CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y ESTRÉS OXIDATIVO
DE CÉLULAS DE ENDOTELIO RENAL HUMANO
CAUSADO POR HIPERGLUCEMIA
Barbosa K.Y.*, Salgado L.M.**, Ramírez J.*, Cruz M****. Barbosa-Sabanero G.*, Sabanero M***. *Instituto de Investigaciones Médicas, **Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN México, ***Instituto de Investigación en Biología Experimental, Unidad de Investigación Médica en Bioquímica, Hospital de Especialidades, Centro Médico Nacional Siglo XXI. [email protected], [email protected], [email protected]. RESUMEN
La principal causa de las complicaciones vasculares durante la Diabetes Mellitius tipo 2 es la hiperglucemia. Los mecanismos propuestos de daño por hiperglucemia son: la formación de especies reactivas de oxígeno y productos finales de glicosilación avanzada, la activación de factores de transcripción y de crecimiento, además de citocinas proinflamatorias que participan en la disfunción endotelial.Sin embargo, se desconocen a nivel celular los cambios estructurales que sufre el endotelio en condiciones de hiperglucemia y el daño que las especies reactivas de oxígeno pudieran estar causando a proteínas y lípidos. En este trabajo se analizan estos aspectos. Se utilizaron cultivos endoteliales de riñón humano (HEK 293) expuestas a glucosa (10, 20, 25 y 40 mM) durante 48 y 72 horas y por inmunocitoquimica con anticuerpos específicos para tubulina y actina se evaluaron los cambios en el citoesqueleto. Además se evaluó la oxidación de lípidos por espectrofotométria utilizando ácido tiobarbitúrico y para analizar la oxidación de proteínas se utilizó el método basado en la reactividad de la 2,4-dinitrofenilhidrazina con los grupos carbonilos.Los resultados muestran que en los endotelios expuestos a glucosa: (1)se altera el citoesqueleto y la adhesión celular (2) los niveles de oxidación de lípidos y proteínas se incrementan. Estas alteraciones son concentración y tiempo dependiente. En conclusión los resultados muestran que los endotelios expuestos a glucosa presentan alteraciones morfologícas y bioquímicas que reflejan el posible daño renal presente durante la hiperglucemia en diabetes tipo 2. Sin embargo desconocemos si en el endotelio se induce apoptosis.
Palabras Clave: Hiperglucemia, citoesqueleto, estrés oxidativo.
INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es una enfermedad metabólica responsable del metabolismo anómalo de los hidratos de carbono, caracterizada por una hiperglucemia resultante de defectos en la secreción de insulina, en la acción de la insulina o en ambas (ADA 2005).
Complicaciones de la Diabetes. La diabetes está asociada a lesiones,
disfunción y fallo de órganos vitales, especialmente de los ojos, los riñones, los nervios, el corazón y los vasos sanguíneos. Los pacientes con diabetes padecen una mayor incidencia de enfermedades cardiovasculares, arterioscleróticas, vasculares periféricas, cerebrales y renales. La nefropatía diabética es una de las complicaciones vasculares más importantes y la mayor causa de morbilidad y mortalidad en pacientes con DM2. (US Renal Data System 2003). En el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), el costo de atención de los pacientes con Diabetes tipo 2 en el año 2000 fue de 552 millones de pesos, de los cuales el 47% del total se aplicó en costos directos y el 23% en el tratamiento de la insuficiencia renal por nefropatía diabética (Aguirre y cols 2000). Se ha descrito que la nefropatía
esta caracterizada por cambios estructurales en el glomérulo y progresiva acumulación de proteínas de matriz extracelular (Ziyadeh 2004). La principal causa de las complicaciones vasculares es la hiperglucemia (Srinivasan y cols. 2004).
Estrés Oxidativo en la Diabetes. Uno de los mecanismos propuestos de daño
endotelial por hiperglucemia es: la formación de especies reactivas de oxígeno (Brownlee 2001, Sen y Cols 1996). Recientes estudios sugieren que la hiperglucemia induce estrés oxidativo y que además disminuye los mecanismos de defensa antioxidante (Nishikawa y cols.2000). Estas especies reactivas de oxígeno (ROS) inician la modificación de lípidos y proteínas carbohidratos y DNA. Las modificaciones de estas moléculas afectan su función, distribución y metabolismo. Las ROS pueden iniciar entonces una cascada de señalización que induce daño celular y disfunción vascular. Entonces la acción de ROS representa un fenómeno crucial involucrado en los mecanismos patofisiológicos de la enfermedad microvascular.
Sin embargo la patología de la enfermedad es incierta, ya que se desconocen los mecanismos celulares y moleculares que participan en dicha patología.
Por ello, es importante entender a nivel celular los cambios estructurales que sufre el endotelio, así como el daño que es producido por especies reactivas de oxígeno en proteínas y lípidos en condiciones de hiperglucemia.
OBJETIVO
Se planteó evaluar los cambios que sufren los endotelios renales humanos durante la hiperglucemia. Para conocer el mecanismo patofisiológico de las especies reactivas de oxígeno, producidas por la diabetes en la enfermedad microvascular
Particularmente se examinó a nivel estructural la distribución de citoesqueleto de microtúbulos y microfilamentos. Además se determinaron los niveles de la oxidación de lípidos y proteínas causadas por hiperglucemia.
METODOLOGÍA
Cultivos Celulares. Las células endoteliales de riñón humano de la línea HEK
293, fueron cultivadas (1 x 106 células/ml) utilizando métodos y medios estándares de crecimiento (Medio de cultivo DMEM GIBCO), conteniendo 10% Suero Fetal Bovino. Incubados en una atmósfera húmeda a 37°C y con un 5% de CO2.
Exposición a Glucosa. Los cultivos fueron expuestos a las siguientes
condiciones experimentales: cultivos de células control y cultivos de células expuestas a diferentes concentraciones de glucosa (10mM, 20mM, 25mM y 40mM) por 48 y 72hrs.
Inmunocitoquímica. Los cultivos fueron fijados con una solución de
paraformaldehído al 4% con glutaraldehído al 0.05% por 30 min. Las células fueron lavadas tre veces con PBS y posteriormente permeabilizadas con un buffer de permeabilización para microtúbulos por 3min. Las células se expusieron al primer anticuerpo anti- β tubulina o anti- actina (Sigma) usado una dilución 1: 100, e incubando por 1 hr. Las células fueron lavadas 3 veces y a continuación se expusieron al segundo anticuerpo anti- IgG de ratón acoplado a FITC (Vector) usado a una dilución 15µg/100µl por 1hr. Por último las células fueron montadas en portaobjetos usando el medio de montaje Vector con Dapi (Vector). Finalmente las preparaciones fueron examinadas en un microscopio de epifluorescencia.
Peroxidación de lípidos y proteínas. La oxidación de lípidos fue medida por el
contenido de malondialdehído cuantificando especies reactivas al ácido tiobarbiturico por un método espectrofotométrico. El daño sobre proteínas se midió cuantificando el contenido de carbonilos mediante el método basado en la reactividad de la 2,4-dinitrofenilhidrazina con los grupos carbonilos.
RESULTADOS
Para evaluar los cambios morfológicos y estructurales inducidos por hiperglucemia, células endoteliales de riñón, fueron expuestas a concentraciones crecientes de glucosa. Los resultados muestran alteraciones en la morfología celular del endotelio, cambio en el patrón de distribución de tubulina y actina los cuales son dependientes de la concentración y tiempo de exposición a la glucosa (fig. 1). Además se observó pérdida de la integridad de la monocapa celular expuesta a 25 y 40 mM de glucosa, en estas condiciones las células del endotelio se desprenden, redondean y el daño es evidente con el cambio de la estructura típica del endotelio. Sugiriendo una alteración o daño de las uniones intercelulares (fig. 1).
Para evaluar la oxidación de lípidos y proteínas por las especies reactivas de oxígeno producido por hiperglucemia, se usó como marcador más relevante de daño oxidativo en el citosol el malondialdehído que indica el daño a los lípidos y la cuantificación de grupos carbonilo como un marcador de daño a proteínas (fig 2). Los resultados muestran que los niveles de oxidación de lípidos y proteínas se incrementan a mayor exposición a glucosa y en forma dependiente de tiempo como lo muestran los resultados de la figura 2. Sugiriendo que en este modelo de endotelio renal en condiciones de hiperglucemia se producen especies reactivas de oxígeno responsables del daño celular.
Figura 1. Endotelio renal expuesto a glucosa. Se muestra el citoesqueleto de microfilamentos (A y A´) y
microtúbulos (B y B´) en los endotelios control (A y B) y expuestos a 25mM de Glucosa (A´y B´). Endotelios control (C)
A B
A´ B´
Figura 2. Peroxidación de lípidos y proteínas de endotelios control y expuestos a glucosa Se muestran
resultados parciales. Las TBARS (Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) representan principalmente el contenido de malondialdehído, las cuales fueron determinados por el método espectrofotométrico utilizando ácido tiobarbitúrico. El contenido de carbonilos se determinó mediante el método basado en la reactividad de la 2,4-dinitrofenilhidrazina con los grupos carbonilos. Experimentos independientes realizados por duplicado.
CONCLUSIONES
Para conocer el mecanismo patofisiológico de las especies reactivas de oxígeno, producidas por la diabetes en la enfermedad microvascular se examinó a nivel estructural la distribución de citoesqueleto de microtúbulos y microfilamentos. Además se determinaron los niveles de la oxidación de lípidos y proteínas causadas por hiperglucemia. Los resultados del estudio muestran: i) El endotelio renal es susceptible a alteraciones morfológicas y estructurales inducidas por la exposición a glucosa. ii) Esta condición también altera la capacidad de adhesión del tejido. iii) El endotelio renal presenta estrés oxidativo por exposición a glucosa. Finalmente, el modelo experimental de endotelio renal humano será valioso para elucidar las señales moleculares del daño renal que se inducen durante la hiperglucemia.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece el apoyo técnico de la unidad de microscopia del CINVESTAV Irapuato. La investigación fué apoyada por la Universidad de Guanajuato (Apoyo DIINPO) a la Dra. Gloria Barbosa Sabanero.
BIBLIOGRAFÍA
1. Aguirre H., Báez B., Soto M., Galindo R. y Wacher N. (2000). Demanda de atención médica en el IMSS por derechoahabientes de 65 años y mayores. Análisis epidemiológico. Rev Med IMSS 38: 39-52.
2. American Diabetes Association (2005) Diagnosis and Classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 28: S37-S42.
3. Brownlee Michael (2001). Review Biochemestry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414: 813 – 820.
4. Hu BF, Meigs Jb, Li TY, Rifai N, Manson J.E. (2004) Inflamatory markers and risk developing type 2 diabetes in women Diabetes 53: 693-700.
Contenido de TBARS
(Representan oxidación de lípidos)
Carbonilos (Representan oxidación de proteínas) n m o le s/ m g d e p ro t. n m o le s/ m g d e p ro t. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 C 10 20 40 C 10 20 40 C 10 20 40 C 10 20 40 GLUCOSA [mM] GLUCOSA [mM] 48h 72h 48h 72h
5. Nishikawa T., Edelstein D., Du X –L., Yamagishi S., Matsumura T., Kaneda Y., Yorek M., Beebe D., Oates P., Hammes HP., Giardino I., Brownlee M. (2000) Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature 404: 787-790.
6. Sen CK, Packer L. (1996) Antioxidant and redox regulation of gene transcription. FASEB J. 10: 709 -720.
7. Srinivasan S., Hatley M.E., Bolick D.T., Palmer L.A., Edelstein D., Brownlee M., Hedrick C.C. (2004) Hyperglycaemia – induced superoxide production decreases eNOS expression via AP- 1 activation in aortic endothelial cells. Diabetologia 47: 1727-1734.
8. US Renal Data System (2003) Annual Data Report: Atlas of end – stage renal disease in the United States. Bethesda: National Institute of Diabetes and Digestive and kidney diseases.
9. Wrigt E. Scism – Bacon J.L., Glass L.C.. (2006) Review Oxidative stress in type 2 diabetes : the role of fasting and postprandial glycaemia. Intl J. Clin. Pract. 60: 308 -314.
10. Ziyadeh FN. (2004).Mediators of diabetic renal disease: The case for TGF B as the major mediator. J. Am Soc. Nephrol. 1:S 55-7.