INFLUÊNCIA DO INIBIDOR DA ACIL COA SINTETASE DE CADEIA LONGA EM EMBRIÕES IN VITRO

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(1)INFLUÊNCIA DO INIBIDOR DA ACIL-COA SINTETASE DE CADEIA LONGA EM EMBRIÕES IN VITRO. Gabrielly Sant Anna 1 Diego Borba Müller 2 Franciele Lanzarini 3 Mateus José Sudano 4. Resumo: A produção in vitro de embriões (PIVE) envolve as etapas de colheita, maturação in vitro (MIV) e fecundação in vitro (FIV) de oócitos, bem como cultivo in vitro (CIV) de embriões .Segundo os dados da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões, o Brasil se destaca como o maior produtor in vitro de embriões bovinos. No entanto, um grande obstáculo para a disseminação desta tecnologia é a grande sensibilidade dos embriões produzidos in vitro à criopreservação. Essa redução na criotolerância está frequentemente associada com o acúmulo lipídico no citoplasma das células embrionárias. Uma proposta para esse entrave é manipular a quantidade lipídica embrionária. A Acil-CoA sintetase (ACS) é uma enzima catalizadora da da etapa inicial do metabolismo de ácidos graxos de cadeia longa. A modulação da ACS pode bloquear todo o metabolismo de ácidos graxos, síntese de lipídios e biomembranas. Ainda não há relatos com o uso dessa molécula na modulação lipídica embrionária. Investigar a influência da suplementação do triacsin C sobre o desenvolvimento e conteúdo lipídico embrionário é o objetivo do presente trabalho. O experimento foi realizado com oócitos aspirados de ovários originados de abatedouro. Os oócitos recuperados (n= 308) com citoplasma homogêneo contendo mais que três camadas de células do cumulus foram lavados em PBS+SFB (soro fetal bovino) e maturados in vitro em meio TCM 199. Após as 24 horas de MIV, foi praticado o protocolo de FIV. A CIV ocorreu 18 horas após a FIV, onde as estruturas embrionárias foram desnudadas e cultivadas no meio SOFaaci suplementado com 2,5% de SFB e 5 mg/mL de BSA, até o dia 10. No dia 3 de cultivo, foram observadas as taxas de clivagem dos zigotos. No dia 4 de cultivo (96 horas após a FIV), os zigotos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: 1) Grupo Controle (placebo): meio suplementado com 2,5 µL de PBS; 2) Grupo Tratado: meio suplementado com 2,5 µL de Triacsin C (dose 1µM), inibidor da ACS. Blastocistos expandido oriundos do grupo Controle (n= 27) e Tratado (n= 23) foram coletados no dia 7 e dia 8, após a FIV e submetidos à coloração de Sudan Black B, a fim de possibilitar a quantificação lipídica. Fotos de microscopia foram capturadas para realizar a quantificação lipídica no programa ImageJ pelo método color segmentation. Para análise estatística, foi realizado ANOVA seguido do teste Tukey com o auxílio do software GraphPad Prisma 5.0. Como resultado, o conteúdo.

(2) lipídico citoplasmático observado no grupo Controle (16,2% ± 1,4) foi superior (P Palavras-chave: Inibidor; conteúdo lipídico; embriões.. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR DA ACIL-COA SINTETASE DE CADEIA LONGA EM EMBRIÕES IN VITRO 1 Aluno de graduação. [email protected]. Autor principal 2 Aluno de graduação. [email protected]. Co-autor 3 Aluno de pós-graduação. [email protected]. Co-autor 4 Docente. [email protected]. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(3) ,1)/8Ç1&,$ '2 ,1,%,'25 '$ $&,/-&R$ 6,17(7$6( '( &$'(,$ /21*$ 62%5( 2 '(6(192/9,0(172 ( &217(Ò'2 /,3Ë',&2 '( (0%5,®(6 %29,126 352'8=,'26 ,1 9,752 1. INTRODUÇÃO. A produção in vitro de embriões (PIVE) envolve as etapas de colheita, maturação in vitro (MIV) e fecundação in vitro (FIV) de oócitos, bem como cultivo in vitro (CIV) de embriões. A PIVE permite a diminuição do intervalo entre as gerações, acelera o melhoramento genético animal, amplia a vida reprodutiva de animais de alto valor genético portadores de alterações adquiridas, facilita a comercialização nacional e internacional do material genético e permite a formação de bancos de gametas e embriões criopreservados, entre outras aplicações (GONÇALVES et al., 2008). Segundo os dados da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS, 2015), o Brasil se destaca como o maior produtor in vitro de embriões bovinos, em comparação com a produção mundial, com 69.140 doadoras, 829.685 oócitos aspirados e 348.468 embriões produzidos in vitro. No entanto, um grande obstáculo para a disseminação desta tecnologia é a grande sensibilidade dos embriões produzidos in vitro à criopreservação. Essa redução na criotolerância está frequentemente associada com o acúmulo lipídico no citoplasma (SUDANO et al, 2011) das células embrionárias. Essas gotículas lipídicas são internamente constituídas por lipídios neutros, como o triacilglicerol, e uma monocamada externa de fosfolipídios e colesterol, como descrito por Brown (2001). Uma proposta para esse entrave é manipular a quantidade lipídica embrionária. Mashek, et al (2006) descreveu a Acil-CoA sintetase (ACS) como enzima catalizadora da da etapa inicial do metabolismo de ácidos graxos de cadeia longa e notou que algumas isoformas da mesma aumentaram a síntese de triacilglicerol. Dessa forma, a modulação da ACS pode bloquear todo o metabolismo de ácidos graxos, síntese de lipídios e biomembranas. Guo (2015); Mashek (2007) e Yaney (2001), comprovaram em seus experimentos que o Triacsin C foi eficaz em sua capacidade inibitória sobre enzimas pertencentes a ACS, impedindo a conversão de ácidos graxos em acil-CoA de cadeia longa, diminuindo assim o metabolismo de síntese lipídica. Todavia, ainda não há relatos com o uso dessa molécula na modulação lipídica embrionária. Dessa forma, investigar a influência da suplementação do triacsin C sobre o desenvolvimento e conteúdo lipídico embrionário é, portanto, o objetivo do presente trabalho. 2. METODOLOGIA. O experimento foi realizado no Laboratório de Genética e Melhoramento Animal da Universidade Federal do Pampa ± Uruguaiana. Os oócitos foram aspirados com seringa de 10 mL de ovários originados de abatedouro e rastreados em PBS (Tampão fosfato-salino) a fim de selecionar os oócitos grau I e II, como descrito por Leibfried e First (1979, apud GONÇALVES et al., 2008, p.264). Em seguida, os oócitos recuperados (n= 308) com citoplasma homogêneo contendo mais que três camadas de células do cumulus foram lavados.

(4) em PBS+SFB (soro fetal bovino) e maturados in vitro em meio TCM 199, SFB, piruvato, FSH (Hormônio folículo estimulante), estrógeno, e penicilina/estreptomicina. Após as 24 horas de maturação, foi praticado o protocolo de fertilização in vitro (FIV; dia zero) relatado por Gonçalves et al. (2008, p. 271 e 272). O cultivo in vitro (CIV) ocorreu 18 horas após a FIV, onde as estruturas embrionárias foram desnudadas e cultivadas no meio SOFaaci suplementado com 2,5% de SFB e 5 mg/mL de BSA, até o dia 10. No dia 3 de cultivo, foram observadas as taxas de clivagem dos zigotos. No dia 4 de cultivo (96 horas após a FIV), os zigotos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: 1) Grupo Controle (placebo): meio suplementado com 2,5 µL de PBS; 2) Grupo Tratado: meio suplementado com 2,5 µL de Triacsin C (dose 1µM), inibidor da ACS. Antes da utilização, o inibidor e o PBS deveria permanecer em temperatura ambiente por 30 minutos e posteriormente ser mantido em incubadora com 5% de Co2 por 15 minutos, para estabilizar a droga. Blastocistos expandido oriundos do grupo Controle (n= 27) e Tratado (n= 23) foram coletados no dia 7 e dia 8, após a FIV e submetidos à coloração de Sudan Black B, a fim de possibilitar a quantificação lipídica, como descrito anteriormente (Sudano et al., 2012, p.02). Fotos de microscopia foram capturadas para realizar a quantificação lipídica no programa ImageJ pelo método color segmentation. Nos dias 9 e 10 observou-se a eclosão dos embriões que continuaram nas gotas de CIV. Para análise estatística, foi realizado ANOVA seguido do teste Tukey com o auxílio do software GraphPad Prisma 5.0. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO A taxa geral de clivagem foi de 64,8% (Figura 1), não havendo interferência do tratamento nesse resultado, pois foi avaliada antes do Dia 4. A produção de blastocisto não diferiu (P<0.05) entre os grupos Controle e Tratado (21,7 ± 4,8 vs 19,3 ± 3,5%, respectivamente; Figura 1).. Figura 1: Efeito do inibidor da acil-coA sintetase de cadeia longa sobre taxa de clivagem e produção de blastocistos de embriões produzidos in vitro.. O conteúdo lipídico citoplasmático observado no grupo Controle (16,2% ± 1,4) foi superior (P<0.05) quando comparado ao grupo Tratado (11,8 ± 0,7), como pode ser observado na Figura 2. A redução do conteúdo lipídico observada no grupo.

(5) tratado sustenta a efetividade da inibição da Acil-CoA sintetase de cadeia longa (ACS) e consequente não ativação de ácidos graxos de cadeia longa para gerar Acil-CoA, diminuindo assim o metabolismo de lipídeos, como descrito anteriormente por Zhang, et al. (2011) em embriões e Drosófila. Esse resultado era esperado, visto que alguns autores, como Guo (2015); Mashek (2007) e Yaney (2001) tinham obtido resultado satisfatório sobre o inibidor das ACS (Triacsin C) e a diminuição da síntese lipídica em células de hospedeiro parasitadas por Giardia intestinalis, em células de hepatoma de ratos e em células pancreáticas, respectivamente. Dessa forma, no presente trabalho observou-se que em embriões produzidos com a suplementação de Triacsin C tem o mesmo efeito sob o metabolismo de lipídios.. Figura 2: Efeito do inibidor da acil-coA sintetase de cadeia longa sobre o conteúdo lipídico citoplasmático de blastocistos bovinos produzidos in vitro. Pontos enegrecidos representam as gotas lipídicas citoplasmáticas. A, B Letras incomuns diferem (P<0.05). 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS. Portanto, a droga Triacsin C, inibidor da ACS, não afetou o desenvolvimento e reduziu o conteúdo lipídico citoplasmático de embriões bovinos produzidos in vitro, surgindo como uma possível estratégia aplicada na produção in vitro de embriões que serão destinados a criopreservação. 5. REFERÊNCIAS BROWN, D.A. Lipiddroplets: proteins floating on a pool offat. CurrentBiology, v.11, p.446449, 2001. GONÇALVES, P.B.D.; FIGUEIREDO, J.R.; FREITAS, V.J.F.Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. 2.ed. São Paulo, Roca, 2008. 393p. GUO, F.; ORTEGA-PIERRES, G.; ARGÜELLO-GARCÍA, R.; ZHANG, H. GiardiafattyacylCoAsynthetases as potentialdrugtargets. FrontiersinMicrobiology, July 2015, v.6, article 753. doi: 10.3389/fmicb.2015.00753.

(6) MASHEK, D.G.; LI, L.O.; COLEMAN, R.A. Long-chainacylCoAsynthetasesandfattyacidchanneling.Future Lipidol.2(4): 465±476, ;Universityof North Carolina, 2007 August. MASHEK, D.G.; MCKENZIE, M.A.; VANHORN, C.G. et al. RatLong Chain AcylCoASynthetase 5 IncreasesFattyAcidUptakeandPartitioningtoCellularTriacylglycerol in McArdle-RH7777 Cells*. The journalofbiologicalchemistry vol. 281, no. 2, pp. 945±950, January 13, 2006 © 2006 by The American Society for Biochemistryand Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A. IETS. 2014 Statistics of Embryo Collection and Transfer in Domestic Farm Animals. Embryo Transfer Newsletter [internet]. Champaign-Illinois, 2015. Acesso em: 23 de agosto de 2017. Disponível em: http://www.iets.org/pdf/comm_data/December2015.pdf SUDANO, MJ; et al. Phosphatidylcholine and Sphingomyelin Profiles Vary in Bos taurus indicus and Bos taurus taurus In Vitro- and In Vivo-Produced Blastocysts. Biology of Reproduction, 87, p.1-1. 2012. SUDANO, M. J.; PASCHOAL, D. M.; RASCADO, T. S. et al. Lipidcontentandapoptosisof in vitro-producedbovineembryos as determinantsofsusceptibilitytovitrification. Theriogenology. Volume 75, p. 1211±1220, 2011. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.11.033 YANEY, G. C.; CIVELEK, V.N.; RICHARD, A.M. et. al. GlucagonLikePeptide1StimulatesLipolysis in Clonal Pancreatic -Cells (HIT). Diabetes, v.50, january 2017. ZHANG, Y., ZHANG, Y., GAO, Y., et al. Drosophila long-chainacyl-CoAsynthetase acts like a gap gene in embryonic segmentation. Developmental Biology. Volume 353, Issue 2, 15 May 2011, Pages 259±265. Disponível em: http://dx.doi.org/10.1016/j.ydbio.2011.02.030.

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