REBIOL. Vol. 28, N° 2: julio-diciembre, 2008
Organo oficial de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo-Perú
ARTÍCULO/ARTICLE
Concentración mínima bactericida “in vitro” del
extracto etanólico de propóleos de Chepén
(Perú) sobre Listeria monocytogenes
“In Vitro” minimal bactericidal concentration of the propolis
ethanolic extract from Chepen (Peru) on Listeria monocytogenes
Eder A. Diestra Guevara
1, Elvia F. Del Castillo-Algarate
1, Maritza
Gerónimo-Gonzales
1, Pedro E. Mercado-Martínez
2*
1
Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología. 2Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú.
*Autor a quien dirigir correspondencia peemercado_1@hotmail.com
RESUMEN
Se determinó la concentración mínima bactericida “in vitro” de un extracto de propóleos sobre Listeria monocytogenes. Se utilizó un cultivo bacteriano en fase exponencial media y propóleos procedente de Chepén, La Libertad-Perú. El método utilizado fue el de inhibición mínima microbicida, usando un grupo control y otro experimental. Para este último se hicieron diluciones al medio, concentraciones desde 15mg/mL hasta 0,01mg/mL, se inoculó la suspensión bacteriana y se incubó. Posteriormente se sembró por estría en agar BHI.
Después de la incubación se determinó la concentración mínima bactericida del extracto etanólico de propóleos frente a Listeria monocitogenes, cuyo valor fue de 1,23mg/mL.
Palabras clave: concentración mínima inhibitoria, Listeria monocytogenes, propóleos.
ABSTRACT
In vitro minimun inhibitory concentration of the ethanol extract of propolis on Listeria monocytogenes was determined. For this, a bacterial culture in half exponential phase and propolis from Chepen, La Libertad-Peru were used. Minimun inhibition microbicide method ws used, as well as, a control and experimental groups. For the last group dilutions were done in the middle, to concentrations since 15mg/mL until 0.01mg/mL, the bacterial suspensión was inoculated and incubated. Then was sow by stretch in BHI agar, the minimun inhibitory concentration of the ethanol extract of propolis about Listeria monocytogenes was determined after incubation, and it was 1.23mg/mL.
Key words: minimun inhibitory concentration, Listeria monocytogenes, propolis.
INTRODUCCIÓN
L. monocytogenes, bacilo Gram-positivo, móvil, no esporulado, anaerobio facultativo y catalasa-positivo, es el agente causal de un síndrome generalizado llamado listeriosis, enfermedad mundial que está reemergiendo debido a que se trasmite fácilmente a través de la ingesta de hortalizas y otros alimentos crudos, para los cuales no hay un proceso de desinfección conveniente para eliminarlo1,2,3,4. La patogenicidad de L. monocytogenes se debe a su capacidad para adherirse, invadir y multiplicarse dentro de una gran variedad de células no fagocíticas
(enterocitos, hepatocitos, fibroblastos, células endoteliales y células dendríticas), lo que lo convierte en un patógeno multisistémico que puede infectar un amplio rango de tejidos hospederos, con un claro tropismo por el útero grávido y el sistema nervioso central 5.
La manifestación primaria de la listeriosis en el hombre puede incluir la presencia de septicemia, meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis, habitualmente precedida de síntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre. También se presentan manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. A pesar de que la morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad puede alcanzar valores de alrededor del 30%. En embarazadas, la infección puede dar lugar a abortos, nacidos muertos o nacimientos prematuros6,7.
El tratamiento oportuno de la listeriosis depende del diagnóstico rápido y preciso. Una condición para el uso adecuado de los antibióticos es el estudio previo de la sensibilidad de L.
monocytogenes a los antibacterianos, lo que se puede realizar a través de la determinación de la
Concentración Mínimo Bactericida mediante técnicas establecidas 8,9.
En los últimos años se vienen desarrollando investigaciones relacionadas con los beneficios para la salud humana de productos producidos por las abejas, siendo el propóleo uno de ellos10. Éste es un producto resinoso y complejo, con variabilidad en el color (ocre, rojo, pardo, marrón claro o verde) y el aspecto (friables y firmes o gomosos y elásticos) 11, 12.
Los principales componentes del propóleos son resinas y bálsamos que contienen flavonoides y ácidos fenólicos o sus ésteres (50%), ceras (7.5-35%), aceites volátiles (10%), polen (5%) e impurezas (4.4-19.5%). Además, contienen pequeñas cantidades de terpenos, taninos, restos de la secreción de las glándulas salivares de las abejas y posibles contaminantes. Los compuestos activos de interés médico son los flavonoides que incluyen flaconas, flavonoles, flavononas y flavononoles 13. El propóleos puede variar de una región a otra, ya que su presencia se asocia en parte a las resinas que las abejas recogen de las plantas presentes en el entorno 10.
Al propóleos se le atribuyen efectos antiinflamatorios, inmunoestimulantes, hepatoprotectores, carcinoestáticos, antimicrobianos, antivirales, antifúngicos antiprotozoarios, anestésicos y de regeneración tisular14, 15. Los disolventes y el método de extracción utilizado pueden modificar la actividad antimicrobiana del propóleos, habiéndose verificado que los extractos etanólicos al 60-80% inhiben el crecimiento microbiano, al 70-80% tienen una mayor actividad antioxidante y al 80% inactivan a la hialuronidasa 13. Así, por
ejemplo, se investigó la efectividad antimicrobiana de propóleos provenientes de Campeche, México, sobre Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pyogenes, encontrando que la efectividad depende del solvente empleado, la procedencia del propóleos y la especie bacteriana evaluada12.
Al mismo tiempo, se evaluó las propiedades antimicrobianas del propoleos procedentes de: Serbia, que tienen actividad antimicrobiana contra bacterias gram- positivas y levaduras16; Turquia, que son efectivos contra 20 especies de bacterias, de las cuales L. monocytogenes mostró ser una de las más sensibles17; Argentina, Colombia y Cuba, que poseen cualidades de inhibir el crecimiento de Streptococcus mutans ATCC25175, a concentraciones de 15 a 3.75 mg/mL 18; y de Bulgaria, que son activos contra Helicobacter pylori 19.
Se investigó, asimismo, la influencia estacional y la actividad antimicrobiana de propóleos provenientes de dos zonas climáticas de Venezuela sobre Staphylococcus aureus y Micrococcus
luteus., cuyos resultados muestran que el efecto de los propóleos varía de acuerdo a la influencia
estacional y que los extractos etanólicos de propóleos pueden ser usados como agentes antimicrobianos frente a las bacterias estudiadas10, al mismo tiempo que se pudo determinar que la actividad microbiana de propóleos provenientes de dos regiones diferentes de Anatolia, se debe principalmente al ácido cafeico y sus ésteres presentes en los propóleos20.
También se ha determinado la acción antibacteriana del extracto etanólico de propóleo peruano (EEPP) proveniente del valle de Oxapampa- Pasco, sobre Streptococcus mutans y
Lactobacillus casei, verificandose que el EEPP, en solución al 0.8%, tiene una mejor acción
antibacteriana contra estas bacterias respecto de la Clorhexidina al 0.12% 21.
Considerando que L. monocytogenes es una bacteria patógena para el hombre y que en el Perú no se ha investigado sobre la sensibilidad de esta bacteria a los componentes antibacterianos presentes en el propóleos, esta investigación está orientada a determinar la concentración
mínima bactericida “in vitro” del extracto etanólico de propóleos, proveniente de Chepén, sobre la supervivencia L. monocytogenes.
MATERIAL Y MÉTODOS Material
Se trabajó con cultivos puros de Listeria monocytogenes proporcionados por el Laboratorio de
Fisiología y Genética Bacteriana de la Universidad Nacional de Trujillo y con propóleos procedente de Chepén, La Libertad (Perú) cuyo extracto etanólico se obtuvo en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo.
Resiembra de Listeria monocytogenes
Se tomó una asada de cultivo de Listeria monocytogenes y se sembró por estría en agar BHI (infusión cerebro corazón), luego se incubó a 37 °C por 16 horas, tiempo en que la bacteria se encuentra en fase exponencial media22.
Obtención del inóculo
Se preparó una suspensión de Listeria monocytogenes, cuya concentración correspondía al tubo N° 3 de la escala de Mc Farland equivalente a 9 x 108 células/mL) 12.
Determinación de la Concentración Mínima Bactericida
Se empleó el método de Inhibición Mínima Microbicida12, que consistió en lo siguiente: Se emplearon dos tubos controles: un control positivo conteniendo 2 mL de caldo BHI y 0,1 mL de la suspensión bacteriana; y un control negativo conteniendo solo 2 mL de caldo BHI. Se preparó una serie de 11 tubos, al primero se le agregó 2 mL de caldo BHI a doble concentración y a los restantes la misma cantidad de caldo BHI a simple concentración. Al primer tubo se le adicionó 2 mL de extracto etanólico de propóleo al 3% (30mg/mL), de este se tomó una alícuota de 2mL que se añadió al siguiente tubo y así se procedió con los tubos restantes hasta desechar los últimos 2 mL, de esta forma se obtuvieron las siguientes diluciones del extracto etanólico de propóleo: 15; 7,5; 3,75; 1,87; 0,93; 0,46; 0,23; 0,11; 0,05; 0,02; 0,01 mg/mL.
A cada tubo se agregó 0,1 mL del inóculo bacteriano. Los tubos del grupo control y experimental se incubaron a 37°C por 24 horas. Posteriormente se tomó una asada de cada tubo y se sembró por estría en agar BHI, luego se incubó nuevamente a 37°C por 24 horas. De las placas donde no se observó crecimiento de Listeria monocytogenes se escogió la de menor concentración, está correspondió a la concentración mínima bactericida del extracto etanólico de propóleo sobre la bacteria evaluada.
RESULTADOS
Se encontró que el extracto etanólico de propóleo de Chepén tiene un efecto bactericida sobre Listeria monocytogenes, lo cual se evidencia por la ausencia de crecimiento de esta bacteria; se determinó que a partir de la concentración de 1.87mg/mL la falta de crecimiento es total y que a las concentraciones de 0.93mg/mL se aprecia crecimieto en algunos de los ensayos (Tabla 1). Se encontró, también, que la concentración inhibitoria mínima en el ensayo 1 fue de 0.23mg/mL y en los ensayos 4, 5, 6 y 7 de 1.87mg/mL (Tabla 2)
Tabla 1. Concentración Mínima inhibitoria del extracto etanólico de propóleos de Chepén (Perú) sobre
Tabla 2. Valores de las concentración mínima bactericida obtenidos al evaluar, en siete ensayos, el efecto del extracto etanólico de propóleo sobre Listeria monocytogenes.
Ensayo Concentración mínima bactericida(mg/mL) 1 0,23 2 0,46 3 0,46 4 1,87 5 1,87 6 7 1,87 1,87
Concentración mínima bactericida promedio (X)= 1,23 mg/mL
DISCUSIÓN
La concentración mínima bactericida obtenida en esta investigación es de 1,23 mg/mL, sin embargo Yang et al22 revelaron que el extracto etanólico de propóleo en una dosis de 0,0075 mg/mL o superior a esta, ejercen un efecto bactericida sobre L. monocytogenes. Por lo antes dicho, el extracto etanólico proveniente de la provincia de Chepén es menos efectivo que el propóleo empleado por Yang; pues es necesario una concentración mayor de este propóleo para inhibir a
Listeria monocytogenes. Incluso el propóleo puede tener un menor efecto inhibitorio sobre la
bacteria o ésta mostrar resistencia ante esta sustancia15.
En un estudio del efecto antimicrobial del extracto de propóleo turco sobre distintas especies microbianas, se determinó el efecto bactericida de esta sustancia sobre Listeria monocytogenes, a la concentración de 0.02% (vol/vol) 23. En general, la actividad antimicrobiana de los propóleos es atribuida al contenido de flavonoides. Estas sustancias actúan sobre las bacterias generando complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles15, inhibiendo la girasa del DNA, inhibiendo la función de la membrana citoplasmática e inhibiendo el metabolismo energético de las células16.
La actividad del propóleo frente a Listeria monocytogenes puede variar según la procedencia de esta resina, ya que de esto depende su composición química.
CONCLUSIÓN
La concentración mínima bactericida “in vitro” del extracto etanólico de propóleo proveniente de Chepén sobre Listeria monocytogenes es de 1,23 mg/mL.
AGRADECIMIENTO
A la Ph. D. Nydia Catañeda, por sus consejos y apoyo incondicional para llevar a cabo la investigación.
REFERENCIAS
1. Murray P, et al. Manual de Microbiología Clínica. 6ª ed. American Society for Microbiology. Washington; 1995. .
2. Quinn P, Carter M, Markey B, Carter G. Clinical Veterinary Microbiology. Mosby International. Escocia; 1999.
3. Oteo J y Alós J. Listeria y listeriosis. Control calidad SEIMC. 2000
4. Casadiego P, Cuartas R, Mercado M, Carrascal J. Efectividad del agua electrolizada oxidadora en la inactivación de Listeria monocytogenes en lechuga (Lactuca sativa). MVZ-Córdoba 2004; 9(2): 428-437. 5. Torres K, Sierra S, Poutoul R, Carrasal A, Mercado M. Patogénesis de Listeria monocytogenes,
Microorganismo zoonótico emergente. MVZ-Córdoba 2005; 10(1): 511-543.
6. OIE. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004. Capítulo 2.10.14. Listeria monocytogenes. Pág: 1222-1237.
7. Álamo C, Rondón A. Meningoencefalitis por Listeria monocytogenes. Pediátrica 2006; 8(1):1-12.
8. Mathey A. Sensibilidad antimicrobiana de cultivos de Listeria monocytogenes aislados de quesos frescos de producción artesanal que se expenden en el mercado “La Unión” de Trujillo-La Libertad entre Enero a Marzo del 2008. Tesis para obtener el título de Biólogo- Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. 2008.
9. Díaz D. Determinación de la CMI de propóleos cubanos a partir de dos técnicas diferentes. Apiciencia 2000; 10(2): 1-12.
10. Manrique A. Actividad antimicrobiana de propóleos provenientes de dos zonas climáticas del estado de Miranda, Venezuela. Efecto de la variación estacional. Zootecnia Tropical 2006; 24(1): 43-53. 11. Peña D. Estandarización en propóleos: antecedentes químicos y biológicos. Cien. Inv. Agr. 2008;
35(1): 17-26.
12. Tolosa L, Cañizares E. Obtención, caracterización y evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos de propóleos de Campeche. Ars Pharmaceutica 2002; 43(1-2): 187-204.
13. Farré R, Frasquet I, Sánchez A. El própolis y la salud. Ars Pharmaceutica 2004; 45(1): 21-43.
14. Drovowolski J, Vohora S, Sharma K, Shah S, Naqvi S, Dandiya P. Antibacterial, antifungal, antiamoebic, antiinflamatory and antipyretic studies on propolis bee products. J Ethnopharmacol. 1991; 35: 77-82.
15. Grange J, Davey R. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine 1990; 83.
16. Stepanovic S Antic N, Dakic I, Svabic- Vlahovic M. In vitro antimicrobial activity of propolis and synergism between propolis and antimicrobial drugs. Microbiol Rev. 2003; 158(4): 353-357.
17. Ozcan M, Sagdc O, Özkan G. Antibacterial effects of Tukish pollen and propolis extracts at different concentrations. Archiv für Lebensmittelhygiene, 2004; 55(2): 39-40.
18. Moreno Z, Martinez P, Figueroa J. Efecto antimicrobiano in vitro de propóleos argentinos, colombianos y cubano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175. Nova- publicación cientifíca 2007; 5(7): 1-100.
19. Boyanova L, Derejian S, Koumanova R, Katsarov N, Gergova G, Mitov I, Nikolov R. Inhibition of Helicobacter pylori growth in vitro by Bulgarian propolis: preliminary report: J Med Microbiol 2003; 52(5): 417-419.
20. Kartal M, Yildiz S, Kaya S, Kurucu S, Topcu G. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia. J Ethnopharmacol 2003; 86(1): 69-73.
21. Equizábal M y Moromi H. Aactividad antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre Streptococcus mutans y Lactobacillus casei. Odontol. Sanmarquina 2007; 10(2): 18-20. 22. Yang H, Chang C, Chen Y, Chou C. Inhibitory effect of propolis extract on the growth of Listeria
monocytogenes and the mutagenicity of 4-nitroquinoline-N-oxide. Journal of the Science of Food and Agriculture 2005; 86(7).
23. Aspoy E. Selective effect of propolis in the isolation of Listeria monocytogenes. Nord Vet Med 1977; 29(10): 440-445.
