PRÁ
PRÁCTICÁ 4 CTICÁ 4 - - OXIDÁDIONES BIOLOGICÁS OXIDÁDIONES BIOLOGICÁS
RELACION DE EXPERIMENTOS:
RELACION DE EXPERIMENTOS:
1.
1. Determinación de la actividad de Determinación de la actividad de Xantino deshidrogenasaXantino deshidrogenasa 2.
2. Oxidación de Lactato y Succinato por la cadena respiratoria mitocondrial.Oxidación de Lactato y Succinato por la cadena respiratoria mitocondrial.
EXPERIMETO 1 EXPERIMETO 1
La enzima xantina: NAD+ oxidoreductasa
La enzima xantina: NAD+ oxidoreductasa (EC(EC 1.17.1.4) 1.17.1.4) es una enzima que cataliza la reacción es una enzima que cataliza la reacción química:
química:
XANTINA
XANTINA + + HH22O O ác. ác. Úrico Úrico + + HH++
FAD
FAD FADH2FADH2
NADH + H
NADH + H ++ NAD NAD++
La siguiente reacción química es catalizada por xantino oxidasa
La siguiente reacción química es catalizada por xantino oxidasa (EC(EC 1.17.3.2 1.17.3.2))
XANTINA
XANTINA + + HH22OO ácido Úricoácido Úrico
F A D F A D H 2 F A D F A D H 2
H
H 22OO22 OO22
Estas enzimas p
Estas enzimas participan en earticipan en el metabolismo del metabolismo de purinas purinas y ambas formas y ambas formas catalizan la oxidaccatalizan la oxidaciónión de hipoxantina en xantina y de xantina en ácido úrico.
de hipoxantina en xantina y de xantina en ácido úrico.
La enzima XANTINO DESHIDROGENASA, después de un proceso de isquemia y posterior La enzima XANTINO DESHIDROGENASA, después de un proceso de isquemia y posterior reperfusion es convertida en XANTINO OXIDASA, perdiendo su afinidad por NAD+, uniéndose reperfusion es convertida en XANTINO OXIDASA, perdiendo su afinidad por NAD+, uniéndose al FAD, Xantina oxidasa (Xo) genera especies reactivas de oxígeno que terminan produciendo al FAD, Xantina oxidasa (Xo) genera especies reactivas de oxígeno que terminan produciendo daño en los tejidos infartados.
daño en los tejidos infartados.
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Precaución:
Precaución: los inhibidores de la los inhibidores de la cadena respcadena respiratoria son altamente iratoria son altamente tóxicos en dotóxicos en dosis pequeña.sis pequeña.
El azul de metileno es un cromóforo con capacidad de aceptar electrones de las enzimas El azul de metileno es un cromóforo con capacidad de aceptar electrones de las enzimas flavoprotéicas como
flavoprotéicas comoXANTINO DESHIDROGENASAXANTINO DESHIDROGENASA o oXANTINO OXIDASAXANTINO OXIDASA..
Significancia Clínica Significancia Clínica En humanos
En humanos XANTINO OXIDASA, XANTINO OXIDASA, es enzima marcadora de daño hepático; es inhibida por es enzima marcadora de daño hepático; es inhibida por allopurinol
allopurinol y es usada y es usada en el tratamiento den el tratamiento de la gota. e la gota. LaLa Xantinuria Xantinuria es un raro desordenes un raro desorden genético genético caracterizado por deficiencia de xantino deshidrogenasa y alta concentración de xantina en caracterizado por deficiencia de xantino deshidrogenasa y alta concentración de xantina en sangre, puede causar falla renal.
sangre, puede causar falla renal.
CTIVID
CTIVID D D DE DE X X NTINO NTINO DESHIDROGEN DESHIDROGEN S S DE DE L L LECHELECHE
OBJETIVOS
1. Verificar la actividad deXANTINO DESHIDROGENASA de la leche, usando como sustrato aXANTINA
2. Estudiar el efecto de los inhibidores URETANO, ALOPURINOL y CIANURO sobre la oxidación deXANTINA por acción de XANTINO DESHIDROGENASA de la leche.
3. Estudiar la oxidación de XANTINA usando una fuente enzimática desnaturalizada por calor.
MÉTODO
Medida de la Actividad de XANTINO DESHIDROGENASA, por decoloramiento del azul de metileno (reducción) y calificación por cruces.
PROCEDIMIENTO
Rotular 5 sistemas de ensayo del 1 al 5 y medir lo siguiente en mililitros.
Mezclar y agregar enseguida a cada tubo aproximadamente 1 cm de parafina líquida, colocar en baño de 37oC y observar hasta que uno de los sistemas haya decolorado totalmente el azul intenso del aceptor de electrones “azul de metileno”, inmediatamente evaluar por cruces la decoloración de todos los sistemas, colocando 5 cruces al que haya decolorado totalmente y cero cruces al que no haya decolorado.
SISTEMAS 1 2 3 4 5
5,.0 5,0 5.0 5.0
5,0
1.5
1,5
0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
LECHE CRUD
LECHE HERVID
URET NO LLOPURINOL CI NURO DE SODIO X NTIN
ZUL DE METILENO
RESULTADOS
Anotar sus observaciones y evaluación.
INTERPRETACION (Indique la composición del sistema y el resultado)
SISTEMA 1:
Hay decoloración, porque tiene sustrato (xantina) y azul de metileno (aceptador artificial H+ y e-
SISTEMA 2:
No funciona por la desnaturalización de leche por accion del calor, no decolora.
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EVALUACIÓN DE LA
ACTIVIDAD DE XANTINO DESHIDROGENASA
1 2 3 4 5
ACTIVIDAD ENZIMATICA (CRUCES)
NORMAL DESNATURALIZACION CON CALOR
DESNATURALIZACION CON URETANO
DESNATURALIZACION CON ALLOPURINOL
DESNATURALIZACION CON CIANURO
5(+) 0 (+) 0(+) 0(+) 5(+)
SISTEMA 3:
Utilizamos inhibidor uretano por eso no hay decoloración por eso no hay una reacción
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SISTEMA 4:
Utilizamos un inhibidor que es xantina y alopurinol tampoco ocurre reacción.
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SISTEMA 5:
Si funciona puesto que tiene un componente que es leche cruda, sustrato, azul de metileno y además un inhibidor cianuro de sodio.
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EXPERIMETO 2
La mayor parte de ATP es producido por fosforilación oxidativa, un proceso dependiente del
transporte de electrones a través de la cadena respiratoria; al mismo tiempo que la combustión de las grasas, los carbohidratos e incluso de las proteínas.
Los intermediarios de la cadena respiratoria se localizan en la membrana mitocondrial interna, consiste en reoxidar NADH y FADH2, pasando los electrones a una cadena de transporte electrónico hasta O2, la energía que se disipa en el transporte es aprovechada para sintetizar ATP.
NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + H2O
Gº’ = - 52.6 Kcal/mol
FADH2 + ½ O2 FAD + H2O
Gº’ = - 43.4 Kcal/mol
La oxidación de un sustrato típico, libera suficiente energía libre para producir 2 a 3 moléculas de ATP por cada átomo de oxígeno consumido.
La transferencia de electrones desde el sustrato hacia el oxígeno para reducir este a agua va acompañada del bombeo de protones al espacio intermembrana, los cuales emplean el complejo ATP Sintasa para impulsar la formación de una molecular de ATP a partir de ADP y Pi.
La cadena de transportadores de electrones o cadena respiratoria mitocondrial, está dispuesta en orden creciente de afinidad por los electrones(Potencial redox).
OXIDACIÓN DE LACTATO Y SUCCINATO
OBJETIVOS
1. Demostrar la necesidad de NAD+ para la oxidación de lactato, más no para la oxidación de succinato.
2. Verificar la acción inhibitoria competitiva del malonato en la reacción de oxidación del succinato.
3. Estimar la oxidación del lactato y succinato por medio de un aceptor artificial de hidrógenos“Azul de metileno”, que al reducirse se decolora.
MÉTODO
Medida de la actividad Deshidrogenasa, a través del decoloramiento del azul de metileno y calificación por cruces.
PROCEDIMIENTO
Rotular los tubos del 1 al 8 y preparar los sistemas de la siguiente manera:
SISTEMAS 1 2 3 4 5 6 7 8
Azul de metileno 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Lactato 0.1 M 2.0 2.0
Succinato 0.1M 2.0 2.0 3.0
Succinato 0,3 M 2.0
Malonato 0.2 M 1.0 1.0 1.0
Agua destilada 1.9 2.0 3.9 4.0 2.0 1.0 -- 1.0
NAD+ 0.1 - 0.1
Homogenizado De corazón
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Mezclar y agregar enseguida a cada tubo aproximadamente 1 cm de parafina líquida, colocar en baño de 37ºC y observar el grado de decoloramiento, hasta que uno de los sistemas haya decolorado totalmente, inmediatamente anotar por cruces el valor de la decoloración, colocando 5 cruces al que haya decolorado totalmente y cero cruces al que no haya decolorado en absoluto.
R ESULTADOS
Construya una tabla para anotar sus observaciones, expresando el tiempo de decoloración y la calificación por cruces.
Actividad LDH Control Actividad SDH
SISTEMAS 1 2 3 4 5 6 7 8
Grado de decoloración 0(+) 0(+) 0(+) 0(+) 4(+) 0(+) 1(+) 5(+)
INTERPRETACION Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Sistema 1:
Se encuentra la coenzima NAD y homogenizado
Sistema 2:
No tiene la coenzima NAD ______________________________________________________
Sistema 3:
Falta el sustrato
Sistema 4:
No funciona no hay sustrato y no hay NAD
Sistema 5:
Tiene todo
Sistema 6:
Tiene todo hasta un inhibidor malonato
Sistema 7:
Tiene un inhibidor malonato mayor sustrato
Sistema 8:
Tiene un inhibidor tres veces mayor el sustrato
Esquema del transporte de electrones por la cadena respiratoria.
INTERROGANTES
1. Esquematice las reacciones catalizadas por LDH y Succinato deshidrogenasa, participando con la cadena respiratoria.
2. Qué diferencias y semejanzas, encuentra entre Xantino deshidrogenasa y Xantino Oxidasa.
Diferencias
La xantina deshidrogenasa: Enzima que cataliza la oxidación de xantina en presencia de NAD+ para formar ácido úrico y NADH. Actua también sobre otra purinas y otros aldehídos. Pertenece al grupo de las enzimas que contienen molibdeno involucradas en el metabolismo oxidativo de las purinas.
La xantina oxidasa: Es una enzima que cataliza la oxidación de hipoxantina a xantina y puede luego catalizar la oxidación de xantina en ácido úrico. Esta enzima juega un papel importante en el catabolismo de purinas en algunas especies, incluyendo humanos.
La xantina oxidasa puede ser convertida a xantina deshidrogenasa a través de una oxidación reversible con sulfhidrilo.
Semejanzas
Tienen el mismo cofactor Molibdeno MoCo
3. Señalar las consecuencias de los siguientes factores, empleando los términos Aumento (A), Disminución (D) y sin alteración (SA)
FACTORES TRANSPORTE DE e
- FOSFORILACIÓN
OXIDATIVA
CIANURO
DEFICIENCIA DE PI
ACIDO ASCÓRBICO
DEFICIENCIA DE ADP
PRESENCIA DE DNP
PRESENCIA DE PI Y/O ADP
EN PRESENCIA DE DNP
4. Haga una interpretación desde el punto de vista termodinámico de los lugares donde se libera suficiente energía para producir la síntesis oxidativa de ATP.
5. ¿Qué es un agente desacoplador de la fosforilación oxidativa, distinga los tipos de desacopladores y cite al menos dos ejemplos?
Agente desacoplador:Sustancias que introducen desde el espacio intermembranoso hacia el interior mitocondial, disminuye la fuerza protón- motriz y la síntesis de ATP.
Ejemplos
Termogenina
2,4- dinitrofenol (DNP)
Pentaclorofenol
CCCP (m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona), 100 veces más activa que el primero.
6. Nombre al menos 4 inhibidores del transporte de electrones por la cadena respiratoria mitocondrial.
Deshidrogenasa ligadas al NAD como coenzima
Deshidrogenasas ligasas a la Flavina que contiene FAD o FMN como grupo prostetico
Proteinas hierro-azufre
Citocromos (hemoproteinas: Fe + profirina
7. ¿Qué objeto tiene usar parafina liquida en cada tubo, que sucedería con el azul de metileno de no usar este producto?
Tiene que usar un colorante para que así se pueda observar la reducción ya sea con el azul de metileno u otro de colorante
8. Cómo es que actúa el azul de metileno, nombre otro compuesto que tenga la misma acción
El azul de metileno es un indicador de óxido-reducción (es azul cuando esta oxidado e incoloro cuando está reducido)
Otros compuestos son Azul de metileno, Metasulfato de fenocina, 2,6 diclorofenolindofenol, ferricianuro de potasio, etc.
9. Interprete el esquema del consumo de oxígeno a través de su electrodo.
A
[O2] B
( ) Desacoplador C D
( ) Sustrato ( ) Inhibidor
( ) Dador de electrones
