UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
PROGRAMA DE DOCTORADO DE BIOCIENCIAS MOLECULARES
Funciones y regulación de la autofagia y la senescencia celular durante el desarrollo embrionario temprano del oído interno
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Sara Pulido Sánchez
Madrid, 2019
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
TESIS DOCTORAL
Funciones y regulación de la autofagia y la senescencia celular durante el desarrollo embrionario temprano del oído interno
Sara Pulido Sánchez
Bajo la dirección de las Doctoras
Isabel Varela Nieto Marta Magariños Sánchez
RESUMEN
El desarrollo del oído interno requiere de la participación simultánea o encadenada de procesos celulares como la autofagia y la senescencia, que son regulados por factores de crecimiento y factores de transcripción. El factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) es uno de los factores que regula el desarrollo ótico en aves y es esencial para mantener la función auditiva en mamíferos. Favorece la supervivencia celular y, en función del contexto celular, se ha descrito que aumenta o reduce el flujo autofágico, mientras que activa rutas intracelulares que inhiben la senescencia celular.
Se desconoce si el IGF-1 regula estos procesos celulares en el otocisto.
En este trabajo, se ha abordado el estudio de la función de la autofagia y la senescencia celular durante el desarrollo temprano del oído interno en Gallus gallus, así como su posible regulación por el IGF-1 y el factor de crecimiento transformante beta tipo 2 (TGFβ2). En paralelo, se ha realizado el estudio de la regulación de la autofagia en la cóclea adulta de Mus musculus y su posible regulación por el IGF-1 en ratones deficientes para su receptor, IGF1R.
Los resultados obtenidos confirman que la autofagia y la senescencia celular contribuyen al correcto desarrollo del oído interno en Gallus gallus. La autofagia participa en dos etapas de la neurogénesis ótica, está regulada negativamente por el IGF-1 y junto con la senescencia celular favorece la morfogénesis y diferenciación de la región dorsal del otocisto. El IGF-1 promueve la proliferación y la supervivencia de los progenitores óticos mediante su receptor de alta afinidad, IGF1R. Por otra parte, el TGFβ2 y la vía PI3K/AKT regulan la senescencia celular, un programa imprescindible para la morfogénesis del conducto endolinfático. Además, la autofagia está presente en la cóclea adulta de ratón y está regulada en función de la edad.
En resumen, durante el desarrollo temprano del oído interno la autofagia y la senescencia celular actúan de forma coordinada junto con la apoptosis y la proliferación favoreciendo la morfogénesis y la diferenciación del otocisto. Estos procesos muestran una regulación espacio temporal y están controlados por los factores IGF-1 y TGFβ2.
ABSTRACT
Inner ear development requires simultaneous and highly coordinated participation of cellular processes such as autophagy and cellular senescence which are regulated by growth factors and transcription regulators. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) is one of the factors that regulate otic development in birds and it is essential to maintain the auditory function in mammals. IGF-1 promotes cell survival and, depending on the cellular context, it has been reported to increase or reduce autophagic flux, while activates intracellular pathways that inhibit cellular senescence. Whether IGF-1 regulates these cellular processes at the otocyst remains unknown.
In this work, we have addressed autophagy and cellular senescence functions during early inner ear development in Gallus gallus, as well as its possible regulation by IGF-1 and transforming growth factor beta 2 (TGFβ2). Furthermore, we have studied autophagy regulation in the Mus musculus adult cochlea along ageing and its possible regulation by IGF-1 in Igf1r-deficient mouse.
The results obtained support that both autophagy and cellular senescence contribute to inner ear proper development in Gallus gallus. Autophagy is involved in two stages of otic neurogenesis, and it is negatively regulated by IGF-1, in coordination with cellular senescence promotes morphogenesis and differentiation of the otocyst dorsal region. IGF-1 promotes otic progenitors proliferation and survival through its high-affinity receptor, IGF1R. On the other hand, TGFβ2 and PI3K/AKT pathways regulate cellular senescence which is essential for endolymphatic duct morphogenesis.
Additionally, autophagy machinery genes are expressed and age-regulated during the lifelong of the mouse cochlea
To conclude, autophagy and cellular senescence act during inner ear development in coordination with apoptosis and proliferation favouring morphogenesis and differentiation of the otic primordium. This biological processes are spatio-temporal regulated and are controlled by IGF-1 and TGFβ2.
CLAVE DE ABREVIATURAS
3
3-MA 3-Metiladenina
A
AER Cresta ectodérmica apical AKT Proteína quinasa B
Ambra1 del inglés, Activating Molecule of Beclin-1 Regulated Autophagy (molécula activada en autofagia regulada por Beclin1)
AMC Autofagia mediada por chaperonas AP Eje antero-posterior
Atg del inglés Autophagy related genes (genes relacionados con la autofagia)
ATP trifosfato de adenosina
B
BAD del inglés Bcl2-associated agonist of cell death (proteína proapoptótica promotora de la muerte asociada a Bcl-xl/Bcl-2) BAF-A1 del inglés Bafilomycin-A1(Bafilomicina A1)
BMP Proteína morfogenética ósea BOC Inhibidor de caspasas Boc-D-FMK BSA Albúmina de suero bovino
C
CCE Células ciliadas externas CCI Células ciliadas internas
CDK Inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas Ce Conducto endolinfático
D
D Dorsal
DAPI 4’, 6’-diamino-2-fenilindol
Del Delaminación
DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol
DV Eje dorso-ventral
E
E Día de desarrollo embrionario ECL Quimioluminiscencia enzimática EdU 5-ethynyl-2’-deoxyuridine
ERK Quinasa regulada por señales extracelulares
F
FGF Factor de crecimiento de fibroblastos
FOXO del inglés Transcription Factor forkhead box O
G
GAV Ganglio acústico vestibular
GH Hormona hipofisaria del crecimiento
GRB2 Proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 2 GSK3 Glucógeno sintasa quinasa 3
H
HH Estadio embrionario según la clasificación de Hamburger y Hamilton (1951)
HRP del inglés HorseRadish Peroxidase (peroxidasa de rábano)
I
IGF-1 Factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1
IGF1R Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 IGF-2 Factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2
IGF2R Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 2 IGFBP Proteínas transportadoras de IGF
IR Receptor de la insulina
IRS Sustratos del receptor de insulina
K
kDa Kilodalton
L
LAMP-A2 Proteína asociada a la membrana lisosomal tipo 2A
LC3 del inglés, Microtubule-associated protein 1 light chain 3 (cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos 1)
M
ML Eje medio-lateral
MMP3 Metaloproteasa de la matriz extracelular 3 mTOR Diana de la rapamicina en mamíferos
mTOR-C1 Complejo 1 de la diana de la rapamicina en mamíferos
N
nav Navitoclax
NBe Neuroblastos epiteliales NBg Neuroblastos ganglionares
NI Neurona inmadura
NM Neurona madura
NVP NVP-AEW541
P
P Día de desarrollo postnatal p62/SQSTM1 Proteína del secuestrosoma 1 palbo Palbociclib
PBS Tampón fosfato salino, 0,1 M, pH 7,4 PBS-T PBS con Tritón al 1%
PBS-Tw PBS con Tween20 al 0,05%
PDK Quinasas dependientes de fosfoinositoles PE Fosfatidiletanolamina
PI Fosfatidilinositol
PI3K Fosfatidilinositol-3-quinasa
PI3KC1 Complejo fosfatidilinositol-3-quinasa de clase 1 PI3KC3 Complejo fosfatidilinositol 3 quinasa de clase 3 PIP2 Fosfatidilinositol-3,4-bifosfato
PIP3 Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato PM Progenitores Multipotentes PS Fosfatidilserina
R
RAP del inglés Rapamycin (rapamicina)
RM Rampa media
RQ Cuantificación relativa
RT Rampa timpánica
RV Rampa vestibular
S
SAFH del inglés Senescence-associated heterochromatin foci (focos de heterocromatina asociados a la senescencia)
SASP del inglés Senescence Associated Secretory Phenotype (fenotipo secretor asociado a senescencia)
SAβG del inglés Senescence Associated β-Galactosidase (tinción β- galactosidasa asociada a senescencia)
SB SB431542
SFM del inglés Serum Free Medium (medio sin suero) SHC del inglés Src homology 2 domain containing Shh del inglés Sonic hedgehog
SIPS del inglés Stress-Induced Premature Senescence (senescencia prematura inducida por estrés)
SOX2 del inglés Sex determining Region Y-box 2
T
TdT del inglés Terminal Deoxinucleotidyl Transferase (enzima desoxinucleotidil-transferasa terminal)
TGFβ Factor de crecimiento transformante β
TGFβ2 Factor de crecimiento transformante beta tipo 2
TGFβR1 Receptor tipo 1 del factor de crecimiento transformante beta TGFβR2 Receptor tipo 2 del factor de crecimiento transformante beta
TK Tirosina quinasa
Trk Receptor de neurotrofinas con actividad tirosina quinasa TuJ-1 Tubulina específica de neuronas tipo β-III
TUNEL del inglés Tdt-mediated dUTP nick-end labelling
U
ULK-1 Complejo 1 de la quinasa tipo UNC 51
V
V Ventral
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
VO Vesícula ótica
W
WB del inglés Western blotting WNT del inglés Wingless/Wnt
ÍNDICE
RESUMEN ...i
ABSTRACT ... iii
CLAVE DE ABREVIATURAS ... v
INTRODUCCIÓN ... 19
1. El oído de vertebrados ... 19
1.1. Anatomía y función del oído interno ... 19
1.2. Desarrollo embrionario del oído interno ... 21
1.2.1. Inducción de la placoda ótica ... 21
1.2.2. Morfogénesis y regionalización de la vesícula ótica ... 22
1.2.3. Formación del ganglio acústico-vestibular ... 23
2. Autofagia ... 25
2.1. Proceso, etapas y maquinaria molecular ... 25
2.2. Funciones celulares de la autofagia ... 28
2.3. Papel de la autofagia durante el desarrollo embrionario y en el adulto ... 28
3. Senescencia celular ... 29
3.1. Características de las células senescentes ... 30
3.2. Funciones de la senescencia celular ... 31
3.3. La senescencia celular programada durante el desarrollo ... 32
3.4. El factor de crecimiento transformante beta tipo 2 (TGFβ2) ... 33
4. El factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1)... 34
4.1. Componentes del sistema IGF y rutas de señalización del IGF-1 ... 34
4.2. El IGF-1 en el oído interno ... 37
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ... 41
MATERIALES Y MÉTODOS ... 45
1. Embriones de Gallus gallus ... 45
1.1 Disección de la vesícula ótica ... 45
1.2 Cultivos organotípicos de vesícula ótica ... 45
1.3 Tratamientos de los cultivos ... 45
1.4 Técnicas de inmunodetección ... 47
1.4.1 Inmunofluorescencia ... 47
1.4.2 Estudio de la muerte celular mediante la técnica de TUNEL ... 48
xiv
1.4.3 Estudio de la proliferación celular mediante la incorporación de EdU ... 49
1.4.4 Estudio de la senescencia mediante tinción con SAβG ... 49
1.4.5 Cuantificación y análisis estadístico ... 49
1.5 Estudio de la expresión génica ... 50
1.6 Estudio de los niveles y activación de proteínas ... 52
2. Ratones modificados genéticamente y su genotipado ... 53
2.1 Estudio de los niveles y activación de proteínas en cóclea ... 53
2.2 Estudio de la expresión génica ... 54
RESULTADOS ... 57
1. IGF-1 y autofagia durante el desarrollo temprano del oído interno ... 57
1.1 Expresión del sistema IGF en la vesícula ótica y especificidad de acciones vía su receptor de alta afinidad IGF1R ... 57
1.2 La autofagia coopera con la apoptosis durante el desarrollo del oído interno en el embrión de Gallus gallus ... 60
1.3 El IGF-1 promueve la supervivencia celular cuando la autofagia está bloqueada 61 1.4 El IGF-1 regula negativamente la autofagia ... 64
1.5 La autofagia es necesaria para la diferenciación neural ... 65
2. Estudio de la autofagia celular en la cóclea del ratón ... 67
2.1 Expresión coclear de genes de autofagia ... 67
2.2 Estudio del flujo autofágico en la cóclea del ratón nulo condicional para Igf1r (UBC-CreERT2; Igf1rfl/+) ... 68
3 La senescencia celular durante el desarrollo temprano del oído interno ... 71
3.1 Presencia de células senescentes durante el desarrollo del oído interno ... 71
3.2 La senescencia celular es necesaria para la correcta morfogénesis del oído interno ... 73
3.3 La apoptosis y la senescencia durante la morfogénesis de la vesícula ótica .... 76
3.4 Rutas implicadas en la regulación de la senescencia celular ... 77
3.4.1 El TGFβ2 participa en la morfogénesis de la vesícula ótica a través de la inducción de senescencia ... 78
3.4.2 La ruta PI3K/AKT inhibe la senescencia celular durante el desarrollo del oído interno ... 80
DISCUSIÓN ... 85
1. Autofagia e IGF-1 en el oído interno... 85
1.1. Las acciones del IGF-1 durante el desarrollo del oído interno están mediadas por su receptor de alta afinidad IGF1R ... 85
1.2. El IGF-1 regula la autofagia durante el desarrollo temprano del oído interno . 87
1.3. El IGF-1 y autofagia durante la neurogénesis ótica ... 89
1.4. La autofagia en la cóclea de ratón ... 91
1.5. El IGF-1 y la autofagia en cóclea de ratón ... 92
2. Senescencia celular programada durante el desarrollo del oído interno ... 93
2.1. La senescencia celular programada participa en la morfogénesis de la región dorsal de la vesícula ótica ... 93
2.2. El TGFβ2 induce la senescencia durante el desarrollo del oído interno y contribuye a la morfogénesis del conducto endolinfático ... 96
2.3. La ruta PI3K/AKT está implicada en la modulación de la senescencia en el desarrollo del oído interno ... 97
3. Morfogénesis regional temprana del oído interno: coordinación de senescencia, apoptosis, autofagia y diferenciación. ... 98
CONCLUSIONES ... 103
CONCLUSIONS ... 107
BIBLIOGRAFÍA ... 111
ANEXO I: PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS DOCTORAL ... 123
ANEXO II: OTRAS PUBLICACIONES ... 161
Introducción
INTRODUCCIÓN
1. El oído de vertebrados
El oído de los vertebrados es el órgano sensorial encargado de la audición y del equilibrio. Se divide en oído externo, medio e interno. El oído externo capta las ondas sonoras que se transmiten a través del conducto auditivo externo hacia la membrana timpánica para llegar al oído medio. En el oído medio el sonido se transmite por la cadena de huesecillos, formada por martillo, yunque y estribo, que en su extremo final conecta con el oído interno (Ekdale, 2016).
1.1. Anatomía y función del oído interno
El oído interno está localizado en el interior del hueso temporal y contiene los órganos responsables de la audición y el equilibrio. La cóclea es la responsable de la audición y se divide en tres rampas helicoidales y paralelas denominadas: rampa vestibular (RV), media (RM) y timpánica (RT) (Figura 1A). Estas rampas tienen en su interior líquido denominado perilinfa o endolinfa dependiendo de su composición iónica. Las RV y RT contienen perilinfa mientras que la RM contiene endolinfa, las RV y RM están separadas por la membrana de Reissner, mientras que la membrana basilar separa las RT y RM. Las principales zonas funcionales de la cóclea son: el órgano de Corti, la pared lateral, formada por el ligamento espiral y la estría vascular, y el ganglio espiral. El órgano de Corti o receptor auditivo se encuentra dentro de la RM, sobre la membrana basilar. Es un receptor me c a n osensorial y está formado por dos tipos principales de células: las células ciliadas y las células de soporte (Figura 1B) (Ekdale, 2016). Las células ciliadas son células mecanorreceptoras implicadas en la transducción del sonido. Se distinguen dos tipos: las células ciliadas internas (CCI) y las externas (CCE), se disponen en el órgano de Corti formando una fila o tres filas respectivamente y están separadas por células de soporte denominadas células pilares (Magariños et al., 2012). Cuando se produce un estímulo acústico, la onda sonora es conducida en forma de vibración por el oído externo, atraviesa el oído medio y llega al oído interno. Se genera una onda en la perilinfa que viaja a lo largo de la cóclea. Esto produce un desplazamiento del órgano de Corti y de los estereocilios de las CCI. Las CCI sufren cambios en el voltaje de la membrana y generan una frecuencia de potenciales de acción que será transmitida mediante sinapsis químicas a las neuronas del ganglio espiral coclear que conectan con los núcleos correspondientes en el sistema nervioso central hasta llegar a la corteza auditiva.
Introducción
20
Figura 1. El oído interno de vertebrados. A) Esquema del oído interno de mamíferos. B) Sección sagital de la cóclea. Abreviaturas: CCI: células ciliadas internas; CCE: células ciliadas externas. Adaptada de Nakashima et al., 2016 (Nakashima et al., 2016).
El aparato vestibular es el encargado del equilibrio y de la detección de la aceleración lineal y angular. Está formado por los conductos semicirculares, el sáculo y el utrículo. El sáculo y el utrículo contienen células ciliadas similares a las del órgano de Corti formando las máculas. Los conductos semicirculares contienen tres órganos sensoriales s i mil ar es denominados crestas ampulares (Ekdale, 2016).
Tanto la cóclea como el vestíbulo están bañados por la endolinfa, un líquido que presenta una concentración alta de iones de potasio (K+) y baja de iones de sodio (Na+) y que es esencial para el correcto funcionamiento de estos dos órganos. El saco endolinfático es una región no sensorial del oído interno que se encuentra en la cavidad craneal y está conectado mediante el conducto endolinfático con el resto del oído interno (Figura 1A) (Barbara et al., 1988). En el saco endolinfático se produce la
Introducción
reabsorción de la endolinfa, se controla su volumen y presión y es esencial para su homeostasis (Erwall et al., 2000, Salt, 2001, Inamoto et al., 2009). La formación del saco endolinfático es crucial para la adquisición de las funciones auditiva y del equilibrio (Kim and Wangemann, 2010, Li et al., 2013, Honda et al., 2017).
1.2. Desarrollo embrionario del oído interno
Las etapas tempranas del desarrollo del oído interno son muy similares entre las distintas especies de vertebrados. Los progenitores de las células sensoriales y de soporte del oído interno, así como, de las neuronas del ganglio acústico-vestibular se originan a partir de la región pre-placodial ótica del ectodermo. Esta región se engrosa dando lugar a la denominada placoda ótica.
1.2.1. Inducción de la placoda ótica
La placoda ótica se induce en el ectodermo localizado en el romboencéfalo entre los rombómeros 5 y 6. Precisa de la acción coordinada de la expresión de genes reguladores pre-placodiales que definen programas genéticos específicos de destino ótico así como de señales inductoras procedentes de los tejidos ectodérmicos y mesodérmicos adyacentes. La zona pre-placodial expresa factores de transcripción que definen la placoda ótica, entre los que se incluyen genes de la familia Dlx (Esterberg and Fritz, 2009) y los genes Sox9a y Foxi1 (Solomon et al., 2004). Por otro lado, el mesodermo y el ectodermo secretan distintos factores de crecimiento de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF10, FGF19, FGF3) que actúan como señales inductivas óticas (Anwar et al., 2017). En la placoda ótica, comienza a distinguirse un dominio neurosensorial, del cual derivaran las células sensoriales y las neuronas, y un dominio no neurosensorial que dará lugar al resto de células que conforman el oído interno adulto (Bissonnette and Fekete, 1996, Adam et al., 1998). Uno de los factores de transcripción que se expresan en el dominio neurosensorial es SOX2 (Sex determining Region Y-box 2) (Dvorakova et al., 2016). SOX2 pertenece a la subfamilia B1 de proteínas SOX. Los progenitores sensoriales y neuronales expresan SOX2, su expresión desaparece al diferenciarse a células ciliadas o neuronas, aunque se mantiene en el adulto en células de soporte y glía.
Posteriormente la placoda ótica se engrosa e invagina, separándose del ectodermo, para formar la copa ótica que se cerrará formándose la vesícula ótica u otocisto (Figura 2). La vesícula ótica es una estructura embrionaria transitoria formada por un epitelio pseudo-estratificado.
Introducción
22
Figura 2. Desarrollo temprano del oído interno de vertebrados. Representación esquemática en la que se indican los estadios en los que ocurren las distintas etapas del desarrollo del oído interno, placoda ótica (A), copa ótica (B) y vesícula ótica (C) en Mus musculus y Gallus gallus.
Abreviaturas: E: día de desarrollo embrionario; HH: estadio embrionario según la clasificación de Hamburger y Hamilton (1951) (Hamburger and Hamilton, 1951); D: dorsal; V: ventral.
Adaptada de Magariños et al., 2012 (Magariños et al., 2012).
1.2.2. Morfogénesis y regionalización de la vesícula ótica
El oído interno adulto es un órgano complejo que se forma a partir de una estructura sencilla, la vesícula ótica, que contiene la información precisa para completar el desarrollo embrionario. Esto se consigue mediante la combinación de señales extrínsecas e intrínsecas que conforman patrones temporales de expresión para cada una de las áreas de la vesícula ótica generándose una especificidad de destino celular. Así, se establecen los compartimentos y los ejes antero-posterior (AP), dorso-ventral (DV) y medio-lateral (ML), que determinan la formación de las distintas estructuras que componen el oído interno adulto (Fekete and Wu, 2002, Chatterjee et al., 2010).
Una vez formada, la vesícula ótica se elonga y se establece la regionalización en el eje DV del que surgirán el futuro órgano auditivo en la zona ventral, y el órgano del equilibrio y el conducto endolinfático en la zona dorsal. La zona ventral está determinada por Shh (Sonic hedgehog) (Riccomagno et al., 2002, Ohta et al., 2016) y por la expresión de los genes homeóticos Otx1/Otx2 y Pax2 (Chatterjee et al., 2010).
Las vías de señalización de WNT (Wingless/Wnt) y de la proteína morfogenética ósea (BMP) determinan la región dorsal (Riccomagno et al., 2005, Ohta et al., 2010, Magariños et al., 2012). En la región dorso-lateral, que dará lugar a los conductos semicirculares, se expresan los genes Hmx2/Hmx3. Los genes homeóticos Dlx-5/Dlx6 participan en la formación del conducto endolinfático y del vestíbulo (Fekete and Wu, 2002, Chatterjee et al., 2010, Magariños et al., 2012). El factor de transcripción GBX2 está implicado en la adquisición del destino dorso-medial y regula a Wnt2b, un gen
Introducción
específico del desarrollo del conducto endolinfático (Chatterjee et al., 2010). La formación del primordio del conducto endolinfático requiere una evaginación dorso- medial en el otocisto que tiene lugar entre los estadios HH19-20 en Gallus gallus (Bissonnette and Fekete, 1996) y E9,5-10,5 en Mus musculus (Hultcrantz et al., 1987).
La vesícula ótica sufre varias rondas de proliferación celular para aumentar el número de células que posteriormente diferenciarán en un proceso secuencial que dará lugar a la variedad de células que componen el oído interno adulto (Ruben, 1967, Lang et al., 2000). La proliferación está controlada por factores de crecimiento, siendo el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) uno de los más estudiados (Leon et al., 1995). En este estadio de crecimiento proliferativo se generan células en exceso, por lo que, en paralelo, se activa la apoptosis o muerte celular programada para mantener el tamaño preciso y eliminar las células innecesarias o defectuosas. Durante el desarrollo del oído interno la apoptosis presenta un patrón espacio-temporal específico (Fekete et al., 1997, Leon et al., 2004) asociado a los principales eventos morfogenéticos. En la etapa de copa ótica hay células apoptóticas en el poro ótico y, más tarde, durante la migración de los neuroblastos epiteliales en la región ventro- medial del epitelio ótico (Leon et al., 2004) así como durante la formación del ganglio acústico-vestibular (GAV). La apoptosis también participa en la formación del conducto endolinfático y más tarde en la fusión de los conductos semicirculares (Fekete et al., 1997, Leon et al., 2004, Chang et al., 2004).
1.2.3. Formación del ganglio acústico-vestibular
En la copa ótica, para que los progenitores óticos adquieran el destino celular de neuroblastos o células sensoriales se requiere la participación de los factores de transcripción SOX2, y Neurog1 (Neurogenina-1) (Evsen et al., 2013, Steevens et al., 2017). La expresión de los genes proneurales NeuroD y NeuroM es esencial para la especificación de los neuroblastos óticos. Los neuroblastos epiteliales migran desde la región ventro-medial hacía el mesodermo adyacente en dirección al tubo neural y pasan a llamarse neuroblastos ganglionares. Tras varios ciclos de proliferación celular, los neuroblastos salen de ciclo y se convierten en neuronas postmitóticas que gradualmente extenderán sus neuritas para inervar los dominios sensoriales óticos, así como sus dianas en el sistema nervioso central.
Las células en distintas etapas de diferenciación secuencial pueden ser identificadas en el GAV de acuerdo con un gradiente de maduración próximo-distal
Introducción
24
mediante la expresión de marcadores característicos y específico de cada etapa (Figura 3) (Magariños et al., 2012).
Figura 3. Fases de la neurogénesis ótica. Distintas etapas de diferenciación durante la neurogénesis temprana y marcadores asociados. Abreviaturas: Del: delaminación; PM:
progenitores multipotentes; NBe: neuroblastos epiteliales; NBg: neuroblastos ganglionares; NI:
neurona inmadura; NM: neurona madura. Adaptada de Magariños et al., 2012 (Magariños et al., 2012)
Además de los factores de transcripción ya mencionados, los neuroblastos expresan genes que codifican proteínas LIM-HD como Islet-1 (Li et al., 2004). Las neuronas inmaduras y maduras comparten la expresión de genes como la tubulina específica de neuronas tipo β-III (TuJ-1) (Aburto et al., 2012b) y el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p27kip (Sanchez-Calderon et al., 2010). Las neuronas maduras expresan la glicoproteína axonal G4, que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas expresadas por neuronas (Rathjen et al., 1987, Camarero et al., 2003) y el antígeno asociado a neurofilamento 3A10 (Camarero et al., 2003). También, en estas poblaciones se expresan de manera diferencial los receptores de neurotrofinas y receptores de factores de crecimiento (Pirvola et al., 1997). En concreto, se ha descrito que dentro del GAV se pueden diferenciar poblaciones de neuroblastos y neuronas maduras mediante el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (IGF1R) y el receptor de neurotrofinas con actividad tirosina quinasa (TRK) respectivamente, que se expresan siguiendo un gradiente proximo-distal de diferenciación. La expresión del Igf1r se restringe a las poblaciones ganglionares más próximas al epitelio ótico que corresponden a una expresión intensa del marcador de neuroblastos Islet-1. Mientras que en la región distal del GAV predomina la expresión
Introducción
del Trk (Aburto et al., 2012b). Posteriormente, el GAV dará lugar a los ganglios auditivo y vestibular que conectan los epitelios sensoriales con el cerebro.
2. Autofagia
La autofagia es un proceso biológico que fue descrito por primera vez por Clark y Novikoff a finales de la década de los 50 cuando observaron en riñones de ratón estructuras con forma de vesícula que contenían materiales u orgánulos citoplasmáticos (Clark, 1957, Novikoff, 1959). La autofagia es una vía lisosomal de degradación altamente conservada en eucariotas que se encarga de suministrar energía metabólica y de reciclar componentes intracelulares tales como orgánulos dañados o proteínas mal plegadas. Desempeña, por tanto, un papel fundamental como mecanismo de muerte, de supervivencia y manteniendo la homeostasis celular.
Hasta el momento se han descrito tres tipos principales de autofagia atendiendo al mecanismo por el cual se secuestra el material a degradar (i) autofagia mediada por chaperonas (AMC); (ii) microautofagia y (iii) macroautofagia. En la AMC las proteínas a degradar presentan una secuencia de aminoácidos específica (KFERQ) que permite su reconocimiento y su traslocación individual a través de la membrana lisosomal utilizando la proteína asociada a la membrana lisosomal tipo 2A (LAMP-A2). En la microautofagia el material a degradar se captura de forma directa mediante la invaginación o deformación de la membrana lisosomal. Por último, la macroautofagia, a la que a partir de ahora nos referiremos como “autofagia”, consiste en la formación de una estructura de doble membrana denominada autofagosoma, que se fusionará con el lisosoma (Dikic and Elazar, 2018). Aunque la autofagia se consideró un proceso inespecífico, actualmente se conocen una gran variedad de formas de autofagia selectivas en las que se degradan orgánulos dañados o innecesarios (como, por ejemplo, mitocondrias y peroxisomas, denominadas mitofagia y peroxifagia respectivamente), proteínas y patógenos de forma específica (Morishita and Mizushima, 2019).
2.1. Proceso, etapas y maquinaria molecular
En presencia de las señales inductoras, las proteínas citoplasmáticas u orgánulos a degradar son rodeados por una estructura denominada fagóforo (Figura 4). La membrana del fagóforo se expande y encierra la carga citoplasmática para formar el autofagosoma, una estructura de doble membrana que posteriormente se fusionará con el lisosoma dando lugar al autofagolisosoma dentro del cual la carga citoplasmática será degradada por enzimas hidrolíticas. Los productos resultantes de este proceso
Introducción
26
(nucleótidos, aminoácidos y ácidos grasos) son devueltos al citosol a través de permeasas, para ser reutilizados en la síntesis de proteínas, macromoléculas y en la generación de trifosfato de adenosina (ATP) (Feng et al., 2014, Dikic and Elazar, 2018).
Este proceso dinámico conocido como flujo autofágico se puede dividir en distintas etapas: inducción, nucleación o ensamblaje, elongación, fusión con el lisosoma y degradación y reciclaje, a lo largo de las cuales intervienen de forma coordinada una gran variedad de proteínas (Figura 4). Entre ellas cabe destacar a las codificadas por genes relacionados con la autofagia (Atg). Se han descrito más de 30 ATG, los cuales están conservados evolutivamente desde levaduras hasta el hombre (Klionsky et al., 2003). Además, recientemente se ha descrito que los ATG participan en procesos no autofágicos. Entre ellos se encuentran la secreción extracelular mediada por autofagia, la fagocitosis vinculada a la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos 1 (LC3), las interacciones patógeno-huésped y la regulación del sistema inmune por los ATG (Cadwell and Debnath, 2018).
La inducción de la autofagia se encuentra regulada negativamente por el complejo 1 de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR-C1), que es activado por el complejo fosfatidilinositol-3-quinasa de clase 1 (PI3KC1) mediante una de las cascadas de señalización iniciadas, entre otros, por el IGF-1 (Feng et al., 2014).
Aunque la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) es considerada una pieza clave en la regulación de la autofagia se han descrito vías independientes de mTOR (Sarkar, 2013). El proceso está regulado positivamente por diversas señales: niveles bajos de nutrientes, factores de crecimiento y ATP, hipoxia o altas concentraciones de calcio (Ca2+). En presencia de estas señales inductoras el complejo mTOR-C1 es inactivado y se disocia del complejo 1 de la quinasa tipo UNC 51 (ULK-1) permitiendo así su activación. ULK-1 fosforila y activa al complejo fosfatidilinositol-3-quinasa de clase 3 (PI3KC3) ( F e n g e t a l . , 2 0 1 4 ) . Durante la nucleación, PI3KC3 genera fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) y se encarga del reclutamiento de las proteínas ATG necesarias para la elongación de la membrana. El origen de la membrana del autofagosoma es desconocido, se han propuesto distintos donadores de membrana como la membrana plasmática, el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático y la mitocondria (Tooze and Yoshimori, 2010). El sistema cíclico ATG9 se encarga del transporte de la membrana desde los donadores siendo, por tanto, esencial durante la formación de la membrana del autofagosoma (Yamamoto et al., 2012). Dos sistemas similares a la conjugación de la ubiquitina están implicados en la elongación de la
Introducción
membrana del autofagosoma, ATG12 y LC3 (homólogo en mamíferos de ATG8).
ATG12 forma un complejo con ATG5 y ATG16L1, en el que intervienen ATG7 y ATG10. Mientras que, LC3 está compuesto por LC3A/B/B2/C y GABARAP/11/12/GATE-16 y es modificado por ATG3, ATG4A/B/C/D y ATG7 (Le Grand et al., 2011, Dikic and Elazar, 2018). Los dos sistemas regulan las modificaciones post-traduccionales de LC3; la proteasa ATG4 se encarga de romper el extremo carboxilo terminal de LC3, generando así la forma citosólica LC3-I que, posteriormente, tras su conjugación con fosfatidiletanolamina (PE) produce LC3-II que permanece unida a la membrana del autofagosoma (Figura 4) (Hurley and Schulman, 2014). Por este motivo, los niveles relativos de LC3-II y la conversión de LC3-I a LC3-II son utilizados como un indicador del número de autofagosomas. La proteína p62, también llamada proteína del secuestrosoma 1 (SQSTM1), puede unirse a LC3- II y a agregados de proteínas ubiquitiniladas facilitando su entrada en el autofagosoma.
Por tanto, la degradación de p62 es dependiente de autofagia y sus niveles se correlacionan negativamente con los de LC3-II ( B j o r k o y e t a l . , 2 0 0 9 , K l i o n s k y , 2 0 1 6 ) .
Figura 4. Maquinaria molecular y fases de la autofagia. Representación esquemática de las distintas etapas de la autofagia y la maquinaria molecular implicada. Adaptada de Hansen et al., 2018 (Hansen et al., 2018).
Una vez concluida la formación del autofagosoma, la membrana externa de éste se fusiona con el lisosoma dando lugar al autofagolisosoma donde se degradará el material citosólico previamente secuestrado (Hurley and Schulman, 2014).
Introducción
28 2.2. Funciones celulares de la autofagia
Aunque inicialmente se describió como un mecanismo de muerte celular, actualmente conocemos que el principal papel de la autofagia es proteger a las células en situaciones de estrés nutricional o ayuno suministrando la energía necesaria para la supervivencia celular (Mizushima and Komatsu, 2011). Además está implicada en el control de calidad de proteínas y orgánulos citoplasmáticos, en la eliminación de microbios intracelulares y en la exposición de antígenos en la respuesta inmune.
Facilita la eliminación de las células apoptóticas, participa en procesos de antienvejecimiento y actúa como supresor de la formación de tumores (Dikic and Elazar, 2018). Debido a la importancia de su papel fisiológico, la desregulación o el incorrecto funcionamiento de la autofagia ha sido relacionado con cáncer, miopatías, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardíacas y hepáticas, así como con desórdenes gastrointestinales (Jiang and Mizushima, 2014).
La autofagia puede ser también un mecanismo de muerte denominado “muerte celular de tipo II”, que ha sido descrito ampliamente en invertebrados (Baehrecke, 2003) pero que resulta controvertido en vertebrados. En células moribundas la presencia de autofagosomas podría interpretarse como la causa de la muerte o como una estrategia de supervivencia. El papel mejor descrito de la autofagia en relación con la apoptosis es su participación en la eliminación de células apoptóticas, suministrando l a energía, en forma de ATP, necesaria para la exposición de fosfatidilserina (PS) en e l e x t e r i o r d e la membrana plasmática de estas células para que puedan ser reconocidas y fagocitadas por macrófagos (Yuan and Kroemer, 2010, Denton et al., 2012).
2.3. Papel de la autofagia durante el desarrollo embrionario y en el adulto La autofagia es crucial durante el desarrollo embrionario de vertebrados (Aburto et al., 2012a), proporciona energía e interviene en procesos de remodelación y diferenciación en distintos tejidos. Inmediatamente después del nacimiento, la aportación de nutrientes por la placenta es interrumpida y los neonatos se enfrentan a condiciones de ayuno hasta que reciben nutrientes de la leche materna. En este período crítico se induce la autofagia en varios tejidos. Ratones deficientes en alguno de los siguientes genes: Atg3, Atg5, Atg7, Atg9, Atg16L mueren poco después de nacer y presentan niveles reducidos de aminoácidos en sangre y tejido adiposo, por lo que la autofagia actúa como fuente suministradora de energía (Kuma et al., 2004). Su
Introducción
implicación en la diferenciación de linfocitos y eritrocitos durante la hematopoyesis ha sido estudiada en ratones quiméricos con células deficientes en Atg5 o Atg7; la autofagia promueve el reciclaje de mitocondrias necesario en los procesos de linfopoyesis y eritropoyesis (Mortensen and Simon, 2010). Suministra la energía necesaria para la supervivencia de los condrocitos y facilita la eliminación de los condrocitos terminales durante la formación del hueso en el desarrollo del tejido óseo (Srinivas and Shapiro, 2006).
La autofagia contribuye a la diferenciación del sistema nervioso a distintos niveles. Un incorrecto funcionamiento de la autofagia afecta al número de progenitores neurales y, en etapas más tardías del desarrollo, puede afectar a la correcta diferenciación de las poblaciones neurales. Embriones de ratones deficientes en Ambra1 (Activating Molecule of Beclin-1 Regulated Autophagy) presentan una desregulación de la autofagia y graves defectos en el tubo neural. Ambra1 es necesaria para controlar la proliferación celular y garantizar la supervivencia celular durante el desarrollo del sistema nervioso (Fimia et al., 2007). Además, se ha observado la relación de la proteína UNC-51, ortólogo de ULK1, en el correcto desarrollo de axones y neuronas en Caenorhabditis elegans y en Drosophila melanogaster (Ogura et al., 1994, Mochizuki et al., 2011).
La autofagia no sólo actúa durante la etapa de desarrollo embrionario sino que después de esta tiene un papel esencial en la homeostasis celular y tisular, actúa como citoprotector eliminando orgánulos dañados y proteínas mal plegadas y está relacionada con mecanismos que promueven el aumento de la longevidad (Marino et al., 2011, Lopez-Otin et al., 2013). La autofagia regula la inflamación y actúa, como mecanismo de protección y supervivencia, frente a la neurodegeneración y el envejecimiento (Nixon, 2013, Tan et al., 2014). La autofagia ejerce un papel preventivo impidiendo una respuesta inflamatoria excesiva y su desregulación ha sido relacionada con enfermedades autoinmunes (Puleston and Simon, 2014).
3. Senescencia celular
La senescencia celular fue identificada por Hayflick y Moorhead en la década de los 60 cuando observaron que cultivos de fibroblastos humanos perdían la capacidad de dividirse indefinidamente estableciendo así que la capacidad de proliferación de las células es limitada (Hayflick and Moorhead, 1961, Hayflick, 1965). En 1995, se demostró la existencia de células senescentes in vivo (Dimri et al., 1995). Actualmente,
Introducción
30
la senescencia celular es considerada una respuesta al estrés por la cual las células mitóticas sufren una parada estable del ciclo celular, adquieren un fenotipo pro- inflamatorio y se mantienen metabólicamente activas.
Pueden distinguirse varios tipos de senescencia: (i) senescencia replicativa, se produce como una respuesta celular al acortamiento de los telómeros y está ligada al envejecimiento; (ii) senescencia prematura inducida por estrés (SIPS), que puede ser inducida por una amplia variedad de estímulos como un daño en el DNA, estrés oxidativo, la activación de oncogenes o la inhibición de genes supresores de tumores, entre otros; y (iii) senescencia programada, es la que ocurre durante el desarrollo embrionario (Lozano-Torres et al., 2019).
3.1. Características de las células senescentes
La principal característica de las células senescentes es la parada del ciclo celular en la fase G1, y para ello aumentan la expresión de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDK) como p16, p21, p15 o p27 (Lozano-Torres et al., 2019).
Las células senescentes presentan una serie de características adicionales (Figura 5).
Figura 5. Características de las células senescentes. Representación esquemática de los inductores de los distintos tipos de senescencia celular y las características de las células senescentes. Adaptada de Varela-Nieto et al., 2019 (Varela-Nieto et al., 2019).
Las células senescentes in vitro presentan cambios en su morfología, son más planas y tienen forma irregular, núcleos alargados y con nucléolos de mayor tamaño, presentan también una acumulación de gránulos citoplasmáticos, y un alargamiento de los lisosomas y del aparato de Golgi. Otra característica que se ha observado en algunos
Introducción
tipos celulares es la formación de focos de heterocromatina asociados a la senescencia (SAFH) (Munoz-Espin and Serrano, 2014, Lozano-Torres et al., 2019). Las células senescentes son metabólicamente activas y presentan un aumento en la actividad de la enzima β-galactosidasa lisosomal como consecuencia del incremento del contenido lisosomal (Kurz et al., 2000). Esta actividad enzimática también existe en células no senescentes en condiciones fisiológicas (pH= 4,0-4,5). La detección de la actividad de la enzima mediante la tinción β-galactosidasa asociada a senescencia (SAβG) a un pH entre 5,8-6 es sub-óptimo para células no senescentes y específico de células senescentes, por lo que permite su identificación (Dimri et al., 1995, Lozano-Torres et al., 2019). Las células senescentes secretan factores solubles y exosomas al medio extracelular, lo que se ha denominado fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP).
El contenido del SASP varía en función del tejido y del tipo celular e incluye citoquinas inflamatorias, metaloproteasas de matriz y componentes de distintas rutas de señalización como el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) o las proteínas transportadoras de IGF (IGFBP), entre otros (Lozano-Torres et al., 2019). La principal función del SASP es promover la eliminación de las células senescentes por el sistema inmune, además es una forma de influir en el microambiente del entorno celular.
3.2. Funciones de la senescencia celular
La senescencia celular es una respuesta de estrés que evita que las células dañadas proliferen. Ha sido relacionada fundamentalmente con el cáncer y el envejecimiento. De hecho, la acumulación de células senescentes es una de las principales características del envejecimiento (Lopez-Otin et al., 2013).
Una vez activada por daño, la senescencia celular impide que células con capacidad tumorigénica se dividan evitando así el desarrollo del cáncer (Campisi, 2001, Campisi, 2005). Por el contrario, se ha descrito que en otros casos ayudaría a la progresión del cáncer (Krtolica et al., 2001). La edad de los organismos podría estar determinando este rol dual de la senescencia celular. A edades tempranas la senescencia protegería a las células impidiendo su transformación en tumores primarios pero con el envejecimiento, la acumulación de células senescentes y del SASP generaría un microambiente protumorigénico favoreciendo la progresión del cáncer (Schosserer et al., 2017). En este sentido, algunos componentes del SASP como la metaloproteasa de la matriz extracelular 3 (MMP3) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) promueven la invasión de células tumorales (Liu and Hornsby, 2007) y la angiogénesis
Introducción
32
tumoral (Ksiazek et al., 2008), respectivamente. La senescencia celular también participa en la cicatrización de las heridas, tras un daño tisular algunas células endoteliales entran en senescencia y liberan SAPS para promover la cicatrización (Demaria et al., 2014). Por otro lado, una ineficiente eliminación de las células senescentes produce su acumulación y conlleva un aumento de la inflamación en los tejidos mediado por el SASP. Debido a esto, la senescencia celular ha sido relacionada con diversas patologías, casi todas asociadas a la edad, como desórdenes metabólicos, osteoporosis y fibrosis, entre otras (Munoz-Espin and Serrano, 2014).
En conjunto, la senescencia celular es una respuesta de estrés que inducida de forma transitoria puede ser beneficiosa para los organismos, pero la activación crónica y la consecuente acumulación de células senescentes tiene efectos perjudiciales (Campisi, 2013).
3.3. La senescencia celular programada durante el desarrollo
Aunque tradicionalmente la senescencia ha sido asociada al envejecimiento celular y al cáncer, en 2013 se describió su participación en el desarrollo embrionario (Munoz-Espin et al., 2013, Storer et al., 2013). Este tipo de senescencia ligada al desarrollo ha sido identificada en mamíferos (humano y ratón), aves, anfibios y peces (Nacher et al., 2006, Munoz-Espin et al., 2013, Storer et al., 2013, Lorda-Diez et al., 2015, Davaapil et al., 2017, Villiard et al., 2017), evidenciando que es un mecanismo conservado evolutivamente.
En el embrión de ratón, se ha descrito la presencia de senescencia celular programada en el saco endolinfático, el mesonefros, las membranas interdigitales, la cresta ectodérmica apical (AER) y el tubo neural (Storer et al., 2013, Munoz-Espin et al., 2013). Algunas de estas estructuras son transitorias y se piensa que la función de la senescencia programada es promover la morfogénesis y la remodelación celular. En estos trabajos se identificó a p21 como el mediador de la senescencia celular programada, ya que embriones de ratones nulos para p21 pero no para otros inhibidores de CDK presentaron una disminución de la senescencia. Además identificaron las rutas que regulan la senescencia celular programada. La ruta TGFβ/SMAD induce la senescencia celular y la vía FOXO/PI3K actúa como regulador negativo del proceso (Munoz-Espin et al., 2013).
Introducción
3.4. El factor de crecimiento transformante beta tipo 2 (TGFβ2)
El TGFβ2 pertenece a la superfamilia del TGFβ. Esta superfamilia está compuesta por los ligandos: TGFβ, activina, nodal, factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y BMP. Así como por los receptores específicos para cada ligando clasificados en receptores tipo I y II. En total se distinguen siete receptores de tipo I [ACVRL1, ACVR1, BMPR1A, BMPR1B, ACVR1B, ACVR1C y el receptor tipo 1 del factor de crecimiento transformante beta (TGFβR1)] y cinco receptores de tipo II [ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, AMHR2 y el receptor tipo 2 del factor de crecimiento transformante beta (TGFβR2)]. Los miembros de esta familia se expresan en varios tejidos tanto en vertebrados como en invertebrados. Actúan a partir de los estadios más tempranos del desarrollo y durante la vida de los organismos regulando la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la migración celular (Zhang et al., 2017).
La acción del TGFβ2 está mediada por los receptores serina/treonina quinasa TGFβR1 y TGFβR2 ubicados en la membrana plasmática. Cuando el TGFβ2 se une a los receptores (Figura 6), se forma un complejo entre los dos tipos de receptor y el TGFβR2 es capaz de fosforilar y activar al TGFβR1 que reclutará y fosforilará a las proteínas SMAD2 y SMAD3 (Zhang et al., 2017). Estas forman un complejo con SMAD4 que será translocado al núcleo dónde regularán la transcripción de genes diana y mediarán una gran variedad de procesos dependiendo del contexto celular (Budi et al., 2017).
Figura 6. Ruta de señalización del TGFβ2. Representación gráfica de la ruta de señalización del TGFβ2. Adaptada de Budi et al., 2017 (Budi et al., 2017).
Introducción
34
4. El factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1)
El IGF-1 pertenece a la familia de proteínas de la insulina y desempeña un papel central en el desarrollo embrionario regulando los procesos celulares de proliferación, supervivencia, migración y diferenciación, así como en la homeostasis del organismo adulto modulando el metabolismo, la reparación y regeneración tisulares (Hakuno and Takahashi, 2018).
4.1. Componentes del sistema IGF y rutas de señalización del IGF-1
El sistema IGF de proteínas está compuesto en los mamíferos por tres ligandos (IGF-1, IGF-2 e insulina), sus correspondientes receptores (los receptores tipo 1 y tipo 2 de IGF, IGF1R e IGF2R y el receptor de insulina, IR) y seis proteínas transportadoras de IGF (IGFBP1-6) (Firth and Baxter, 2002). Además de estos miembros, se han identificado otros que podrían pertenecer también a este sistema, como son, el péptido antimicrobiano LL-37, el receptor híbrido IR/IGF1R, los receptores IGFBP y un número creciente de proteínas con elevada homología con las IGFBP (Girnita et al., 2016).
La insulina fue el primer miembro del sistema IGF que se identificó. Es un polipéptido formado por dos dominios de 21 y 30 aminoácidos cada uno, unidos por un puente disulfuro. Es sintetizada en las células β del páncreas y posteriormente liberada al torrente sanguíneo. El IGF-1 y el IGF-2 son polipéptidos de cadena sencilla de 70 y 67 aminoácidos, respectivamente, que funcionan como hormonas circulantes y como factores de crecimiento de tejidos. Los dos se sintetizan principalmente en el hígado en respuesta a la estimulación de la hormona hipofisaria del crecimiento (GH) y son liberados a la circulación sanguínea donde son transportados para llegar a sus tejidos diana. Además, otros órganos producen IGF, aunque en menor cantidad, en los que ejercen funciones autocrinas y paracrinas (Annunziata et al., 2011).
Los encargados de mediar las acciones biológicas de los IGF son los receptores de membrana tirosina quinasa (TK) IR e IGF1R. El IGF2R es un receptor manosa-6-fosfato, sin actividad catalítica conocida, que media únicamente las acciones del IGF-2 (Annunziata et al., 2011). Tanto el IGF1R como el IR están formados por dos subunidades extracelulares α y dos subunidades intracelulares β. El IGF1R es el receptor de alta afinidad del IGF-1, pero también pueden unirse a él con menor afinidad otros ligandos como la insulina y el IGF-2. El IR presenta un
Introducción
gradiente de afinidad para los péptidos de la familia de la insulina, siendo la más alta la afinidad por la insulina. Existe un 70% de homología entre las secuencias de aminoácidos del IGF1R y del IR. En concreto, los dominios TK del IGF1R y del IR de la subunidad β presentan un 84% de homología, a pesar de esto, está ampliamente aceptado que los dos receptores tienen distintas funciones biológicas. La activación del IR regula principalmente el transporte de glucosa y la biosíntesis de glucógeno, mientras que la del IGF1R controla el crecimiento, la proliferación, la migración y la diferenciación celular aunque, en función del tejido, también regula la síntesis de glucógeno y proteínas (Girnita et al., 2016).
Las IGFBP forman una familia de proteínas transportadoras encargadas de regular la biodisponibilidad y la actividad de los IGF. Las seis IGFBP descritas comparten una estructura formada por tres dominios. Los dominios N- y C-terminal presentan un gran grado de homología y un número de puentes disulfuro altamente conservados. Tanto el dominio N- como el C-terminal contienen una región específica de unión al IGF permitiendo una unión de alta afinidad al IGF-1 y al IGF-2 pero no a la insulina. Constituyen, por tanto, un mecanismo adicional de regulación de los IGF en el espacio extracelular. Se ha descrito que más del 99% de los IGF circulantes se encuentran unidos a IGFBP (Rajaram et al., 1997, Firth and Baxter, 2002). Normalmente, las IGFBP actúan como inhibidores competitivos impidiendo la unión de los IGF con sus receptores específicos pero también pueden promover sus acciones prolongando su vida media, de minutos a horas, y transportándolos a los tejidos diana. Por otra parte, el dominio central no presenta homología entre las proteínas transportadoras, en él se producen la mayoría de las modificaciones post- traduccionales y contiene sitios de reconocimiento por proteasas específicas. Estas modificaciones post-traduccionales modulan las propiedades de las IGFBP, mientras que su proteólisis permite la liberación de los IGF (Brahmkhatri et al., 2015). En las últimas dos décadas se ha demostrado que las IGFBP también median acciones independientes de los IGF, como son la modulación de otros factores de crecimiento, la regulación transcripcional, la interacción con la ruta de los esfingolípidos y la unión a otras biomoléculas distintas del IGF (Bach, 2018).
El IGF-1 media distintas rutas de señalización celular. Para ello, el IGF-1 se une al IGF1R en su región extracelular (subunidades α), se produce un cambio conformacional en las subunidades β del receptor que se autofosforilan en tres residuos tirosina (Tyr1131, Tyr1135, Tyr1136) del dominio TK. La autofosforilación también
Introducción
36
ocurre fuera del dominio TK donde se crean sitios de anclaje para los sustratos del receptor que se encargan de la activación de las vías de señalización (Figura 7) (Girnita et al., 2014, Hakuno and Takahashi, 2018).
Figura 7. Rutas de señalización mediadas por el IGF-1. Representación gráfica de las principales rutas de señalización activadas por el IGF-1 tras su unión al receptor IGF1R.
Adaptada de Murillo-Cuesta et. al, 2011 (Murillo-Cuesta et al., 2011).
Los sustratos del receptor de insulina (IRS) son los primeros en unirse al receptor, 1-2 minutos tras la autofosforilación. El segundo en unirse al receptor es SHC (Src homology 2 domain containing), 5-10 minutos tras la activación del IGF1R (Girnita et al., 2014). Los IRS interaccionan con moléculas que presentan dominios SH2 como son la proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 2 (GRB2) y la subunidad p85 de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K). La interacción de los IRS con la subunidad p85 de la PI3K activa la subunidad catalítica p110 de la PI3K que fosforila en la posición 3 a derivados del fosfatidilinositol (PI) para generar fosfatidilinositol-3,4-bifosfato (PIP2) y PIP3. El dominio de homología con pleckstrina de la proteína quinasa B (AKT) une estos lípidos, que están restringidos a la membrana plasmática, lo que causa su translocación desde el citosol y favorece su fosforilación por quinasas dependientes de fosfoinositoles (PDK) en los residuos Thr308 y Ser473 (AKT) produciendo así su activación. El AKT activado es un nodo de señalización y fosforila distintas proteínas, en general inhibiéndolas, para finalmente regular el metabolismo y favorecer la supervivencia celular. Entre las dianas de AKT se
Introducción
encuentran: i) la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), que regula la síntesis de glucógeno; ii) la proteína proapoptótica promotora de la muerte asociada a Bcl-xl/Bcl-2 (BAD), que está implicada en la apoptosis; iii) mTOR, que regula la síntesis de proteínas y la autofagia; y iv) el factor de transcripción FOXO, que regula la expresión génica de genes implicados en gluconeogénesis, apoptosis y homeostasis energética, entre otros (Hakuno and Takahashi, 2018). Por otro lado, tras la activación del IGF1R, tanto los IRSs como SHC reclutan a la proteína GRB2 que interacciona con el factor de intercambio de nucleótidos SOS y como resultado se activa la proteína RAS-GTP que, a su vez, media la activación de la cascada de señalización RAF/MEK/ERK. Una vez activada, la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) es translocada al núcleo para activar por fosforilación factores de trascripción como c-FOS y c-MYC regulando así la progresión del ciclo celular e induciendo la proliferación celular (Eblen, 2018, Maik-Rachline et al., 2019).
4.2. El IGF-1 en el oído interno
La actividad de los IGF está estrictamente controlada por la regulación espacio-temporal de sus niveles y del de sus receptores (Clemmons, 2007, Bach, 2018). En el oído interno, se ha descrito que tanto Igf1 como Igf1r se expresan durante el desarrollo en aves, mamíferos (ratón y humano), anfibios y peces (Ayaso et al., 2002, Schlueter et al., 2007, Zou et al., 2009, Sanchez-Calderon et al., 2010, Okano et al., 2011, Aburto et al., 2012b, Tafra et al., 2014).
Durante el desarrollo del oído interno del embrión de Gallus gallus el IGF1 se expresa en el epitelio ótico desde la etapa de copa ótica hasta la vesícula ótica (estadios comprendidos desde HH14 hasta HH20). Se ha localizado la expresión del IGF1R desde el estadio HH16 hasta HH20 en el epitelio ótico y en la región ventral correspondiente al GAV (Camarero et al., 2003, Aburto et al., 2012b). En la cóclea de Mus musculus, el Igf1r se expresa en la región ventral desde E10,5. Su expresión se localiza en el dominio prosensorial y en la futura membrana de Reissner, así como en la región que dará lugar al ganglio espiral. La expresión del Igf1 se restringe a las zonas que darán lugar a la estría vascular y al limbo espiral. Esta expresión se mantiene y a la edad E16,5 el Igf1 muestra un gradiente de expresión a lo largo de la cóclea desde el ápex hasta la base (Sanchez-Calderon et al., 2010, Okano et al., 2011). La expresión de ambos disminuye en edades postnatales aunque se mantiene en la cóclea adulta (Rodriguez-de la Rosa et al., 2017).
Introducción
38
El tratamiento con IGF-1 exógeno de cultivos organotípicos de explantes de vesícula ótica de pollo aumenta su tamaño, induce morfogénesis e incrementa el número de células proliferativas, imitando el patrón mitótico y morfogenético que tiene lugar durante el desarrollo del embrión in vivo (Leon et al., 1995). Por otra parte, el bloqueo del IGF-1 endógeno en estos cultivos inhibe la formación del GAV y aumenta la muerte celular (Camarero et al., 2003). El IGF-1 activa la ruta PI3K/AKT y protege a los progenitores óticos epiteliales de la muerte celular, promoviendo su supervivencia. Precisamente, el bloqueo con inhibidores específicos de la actividad de PI3K o AKT resulta en un aumento de la muerte de las poblaciones de progenitores óticos en la vesícula ótica (Aburto et al., 2012b). El IGF-1 también interviene en la neurogénesis y la diferenciación de los neuroblastos ganglionares.
Controla la supervivencia de los neuroblastos epiteliales y ganglionares mediante la vía PI3K/AKT y la proliferación y expansión de los neuroblastos epiteliales.
El IGF-1 en la cóclea adulta de los mamíferos es un protector ótico, mantiene la fisiología de la estría vascular y promueve la supervivencia de las neuronas auditivas (Murillo-Cuesta et al., 2011). Es interesante apuntar que la deficiencia genética en Igf-1 es una enfermedad rara humana, así mismo causa alteraciones morfológicas y funcionales en el oído interno de distintas especies (Rodriguez-de la Rosa et al., 2017).
Ratones homocigotos nulos para el Igf-1 presentan un retraso en el desarrollo postnatal del oído interno, alteraciones del tamaño y de la morfología de la cápsula ótica. Otras anomalías que se observaron incluyen: degeneración del ganglio coclear, patrones de inervación aberrantes, deficiencias en la mielinización, pérdida por apoptosis de neuronas auditivas y degeneración prematura de la estría vascular (Camarero et al., 2001, Camarero et al., 2002). Como consecuencia de todas estas alteraciones, los ratones deficientes en Igf1, presentan sordera neurosensorial profunda (Riquelme et al., 2010, Murillo-Cuesta et al., 2011). Los niveles de IGF-1 en suero disminuyen progresivamente con la edad en todos los mamíferos, al tiempo que progresa la presbiacusia. Ambos factores presentan una relación inversamente proporcional en el ratón (Varela-Nieto et al., 2013, Rodriguez-de la Rosa et al., 2017). Por último, indicar que el IGF-1 se ha utilizado con éxito en el tratamiento de la sordera súbita humana (Yamahara et al., 2015).
Hipótesis y objetivos
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Durante el desarrollo del oído interno la proliferación, apoptosis, migración y diferenciación celulares están exquisitamente coordinadas y fuertemente reguladas por factores de transcripción y factores de crecimiento. Conocer en detalle los procesos celulares que participan en el desarrollo del oído interno y su regulación es fundamental para comprender las bases moleculares y genéticas de la audición.
Se ha descrito la participación de la autofagia y la senescencia celular en el desarrollo embrionario, procesos biológicos que están regulados por factores extrínsecos. Estudios previos han demostrado que el IGF-1 es uno de los factores que modulan el desarrollo del oído interno en aves, así como el mantenimiento de la función auditiva adulta. Por otra parte, el TGFβ2 es un inductor de la senescencia celular.
Considerando estos antecedentes, la hipótesis de trabajo fue que tanto la autofagia como la senescencia podrían ser procesos esenciales durante el desarrollo del oído interno que estarían regulados por el IGF-1 y el TGFβ2.
Para confirmar esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:
1. Estudiar las funciones de la autofagia y su regulación por el IGF-1 durante el desarrollo del oído interno en embriones de Gallus gallus.
1.1. Estudiar si las acciones del IGF-1 están mediadas por su receptor de alta afinidad, IGF1R.
1.2. Estudiar si el IGF-1 regula la autofagia en el desarrollo del oído interno.
1.3. Estudiar la implicación de la autofagia en la neurogénesis y la morfogénesis del oído interno.
2. Estudiar la autofagia durante el desarrollo y envejecimiento del órgano auditivo de Mus musculus y estudiar si existen alteraciones en la autofagia debidas al déficit del Igf1r.
2.1. Estudiar la expresión de genes implicados en autofagia en la cóclea a lo largo del envejecimiento.
2.2. Estudiar si hay alteraciones en la autofagia en la cóclea del ratón deficiente para el Igf1r.
3. Caracterizar el proceso de senescencia celular durante el desarrollo temprano del oído interno del Gallus gallus.
3.1. Estudiar la senescencia celular durante el desarrollo temprano del oído interno.
3.2. Estudiar si la senescencia está regulada por TGFβ2 e IGF-1.