Simulación de Leucocitos en Imágenes de Hematología Celular

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(1)Facultad de Ingeniería Eléctrica Departamento de Electrónica y Telecomunicaciones. TRABAJO DE DIPLOMA. Simulación de Leucocitos en Imágenes de Hematología Celular. Autor: Lester Toledo Garcia. Tutor: Ing. Arnaldo Moreno Montes de Oca. Consultante: DrC. Juan V. Lorenzo Ginori. Santa Clara 2011 "Año del 53 de la Revolución".

(2) Facultad de Ingeniería Eléctrica Departamento de Electrónica y Telecomunicaciones. TRABAJO DE DIPLOMA Simulación de Leucocitos en Imágenes de Hematología Celular Autor: Lester Toledo Garcia. Email: [email protected]. Tutor: Ing. Arnaldo Moreno Montes de Oca. Profesor. Instructor. del. Departamento. de. Electrónica. Telecomunicaciones, FIE, UCLV Email: [email protected]. Consultante: DrC Juan V. Lorenzo Ginori. Profesor Titular Consultante del CEETI, FIE, UCLV Email: [email protected]. Santa Clara 2011 “Año del 53 de la Revolución ". y.

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ingeniería en Telecomunicaciones y Electrónica, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. Firma del Autor Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. Firma del Tutor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. Firma del Responsable de Información Científico-Técnica.

(4) i. PENSAMIENTO. EL FUTURO TIENE MUCHAS VARIANTES: PARA LOS DÉBILES, ES LO INALCANZABLE PARA LOS TEMEROSOS, LO DESCONOCIDO PARA LOS VALIENTES, ES LA OPORTUNIDAD. VÍCTOR HUGO.

(5) ii. DEDICATORIA. -A MI FAMILIA Y EN ESPECIAL A MIS PADRES Y HERMANA, QUE HAN SABIDO GUIARME POR EL CAMINO CORRECTO. -A MIS HIJOS PARA SERVIRLES DE INSPIRACIÓN. -A MI ESPOSA QUE TANTO HA LUCHADO A MI LADO PARA PODER LOGRARLO. -A MÍ, POR SABER ESCOGER EL CAMINO CORRECTO Y MANTENER MIS PRINCIPIOS EN DECISIONES DIFÍCILES..

(6) iii. AGRADECIMIENTOS. -A MI TUTOR ARNALDO, GRACIAS A EL PUDE CULMINAR EXITOSAMENTE Y ESTAR AQUÍ HOY. -A MIS JEFES GUILLERMO Y BETSY POR BRINDARME SU APOYO Y COMPRENSIÓN. -A NERITA POR CONTRIBUIR CON SU AYUDA A ESTOS RESULTADOS. -A MIS AMIGOS, ALEXIS, NIORGIS, DARIÉN POR UNIRME EN EL PIQUETE DE LOS BUENOS RESULTADOS. -A MI COMPAÑERA DE ESTUDIO MARLEN ÁLVAREZ POR DARME BUENOS CONSEJOS Y BRINDARME SU AYUDA INCONDICIONALMENTE. -A MIS COMPAÑEROS DE ESTUDIOS POR SER INSEPARABLES EN ESTE CAMPO DE BATALLA. -A LOS PROFESORES QUE SIEMPRE ME APOYARON Y ME ENSEÑARON CADA DÍA ALGO NUEVO. -A LA COMPAÑERA LYANETT CHINEA VALDÉS QUE ME BRINDO SU APOYO INCONDICIONAL Y FUE DE MUCHA AYUDA PARA LA OBTENCIÓN DE LOS RESULTADOS FINALES. -A MIS PADRES QUE SIEMPRE ME AYUDARON EN TODO Y SIEMPRE TUVIERON FE EN MÍ. -A MIS SUEGROS Y DEMÁS FAMILIARES POR SU CONSTANTE SEGUIMIENTO Y PREOCUPACIÓN. -A MI ESPOSA POR SU AYUDA Y SU AMOR. -A MIS HIJOS LESKIEL Y LISKEISY POR SER MI MAYOR INSPIRACIÓN. -A MI PRIMA YULEXY POR BRINDARME SU AYUDA CUANDO LA NECESITÉ. -A TODAS LAS PERSONAS QUE DE UNA FORMA U OTRA HAN FAVORECIDO MI PASO POR LA UNIVERSIDAD, MUCHAS GRACIAS DE TODO CORAZÓN..

(7) iv. TAREA TÉCNICA • Realizar búsqueda y estudio de los métodos matemáticos que permitan simular las imágenes de microscopía celular. • Obtener las imágenes sintéticas donde aparezcan linfocitos. • Aplicar diferentes algoritmos de segmentación a las imágenes sintéticas obtenidas y evaluar los resultados.. Firma del Autor. Firma del Tutor.

(8) v. RESUMEN. El análisis automatizado en la microscopía celular ha adquirido gran importancia producto de los grandes volúmenes de imágenes que son generados por diversas aplicaciones. Los programas computacionales y algoritmos para llevar a cabo dicho análisis están en constante evolución, por lo que evaluar los resultados de cada uno es de gran importancia. En el caso de la segmentación de imágenes, evaluar los resultados mediante la comparación con una referencia o ground-truth requiere de imágenes en las cuales la segmentación sea perfecta. Este requisito es muy difícil de satisfacer empleando la segmentación manual sobre imágenes reales debido a la subjetividad inherente a los analistas humanos. Por tanto, para evaluar algoritmos de segmentación en aplicaciones de hematología celular, la simulación de imágenes realistas que puedan servir como base para la. comparación. adquiere una importancia especial. En este trabajo se describe y desarrolla un algoritmo para la simulación de imágenes de hematología celular donde aparecen linfocitos. El algoritmo estuvo basado en la deformación aleatoria de una esfera, a lo que se añadieron efectos como ruido y filtrado. Las imágenes obtenidas permitieron la evaluación de diferentes algoritmos de segmentación, demostrando su utilidad a la hora de discernir entre varios algoritmos empleados en la segmentación de este tipo de imágenes..

(9) vi. TABLA DE CONTENIDOS. PENSAMIENTO .....................................................................................................................i DEDICATORIA .................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ iii RESUMEN .............................................................................................................................v INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................1 Organización del informe ...................................................................................................3 CAPÍTULO 1.. FUNDAMENTOS. TEÓRICOS. DE. LAS. IMÁGENES. DE. MICROSCOPÍA CELULAR..................................................................................................4 1.1. Células Presentes en el Extendido de Sangre Humana...........................................4. 1.1.1. Eritrocitos........................................................................................................4. 1.1.2. Leucocitos.......................................................................................................5. 1.1.2.1. Neutrofilos ......................................................................................................6. 1.1.2.2. Eosinofilos ......................................................................................................7. 1.1.2.3. Basófilos .........................................................................................................7. 1.1.2.4. Monocitos .......................................................................................................9. 1.1.2.5. Linfocitos ........................................................................................................9. 1.1.3. Plaquetas .......................................................................................................10. 1.1.4. Concentración de los distintos tipos de Células............................................11. 1.2. Imágenes Digitales................................................................................................12.

(10) vii 1.3. Algoritmos de Segmentación de Imágenes...........................................................13. 1.3.1. Algoritmo de Segmentación de Otsu. ...........................................................15. 1.3.2. Algoritmo de Segmentación de Lloyd. .........................................................15. 1.4. Antecedentes de la simulación de Imágenes Celulares ........................................16. 1.5. Herramientas a Utilizar en la Simulación .............................................................18. 1.5.1. MATLAB......................................................................................................18. 1.5.2. Toolbox de Procesamiento de Imágenes.......................................................19. CAPÍTULO 2.. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO. LINFOCITOS. 21. 2.1. Simulación de un Linfocito...................................................................................21. 2.1.1. Creación de las Máscaras de un Linfocito y de su Núcleo. ..........................22. 2.1.2. Creación de la Textura de los Linfocitos. .....................................................24. 2.2. Simulación de un Eritrocito. .................................................................................26. 2.2.1. Creación de la Máscara de un Eritrocito.......................................................26. 2.2.2. Creación de la textura de un Eritrocito. ........................................................27. 2.3. Creación de la Población de Células.....................................................................28. 2.4. Adición de detalles................................................................................................31. 2.5. Conversión de Escala de Grises a Colores............................................................31. CAPÍTULO 3.. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.....34. 3.1. Imágenes Sintéticas Obtenidas. ............................................................................34. 3.2. Evaluación de los Algoritmos de Segmentación. .................................................37. 3.3. Segmentación de los Linfocitos............................................................................38. 3.4. Segmentación de los Eritrocitos. ..........................................................................39. 3.5. Utilidad de las Imágenes Sintéticas. .....................................................................40. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................................41.

(11) viii Conclusiones.....................................................................................................................41 Recomendaciones .............................................................................................................41 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................42 ANEXOS ..............................................................................................................................44 Anexo I. Figuras Generadas con el MATLAB durante el proceso de creación de las. mascaras de los linfocitos. ................................................................................................44.

(12) INTRODUCCIÓN. 1. INTRODUCCIÓN. En la actualidad la medicina evoluciona constantemente, y en muchas de las áreas de desarrollo es necesario analizar imágenes de microscopía celular con el objetivo de diagnosticar o evaluar los resultados de diferentes procesos. La microscopía también ha evolucionado y como resultado de diferentes experimentos se generan grandes volúmenes de imágenes(Ginori, 2010). Todo esto ha llevado a que el análisis manual tradicional realizado por expertos humanos se convierta en impráctico y tedioso, consumiendo además el tiempo de muchos especialistas. El análisis computacional automatizado de dichas imágenes ha surgido para solucionar parcialmente esta problemática. Dentro de los algoritmos empleados en el análisis computacional automatizado de imágenes, los algoritmos de segmentación son los que posibilitan extraer de una imagen objetos o áreas de interés, convirtiéndose así en el elemento crítico(Rosenberger, 2006). Por tanto es muy importante conocer cual o cuales algoritmos brindan los mejores resultados para la aplicación dada. La segmentación es un proceso en el cual la opinión de expertos puede diferir cuando se trata de imágenes reales con cierto nivel de complejidad. Por tanto, para evaluar algoritmos computacionales de segmentación se hace imprescindible crear las imágenes previamente, de modo que se conozca de antemano cuáles deben ser los resultados del proceso de segmentación. De esta forma se podrán evaluar diferentes algoritmos para la segmentación, y determinar la efectividad de cada uno de ellos en el tipo de imágenes deseado. Existen trabajos acerca de la simulación de imágenes donde aparecen diferentes tipos de células. Estás imágenes sintéticas se han empleado en la evaluación de diferentes algoritmos de segmentación, lo que ha permitido evaluar los mismos en dependencia del.

(13) INTRODUCCIÓN. 2. tipo de imagen que se desee, aunque en el caso de la hematología no se dispone de un atlas de imágenes sintéticas para tales fines. A pesar de que existen numerosos algoritmos para la segmentación de imágenes de microscopía celular, en nuestro país no se ha generalizado la aplicación de algún mecanismo computacional para analizar este tipo de imágenes de manera automática. Una de las aplicaciones fundamentales consiste en el desarrollo de medicamentos, donde los resultados pueden estar relacionados con la aparición o no de ciertas células y por tanto el conteo de dichas células se convierte en la tarea fundamental(Lehmussola., 2008). Por tanto la simulación de imágenes realistas que permitan evaluar y comparar varios algoritmos de segmentación adquiere una importancia especial en la selección y desarrollo de nuevos algoritmos. Debido a todo lo expuesto se desprenden las siguientes interrogantes científicas: ¿Cuáles son los métodos matemáticos que permiten simular las imágenes de microscopía celular donde aparecen linfocitos y eritrocitos? ¿Cómo obtener dichas imágenes sintéticas así como la máscara correspondiente? ¿Cómo aplicar algoritmos de segmentación sobre estas imágenes demostrando así su utilidad? Dado estas interrogantes científicas se desprende como objetivo general: •. Simular imágenes de microscopía celular donde aparezcan linfocitos para propósitos de evaluación de algoritmos de segmentación.. Del objetivo general se desprenden los siguientes objetivos específicos: • Desarrollar algoritmos para la simulación de linfocitos. • Desarrollar algoritmos para la confección de una imagen celular a partir de una población de eritrocitos y linfocitos. • Aplicar diferentes algoritmos de segmentación a las imágenes obtenidas y evaluar los resultados obtenidos..

(14) INTRODUCCIÓN. 3. Organización del informe Para dar respuesta a estos objetivos el informe se ha estructurado en 3 capítulos que tratan las siguientes temáticas: CAPITULO 1: Se estudia la morfología de los tipos de células presentes en la sangre, los fundamentos teóricos de las imágenes digitales y las herramientas a utilizar en el trabajo. CAPITULO 2: Se describen los modelos matemáticos y algoritmos empleados en la simulación de las imágenes. CAPITULO 3: Se ejemplifica la utilidad de las imágenes al aplicarles varios algoritmos de segmentación y comparar los resultados obtenidos..

(15) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 4. CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. En este capítulo se describen los aspectos teóricos necesarios para el desarrollo del presente trabajo. Dichos aspectos son: los diferentes tipos de células presentes en un extendido de sangre humana, los principios de las imágenes digitales así como los diferentes tipos de imágenes que se emplean en la actualidad, los antecedentes de la simulación de este tipo de imágenes donde se han obtenido resultados que sirven de base en este trabajo, los algoritmos de segmentación aplicados a las imágenes sintéticas y las herramientas utilizadas así como el por qué de su selección. 1.1. Células Presentes en el Extendido de Sangre Humana. En un extendido de sangre humana se pueden encontrar básicamente tres tipos de células pertenecientes al mismo, eritrocitos, leucocitos y plaquetas, donde cada tipo de célula está destinada con un fin para el correcto funcionamiento del organismo(Freggiaro, 2000). 1.1.1. Eritrocitos. Los eritrocitos, también conocidos como glóbulos rojos o hematíes, son los que aparecen con mayor densidad dentro de la sangre humana, estos tienen forma de discos redondeados bicóncavos con poco cuerpo o capa débil en el centro como se muestra en la figura 1.1 y con un diámetro entre los 6 y 8 μm(Shafer, 2007)..

(16) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 5. Fig. 1.1 Forma de un Eritrocito Como resultado de una observación en una película de sangre, se observa que tienen un contorno circular y un área central pálida correspondiente a la depresión central y que carecen de núcleo como se muestra en la figura 1.2(Shafer, 2007).. Fig.1.2 Eritrocitos Los eritrocitos deben su color rojizo-pardo a la presencia de una proteína compleja llamada hemoglobina la cual transporta dentro de la sangre. Mientras más hemoglobina transporte una célula menor será la depresión central de la misma. El incremento de estos colores en una película de sangre se debe al uso de tinciones con el objetivo de resaltar los detalles celulares. 1.1.2. Leucocitos. En las personas existen al menos cinco tipos de leucocitos o glóbulos blancos circulando en la sangre. A diferencia de los eritrocitos los leucocitos están compuestos por un núcleo y el.

(17) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 6. citoplasma. Los leucocitos se dividen en dos grupos, los agranulocitos o mononucleares y los granulocitos o polimorfo nucleares. Dentro del primer grupo se encuentran los linfocitos y monocitos, mientras que dentro del segundo grupo se encuentran los neutrófilos, basófilos y eosinófilos. La definición de granulocitos parte de la aparición de gránulos en el citoplasma, aunque estos también pueden aparecer en los monocitos y linfocitos. La definición de polimorfo nucleares parte de la forma tan irregular del núcleo en los granulocitos. En la figura 1.3 se muestra la división en grupos. La coloración de este tipo de células está dada por la tinción empleada, ya que las mismas no poseen coloración alguna(Bain, 2000).. Fig. 1.3. Clasificación de los leucocitos 1.1.2.1 Neutrofilos Los neutrófilos, denominados también macrófagos o polimorfo nucleares miden de 12 a 18 μm y es el tipo de leucocito más abundante de la sangre en el ser humano, presentándose entre un 60 y 75%. Su función principal es la fagocitosis de bacterias y hongos. Los neutrófilos tienen un núcleo color púrpura-azul-violeta el cual se encuentra dividido en segmentos o lóbulos, típicamente entre dos a cinco partes. Cuando aparecen un número.

(18) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 7. mayor de divisiones nucleares entonces se denominan neutrófilos híper segmentados. Los lóbulos están unidos por un delgado hilo o filamento del propio material nuclear. El citoplasma de los neutrófilos es azul pálido-rosadizo, y está compuesto por una gran cantidad de gránulos. En la figura 1.4 se muestra un neutrófilo normal.. Fig. 1.4 Neutrófilo normal(Shafer, 2007). 1.1.2.2 Eosinofilos Los eosinófilos presentan un tamaño entre los 10 a 12 µm. Tienen un núcleo compuesto usualmente de dos lóbulos. El citoplasma es azul claro y presenta gránulos de color rojonaranja. Los eosinófilos son importantes en la defensa del organismo ya que descargan el contenido de sus gránulos dañando así ciertos tipos de parásitos. También se involucran en las reacciones alérgicas. En la figura 1.5 se muestra un eosinófilo normal. 1.1.2.3 Basófilos Se denomina basófilo a cualquier célula que se tiñe fácilmente con colorantes básico. Sin embargo, cuando se emplea este término sin ninguna aclaración adicional, suele referirse a uno de los tipos de leucocitos de la familia de los granulocitos..

(19) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 8. Fig. 1.5 Eosinófilo(Shafer, 2007). Los basófilos presentan un tamaño entre los 10 a 14 µm. Tienen un núcleo lobulado, el cual es a menudo oscurecido por la gran cantidad de gránulos violetas, el cual empaqueta al citoplasma azul muy pálido. Se involucran en las respuestas alérgicas e inflamatorias del organismo. En la figura 1.6 se muestra a un basófilo normal.. Fig. 1.6 Basófilo(Shafer, 2007)..

(20) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 9. 1.1.2.4 Monocitos Los monocitos son los leucocitos de mayor tamaño, con un diámetro entre los 14 y 30 µm. Presenta un núcleo arriñonado que se tiñe de color violeta-azulado mientras que el citoplasma es de color gris azulado pudiendo estar acompañado de vacuolas blanquecinas. Su principal función es la de fagocitar, es decir, comerse a diferentes microorganismos o restos celulares. En la figura 1.7 se muestra un monocito normal.. Fig. 1.7 Monocito normal(Shafer, 2007). 1.1.2.5 Linfocitos Los linfocitos son divididos en tres categorías morfológicas dependiendo de su tamaño, la cantidad de citoplasma y la presencia o ausencia de gránulos citoplasmáticos. Estas categorías son: linfocitos pequeños, linfocitos grandes y linfocitos grandes granulares. Dentro de este grupo los linfocitos pequeños son los más numerosos dentro de la sangre. Estos son células esféricas o ligeramente ovoides con un diámetro entre 7 y 15 µm. El núcleo es azul oscuro y ocupa casi la totalidad de la célula, no siendo así en los otros tipos de linfocitos(Freggiaro, 2000). El citoplasma es muy delgado y se tiñe de color azul claro formando un anillo alrededor del núcleo. Su función está ligada al sistema inmune del organismo. En la figura 1.8 se muestra un linfocito pequeño, mientras que en la figura 1.9 se muestran varios linfocitos grandes granulares..

(21) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 10. Fig. 1.8 Linfocito pequeño(Shafer, 2007).. Fig. 1.9 Linfocitos grandes granulares(Shafer, 2007). 1.1.3. Plaquetas. Las plaquetas, o trombocitos, son fragmentos citoplasmáticos pequeños, irregulares y carentes de núcleo, con un tamaño de 2 a 3 µm de diámetro. Presentan un color azul pálido con finos gránulos. Las plaquetas se encuentran normalmente separadas aunque bajo ciertas circunstancias forman aglomeraciones o conjuntos. Las plaquetas juegan un papel fundamental en la hemostasia y son una fuente natural de factores de crecimiento. En la.

(22) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 11. figura 1.10 se pueden ver las plaquetas aisladas como pequeños puntos entre los eritrocitos(Bain, 2000, Shafer, 2007).. Fig. 1.10 Plaquetas(Shafer, 2007). 1.1.4. Concentración de los distintos tipos de Células. Una vez descritos los distintos tipos de células que se encuentran en la sangre es importante conocer la cantidad de células de cada tipo que se encuentran en la misma. La tabla 1.1 muestra los niveles esperados de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por litro de sangre. Se debe aclarar que estas cantidades pueden variar en dependencia de la edad, estado de salud y procedencia étnica de la persona. Los datos mostrados se corresponden a los niveles esperados en una persona adulta caucasiana saludable. Se puede observar como los eritrocitos son el número de células más abundantes, apareciendo en el orden de 1012 células por litro de sangre mientras que las demás aparecen en el orden de 109 células por litro de sangre(Bain, 2000)..

(23) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 12. Tabla 1.1 Cantidad de células por litro de sangre(Bain, 2000). Tipo de Célula. Hombres. Ambos. Mujeres. Eritrocitos. 4.32 - 5.66·1012. 3.88 - 4.99·1012. Neutrófilos. 1.7 - 6.1·109. 1.7 - 7.5·109. Eosinófilos. 0.03 - 0.06·109. Basófilos. 0.02 - 0.29·109. Monocitos. 0.2 - 0.6·109. Linfocitos. 1.0 - 3.2·109. Plaquetas. 1.2. 143 - 332·109. 169 - 358·109. Imágenes Digitales. Se puede decir que una imagen digital puede ser definida como una función de dos dimensiones f(x, y) donde x e y son números enteros finitos que representan coordenadas espaciales en el plano(Gonzalez, 2002). A cada coordenada (x, y) le corresponde un punto o píxel, el cual tiene un valor correspondiente a la amplitud de f en dicho par coordenado(Pratt, 2001). El valor de f(x, y) es conocido como intensidad o nivel de gris de la imagen en tal punto. El rango de dicha intensidad se corresponde con un conjunto de valores finitos y discretos(Nixon, 2002). En la figura 1.11 se muestra una representación de una imagen digital. El término nivel de gris se corresponde a una imagen monocromática, donde solo existe una matriz para representar la imagen. Para representar imágenes en colores existen varias normas como RGB (red, green, blue), CMY (cyan, magenta, yellow), CMYK (cyan, magenta, yellow, black) y HSI (hue, saturación, intensity). En estas normas existe una matriz para cada componente, de manera que de la unión de todas las.

(24) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 13. componentes resulta la imagen en colores(Platero, 2001). También existen las imágenes indexadas donde f(x, y) corresponde a los índices de un mapa de colores. Otro tipo de imágenes son las binarias, donde f(x, y) corresponde a una matriz de unos y ceros solamente, donde los píxel con valor igual a uno se les dice que pertenecen al plano frontal(The MathWorks, 2007; Gonzalez, 2002; Gonzalez, 2008).. Fig. 1.11 Distribución de píxel en una imagen digital(Gonzalez, 2008). El procesamiento digital de imágenes se refiere al procesamiento realizado sobre una imagen mediante una computadora digital con el propósito de mejorar la información contenida en la misma ya sea para su observación, almacenamiento, transmisión o para otro procesamiento posterior(Jähne, 2005). También existen otros tipos de procesamiento en los cuales el resultado no es una imagen mejorada, sino una parte de la misma o simplemente un número que tiene un significado relacionado con el procesamiento sobre la imagen(Anonimo, 2000). 1.3. Algoritmos de Segmentación de Imágenes. La segmentación de imágenes es un paso previo cuando se requiere identificar y extraer las diferentes características de un objeto en una imagen dada, que permitan realizar una descripción de dicho objeto(Markiewicz, (2003))..

(25) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 14. La segmentación subdivide una imagen en regiones u objetos(Rosenberger, 2006). El nivel con el cual la subdivisión es llevada a cabo depende del problema a resolver, lo cual implica que la segmentación debe parar cuando el objeto de interés es aislado. Los algoritmos de segmentación de imágenes generalmente están basados en una de las dos propiedades básicas de los valores de intensidad: discontinuidad y similitud. La primera categoría está enfocada a la partición de la imagen a partir de los cambios abruptos de intensidad, como son los bordes en una imagen. La segunda categoría está basada en dividir una imagen en regiones similares de acuerdo con un conjunto de criterios predefinidos. La segmentación de imágenes tiene su origen en numerosos estudios psicológicos que indican la preferencia de los humanos por agrupar regiones visuales en términos de proximidad, similitud y continuidad, para construir un conjunto de unidades significativas. En cuanto a la unidad significativa que rige la segmentación, ésta suele corresponder a píxeles, regiones o contornos que muestran o disciernen una similitud en cuanto a intensidad, color, textura, gradiente local, movimiento, etc. Existe una gran variedad de técnicas de segmentación(Gonzalez, 2008, Rosenberger, 2006).En general, los métodos clásicos de segmentación, se pueden clasificar como se indica a continuación: •. Métodos basados en la comparación con umbrales en el histograma, en los cuales se obtiene un umbral de comparación para el agrupamiento de los píxeles.. •. Métodos basados en la detección de discontinuidades, éstos dividen la imagen a partir de cambios bruscos de los niveles de grises.. •. Métodos basados en la propiedad de similitud de los valores de los niveles de grises, que permiten la agrupación de puntos a partir de ciertos criterios de homogeneidad.. •. Métodos heurísticos de segmentación, los cuales se basan en el conocimiento previo de la imagen a segmentar y en la experiencia del observador, ellos incluyen en muchas ocasiones los métodos supervisados de segmentación.. A continuación se presenta una descripción abreviada de los algoritmos de segmentación aplicados a las imágenes sintéticas en este trabajo: el algoritmo de Otsu, orientado a la.

(26) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 15. segmentación de imágenes en escala de grises y el algoritmo de Lloyd, que utiliza la información del color en el espacio RGB. 1.3.1. Algoritmo de Segmentación de Otsu.. El algoritmo de segmentación de Otsu fue publicado en el año 1979 por Nobuyuki Otsu(Markiewicz, (2003)). Este método de detección de umbrales utiliza técnicas estadísticas, para analizar la dispersión de los niveles de grises. La importancia del método de Otsu radica en que es automático, ya que no necesita supervisión humana ni información previa de la imagen antes de su procesamiento. El problema de la segmentación mediante umbrales se puede formular a partir de la teoría de la decisión estadística, donde el objetivo es minimizar el error promedio en que se incurre al asignar píxeles a uno o más grupos o clases. En el método de Otsu la solución de este problema se basa en el uso de dos parámetros: la función de densidad probabilística de los niveles de intensidad de cada clase y la probabilidad de ocurrencia de cada clase en una aplicación dada. El método de Otsu se basa en maximizar una medida estadística que se denomina “varianza entre clases“. Un umbral que produzca la mejor separación entre clases, en términos de los valores de intensidad de estas, será el umbral óptimo(Otsu, (1979)). El método de Otsu está basado completamente en cálculos que se realizan a partir del histograma de la imagen. 1.3.2. Algoritmo de Segmentación de Lloyd.. El algoritmo de Lloyd, es un algoritmo para agrupamiento de puntos de datos dentro de determinado número de categorías, usado para el agrupamiento según el método conocido como k-medias. El diseño básico del algoritmo fue descrito por primera vez por Stuart P. Lloyd en un reporte no publicado en 1957 y que fue publicado en 1982 (Lloyd, (1982)). El algoritmo es llamado algunas veces algoritmo de Lloyd I, para distinguirlo del segundo algoritmo introducido por Lloyd en el mismo reporte. El algoritmo de Lloyd I es usado ampliamente para el diseño de cuantificadores escalares y vectoriales..

(27) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 16. El algoritmo realiza una discretización o particionamiento del espacio, generando las llamadas regiones de Voronoi, que se definen mediante el uso de una medida de distancia, obteniéndose un conjunto de ejemplos representativos (prototipos o centroides(Lloyd, (1982)). El objetivo del mismo es generar el conjunto de prototipos que minimice una determinada medida de distorsión o de distancia promedio. 1.4. Antecedentes de la simulación de Imágenes Celulares. Existen trabajos previos relacionados con la simulación de imágenes así como sus aplicaciones. En el campo de la microscopía celular existen simulaciones donde los objetos se generaron manualmente y en otros se realizaron simulaciones simples mediante esferas, discos y elipsoides. Recientemente se han desarrollado nuevos algoritmos donde en las simulaciones se han logrado formas más complejas como se muestra en la figura 1.12(Lehmussola., 2008).. Fig. 1.12 Simulaciones de distintos tipos de células. También se han simulado distintos métodos para lograr las poblaciones celulares. Primeramente se crearon métodos de posicionamiento aleatorio y luego métodos que responden a diferentes exigencias como se muestra en la figura 1.13(Lehmussola., 2008)..

(28) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 17. Fig. 1.13 Poblaciones de Células. En cuanto a las simulaciones relacionadas con la hematología celular existen trabajos previos donde se simularon eritrocitos convencionales así como varias formas no convencionales como se muestra en la figura 1.14. Sin embargo los leucocitos presentan un nivel de complejidad superior y no se disponen de trabajos previos donde se haya simulado algún tipo de leucocito.. Fig. 1.14 Simulación de eritrocitos(Montes de Oca, 2010)..

(29) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 1.5. 18. Herramientas a Utilizar en la Simulación. Para la implementación de los algoritmos y métodos matemáticos que se permiten obtener en las imágenes sintéticas así como para la implementación de los algoritmos de segmentación y evaluación de los resultados se empleó la herramienta MATLAB y el IPT (Image Processing Toolbox) perteneciente a la misma(Young, 1998). 1.5.1. MATLAB. El MATLAB implementa un lenguaje de programación propio orientado a las aplicaciones de ingeniería(The MathWorks, 2000). Dicho lenguaje maneja los datos en forma de matrices lo cual lo hace muy potente en los cálculos numéricos con vectores y matrices(Javier García de Jalón, 2005). Como caso particular puede trabajar con números escalares tanto reales como complejos, con cadenas de caracteres y con otras estructuras de información más complejas. Debido a que una imagen digital se representa como una matriz donde sus elementos son los valores de intensidad de los píxel, este lenguaje resulta ideal para el procesamiento de imágenes y por tanto, para el presente trabajo. Otra de las capacidades más atractivas es la de realizar una amplia variedad de gráficos en dos y tres dimensiones. El MATLAB dispone de varias librerías especializadas o toolboxs orientados a las distintas aplicaciones entre los que encontramos: •. Control system Toolbox, Robust Control Toolbox.. •. Frequency Domain System Identification Toolbox.. •. Fuzzy Logic Toolbox.. •. Higher Order Spectral Analisys Toolbox.. •. Image Processing Toolbox.. •. Mapping Toolbox. •. Model Predective Control Toolbox.. •. Mu Analisis and Synthesis Toolbox.. •. NAG Foundation Toolbox..

(30) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. •. Neural Network Toolbox.. •. Nonlinear Control Design Toolbox.. •. Optimization Toolbox.. •. Quantitative Feedback Theory Toolbox.. •. Signal Processing Toolbox.. •. SIMULINK, SIMULINK Real Time Workshop.. •. Spline Toolbox.. •. Statistics Toolbox.. •. Symbolic Math Toolbox.. •. System Identificación Toolbox.. 19. Lo que hace que el MATLAB sea una herramienta muy utilizada en muchas otras aplicaciones, siendo en muchos de los casos la herramienta más difundida como por ejemplo en el procesamiento digital de imágenes. 1.5.2. Toolbox de Procesamiento de Imágenes.. El image processing toolbox es una colección de funciones que extienden la capacidad de trabajo del MATLAB sobre imágenes digitales(The MathWorks, 2007). Esto permite una serie de funcionalidades entre las que encontramos: • Operaciones geométricas. • Operaciones sobre bloques o vecindad de un píxel. • Filtrados lineales y no lineales así como diseños de filtros. • Aplicación de Transformadas. • Análisis de imágenes y mejoramiento de la misma. • Manejo de imágenes binarias y operaciones lógicas sobre las mismas. • Operaciones sobre regiones de interés. • Manejo de imágenes en colores..

(31) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LAS IMÁGENES DE MICROSCOPÍA CELULAR. 20. Existen otros toolboxs que implementan funciones relacionadas al IPT los cuales extienden las potencialidades del mismo, estos son: • Fuzzy Logic Toolbox. • Mapping Toolbox • Neural Network Toolbox. • Optimization Toolbox. • Signal Processing Toolbox. • Statistics Toolbox. • Wavelet Toolbox.

(32) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 21. CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS. En este capítulo se describen los diferentes algoritmos matemáticos desarrollados para la simulación de una imagen celular donde aparecen leucocitos. Dentro de los posibles leucocitos se escogieron los linfocitos pequeños y medianos por ser los más sencillos desde el punto de vista de su simulación, así como los segundos más abundantes en la sangre humana. Los algoritmos empleados permitieron la simulación de una imagen donde se generaron la forma de los linfocitos y su textura. También se describe como fue simulada una segunda imagen donde aparecen los eritrocitos que deben acompañar a los linfocitos simulados. Finalmente se unieron las dos imágenes en una sola, se le agregan un conjunto de detalles y colores buscando que la imagen obtenida fuese lo más real posible. 2.1. Simulación de un Linfocito.. En la creación de las imágenes sintéticas las células son el componente básico, por lo que el nivel de detalle y refinamiento de las mismas definen en gran medida la calidad de la imagen final. Para simular un linfocito se debe definir la forma de la célula y de su núcleo, de manera que el área de la célula que no pertenece al núcleo corresponderá al citoplasma. Una vez hecho esto se crea una textura correspondiente para cada área y se le adicionan colores. Para definir todos estos parámetros se analizaron un conjunto significante de imágenes reales(Freggiaro, 2000)..

(33) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 2.1.1. 22. Creación de las Máscaras de un Linfocito y de su Núcleo.. Los linfocitos pequeños y medianos son células esféricas o ligeramente ovoides, por lo que para generar su forma aleatoria se empleó un modelo basado en la forma paramétrica de un círculo, cuyas coordenadas ( x(θ ), y(θ )) responden a las ecuaciones 2.1 y 2.2.. x(θ ) = cos(θ ). (2.1). x(θ ) = sin(θ ). (2.2). Donde θ ∈ [0, 2π] y es el ángulo polar. Primero, se generó un polígono regular con k vértices formados por muestras equidistantes según el ángulo θ. Luego se aleatorizó la posición de los vértices según las ecuaciones 2.3 y 2.4, donde i = 1,..., k. xi (θ i ) = r [U (− α , α ) + cos(θ i + U (− β , β ))]. (2.3). y i (θ i ) = r [U (− α , α ) + sin (θ i + U (− β , β ))]. (2.4). El tamaño o escala del polígono estará dado por el parámetro r, y la cercanía de las muestras por k. U(a, b) es una distribución uniforme en el intervalo [a, b]. Por tanto el parámetro β controla la aleatoriedad de las muestras en cuanto al ángulo de la misma, y α en cuanto al radio de la muestra. Luego se interpolaron los vértices empleando para ello una función cúbica. La curva de interpolación se define como una función por partes, donde cada parte une un par de puntos consecutivos, cumpliendo con la condición de que la pendiente de ambas funciones en el punto sea la misma, de manera que exista suavidad en el contorno. Mediante estás fórmulas se pueden crear diversas formas, en dependencia de los parámetros que intervienen en las mismas. En la figura 2.1A se muestra un polígono generado al unir con rectas un conjunto vértices muestreados sin aleatoriedad. En 2.1B se muestra la interpolación cúbica de dichos vértices y en 2.1C y 2.1D se aleatorizan los vértices, empleando en D valores mayores para α y β, logrando así una deformación mayor en comparación con el círculo. (Lehmussola., 2007).

(34) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 23. Fig. 2.1 Formas aleatorias generadas. De esta forma queda definida el área de la célula como el área comprendida en el interior de la línea de interpolación. Luego se creó una imagen binaria donde en el plano frontal se encuentra el área de la célula. Para obtener la forma del linfocito a k se le asignó un valor entero entre 7 y 10 con igual probabilidad para cada posible valor. Al parámetro α se le asignó 0.15 y a β 0.3 radianes. El radio de la célula depende del tamaño en píxeles de la imagen, donde para una imagen de 750 × 500 píxeles r respondió a una distribución normal acotada dentro de ciertos límites con media 55. La distribución normal acotada dentro de ciertos límites se define según el algoritmo de dos pasos: 1. Se genera un valor y = f(x, μ, σ) según una distribución normal con media μ y desviación estándar σ. 2. Si (y < límite _ inferior) o (y > límite _ superior) ir al paso 1. Debido a la aleatoriedad involucrada en este proceso no se tiene un control total sobre el resultado de la interpolación, de manera que pueden aparecer formas con entrantes o salientes estrechos. Para eliminar este efecto y lograr una forma de la célula más redondeada se realizó una apertura morfológica seguida de un cierre morfológico. En ambas operaciones se empleó un elemento estructurante en forma de disco. La apertura permite eliminar todos los salientes estrechos mientras que el cierre elimina los entrantes estrechos..

(35) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 24. Para generar el núcleo de la célula se siguió un proceso similar pero empleando un menor valor para el parámetro r, el cual respondió a una distribución normal acotada con media 0.8*radio_de_la_célula. La posición del centro del núcleo también respondió a una distribución normal acotada dentro de ciertos límites con media en el punto central de la célula por lo cual el núcleo tendrá casi toda su área en el interior de la célula. En caso de que en este proceso se genere un núcleo con una parte de su área fuera del área de la célula, se procede entonces a eliminar el área sobrante. En el anexo 1 se muestran las figuras generadas con el MATLAB durante el proceso de creación de las máscaras de los linfocitos. 2.1.2. Creación de la Textura de los Linfocitos.. En este punto se tienen las máscaras correspondientes a la célula y su núcleo en imágenes binarias. Para crear la textura del núcleo y el citoplasma se empleó una mezcla de ruidos y filtrados para obtener una imagen en escala de grises. La función para agregar ruido a la imagen fue imnoise. Debido a que existen diferentes tipos de ruido fue necesario compararlos todos para explorar con cual se obtenían los mejores resultados. Entre los ruidos probados se encuentran el ruido gaussiano, el ruido localvar, el ruido de Poisson, el ruido sal y pimienta y el ruido speckle. Después de obtener imágenes con todos se pudo comprobar que la mejor similitud con las imágenes reales se obtuvo al combinar, el ruido gaussiano y el ruido de sal y pimienta para el núcleo y el ruido gaussiano para el citoplasma. Teniendo en cuenta que la imagen en escala de grises se trabajó en una escala entre 0 y 1 y que los valores que produce la función para agregar ruido se encuentran en este rango, los parámetros de los ruidos empleados fueron los siguientes, Núcleo: • Ruido gaussiano con media 0.9 una varianza de 0.02 • Ruido de sal y pimienta con densidad del 80% Citoplasma: • Ruido gaussiano con media 0 una varianza de 0.1.

(36) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 25. Pero no solo agregando ruido se logró obtener la textura correcta de la célula, si no que también fue necesario filtrar la imagen después de agregarle ruido para evitar algunos efectos indeseados como pueden ser máximos y mínimos que no aparecen en las células reales, además de que agrega uniformidad a la textura. La función utilizada en el filtraje de la imagen fue imfilter, y el filtro implementado fue un filtro promediador, el cual suaviza los máximos y mínimos del ruido de sal y pimienta así como los que pueden aparecer al aplicar ruido gaussiano. Las máscaras empleadas para este fin fueron circulares con un radio del 7.3% del tamaño de la célula para el núcleo y del 3.65% del tamaño del núcleo para el citoplasma. Este filtraje hace que aparezcan zonas oscuras o claras debido a que promedia dichos máximos o mínimos en la vecindad de los mismos. Finalmente se dividió por cuatro los niveles correspondientes al citoplasma producto de que en esa área los colores serán más pálidos. En la figura 2.2 se muestra la textura de un linfocito sin aplicar el filtrado y en la figura 2.3 luego de aplicar el filtrado.. Fig. 2.2 Textura de un linfocito sin aplicar el filtrado..

(37) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 26. Fig. 2.3 Textura de un linfocito después de aplicar el filtrado. 2.2. Simulación de un Eritrocito.. Debido a que los eritrocitos son las células más abundantes en la sangre siempre estarán presentes en cualquier imagen de hematología celular. Por tanto en la imagen final además de los linfocitos estarán presentes eritrocitos, formando los mismos el fondo de la imagen. Para crear los eritrocitos se emplearon algoritmos desarrollados previamente a los cuales se les retocaron algunos detalles. 2.2.1. Creación de la Máscara de un Eritrocito.. Para representar la forma básica de un eritrocito se empleó una elipse. Para generar cada elipse se tuvo en cuenta el punto central, dos radios y el ángulo de rotación(Weisstein, (2010) , Beyer, (1987)). Los radios respondieron a una distribución normal acotada dentro de ciertos límites, habiéndose obtenido células de distintos tamaños con formas circulares en caso de que los valores resultantes de ambos radios fuesen semejantes o formas elípticas en caso contrario. El ángulo de rotación se definió entre el radio en el sentido de las.

(38) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 27. abscisas y los bordes horizontales de la imagen, respondiendo a una distribución uniforme entre 0 y 2π. La inecuación 2.5 fue la empleada para definir todos los puntos comprendidos en la elipse, donde: • (X; Y): punto central. • r: radio en el sentido de las abscisas. • s: radio en el sentido de las ordenadas. • α: ángulo de rotación a favor de las manecillas del reloj. ( x cos(α ) − y sin(α ) − X ) 2 ( x sin(α ) − y cos(α ) − Y ) 2 + ≤1 r2 s2. (2.5). A las variables x y y en la inecuación 2.5 se le resta un término que indica la traslación que sufre la elipse producto de dicha ecuación. Las ecuaciones 2.6 y 2.7 representan los términos para x y y respectivamente donde ΔX y ΔY son los desplazamientos en los ejes de coordenadas respectivos(Montes de Oca, 2010). ΔX = X − ( X cos(α ) + Y sin(α )). (2.6). ΔY = Y − (Y − (Y cos(α ) + X sin(α )). (2.7). Las ecuaciones 2.5, 2.6 y 2.7 permitieron la creación de una máscara o imagen binaria que representa el área correspondiente a la célula como se muestra en la Figura 2.4.. Fig. 2.4 Máscara de un eritrocito. 2.2.2. Creación de la textura de un Eritrocito.. A partir de la máscara se creó una imagen negativa en escala de grises donde en el centro de la célula aparece un "foco" con niveles de intensidad ligeramente superiores a los del área del fondo de la imagen, y una transición hacia niveles de intensidad mayores que se.

(39) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 28. emplean en el borde de la célula, como se muestra en la Figura 2.5. La posición del "foco" central estuvo dada por una distribución normal acotada dentro de ciertos límites y valor medio en el punto central de la célula en cuestión. Para generar la transición se utilizó la expresión reflejada en la ecuación 2.10, donde a indica la pendiente de la transición y c el desplazamiento de la transición desde el centro del "foco"(help, (2009)).. Fig. 2.5 Negativo de la célula en escala de grises f (dist , a, c) =. 1 1+ e. − a ( dist − c ). (2.8). El parámetro dist., va a ser una función de distancia evaluada en cada punto de la célula, donde las superficies equidistantes corresponden a elipses proporcionales a la máscara, de manera que el foco central resultará tener la misma forma de la célula. El parámetro a se calcula, a través de una distribución normal acotada dentro de ciertos límites y media determinada experimentalmente igual a 0.25, mientras que c indica el radio medio de la depresión central, igual al 33% del promedio de los radios de la célula. 2.3. Creación de la Población de Células.. Debido a que los linfocitos aparecen en mucha menos proporción en comparación con los eritrocitos, solo van a aparecer muy pocos linfocitos en una imagen. Para generar la cantidad de linfocitos que contendrá la imagen se empleó una distribución normal, resultando el valor más esperado el de una célula. Para ubicar los linfocitos se comenzó por ubicar un linfocito en una posición cercana al centro de la imagen, para lo que se emplearon distribuciones normales con topes. Esto da la idea de que la imagen se tomó con el objetivo de analizar dicho linfocito. Luego se.

(40) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 29. ubicaron los demás linfocitos de manera aleatoria, manteniendo siempre el cuidado de que no se solapen entre ellos, ya que en el análisis de las imágenes reales esto no es común. En cuanto a los eritrocitos, la cantidad de estos que contendrá la imagen respondió a una distribución normal con topes. Para definir los parámetros de dicha distribución se realizó el análisis de un número apreciable de imágenes reales de este tipo tomadas con un aumento de magnitud ×400 veces, llegando a la conclusión de que la media será de 55 células. Los eritrocitos se ubican de manera semialeatoria. Para el posicionamiento de los mismos se generan dos números enteros M y N que representan los números de eritrocitos por fila y por columna respectivamente que se pueden distribuir en la escena. Para ello se emplearon las ecuaciones 2.9 y 2.10. Los resultados se redondearon por exceso y por defecto y se escogió la combinación de M y N tal que M × N fuese lo más cercano posible al número de eritrocitos previamente generado, resultando en una distribución con la forma igual a la mostrada en la figura 2.6. M × N = número _ de _ eritrocito s. M = relación _ de _ aspecto N. (2.9) (2.10). Fig. 2.6 Distribución de 12 posiciones y relación de aspecto 4:3. En caso de que M × N fuese mayor que el número de células generado para la imagen, se eliminaron aleatoriamente algunos puntos. En caso contrario se agregaron los puntos.

(41) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 30. necesarios siguiendo una distribución uniforme para su ubicación. Todo esto permitió que finalmente se tuviesen tantos puntos como el número de eritrocitos que debe contener la imagen. A los puntos obtenidos se les agregó una perturbación que respondió a una distribución normal con valor medio igual a las coordenadas del punto en cuestión. Esto permitió obtener una distribución de eritrocitos equitativamente espaciados pero con cierto grado de aleatoriedad en su posición. En el caso de que el área de algún eritrocito coincidiese en el mismo espacio con el área de un linfocito, se escogió aleatoriamente entre eliminar el eritrocito o moverlo. En caso de que se deba mover, se generó una dirección de desplazamiento aleatoria y se fue moviendo mediante pequeños pasos hasta que las máscaras del eritrocito y el linfocito no se solapen. Este procedimiento permite que el eritrocito se ubique muy cerca del linfocito tal y como es común observar en imágenes reales(Freggiaro, 2000) , pero a su vez evita que demasiados eritrocitos rodeen al linfocito, lo cual se puede producir en caso de que no se eliminasen algunos de los eritrocitos en este proceso. Los eritrocitos si pueden encontrarse superpuestos entre ellos. En caso de que dos o más eritrocitos compartieran un área común de la imagen, el orden de creación de los mismos determinó cuales están por encima de los otros, de manera que los últimos eritrocitos en generarse se sobrepondrán a los primeros. Para lograr este efecto se agregó un reborde al eritrocito que se está añadiendo a la imagen con valores negativos de magnitud entre el 40% del máximo valor que puede aparecer en un eritrocito y cero, donde la magnitud fue mayor en dependencia de la cercanía al borde del eritrocito. Solamente se consideraron pertenecientes al reborde los puntos exteriores al eritrocito y con distancia euclidiana del borde del mismo como promedio menor al 20% del radio medio empleado para generar los eritrocitos. Esto provocó un sombreado cerca del borde del eritrocito recientemente añadido sobre el eritrocito generado anteriormente. Al área común a los eritrocitos que se solapan, se le asignó un valor superior en un 10% al promedio de los valores contenidos en las áreas coincidentes de los eritrocitos. Los resultados se muestran en la Figura 2.7a para la imagen negativa que se obtiene primeramente, y 2.7b la imagen final que se obtiene al invertir la imagen de 2.7a..

(42) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 31. Fig. 2.7 Superpoción de eritrocitos Finalmente se unen los linfocitos y eritrocitos en una sola imagen en escala de grises mientras que sus máscaras se mantienen independientes con el objetivo de comparar los resultados de los algoritmos de segmentación para ambos tipos de células. 2.4. Adición de detalles.. Para incrementar el realismo se adicionaron una serie de detalles los cuales aparecen en las imágenes reales. Primeramente se adicionó ruido gaussiano con media -0.05 y varianza 0.005, del cual solo se toman los valores positivos, logrando así una imagen menos nítida. Después se adicionó un efecto de reborde sobre el fondo, como el explicado anteriormente en la superposición de las células, lo cual permite ver una pequeña franja clara bordeando a las células. Finalmente se simuló un efecto de iluminación no uniforme, adicionando a la imagen una función de intensidad en forma de paraboloide elíptico. La ubicación del centro del paraboloide siguió una distribución normal acotada, con valor medio en el centro de la imagen. Otro detalle consiste en que para generar la imagen se trabajó con dimensiones mayores a las que tendría la misma una vez finalizada, de manera que pudiesen aparecer células con una parte de su área fuera de la imagen. 2.5. Conversión de Escala de Grises a Colores.. Una vez generada la imagen en escala de grises con todos los detalles, se procedió a convertir la misma en una imagen RGB (red, green, blue), debido a que este tipo de representación es una de las más difundidas y se ajusta a las necesidades del presente trabajo..

(43) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. 32. Los colores de los linfocitos y eritrocitos son bien distintos, pero la textura de ambos en la imagen en escala de grises tuvo amplitudes similares. Debido a esto el procedimiento consistió en crear dos mapas de colores y trabajar con dos imágenes de las que finalmente se obtuvo una sola. Por tanto se creó un mapa de colores para los leucocitos y otro para los eritrocitos tomando como referencia imágenes reales(Hoffman, 2008). Luego se crearon las dos imágenes indexadas con cada mapa de colores y finalmente se sustituyeron los linfocitos de la imagen creada con el mapa de colores de los eritrocitos por los linfocitos de la otra imagen. El último paso consistió en realizar un filtrado espacial, para lo que se aplicó un filtro promediador con una ventana cuya dimensión depende del tamaño de la imagen, suavizando así los bordes de las células y eliminando algunos efectos indeseados producidos por la adición del ruido gaussiano. En la figura 2.8 se muestra un diagrama de flujo que resume todos los pasos descritos en el capítulo..

(44) CAPÍTULO 2. SIMULACIÓN DE IMÁGENES CELULARES CONTENIENDO LINFOCITOS.. INICIO Crear cantidad de Linfocitos y Cantidad de Eritrocitos. Crear Mascara del Linfocito Principal. Crear Mascara de los Linfocitos Secundarios. ¿Se solapan los Linfocitos?. SI. NO. Crear Mascara de Eritrocitos. ¿Se solapan los Eritrocitos con los Linfocitos?. SI. Eliminar o Mover Ligeramente los eritrocitos que se solapan. NO. Agregar Textura a los Linfocitos y Eritrocitos. Agregar Detalles. Convertir la Imagen en Colores. Filtrado Espacial. Figura 2.8 Diagrama de flujo. FIN. 33.

(45) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 34. CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS. En el presente capítulo se comparan las imágenes sintéticas obtenidas con imágenes reales. Esto se realiza teniendo en cuenta varios parámetros importantes que definen el realismo de las imágenes sintéticas, determinando así el nivel de calidad de las mismas. Luego se ejemplifica la utilidad de las imágenes obtenidas al aplicarle dos algoritmos de segmentación y analizar los resultados que brindan los mismos. 3.1. Imágenes Sintéticas Obtenidas.. Las imágenes sintéticas obtenidas se compararon con las imágenes reales en cuanto a forma, tamaño, textura, colores y ubicación de las células. En la figura 3.1 se muestra una imagen simulada y en la figura 3.2 una imagen real, de manera que puedan servir como punto de comparación. En cuanto a los linfocitos se observa cómo se imita muy bien la forma así como el tamaño. Debido a que los linfocitos simulados pertenecen al grupo de los linfocitos pequeños el tamaño puede variar desde pequeños como un eritrocito hasta más de dos veces el tamaño de un eritrocito, y todo esto se logró con las distribuciones empleadas. En cuanto a los eritrocitos se tomaron los resultados de trabajos previos donde también se logró una forma y tamaño similar a la de un eritrocito convencional. Es importante destacar que existen formas no convencionales de los eritrocitos las cuales ya se encuentran desarrolladas, pero no se emplearon en el presente trabajo..

(46) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. Fig. 3.1 Imagen simulada conteniendo dos linfocitos. Fig. 3.2 Linfocitos convencionales. 35.

(47) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 36. En cuanto a la textura de los linfocitos se logró imitar muy bien la textura en el núcleo de la célula, lográndose áreas claras y oscuras como en los linfocitos reales, mientras que el citoplasma a pesar de que se imita aceptablemente, la textura del mismo carece de ciertas áreas transparentes presentes en los linfocitos reales. En los eritrocitos la textura es similar a la real, encontrándose variaciones en el tamaño de la depresión central. Los colores empleados en los linfocitos se corresponden con los colores con que se tiñen los mismos en un extendido de sangre humana. En los eritrocitos la tonalidad es también correcta, aunque en estos últimos es común encontrar varias tonalidades al analizar un conjunto de imágenes. En cuanto a la ubicación de las células los algoritmos empleados brindan resultados buenos ya que en un extendido de sangre humana las células no se distribuyen con total aleatoriedad, sino que siguen una distribución equitativa sobre el área en cuestión. Sin embargo se no se logró ubicar los eritrocitos cerca de los linfocitos de de manera que exista una deformación en las células producto de su cercanía como se muestra en la imagen real de la figura 3.3, sin embargo se lograron muy buenos resultados en la superpoción de eritrocitos así como en la concentración de células en la imagen.. Fig. 3.3 Deformación de los eritrocitos en la cercanía de los linfocitos.

(48) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 37. Los detalles agregados finalmente posibilitaron realzar el realismo debido a que en las imágenes reales es común encontrar efectos indeseados como una iluminación no uniforme y ruido. El importante destacar que es posible generar un conjunto de imágenes de manera aleatoria y posteriormente hacer una selección de las mismas según el criterio de expertos, de manera que se empleen solo las mejores imágenes en la evaluación de los algoritmos de segmentación. 3.2. Evaluación de los Algoritmos de Segmentación.. Para evaluar un algoritmo de segmentación sobre una imagen sintética se realiza el cálculo de ciertos coeficientes que dan una medida de la igualdad entre la imagen binaria obtenida producto de la segmentación y la máscara o ground-truth de la imagen sintética. En el presente trabajo se utilizó el cálculo de los coeficientes de Dice y Jaccard. El coeficiente de Dice se calcula según la ecuación 3.1, donde se divide el duplo de la intersección entre los píxel pertenecientes al objeto segmentado y los píxel pertenecientes a la segmentación ideal entre la suma de las cantidades de dichos píxel, dando como resultado un valor entre 0 y 1, donde un 1 indicaría una segmentación perfecta(Rosenberger, 2006).. D( A, B) =. 2 A∩ B A+B. , 0 ≤ D( A, B) ≤ 1.. (3.1). El coeficiente de Jaccard se calcula según la ecuación 3.2, donde se divide la intersección entre los píxeles pertenecientes al objeto segmentado y los píxeles pertenecientes a la segmentación ideal entre la unión de dichos píxeles, dando como resultado un valor entre 0 y 1, donde un 1 indicaría una segmentación perfecta.. J ( A, B) =. A∩ B A∪ B. , 0 ≤ J ( A, B) ≤ 1.. (3.2).

(49) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 3.3. 38. Segmentación de los Linfocitos.. Las imágenes sintéticas fueron segmentadas con tres algoritmos diferentes y se compararon los resultados con las máscaras respectivas. En los primeros dos casos se aplicó el método de Otsu sobre la componente de saturación de la imagen en el espacio de color HSV y sobre la componente de valor de la imagen en dicho espacio respectivamente. El tercer método estuvo basado en el algoritmo de Lloyd o k-media. En trabajos previos donde solo aparecieron eritrocitos estos algoritmos produjeron resultados similares, siendo más preciso el algoritmo de Lloyd. Con las imágenes simuladas en al presente trabajo los resultados de ambos algoritmos difieren considerablemente. Esto está dado porque el método de Otsu está basado en la determinación de un umbral, y para determinar dicho umbral se tuvo en cuenta la imagen en su totalidad. Como los niveles de la componente saturación y valor del núcleo de los linfocitos es notablemente mayor a los niveles restantes en la imagen, ocurrió que en algunas ocasiones el método de Otsu no detectó el citoplasma de los linfocitos como parte de la célula, sino que lo detectó como parte del fondo de la imagen. Sin embargo el algoritmo de Lloyd el cual se basa en la información de color de las imágenes si logró diferenciar entre las células y el fondo de la imagen con muy buena precisión. En la tabla 3.1 se muestran los resultados de la segmentación de los linfocitos evaluados según el coeficiente de Dice, mientras que en la tabla 3.2 se muestran los resultados evaluados según el coeficiente de Jaccard. Tabla 3.1 Resultados de la segmentación sobre linfocitos según el coeficiente de Dice. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Otsu sobre saturación. 0.735. 0.0959. 0.6483. 0.9096. Otsu sobre intensidad. 0.8135. 0.1375. 0.6552. 0.9879. Algoritmo de Lloyd. 0.9814. 0.0095. 0.9690. 0.9954. Tabla 3.2 Resultados de la segmentación sobre linfocitos según el coeficiente de Jaccard. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Otsu sobre saturación. 0.6255. 0.1315. 0.4796. 0.8342. Otsu sobre intensidad. 0.7044. 0.2031. 0.4872. 0.9760. Algoritmo de Lloyd. 0.9636. 0.0184. 0.9398. 0.9908.

(50) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 3.4. 39. Segmentación de los Eritrocitos.. En el proceso de segmentación de los eritrocitos ocurrió de manera similar que con los linfocitos, donde el método de Otsu determinó en muchas ocasiones un umbral por encima del nivel existente en los eritrocitos, de modo que detectaba los mismos como parte del fondo de la imagen(Valdés, 2010). Por tanto fue necesario realizar la segmentación donde en el proceso interviniese un humano el cual seleccionaría la región de interés para segmentar. Esto permitió que el método de Otsu no tuviese en cuenta los niveles de saturación y valor del núcleo de los linfocitos. En las tablas 3.3 y 3.4 se muestran los resultados de la segmentación por regiones basada en el método de Otsu según los coeficientes de Dice y Jaccard respectivamente. Tabla 3.3 Resultados de la segmentación sobre eritrocitos según el coeficiente de Dice. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Otsu sobre saturación. 0.9827. 0.0072. 0.9743. 0.9953. Otsu sobre intensidad. 0.9819. 0.0070. 0.9735. 0.9942. Tabla 3.4 Resultados de la segmentación sobre eritrocitos según el coeficiente de Jaccard. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Otsu sobre saturación. 0.9961. 0.0139. 0.9499. 0.9907. Otsu sobre intensidad. 0.9646. 0.0137. 0.9483. 0.9885. La segmentación de los eritrocitos empleando el algoritmo de Lloyd produjo buenos resultados y no fue necesario realizar el procedimiento previamente explicado para los eritrocitos. En las tablas 3.5 y 3.6 se muestran los resultados evaluados según los coeficientes de Dice y Jaccard respectivamente..

(51) CAPÍTULO 3. UTILIZACIÓN DE LAS IMÁGENES SINTETICAS OBTENIDAS.. 40. Tabla 3.5 Resultados de la segmentación sobre eritrocitos según el coeficiente de Dice. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Algoritmo de Lloyd. 0.9837. 0.0069. 0.9765. 0.9960. Tabla 3.6 Resultados de la segmentación sobre eritrocitos según el coeficiente de Jaccard.. 3.5. Métodos. Media. Std.. Mínimo. Máximo. Algoritmo de Lloyd. 0.9699. 0.0135. 0.9540. 0.9920. Utilidad de las Imágenes Sintéticas.. El empleo de las imágenes sintéticas obtenidas y las máscaras correspondientes permitieron comparar tres algoritmos de segmentación. Los algoritmos de segmentación comparados pueden brindar diferentes resultados en dependencia del tipo de imágenes sobre el que se apliquen. Para el caso de las imágenes de hematología celular donde aparecen linfocitos y eritrocitos el algoritmo de Lloyd brinda mejores resultados que los algoritmos basados en el método de Otsu, conclusión a la que se llegó al emplear las imágenes sintéticas obtenidas..

(52) CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. 41. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. Conclusiones 1. Se desarrollaron los modelos matemáticos así como el algoritmo que permite la creación de los linfocitos, y se sentaron las bases para la simulación de otros leucocitos del extendido de sangre humana. 2. Se lograron simular imágenes sintéticas de hematología celular conformadas por una población de linfocitos y eritrocitos, obteniendo buenos resultados para la evaluación de algoritmos de segmentación. 3. Se aplicaron diversos algoritmos de segmentación a las imágenes sintéticas obtenidas, permitiendo la comparación entre ellos y demostrando la utilidad de dichas imágenes.. Recomendaciones 1. Incrementar el nivel de detalle en las imágenes simuladas hasta lograr una alta similitud con las imágenes reales. 2. Crear otros tipos de leucocitos a partir de modificaciones en los algoritmos desarrollados. 3. Aplicar las imágenes obtenidas a otros algoritmos de segmentación..