INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS (N.A.T.)

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS

DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLÉICOS

(

N.A.T.

)

BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO

INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN

 Patógenos transmisibles por transfusión

 Virus Virus de la Hepatitis B (HBV) Virus de la Hepatitis C (HCV)

Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2) Virus Linfotrópico Humano I/II (HTLV I/II)

otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus

 Parásitos Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza) otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum

 Bacterias Treponema pallidum (Sífilis) Brucella abortus (Brucelosis)

otros

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN EN ARGENTINA

(LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )

 HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total

 HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV

 HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2  HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II

 Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinación indirecta, ambos

anti-Tripanosoma cruzi

 Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum

 Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-Brucella abortus

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN

Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o plasma) del donante de la presencia de una respuesta inmune contra un patógeno dado

 Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio

 Ej: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del donante (EIA anti-HIV 0/1/2)

Métodos directos: detección directa de la presencia del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del donante

 Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag

 Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral

F

ACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIÓN DE INFECCIONES A TRAVÉS DE LAS TRANSFUSIÓN

 Errores humanos o de laboratorio

Problemas en los sistemas de análisis/equipos Insuficiencias en la calidad de los análisis

Entrenamiento deficitario

 Seroconversiones atípicas

 Variantes o genotipos del patógeno no detectadas

 Cambios epidemiológicos

 Periodo de “ventana” serológico

Tiempo Infección

Reacción inmune

Reactivo Serológico

P

ERÍODO

V

ENTANA

TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIÓN Y EL

DESARROLLO DE MARCADORES SEROLÓGICOS

6 Período

Ventana: NAT

Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al. Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003

Año 1/1000 1/10,000 1/100,000 1/1000,000 Rie sg o de infe cció n po r un id ad tr ansf un di da 1985 1990 1996 1999 2001 HCV HBV HIV 1/180,000 1/1.600,000 1/1.900,000 1/100

Ac Anti-HIV Ac Anti-HCV p24 NAT

EVOLUCIÓN DEL RIESGO EN LA PROVISIÓN DE SANGRE

N

UCLEIC

A

CID

T

ESTING

Ventajas de NAT

 Importante avance teconológico en screening de sangre

 Altamente sensible & específico

 dirigido especificamente a las secuencias nucléicas virales

 Detección directa del RNA or DNA viral

 Ayuda a la prevención de enfermedades transmisibles por transfusión

 Provee una etapa adicional de seguridad a la provisión de sangre segura

 Reduce el Período Ventana desde la infección hasta la detección

Tiempo Infección Reactividad Serológica Virus Detección más temprana NAT positivo

O

BJETIVO DE NAT O DGV

:

D

ISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA

Reacción inmune

9

Eclipse

Período Ventana

EJ: EVOLUCIÓN CLÍNICA DE HIV: DÓNDE ACTÚA NAT?

EVOLUCIÓN EN LA IMPLEMENTACIÓN DE LAS TÉCNICAS NAT EN LOS BANCOS DE SANGRE

 1993 se considera formalmente la utilización de NAT para el tamizaje en bancos de sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos de infección por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa manufacturada.

 1995 Comité Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se adhirió a este lineamiento, haciéndolo extensivo a todos los productos medicinales derivados del plasma.

 1997 Organización Mundial de la Salud (OMS) se establecen estándares para el ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.

 2000-2001 diferentes países incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el

tamizaje de donaciones.

 2009 OMS en su documento “Recommendations: Screening Donated Blood for Transfusion-Transmisibles Infection” sugiere que junto a los ensayos de tamizaje serológicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serológicos de antígenos y/o anticuerpos, se realice la búsqueda de ácidos nucléicos virales para

P

ERÍODO

V

ENTANA

MODEL TESTING DATA

Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.

Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .

VENTAJAS NAT

13 VIRUS Pruebas serológicas NAT MP (Minipool) NAT ID (Individual) VIH

(incluye p24) 16 días 10 días 7 días VHC 70 días 9 días 7 días

VHB 59 días 49 días 38 días

Acortamiento del período de ventana inmunológico

TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA

MOLECULAR



Involucran tres etapas:

1.

Extracción o captura del genoma viral

2.

Amplificación

3.

Detección

Ejemplos:

 PCR(Polymerase Chain Reaction)

 RT-PCR (Real Time PCR)

 NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)

15 EasyQ Instrument &

Reagents Desktop computer Strip centrifuge NucliSens EasyQ Incubator NucliSens EasyQ Analyzer

Nuclisens Easy Q system TMA: pasos principales del ensayo

Detección

Captura del blanco o diana (target) Amplificación PCR Real Time PCR TMA NASBA

MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS

TÉCNICAS NAT

 Técnicas “in house”  Técnicas comerciales  Técnicas Cualitativas  Técnicas Cuantitativas

 Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)

16 POOL 48 POOL 24 UNIDADES POOL 24 UNIDADES POOL 8 POOL

NAT D

ETECTA

I

NFECCIÓN

HCV

MÁS TEMPRANO QUE EL

T

EST DE

A

NTICUERPOS 17 0 1,000 10,000 100,000 10,000,00 10,000,000 0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 NAT pool HCV Ac HCV GEq/mL _S/CO Días 28 días 7 días

Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999

NAT ID test

PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR

:

Sensibilidad Especificidad

Detección de variantes/subtipos Reproducibilidad

Trazabilidad de reactivos y resultados Software adecuado

Control Interno

Control de Contaminación

Ensayos discriminatorios/confirmatorios Identificación de su uso: RUO o IVD

Marca CE, FDA, ANMAT

PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS EN SUS DIFERENTES ETAPAS:

 Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de

ADN/ARN foráneo o productos de amplificaciones precedentes.

 Control Negativo: para evaluar los riesgos de

contaminación (en la organización del espacio físico, en los métodos de trabajo, posible aerozolización durante el alicuotado de reactivos)

 Control Positivo: para controlar la presencia de

inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas.

 Control Interno: para verificar la idoneidad de la

amplificación y/o la presencia de inhibidores de la

Marca (s) Formato Muestra Uso habilitado Fabricante Fecha de Aprobación COBAS Ampliscreen HIV-1 Test PCR _Plasma Donor Screen Expanded Indications

For Use: Source Plasma donors, other

living donors, and organ donors

Roche Molecular

Systems, Inc 12/20/2002

Procleix HIV-1/HCV Nucleic Acid Test (TMA)

Plasma

Donor Screen Expanded Indications

For Use: Source Plasma donors, living

organ donors and cadaveric samples Gen-Probe San Diego, CA 92121 02/08/2002 UltraQual HIV-1 RT-PCR Assay PCR _Plasma

Donor Screen National Genetics Institute

Los Angeles, CA 92121 09/18/2001

UltraQual HCV

RT-PCR Assay PCR _Plasma

Donor Screen National Genetics Institute Los Angeles, CA 92121 09/18/2001 COBAS AmpliScreen HCV Test PCR Plasma Donor Screen Expanded Indications

For Use: Source Plasma donors, other

living donors, and organ donors Roche Molecular Systems, Inc _12/3/2002 COBAS AmpliScreen HBV Test PCR Plasma Donor Screen Indications For Use: Source Plasma donors,

other living donors, and organ donors

Roche Molecular

Systems, Inc _04/21/2005

Procleix WNV Assay

Nucleic Acid Test (TMA)

ID

Plasma

Qualitative detection of West Nile Virus (WNV) RNA from volunteer donors Gen-Probe San Diego, CA 92121 12/01/2005 20

COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LOS TEST NAT

95% Límite de Detección (95% CI)

Ensayo HIV (IU/ml) HCV (IU/ml) HBV (IU/ml) WNV** (Copies/ml) Procleix TMA* 19.62 (17.15-23.16) 2.78 (2.44-3.37) 7.46 (6.43-8.97) 3.4 AmpliScreen* Std preparation 323.4 (284.9-387.3) 41.9 (28.0-111.8) 15.99 (13.78-20.06) Taq Screen 15 AmpliScreen* Multiprep 78.4 (68.4-94.4) 28.8 (20.5-85.8) 4.41 (3.56-6.13)

* Roche’s COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert ** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499

DISEÑO

,

ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Metas principales para la instalación:



Proporcionar el espacio suficiente para el flujo

de trabajo y mantenimiento de equipos



Evitar la contaminación



Mantener la correcta temperatura , humedad y

presión del ambiente

CONDICIONES GENERALES

 Nivel de seguridad 2 : BSL2

 Paredes con pintura resistente a la descontaminación

(ácidos o álcalis)

 Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo.

 Presión relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa

en área de post-amplificación

 Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con

bordes sanitarios y puertas corredizas

 Mesadas: resistentes a agentes químicos

 Iluminación: compartimiento estanco

 Electricidad: UPS de soporte / grupo electrógeno

ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

 Área de preparación de reactivos y muestras

 Área de pre-amplificación

 Área de post-amplificación y detección

Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra.

Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo diferentes

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

BIOLOGIA MOLECULAR

Principal objetivo: minimizar la contaminación a través de…

 Diseño del ensayo

 Disposición del laboratorio

 Control del flujo de trabajo

ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

26

Pre-Amplificación

GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

 Manuales de Gestión de la Calidad

 Manuales de procedimientos

 Manual de Bioseguridad

 Estándares y normativas:

 Norma ISO 9001:2000

 Norma ISO /IEC17025 /1999

 Estándar Paul Erlich Institute

 Organismos internacionales: OMS “Collaborative Study

Group” (provee CCE y establece la unidad de medida:

UI/ml)

 Acreditación

C

ONCLUSIONES

(1)

 Disminución del período ventana

 Otras aplicaciones: tests que permiten una

detección directa de otros virus. Ej: WNV, otros virus emergentes

 Progresar desde analizar mini-pooles a analizar

muestras individuales.

 Lograr la implementación de automatización total

de las técnicas de NAT:

-disminución de los errores del operador. -mejor estandarización operativa.

-optimización de los tiempos de reacción.

C

ONCLUSIONES

(2)

Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas puntuales referentes a la implementación de NAT en Argentina:

 _{la obligatoriedad de las técnicas NAT en Medicina Transfusional,}

creación de comités de expertos que evalúen la necesidad de legislar el tema

 _{definición de la logística de centralización de muestras para lograr}

un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable

 _{evaluación de resultados obtenidos hasta el momento mediante las}

técnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de definir si la sensibilidad de dichas técnicas y su ejecución son útiles en nuestro sistema de salud

 _{consolidación en la formación de los recursos humanos dedicados}