 10 µL de agua MQ y 10 µL de SB (tampón de carga) 2X.
7. Se hirvieron las muestras 5 minutos a 97 oC. Pasado este tiempo se incubaron durante un minuto en hielo.
8. Se centrifugó 5 minutos a velocidad máxima.
9. Se cargaron 15 µL del sobrenadante en el gel de electroforesis SDS-PAGE.
20 4.5.5.- Diálisis, cuantificación y concentración.
Una vez se han purificado las proteínas, y, se ha realizado una electroforesis de las alícuotas obtenidas en dicho proceso, aquellas con una mayor cantidad de proteína se combinaron y se dializaron. Las proteínas se sometieron a 4-5 ciclos de diálisis en 3 L de tampón acético-acetato 10 mM, pH 5.5 en frío. Tras estos ciclos de diálisis el contenido de la tripa se alicuotó y se conservó a - 20 oC.
Para cuantificar las proteínas se realizó un espectro de la mismas, y, mediante la ley de Lambert-Beer se calculó la concentración, conociendo el coeficiente de extinción molar teórico de las mismas (ε) y el valor de absorbancia a 280 nm.
( )
Si la concentración proteica obtenida es muy baja, se procede a concentrar las proteínas. Para ello se utilizó un dispositivo Amicon 3K (milipore).
4.6.- Caracterización bioquímica y actividad biológica de las proteínas recombinantes.
4.6.1.- Determinación de la presencia de Zn2+ por ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry).
Los análisis mediante ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry) permiten la determinación de la cantidad de zinc en una solución por mol de proteína. Las muestras que fueron analizadas mediante esta técnica se prepararon de la siguiente forma: sobre un tubo falcon de 15 mL se añadieron 7-8 mL de ácido nítrico 5 %, a continuación, se añadió la cantidad de proteína adecuada para ajustarla a una concentración mínima de 0.01 mg/mL, y, por último se enrasó hasta 10 mL con el ácido nítrico. Una vez obtenidos los resultados y conociendo el volumen de proteína que se añadió a los 10 mL de ácido nítrico y la concentración de ésta, se pudo calcular la cantidad de metal por mol de proteína que contenía la solución.
4.6.2- Ensayos de retardo en gel (EMSA).
El ensayo de retardo en gel permite evaluar la actividad biológica de proteínas de unión a DNA.
Esta técnica se basa en la interacción in vitro del regulador transcripcional con una secuencia de DNA diana conocida. Al producirse la interacción DNA-proteína en condiciones óptimas, se forman complejos cuyo peso molecular es mayor que aquel correspondiente al DNA libre, de modo que, dichos complejos pueden diferenciarse de este DNA por tener una menor movilidad electroforética. Para llevar a cabo este ensayo fue necesaria la presencia de un DNA competidor al cuál la proteína objeto de estudio no se una (en nuestro caso en particular se trata del promotor del gen nifJ de Anabaena sp.). La presencia de este DNA competidor sirvió para comprobar que la unión de la proteína al DNA diana no es inespecífica.
Se utilizaron geles no desnaturalizantes con un porcentaje de poliacrilamida del 6 %, ya que dicho entrecruzamiento es lo suficientemente bajo como para permitir la migración de los complejos DNA-proteína que se formen. La composición de los geles se detalla a continuación:
21 Tabla 4: Composición de los geles de EMSA.
REACTIVO VOLUMEN
Acrilamida:bisacrilamida 30% 2.06 mL Running Buffer 5X (30.28 g/L Tris,
142 g/L glicina, pH 8)
1.86 mL
Glicerol 50% 1.4 mL
Agua MQ 4.86 mL
PSA 10% 50 µL
TEMED 20 µL
Las mezclas de reacción con un volumen final de 20 µL tenían la siguiente composición:
100 ng de cada uno de los promotores (competidor o inespecífico y promotor objeto de estudio).
Proteína a diferentes concentraciones, indicadas en cada caso en concreto, en el rango de nM (nanomolar).
Tampón de unión 10X (100 mM bis-Tris pH 7.5, 400 mM KCl, 20 mM MgCl2.
6H2O y glicerol 50%).
0.05 mg/mL de BSA.
1 mM DTT.
5 µM ZnSO4.
H2O.
Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Transcurrido este tiempo se les añadieron 3 µL de tampón de carga 6X (35 mM bis-Tris pH 8, 30 % glicerol y 0.05 % azul de bromofenol).
Los geles de electroforesis se pre-corrieron durante 45 minutos a 60 V y 4 oC con buffer de electroforesis 6.05 g/L Tris, 28.4 g/L glicina, pH 8 (con esta operación se consiguen eliminar los residuos que pudieran dificultar la movilidad de las muestras y, además, se equilibra el gel con el tampón). Transcurrido el tiempo indicado, se cargaron las muestras en el gel y se realizó la electroforesis durante aproximadamente 2 horas a 90 V y 4 oC. Finalmente los geles se tiñeron en cubetas con 50 mL del buffer de electroforesis y 5 µL de SYBR Safe 10000X y se visualizaron en un dispositivo GelDoc.
4.7.3.- Dicroísmo circular.
El ensayo de dicroísmo circular proporciona un espectro del cual se puede obtener información sobre la estructura secundaria de la proteína objeto de estudio si se realiza sobre la región lejana del ultravioleta. Para realizar este espectro se partió de una solución proteica cuya concentración fue 20 µM. Se utilizó un espectro (Chirascan) y se realizaron barridos entre 195 nm y 265 nm.
4.6.4.- Ensayo de oligomerización.
En este ensayo se somete a las proteínas a condiciones reductoras y oxidantes para ver, mediante un análisis electroforético, la contribución de los posibles puentes disulfuro de las proteínas en la oligomerización de las mismas en solución. Para ello se usó el DTT como agente reductor y del peróxido de hidrógeno (H2O2) como oxidante.
22 En un volumen final de 20 µL se añadieron 5 µg de la proteína FurB nativa, así como, de los mutantes simples para las cisteínas: C81A, C84A, C121A y C124A. Estas muestras se trataron con DTT (concentración final 10 mM), con H2O2 (concentración final 1mM) o sin ninguno de los dos agentes anteriores (esta muestra sirvió como control). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Pasado este tiempo se añadieron 3 µL de SB (tampón de carga) 6X sin β-mercaptoetanol. Se incubaron las muestras a 97 oC durante 5 min y se centrifugaron otros 5 min a velocidad máxima antes de cargarlas en el gel SDS-PAGE.
4.6.5- Ensayo de unión al grupo hemo.
Para llevar a cabo este ensayo se usó de la espectroscopia diferencial.
1. En primer lugar se preparó una disolución de hemo en etanol e hidróxido de sodio, NaOH.
2. Una vez preparada la solución de hemo se hizo un espectro de la misma para calcular con exactitud la concentración de dicha solución, utilizando ley de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar del grupo hemo a 385 nm en NaOH.
3. A partir de la disolución de hemo anterior, se preparó una disolución de hemo 2 µM en Tris 50 mM pH 8.
4. Partiendo de una solución de proteína a una concentración de 25 µM, se fueron haciendo adiciones de 1 µL de proteína sobre la solución de hemo 2 µM hasta alcanzar los 6 µL añadidos.
5. A partir de este momento, se adicionaron 2 µL de proteína hasta alcanzar la saturación (momento en el que la variación de absorbancia entre el máximo y el mínimo se mantiene constante).
Para que la cubeta de referencia tuviera, siempre, el mismo volumen que la cubeta con la muestra, se añadió sobre la primera la misma cantidad de buffer que de proteína en la segunda. El buffer que se añadió fue aquel en el cual se encontraban las proteínas disueltas (acético-acetato 10 mM pH 5.5).
4.7.- Obtención de DNA genómico de Anabaena sp. y promotores.
El DNA genómico de Anabaena sp. se utilizó en el presente trabajo para amplificar diversos promotores de interés.
4.7.1.-Extracción de DNA genómico de Anabaena sp.
Para obtener dicho DNA se necesita un cultivo de Anabaena sp. con un contenido en clorofila de 5-6 µg/mL y una DO600 = 1.5. A partir de 50 mL de un cultivo de Anabaena sp. en las condiciones citadas, se llevaron a cabo los siguientes pasos:
1. Se centrifugó en tubos Falcon a 4000 rpm, 5 min y temperatura ambiente.
2. Se decantó el sobrenadante y se repartieron las células en dos tubos eppendorf con tapón de seguridad.
3. Se resuspendieron en 400 µL de Tris-HCl 10 mM pH 8 y EDTA 0.1 mM.
4. Se añadieron 20 µL de SDS 10 %, 450 µL de fenol-cloroformo (1:1 v/v) y 150 µL de perlas de vidrio (3-4 puntas de espátula).
23 5. Las células se rompieron mediante 4 ciclos de 1 minuto de agitación en vórtex y un
minuto de reposo en hielo.
6. Se centrifugó a 13000 rpm, 15 min y 4oC. Se transfirió la parte superior acuosa a tubos eppendorf nuevos.
7. Se lavaron las células con 1 volumen de fenol, 1 volumen de fenol-cloroformo (1:1 v/v) y dos veces con 1 volumen de cloroformo. En todos los lavados se recuperó la fase superior acuosa.
8. A la última fase acuosa se le añadió 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y dos volúmenes de etanol absoluto frío. Se incubó la mezcla durante 1 h a - 80 oC para precipitar el DNA.
9. Transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugó a velocidad máxima, 15 min y 4oC.
10. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado con etanol 70 % frío. Se resuspendió en 30 µL de agua MQ estéril.
11. Se cuantificó el DNA cromosómico obtenido en nanodrop (NanoVue Plus de GE Healthcare).
4.7.2.- Amplificación de promotores mediante PCR.
En este trabajo se utilizaron dos promotores de genes de Anabaena sp. Estos dos promotores se corresponden con los genes nifJ y all4725 (secuencias en ANEXO Tabla 1). La mezcla de PCR se preparó añadiendo las cantidades que aparecen en la tabla 5.
Tabla 5: Composición de la mezcla de PCR para un volumen de 50 µL.
Reactivo Volumen
Agua MQ 36.7 µL
Buffer 10X 5 µL
MgCl 2 50 mM 1.5 µL
dNTPs 2.5 mM 1 µL
Primer directo 10 pmol/µL 1.4 µL
Primer reverso 10 pmol/µL 1.4 µL
DNA genómico 2 µL
Taq polimerasa 1 µL
El programa de PCR utilizado tiene una etapa inicial de desnaturalización del DNA a 95 oC durante 1 min, seguida por 25 ciclos con una fase de 95 °C durante 30 segundos (desnaturalización), otra de 52 oC de 1 minuto (hibridación de primers) y una última etapa de extensión a 72 oC durante 1 minuto cada uno. La etapa de extensión final a 72 oC tiene una duración de 7 minutos. Una vez finalizado el proceso de amplificación las muestras se mantuvieron a 4 oC.
Por otro lado, las muestras amplificadas se cuantificaron en el nanodrop (NanoVue Plus de GE Healthcare). Posteriormente, los promotores amplificados se purificaron con el kit de purificación de DNA GE Healthcare según las indicaciones del fabricante.
24 5.-RESULTADOS.
5.1.- Sobreexpresión de las proteínas recombinantes.
Para la sobreexpresión de las proteínas FurB mutantes: C81A, C84A, C121A y C124A, se transformaron, mediante choque térmico, células competentes de E.coli BL 21 con plásmidos pET28a conteniendo el gen furB con cada una de las mutaciones. Las células transformadas se dejaron crecer hasta alcanzar la fase exponencial (DO600 = 0.6-0.8), momento en que se indujo la expresión de las proteínas mutantes con IPTG 0.8 mM durante toda la noche a 15 oC. El resultado obtenido se visualizó y analizó a través de una electroforesis desnaturalizante en gel SDS-PAGE 17 % (Figura 10).
Como se puede observar en la figura 10, en todos los casos las proteínas mutantes se sobreexpresaron de forma satisfactoria bajo las condiciones de cultivo utilizadas (inducción durante toda la noche con IPTG 0.8 mM a 15 oC). En todos los geles (Figura 10) se puede ver Figura 10. Sobreexpresión de las proteínas FurB C81A (A), C84A (B), C121A (C) y C124A (D) en E.coli BL 21. Se muestra el gel SDS-PAGE 17 % teñido con Azul de Coomassie. El primer carril contiene el marcador de peso molecular, MW (Low Molecular Weight Calibration kit, GE Healthcare) en kDa, y el resto de carriles contienen los extractos celulares correspondientes a 1 mL de muestra de cada uno de los cultivos. La indicación + se encuentra en los carriles que contienen una muestra de cultivo inducida con 0.8 mM de IPTG O/N. Se rodea en rojo la colonia seleccionada, en cada caso, para la generación de biomasa.
25 una banda más gruesa entorno a los 17 kDa correspondiente con las proteínas mutantes FurB C81A, C84A, C121A y C124A con cola de histidinas.
Para cada una de las proteínas mutantes se seleccionó aquella colonia con una mayor sobreexpresión con el objetivo de cultivarla a gran escala, para obtener la cantidad de biomasa suficiente, que permitiera su posterior purificación. En el caso del mutante C81A se eligió la colonia 1. La colonia 4 fue la escogida en el caso del mutante C84A. Por último las colonias 1 y 3 fueron las elegidas para los mutantes C121A y C124A respectivamente
.
5.2.- Purificación de las proteínas mutantes FurB C81A, C84A, C121A y C124A.
Tras haber seleccionado la colonia de mayor expresión para cada una de las proteínas mutantes, se cultivaron 5 L de medio LB/Km, por mutante, para recoger la biomasa y, así, purificar las proteínas. Las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad por unión a metales, en nuestro caso el zinc (IMAC-Zn2+), empleando un tampón de purificación con cloruro de guanidinio 2 M. A pesar de que el cloruro de guanidinio es un agente desnaturalizante, en el grupo de investigación ya se había purificado, previamente, la proteína FurB nativa y fue con este tampón con el que mejores resultados se obtuvieron (Pellicer et al., 2010).
Una vez finalizada la purificación, se realizó un análisis mediante electroforesis en gel SDS- PAGE 17 % de las fracciones obtenidas en el proceso, con el objeto de comprobar en cuales de ellas se encontraban las proteínas de interés (Figura 11).
