UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA
EFECTO DE DIFERENTES NIVELES DE PROTEÍNA EN LA DIETA Y TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO Y EXCRECIÓN DE
NITRÓGENO AMONIACAL TOTAL EN GOLDFISH (Carassius auratus), BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO
EDNA ROCIO RIAÑO CASTILLO
Trabajo de Grado de Pregrado para optar el título de BIÓLOGA
Director:
HERNÁN HURTADO GIRALDO BSc PhD
Co-director:
EDWIN GÓMEZ RAMÍREZ, BSc. Esp en Acuicultura
UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA APLICADA
BOGOTÁ 2013.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Militar Nueva Granada; a la Facultad de Ciencias Básicas y a la vicerrectoría de investigaciones por su apoyo económico en la elaboración del proyecto CIAS 8370.
Agradezco al Doctor Hernán Hurtado Giraldo por su apoyo; Ana Torres por su ayuda y especialmente a Edwin Gómez Ramírez por su enseñanza, compañía, orientación y apoyo en el desarrollo del proyecto.
Agradezco a mis padres por su gran apoyo en el transcurso de toda la carrera; a Paola Riaño y Angie Riaño por su hermandad, su gran compañía y apoyo durante toda la carrera.
A Estefany García por su apoyo y amistad, y especialmente a Tatiana Peña por su amistad y apoyo incondicional (confraternidad), no solo en el transcurso del proyecto sino de la carrera.
TABLA DE CONTENIDO Pág. 1. RESUMEN 7 2. INTRODUCCIÒN 9 3. MARCO TEÒRICO 11
3.1. Metabolismo de compuestos nitrogenados 13
3.2. Mecanismos de transporte iónico o excreción 14
de amonio a través de las branquias 3.2.1. Difusión simple de NH3 y NH4+ 14
3.2.2. Antiporte Na+ / NH4+ 15
3.2.3. Captura de H+ 16
3.3. Respuesta de los peces a elevadas concentraciones 17
de NH3 3.4. Efecto del nivel de proteína en el crecimiento y 18
excreción de NAT 3.5. Efecto de la temperatura en el crecimiento y excreción 19
de NAT 3.6. Biología de Goldfish (Carassius auratus) 20
3.6.1. Ecología 21 3.6.2. Morfología 22 4. OBJETIVOS 23 4.1. Objetivo general 23 4.2. Objetivos específicos 23 5. MATERIALES Y MÉTODOS 24
Pág.
5.1. Diseño experimental 24
5.2. Medición de parámetros 26
5.2.1. Parámetros de crecimiento 26
5.2.2. Medición de excreción de NAT 27
5.2.3. Parámetros fisicoquímicos 28 5.3. Análisis estadístico 28 6. RESULTADOS 29 6.1. Crecimiento 30 6.2. Parámetros productivos 32 6.3. Excreción de NAT 34 6.4. Parámetros fisicoquímicos 39 7. DISCUSIÓN 41
7.1. Efecto de la temperatura y el nivel de proteína bruta 41
en la dieta sobre el crecimiento en Carassius auratus 7.2. Efecto de la temperatura y el nivel de proteína bruta 47
en la dieta sobre la excreción de NAT en Carassius auratus 8. CONCLUSIONES 52 9. RECOMENDACIONES 53 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 54 11. ANEXOS 67 11.1. Anexo 1 67 11.2. Anexo 2 69
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo que describe la excreción y producción de amoniaco en peces teleósteos
Figura 2. Modelo de excreción de amonio, bajo el modelo de captura de H+
Figura 3. Esquema anatómico de C. auratus Figura 4. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%) y la temperatura en el agua sobre el crecimiento en peso de C. auratus
Figura 5. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%) y la temperatura en el agua sobre el crecimiento en longitud estándar
de C. auratus
Figura 6. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%) y la temperatura en el agua sobre el crecimiento en longitud total
de C. auratus
Figura 7. Efecto de la temperatura (23-25ºC), el nivel de proteína bruta, En la dieta (30, 40 y 45%) y biomasa sobre la excreción total de
NAT en C. auratus
Figura 8. . Efecto de la temperatura (16-18ºC), el nivel de proteína bruta, En la dieta (30, 40 y 45%) y biomasa sobre la excreción total de
NAT en C. auratus
Figura 9. Parasito de tipo Gyrodactylus sp encontrado en los individuos de C. auratus
Figura 10. Presencia de enfermedad bacteriana en los individuos de C. auratus
Figura 11. Centros melanomacrofagos en los principales órganos Histopatológicos
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tabla de conversión para conocer el % de amoniaco libre basado en pH y TºC
Tabla 2. Diseño experimental con los datos iniciales de peso, longitud estándar y longitud total en C. auratus
Tabla 3. Parámetros productivos para la evaluación del crecimiento de
C. auratus
Tabla 4. Modelos de crecimiento en peso de C. auratus Tabla 5. Parámetros productivos de C. auratus durante los 40 días y 94 días del experimento
Tabla 6. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%) y la temperatura en el agua sobre la tasa de excreción de NAT por
individuo durante 72 horas en C. auratus
Tabla 7. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%) y la temperatura en el agua sobre la tasa de excreción de NAT por
gramo de pez / hora en C. auratus
Tabla 8. Parámetros fisicoquímicos de los tratamientos con temperatura de 16-18ºC (T1, T3 y T5)
Tabla 9. Parámetros fisicoquímicos de los tratamientos con temperatura de 23-25ºC (T2, T4 y T6)
Tabla 10. Componentes de Sera-Backtopur y Sera-Costapur Tabla 11. Comparación del efecto del nivel de proteína bruta sobre la excreción de NAT (mg/L /g / h)
Tabla 12. Comparación del efecto de temperatura en el agua sobre la excreción de NAT (mg/L /g / h)
1. RESUMEN
En el agua el amonio se encuentra de dos formas, que en conjunto se denomina nitrógeno amoniacal total (NAT): la forma no ionizada (NH3) y la forma ionizada (NH4+). La forma no ionizada, amoniaco (NH3), es el principal producto excretado y producto final del metabolismo proteico en los peces, siendo altamente tóxico hasta en bajas concentraciones, debido a su alta solubilidad en lípidos; su falta de carga y su fácil difusión a través de las membranas de las branquias. Además la excreción de NAT está directamente relacionada con el nivel de proteína bruta en la dieta y temperatura en el agua, es por ello que este trabajo evaluó tres niveles de proteína bruta en la dieta y dos rangos de temperatura sobre el crecimiento y la excreción de NAT en C. auratus, una de las principales especies de peces ornamentales comercializada en Colombia. Se evaluaron 6 tratamientos, cada uno con tres repeticiones, para un total de 18 acuarios, con un volumen de 40L. En cada unidad experimental se sembraron 10 peces por acuario (180 peces en total); se controlaron tres niveles de proteína bruta (PB): 35%, 40% y 45% y dos rangos de temperatura (1618°C y 2325°C). El pH se mantuvo en 6.8±0.13 -7.01±0.09, el OD >4 mg/L y la temperatura en 17.9±0.55ºC - 18.4±0.39°C y 24.0±0.2ºC - 24.9±0.2ºC. Mensualmente se registro NAT y el crecimiento en peso, longitud total y estándar; con estos datos se determino la tasa de excreción de NAT y los parámetros productivos (GP, CR, TCA, FCA, K, TEP y TEA) en C.
auratus. Semanalmente se registro los parámetros fisicoquímicos (NAT, nitrito,
nitrato, GH, KH) y diariamente se controlo el pH y OD para mantener las condiciones óptimas reportadas por la especie. A partir de este estudio, se logró determinar que entre los 6 tratamientos evaluados, el tratamiento con temperatura promedio 24.8±0.45ºC y nivel de proteína del 45% (tratamiento 6) alcanzó el mayor peso promedio (10.61±4.07g) y longitud estándar (6.44±0.86cm) en un periodo de tres meses; además los parámetros productivos indicaron que hubo un buen desempeño en el crecimiento del T5 y T6 (temperatura 17.3±0.2ºC y 24.8±0.45ºC), alimentados con proteína del 45%. Esto demuestra que entre la temperatura y el nivel de proteína bruta en la dieta, esta última afecta más el crecimiento de C. auratus; y para el levante de la especie en acuarios es mejor implementar una dieta con alta proteína bruta (45%) y mantener la temperatura entre 18-25ºC. Adicionalmente, se encontró que el nivel de proteína tiene un efecto proporcional sobre la excreción de NAT, mientras que la temperatura no presentó un efecto proporcional sobre la excreción, lo que demuestra que entre estas dos variables el nivel de proteína bruta afecta más la excreción de NAT. También se observó en los tratamientos con temperatura alta (24.0±0.2°C - 24.9±0.2ºC) una disminución en la excreción de NAT al incrementar la biomasa, mientras que en los tratamientos de temperatura baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C)
no se observó esta tendencia, por lo cual nos hace pensar que además del nivel de proteína bruta, la temperatura y el peso corporal hay otras variables que pudieron haber influenciado en la excreción de NAT, como el estrés térmico. Finalmente se presento una alta mortalidad en los tratamientos 1 y 3, siendo motivo de anulación a los 40 días del experimento; se cree que esto pudo ser causado por el efecto sinérgico de temperatura baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C), nivel de proteína baja (30% y 40% PB), presencia del parasito Gyrodactylus y ataque bacteriano.
Palabras clave: Carassius auratus, excreción de NAT, crecimiento, sistemas cerrados de recirculación, sistemas acuapónicos temperatura y nivel de proteína.
2. INTRODUCCIÓN
En el metabolismo de aminoácidos, el grupo amino es liberado (desaminado) y transferido a otra molécula para su eliminación o reutilización (Randall, 2011). Los grupo amino que no son reutilizados en la síntesis de aminoacidos, deben ser excretados para evitar su acumulación en el plasma sanguíneo y en los tejidos del organismo (Randall, 2011). Invertebrados acuáticos, peces teleósteos y ciclóstomos, denominados organismos amoniótelicos, pueden excretar este producto del catabolismo proteico directamente en forma de amoniaco (NH3); mientras que mamíferos, anfibios y elasmobranquios, denominados ureotélicos, pueden excretar los desechos nitrogenados en forma de urea; aves y reptiles, denominados uricotélicos, pueden excretar en forma de ácido úrico (Schmidt, 1997). Los organismos amoniotélicos utilizan esta estrategia principalmente por dos factores: primero porque es energéticamente más ventajoso, puesto que no convierten el amonio a urea y ácido úrico (Altinok & Grizzle, 2004); y segundo porque el NH3 tiene una fácil salida a través de la membrana branquial, sin consumir energía (Sinha et al., 2012).
La alta toxicidad del NH3 se atribuye principalmente a su forma no ionizada, ya que se puede difundir fácilmente a través de las membranas de las branquias, afectando el crecimiento de la especie, cambiando la estructura de las branquias y causando hipoxia y daño en los tejidos epidérmicos (Wilkie, 1997; Sinha et al., 2012). Por este motivo, en la acuicultura, especialmente en los sistemas cerrados de recirculación (SCR), se considera al NH3 como uno de los factores que debe ser estudiado, dado que es una de las preocupaciones con respecto a la calidad del agua y al bienestar de la especie cultivada (Nereci et al., 2012).
Este compuesto se estudia principalmente como NAT, el cual incluye las dos formas químicas que están en el agua (NH4+ y NH3). Varios factores afectan la excreción y concentración de NH3 en el organismo y, por ende, la concentración de NAT en el agua; estos factores son: el tamaño corporal del pez, el pH, el oxigeno disuelto, la ración de comida, el nivel de proteína en la dieta y la temperatura del agua (Wood, 2001; Vásquez, 2004; Ilmo, 2009). Teniendo en cuenta que la proteína interviene en la producción de NAT y es uno de los principales nutrientes de la dieta su estudio es importante, pues contribuye en la regeneración y formación de nuevos tejidos (función estructural) y puede afectar en el rendimiento del crecimiento de la especie (Vásquez, 2004; Ilmo, 2009). Además, se ha demostrado que la tasa de excreción y el crecimiento aumentan con el incremento del nivel de proteína bruta en la dieta (Merino et al., 2007; Sun & Chen, 2009). Así mismo, la temperatura es un factor que afecta directamente a los
peces teleósteos por ser organismos ectotérmicos, donde a medida que incrementa la temperatura también aumenta la tasa metabólica y, por consiguiente, aumenta el consumo del alimento, la tasa de excreción y el crecimiento (Ilmo, 2009).
Además conocer la cuantificación de NAT es de gran utilidad en sistemas cerrados de recirculación (SCR) y sistemas acuapónicos (sistema integrados, que combinan un SCR para la producción de peces y un sistema hidropónico para la producción de vegetales), ya que permite estimar la carga máxima en biomasa/densidad en peces, estimar la cantidad de plantas que pueden ser mantenidas en los sistemas y el tamaño de los filtros biológicos para mantener las concentraciones adecuadas de NAT (Leung et al., 1999). Así mismo, permite mantener una supervivencia alta y un mejor crecimiento de la especie cultivada (Leung et al., 1999).
Carassius auratus (Goldfish) es una especie ornamental con gran impacto
comercial y una de la más cultivadas en América, Europa y Asia, alcanzando una producción en el 2010 de 69 t en América, 167 t en Asia y 4815 t en Europa (FAO, 2012). Así mismo, es una de las especies con alta tolerancia térmica y de fácil adaptabilidad, siendo un modelo excelente para estudios científicos en áreas de neurobiología, biología celular, inmunología, toxicología y evolución molecular (Huesa et al., 2005; Gómez et al., 2006; Hanington et al., 2006; Komiyama et al., 2009; Preuss et al., 2006).
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de tres niveles de proteína bruta en la dieta (30%, 40% y 45%) y dos rangos de temperatura (16-18°C y 23-25°C) sobre el crecimiento y excreción de NAT en C. auratus, con el fin de aportar conocimiento sobre la biología de la especie y otorgar información básica para estudios posteriores orientados en la excreción de NAT, diseño y optimización en sistemas cerrados de recirculación y sistemas acuapónicos.
3. MARCO TEÓRICO
Los productos metabólicos excretados o eliminados en los vertebrados e invertebrados son principalmente productos de la respiración celular (dióxido de carbono y agua) y productos de la desaminación de aminoácidos (exceso de nitrógeno) (Brusca et al., 2002). La excreción de los residuos nitrogenados están asociados con la osmorregulación, que lleva a cabo una regulación de agua y el equilibrio de iones dentro de los fluidos corporales, proceso fisiológico que también sirve para liberar residuos tóxicos; sin embargo la excreción, osmorregulación y regulación de iones no solo sirve para liberar del cuerpo residuos tóxicos sino también para mantener concentraciones de varios componentes de fluidos corporales en niveles apropiados para la actividad metabólica (Brusca et al., 2002).
Una de las fuentes de nitrógeno en el sistema animal son los aminoácidos obtenidos de la digestión de proteínas. Una vez absorbidos estos aminoácidos pueden ser usados para construir nuevas proteínas o pueden ser desaminados y los residuos ser utilizados para formar otros compuestos (amoniaco, urea y ácido úrico) (Brusca et al., 2002). La mayoría de peces teleósteos son amoniotélicos, puesto que el exceso de nitrógeno liberado durante la desaminación es liberado en forma de NH3 (principal producto excretado y producto final del catabolismo proteico).
En el agua, el amonio se encuentra de dos formas: la no ionizada denominada amoniaco (NH3) y la ionizada denominada amonio (NH4+); la suma de estos dos compuestos se denomina como nitrógeno amoniacal total (NAT) (Wajsbrot et al., 1993; Randall & Tsui, 2002). La forma más tóxica es el amoniaco (NH3), ya que puede difundirse fácilmente a través de las membranas de las branquias, debido a su solubilidad en los lípidos y a su falta de carga (Sinha et al., 2012), siendo un contaminante común en sistemas acuáticos (Yuxiang & Patrick, 2000; Wood, 2006). La acumulación de esta molécula en los sistemas acuícolas puede disminuir el crecimiento de la especie, debido a que causa cambios en la estructura de las branquias, interfiriendo en el proceso fisiológico de intercambio de iones; causa una mayor susceptibilidad a patógenos debido al daño de los tejidos epidérmicos y puede interferir en el metabolismo de oxígeno, ya que se une a la hemoglobina (heteroproteína encargada de transportar el oxigeno por el cuerpo), interfiriendo en la captura del oxigeno por parte de los eritrocitos, causando hipoxia y en ocasiones muerte del organismo (Wilkie, 1997).
La concentración de NAT en el agua y la excreción de NH3 por el pez son afectadas por el nivel de proteína en la dieta de los peces, la temperatura, el pH y
especie del pez (Randall & Tsui, 2002). Estudios han reportado que a medida que aumenta el pH y la temperatura incrementa la proporción de amonio en forma NH3 (Randall & Tsui, 2002; Yang et al., 2002; García et al., 2011); esto debido a que NH4+ es un ácido débil, lo cual en reacción con el H2O y OH- (pH básicos) cede electrones para formar NH3 (Reacción 1 y 2); mientras que el NH3 es una base débil, lo cual en reacción con el H2O y H+ (pH ácido) tiene la capacidad de formar enlaces de hidrógeno para formar NH4+ (Reacción 1 y 3) (Randall & Tsui, 2002; Shakhashiri, 2006). Es así como han demostrado que una unidad de pH puede incrementar casi diez veces la concentración de NH3, y el aumento de la temperatura en 5ºC puede causar un incremento del 40-50% (CCME, 2010).
Como en el agua se encuentran las dos formas de amonio (NAT=[NH4+]+[NH3]), Ruff (2009) implemento una tabla de conversión para conocer la concentración de NH3 a partir del nitrógeno amoniacal total (NAT) (Tabla 1). Para ejemplificar esto se determinó el amoniaco de 2 mg/L de NAT, obtenido de una muestra de agua con un pH de 7.5 y a temperatura de 23ºC. Al mirar la tabla de conversión (Ruff, 2009) nos arroja que 1.54% del NAT está en NH3; por lo cual 0.03 mg/L (2 mg/L x 0.0154 = 0.03mg/L) equivale la concentración real de NH3 en la muestra.
Tabla 1. Tabla de conversión para conocer el % de amoniaco libre basado en pH y T°C. º C pH 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 6.0 0.040 0.043 0.046 0.049 0.053 0.057 0.061 0.065 0.070 0.075 0.080 6.5 0.125 0.135 0.145 0.156 0.167 0.180 0.193 0.207 0.221 0.237 0.254 7.0 0.396 0.425 0.457 0.491 0.527 0.566 0.607 0.651 0.697 0.747 0.799 7.5 1.24 1.33 1.43 1.54 1.65 1.77 1.89 2.03 2.17 2.32 2.48 8.0 3.82 4.10 4.39 4.70 5.03 5.38 5.75 6.15 6.56 7.00 7.46 8.5 11.2 11.9 12.7 13.5 14.4 15.3 16.2 17.2 18.2 19.2 20.3
También la concentración de NH3 se puede calcular empleando dos ecuaciones: 1. pKa = 0.0901821 + 2729.92 / T, donde pKa es la constante de disociación y T es la temperatura en grados Kelvin; y 2. f = 1 / [10(pKa-pH)+1], donde f es la fracción no ionizada (NH3) del amonio total NAT (Emerson et al., 1975). Al remplazar los datos de pH y T en estas dos ecuaciones obtenemos un resultado; este debe ser multiplicado por el NAT y el resultado obtenido será la proporción de NH3 en mg/L (Emerson et al., 1975).
3.1. Metabolismo de compuestos nitrogenados
Los procesos bioquímicos que permiten la eliminación de los grupos α-amino son conocidos como transaminación y desaminación (vías enzimáticas que producen amonio a partir de los aminoácidos) (Jobling, 1994). En la transaminación el grupo α amino de los aminoácidos se transfiere al ceto-glutarato, reacción catalizada por la enzima amino-transferasa, y el glutamato que resulta de esta serie de reacciones es desaminado por la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH), resultando la generación de α-ceto-glutarato y amonio (NH4+
) (Jobling, 1994; Wilkie, 1997).
En teleósteos este proceso se lleva a cabo en el hígado, riñón y músculo, siendo el hígado el principal órgano de producción de NH4+, el cual es liberado al torrente sanguíneo. La mayoría de este amonio pasa al músculo blanco y a su vez se convierte en amoniaco (NH3), donde una parte es liberada de nuevo al torrente sanguíneo y la otra se mantiene en el músculo para la regeneración de adenosín monofosfato (AMP); el amoniaco que es liberado al torrente sanguíneo y parte del amonio liberado del hígado es transportado a las branquias para su excreción (Figura 1) (Wilkie, 1997). La distribución de NH3 entre el fluido extracelular y el espacio intracelular del músculo blanco y su excreción entre el torrente sanguíneo y el agua esta conducida por el gradiente de presión parcial (PNH3). La difusión del NH4+ dentro del espacio intracelular del músculo blanco es facilitado por el gradiente eléctrico transmembranal (interior negativo) (Figura 1). Este gradiente electroquímico indica la dirección en la que cambia la concentración y el potencial eléctrico de una solución, donde la molécula con carga se moverá siguiendo la dirección de mayor gradiente electroquímico, trasladándose desde el medio de mayor concentración hacia el medio de menor concentración (Richard, 1980).
Figura 1. Modelo que describe la excreción y producción de amoniaco en peces teleósteos (Tomado de Wilkie, 1997).
3.2. Mecanismos de transporte iónico o excreción de amonio a través de las branquias
El estudio de los mecanismos de excreción y transporte de NH4+ y NH3 aún permanecen en controversia, debido a la dificultad de medir o controlar la presión parcial de NH3 y NH4+ y el potencial eléctrico transmembranal (Ruales et al., 2010). De los mecanismos descritos los datos experimentales soportan principalmente cuatro mecanismos de excreción de amonio: Difusión simple de NH3, difusión simple de NH4+, antiporter Na+/ NH4+ y captura de H+ para formar NH4+, los cuales serán explicados a continuación:
3.2.1. Difusión simple de NH3 y NH4+
La mayor parte de NAT que se transfiere por las branquias se hace en la forma no ionizada (NH3), bajo un gradiente de difusión entre la sangre y el agua (Evans et
al., 1989; Wilkie, 1997; Ruales et al., 2010). Esta excreción de NH3 por difusión simple o pasiva ocurre bajo un gradiente favorable de presión parcial (PNH3). El gradiente de presión indica las diferencias de concentración, permitiendo así el movimiento de iones o moléculas a través de la membrana desde la zona de mayor concentración hacia la de menor concentración (Wilkie, 1997; Wood, 2006). Estudios reportan que el incremento de NH3 en el agua está acompañado por la disminución de los mecanismos de excreción de NH3, por una reducción del gradiente de presión parcial (PNH3) entre el pez y el medio (Cameron & Heisler, 1983). Además observaciones y estudios realizados en Cyprinus carpio,
Oncorhynchus mykiss y Carassius auratus reportan que a bajo pH en el agua
disminuye la concentración de NH3 en el exterior y aumenta la excreción de NH3 branquial por el aumento del gradiente de presión parcial (PNH3) (Cameron & Heisler, 1983; Claiborne & Heisler, 1986). Sin embargo, otro estudio realizado en
Oncorhynchus mykiss demostró que el aumento de pH en el agua incrementa la
concentración de NH3 en el exterior, debido a la pobre disponibilidad de H+ en el medio para conjugarse y formar NH4+, lo cual disminuye la tasa de flujo de NAT (Cameron & Heisler, 1983).
Por otro lado, la excreción branquial de amonio (NH4+) por difusión es mínima en peces de agua dulce, debido a su baja permeabilidad en el epitelio branquial (Ruales et al., 2010). Esta baja permeabilidad, se debe a un mecanismo que desarrollaron, pues al encontrarse en un medio con gradientes químicos extremadamente altos, favorecían la perdida de iones (Na+ y Cl-) a través de la branquias, lo que los llevo a evolucionar, cambiando la estructura de las células epiteliales, con el fin de volverse impermeables a los iones y así minimizar las perdidas por difusión (Wilkie, 1997). Sin embargo, Knepper et al., (1989) reporta que el mecanismo de difusión paracelular de NH4+ (transferencia deNH4+ a través del espacio intracelular) puede ocurrir en peces de agua dulce cuando el pez está sometido a concentraciones de NH3 interno extremadamente altas, puesto que el NH4+ podría seguir el patrón de flujo del K+, debido a que presenta el mismo ion de carga positiva (Wilkie, 1997). De lo contrario, no ocurre este proceso, debido a que la concentración de K+ en la sangre (3-5 mmol 1-1) es mayor que la concentración de NH4+ (0.1-0.3 mmol 1-1), por lo cual el gradiente electroquímico de la sangre al agua está más a favor del K+ que del NH4+ (Wood, 2006).
3.2.2. Antiporte Na+/NH4+
Antiporte Na+/NH4+ es un mecanismo donde la entrada de Na+ a través de la membrana apical en la branquia es unido a la salida de NH4+, reemplazando el H+ en el antiporte electroneutral Na+/H+ (Ruales et al., 2010). Esta hipótesis ha sido debatida por varios autores, en el cual han descartado este mecanismo en peces
de agua dulce, pues indican que para el funcionamiento del antiporte Na+/NH4+ en peces de agua dulce se necesitaría energía suministrada por las ATPasas para poder funcionar, debido a los bajos gradientes de Na+ que se encuentran en el exterior con respecto a su concentración interna (Wood, 2006; Ruales et al., 2010). Algunos estudios que rechazan esta hipótesis en peces de agua dulce se muestran a continuación: 1. Avella & Bornancin (1989) no encontraron una evidencia directa de este mecanismo, pues observaron que el incremento gradual en la concentración de NH3 (0-1mM) a un pH interno constante estimula la excreción de NH3, pero no la entrada de Na+ en trucha y explica que la captación de Na+ está relacionado con las ATP asas; 2. Wilkie (1997) reporta que en peces de agua dulce el NH4+ podría competir con el Na+ o con el K+ de la Na+- K+ ATPasa o con el antiporte Na+/2Cl-/K+ de la membrana basolateral, e indica que este intercambio está influenciado por el pH, la temperatura y presión parcial de amonio; 3. Morgan et al., (1994) y Wood & LeMoigne, (1991) reportan que la concentración de Na+ en agua dulce son generalmente bajas (1 mmol 1-1), mientras que la concentración de Na+ intracelular branquial son 5-10 veces más alta, lo cual hace que sea poco probable que el gradiente de Na+ se dirija al interior a través de la membrana apical branquial; y 4. Potts (1984) reporta que la difusión de NH4+ es más importante en peces marinos que en peces de agua dulce, ya que los teleósteos marinos tienen una alta permeabilidad branquial, lo cual facilita la absorción de Na+ y permite la difusión de NH4+, además la alta concentración externa de Na+ en el medio marino, hace que la presencia del antiporte electroneutral Na+/H+ y el intercambio Na+/NH4+ pueda presentarse en peces marinos (Evans, 1984).
3.2.3. Captura de H+
La difusión de NH3 depende de la remoción constante de esté en las capas superficiales de las branquias, debido a que, la acumulación de este compuesto nitrogenado en el medio externo (agua) reduce el gradiente de presión parcial de difusión (PNH3) en el pez, lo cual puede causar cambios en la estructura de las branquias e interferir en el proceso fisiológico de intercambio de iones (Ruales et
al., 2010). Además de la vía de remoción por difusión continua, también está el
mecanismo de unión de NH3 con H+ (captura) para formar NH4+ en la capa superficial de las branquias (remoción química) (Ruales et al., 2010).
Para mantener los gradientes de difusión de NH3 a través de las branquias es indispensable la disponibilidad de H+ en la capa límite, pues facilita la captura del NH3 (Wilkie, 1997). En este mecanismo se ha observado que el CO2 juega un papel importante en la moderación del efecto tóxico del NH3, ya que este compuesto al reaccionar con el agua forman ácido carbónico (HCO3-) e H+
(reacción catalizada por anhidrasa carbónica), donde los H+ acidifican la capa límite de las branquias y se une al NH3 (que se difunde pasivamente a través del epitelio branquial) formando NH4+, reduciendo de esta forma la concentración permanente de NH3 en la superficie de las branquias (Figura 2) (Wilkie, 1997; Ruales et al., 2010).
Figura 2. Modelo de excreción de amonio, bajo el mecanismo de captura de H+ (Randall & Wrigt, 1989).
3.3. Respuesta de los peces a elevadas concentraciones de NH3
Las elevadas concentraciones de amoniaco en el medio dan como resultado final una elevación de los niveles de NH3 en el cuerpo del organismo (Randall & Tsui, 2002). Algunas especies de peces son tolerantes a altas concentraciones de NH3 y tienen como estrategia mantener la excreción y/o convertir el NH3 a sustancias menos tóxicas (Randall et al., 1999; Randall & Tsui, 2002).
Una de las estrategias es convertir NH4+ en glutamina; la glutamina está formada de glutamato y NH4+ por la enzima glutamina sintetasa. La formación de 1 mol de glutamina desintoxica 2 moles de NH4+ (Ip et al., 2001). Generalmente en los tejidos cerebrales es donde se ha encontrado alta actividad de glutamina para la
desintoxicación de NH3, lo cual se cree que es un mecanismo que protege los órganos sensibles de este compuesto tóxico tanto en mamíferos como en peces (Cooper & Plum, 1987). Sin embargo, este mecanismo genera un alto gasto energético, pues 1 mol de amoniaco desintoxicado requiere de 2 moles de ATP, siendo una desventaja de gran importancia (Randall & Tsui, 2002).
C. auratus (Goldfish) es un ejemplo de este mecanismo; estudios han reportado
que los niveles de glutamina cerebral presenta una correlación lineal con los niveles de NH3 ambiental (Levi et al., 1974). También esta correlación se ha encontrado en otras especies de peces como: carpa común (Cyprinus carpio), tilapia (Oreochromis alcalicus) y mudskippers (se denominan anfibio-pez de la familia Gobiidae, que pueden utilizar las aletas pectorales para caminar sobre la tierra y comúnmente llamado Zappa –Zappa sp- (Randall & Tsui, 2002).
Otro mecanismo de algunos peces es convertir NH3 a urea por medio del ciclo urea ornitina. Un ejemplo de ello es la tilapia del lago Magadi (Oreochromis
alcalicus grahami) que excreta todo los residuos de nitrógeno como urea, dado por
el medio en el que habita, pues el lago Magadi alcanza alrededor de un pH 10, en el cual prevalece la producción de amonio en forma NH3 ocasionando la muerte de otros peces, incluyendo especies cercanamente relacionadas con O. alcalicus
grahami (Randall et al., 1989). Heteropneustes fossilis (pez gato), un pez de agua
dulce con capacidad de utilizar el aire atmosférico, es otro ejemplo, ya que puede producir urea para evitar la toxicidad de NH3 mientras está expuesto al aire (Saha
et al., 2001).
Por último, otra estrategia utilizada por los peces es la reducción de producción de NH3, en el cual ha sido observado en varias especies de peces cuando se encuentran a pH alto y en condiciones aéreas (Lim et al., 2001). Un ejemplo de ello son los mudskippers (Periophthalmodon schloseri y Boleophthalmus
boddaerti) en el que reducen la tasa de excreción de NH3 y urea cuando se
encuentran en condiciones aéreas (Lim et al., 2001). También Wilson et al., (1998) ha observado que Orcorhynchus mykiss (trucha arcoíris) usa esta estrategia cuando se encuentran expuestos a pH altos (alrededor de 10).
3.4. Efecto del nivel de proteína en el crecimiento y excreción de NAT La proteína es uno de los componentes más importante en el alimento de los peces, pues de allí provienen los aminoácidos esenciales y no esenciales para sintetizar las proteínas corporales y proporcionar energía (Yang et al., 2002). En peces teleósteos se ha demostrado que el nivel de proteína es el principal factor que está relacionada con la excreción de nitrógeno, donde la excreción de
nitrógeno o excreción de NH3 aumenta con el incremento del nivel proteínico, mostrando una relación directamente proporcional (Chakraborty & Chakraborty, 1998; Martínez, 2002).
Muchos estudios se han realizado para determinar los requerimientos proteínicos para los peces, con el fin de definir los niveles óptimos de proteína para un rápido y buen crecimiento de la especie; esto debido a que los peces, para desarrollarse adecuadamente requieren de un amplio rango de proteína bruta (PB) en la dieta, y está varía dependiendo de las condiciones ambientales, el estado fisiológico y fuente de proteína (de origen animal o vegetal) (Yang et al., 2002); además se debe tener en cuenta la especie y el tamaño del pez (Martínez, 2002).
En un estudio realizado por Yang et al., 2002, determinaron el efecto del nivel de proteína en el crecimiento y excreción de NAT en peces juveniles de Bidyanus
bidyanus, donde utilizaron como principal fuente de proteína la harina de pescado
blanco con 13 - 55% de proteína, los cuales fueron alimentados durante ocho semanas. Obtuvieron que la ganancia de peso y la eficiencia alimenticia aumento significativamente a medida que incrementaba los niveles de proteínas hasta un 37%, mientras que no hubo diferencias significativas al ser alimentados desde el 37 al 55%. También encontraron una relación lineal entre la excreción de NAT y el nivel de proteína, donde la concentración de NAT en mg/Kg de pez incrementaba a medida que aumentaba el porcentaje de proteína en la dieta.
Martínez (2002) evaluó el efecto de la dieta y otros factores sobre la excreción de NAT y el aprovechamiento del nitrógeno por Sparus aurata (Dorada). Encontraron que un incremento en la temperatura y el nivel proteico de la dieta provoca un aumento significativo en la excreción de NAT, donde obtuvieron que la excreción diaria de amonio para individuos menores de 45g fue de 450-500 mg N/Kg pez día y para individuos de 115-150 gr fue de 116 mg N/Kg pez día.
3.5. Efecto de la temperatura en el crecimiento y excreción de NAT
En los peces, la temperatura es un factor importante en el metabolismo, debido a que son organismos ectotérmicos, por lo cual se desarrollan y crecen rápido cuando se encuentran dentro del rango de temperatura que es adecuado u óptimo para la especie (Fine et al., 1996; Morales, 2004). Son poco los estudios que se han realizado en la interacción de este factor y su influencia en la excreción de NAT (Leung et al., 1999); sin embargo se ha encontrado que la mayoría de los peces teleósteos incrementan la excreción de NAT al aumentar la temperatura dentro del medio de cultivo, lo que resulta en la elevación de las demandas metabólicas (Leung et al., 1999). Esto ocurre porque al incrementarse la
temperatura aumenta la velocidad de los procesos de desaminación de los aminoácidos provenientes de las proteínas de las dietas (Leung et al., 1999; Kaushik, 2000; Martínez, 2002).
En un estudio realizado por Uliano et al., (2010), evaluaron el efecto de diferentes salinidades y temperatura en la excreción de NAT y urea en dos peces de agua dulce: Gambusia (Gambusia affinis) y pez cebra (Danio rerio), los cuales encontraron que a altas salinidades y temperatura Gambusia estimulaba la excreción de NAT, mientras que el pez cebra estimulaba la excreción de NAT a temperatura alta y bajas salinidades. Este estudio demostró que el estrés puede afectar la excreción de nitrógeno como respuesta adaptativa de los animales frente a cambios adversos en el ambiente.
Por otro lado hay una relación entre la temperatura y la ración de comida; se ha estudiado que a medida que aumenta la temperatura el consumo de alimento incrementa y por ende también lo hace la excreción de NAT (Wood, 2001). Esto lo demuestra un estudio realizado por Sun & Chen (2009) donde evaluaron el efecto de la ración de comida y la temperatura en el crecimiento, producción de heces y excreción de nitrógeno en bacalao (Rachycentron canadum), las cuales encontraron que la producción de heces y la excreción de nitrógeno están afectados significativamente con la ración de comida y la temperatura; y que la excreción de nitrógeno incrementa al aumentar el nivel de ración de comida. Además al compararlo con el efecto de la temperatura determinaron que a temperaturas más altas y a niveles de ración más altos era mayor la excreción de nitrógeno.
3.6. Biología de Goldfish (Carassius auratus)
C. auratus (Linnaeus, 1758), es una especie nativa de Asia oriental, que se ha
establecido con éxito en toda Europa (Kottelat & Freyhof, 2007), América del Norte (Jenkins & Burkhead, 1993), América del Sur (Gómez et al., 1997), Nueva Zelanda y Australia (Departament of Fisheries of Western Australia, 2005). Es una especie ornamental de agua dulce que pertenece a la familia Cyprinidae y es una de las más cultivadas y comercializadas, debido a su capacidad reproductiva y su tolerancia a diferentes condiciones ambientales (Igaki & Sakagami, 2004); los registros de producción en América se inicio en 1995 con 5 toneladas por año y ha incrementado alcanzando en el 2010 una producción de 69 toneladas anuales; en Europa se inicio en 1980 con 30 toneladas y ha incrementado alcanzando en el 2010 una producción de 167 toneladas anuales y en Asia se inicio en 1950 con 500 toneladas, alcanzando en 2010 una producción de 4815 toneladas anuales (Smartt, 2001; Komiyama et al., 2009; FAO, 2012).
C. auratus es un pez muy utilizado como modelo para investigaciones de múltiples
disciplinas; se ha utilizado en áreas de biología celular, inmunología, toxicología, evolución molecular y neurobiología (Huesa et al., 2005; Gómez et al., 2006; Hanington et al., 2006; Preuss et al., 2006; Komiyama et al., 2009). Además se han realizado estudios relacionados con la señalización neuroendocrina, nutrición, reproducción, comportamiento y respuesta al estrés (Chang et al., 2000; Partha et
al., 2005; Martyniuk et al., 2006; Nero et al., 2006; Popesku et al., 2008).
El grupo de ictiología de la Universidad Militar Nueva Granada ha realizado algunos estudios con esta especie, debido a su fácil adaptabilidad a las condiciones ambientales y alta tolerancia a la temperatura (Dinara-FAO, 2008), la cual ha permitido ser cultivada a la temperatura del agua de la Sabana de Bogotá. Algunos estudios realizado en la universidad son: “Relación entre el tamaño del cuerpo, cerebro y algunos lóbulos cerebrales en C. auratus” (Obando, 2010); levante de C. auratus en sistemas cerrados de recirculación (SCR) (Moreno et al., 2011); evaluación y montaje de un sistema acuapónico C. auratus-Lactuca sativa (Ramírez et al., 2009) y C. auratus-C. carpio-Origanum vulgare (Cifuentes et al., 2012).
3.6.1. Ecología
C. auratus habita en ríos, lagos y estanques; es una especie omnívora, pues se
alimentan principalmente de plancton, invertebrados bentónicos, plantas y detritus; ponen huevos en la vegetación sumergida y desovan varias veces durante el año (Man & Hodgkiss, 1981; Etnier & Stames, 1993). Además presentan dimorfismo sexual, pero la diferencia entre estos se aprecia hasta que el pez ha alcanzado su madurez sexual. Cuando esto ocurre, la hembra, que generalmente posee un mayor tamaño, adquiere protuberancias nupciales y en el macho presentan unas pequeñas manchas blancas en las cubiertas de las branquias y también en las aletas pectorales a nivel del primer radio (Landines et al., 2007).
C. auratus es una especie que puede tolerar diferentes condiciones ambientales,
pero requiere de unos parámetros fisicoquímicos para su crecimiento adecuado, estos son: temperatura entre 20–28°C; concentración de oxigeno disuelto (OD) mayor a 4mg/L y el pH entre 6.5–7 (Dinara-FAO, 2008).
3.6.2. Morfología
Figura 3. Esquema anatómico de las diferentes partes de C. auratus (Goldfish) (Tomado y modificado de Smartt, 2001).
Puede alcanzar hasta 60cm de longitud y 3kg de peso; presentan 3-4 espinas dorsales, 14-20 radios dorsales blandos, 2-3 espinas anales, 4-7 radios anales blandos, 17-19 radios en la aleta caudal. Aletas anales y dorsales con espinas óseas aserradas, la vejiga natatoria la utilizan para la transmisión del sonido; no presentan barbas, presentan maxilar superior y línea lateral completa (Smartt, 2001).
4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general
Evaluar el efecto de dos rangos de temperatura y tres niveles de proteína bruta en la dieta sobre crecimiento y excreción de nitrógeno amoniacal total en C. auratus, bajo condiciones de laboratorio.
4.2. Objetivos Específicos:
Evaluar el crecimiento en peso, longitud total, longitud estándar y parámetros productivos de C. auratus mantenidos a diferentes rangos de temperatura y alimentados con diferentes niveles de proteína bruta en la dieta.
Evaluar varios modelos de crecimiento en C. auratus mantenidos a diferentes rangos de temperatura y alimentados con diferentes niveles de proteína bruta en la dieta.
Evaluar el efecto de diferentes rangos de temperatura en el agua y niveles de proteína bruta de la dieta sobre la tasa de excreción de NAT en C. auratus.
Determinar el efecto de la biomasa total sobre la excreción total de NAT y tasa de excreción de NAT en C. auratus.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo se llevo a cabo en el Laboratorio de Fisiología Animal de la Universidad Militar Nueva Granada, sede Cajicá, durante un periodo de tres meses (Marzo-Junio del 2012). Se trabajo con 180 individuos de C. auratus que fueron adquiridos en una tienda autorizada para la venta de mascotas, con un peso promedio de 2,70±1,10g y una longitud total promedio de 6,54±0,85cm. Estos individuos fueron mantenidos en un periodo de 15 días en sistemas cerrados de recirculación de 250L, tiempo en el cual se controlaron las condiciones fisicoquímicas del agua (NAT, nitrito, nitrato, pH, dureza general –GH-dureza de carbonatos –KH- y temperatura) y fueron alimentados con concentrado comercial Tilapia® al 30%.
5.1. Diseño experimental
Se realizo un diseño experimental completamente aleatorizado (DCA), donde se evaluaron 6 tratamientos, cada uno con 3 repeticiones, para un total de 18 acuarios, con un volumen de agua de 40L (60cm de largo X 40cm de ancho X 25cm de alto). En cada unidad experimental se sembraron 10 peces por acuario (densidad recomendada como óptima por Marshall (1995) para el levante en acuario de C. auratus).
Se evaluaron tres niveles de proteína bruta (PB): 30%, 40% y 45% y dos rangos de temperatura (16-18ºC y 23-25ºC). Para ello, se empleo concentrado comercial de Tilapia® para las unidades experimentales con 30% PB y concentrado comercial Truchina® para las unidades experimentales de 40% y 45% PB; los individuos fueron alimentados tres veces al día (8:00h, 12:00h y 16:00h) ajustada al 5% de la masa corporal/día. Para controlar la temperatura de 23-25ºC se emplearon termostatos de 150W. La Tabla 2 muestra el diseño experimental de los tratamientos.
Tabla 2. Diseño experimental. Los datos de peso, longitud total (LT) y longitud estándar (LS) representan el valor promedio ± la desviación estándar al inicio del experimento. Tratamiento PB TºC Peso (g) LT (cm) LS (cm) T1 30% 16-18 2.92±1.28 6.45±0.79 4.21±0.58 T2 40% 23-25 2.69±0.99 6.61±0.89 4.38±0.65 T3 30% 16-18 2.36±0.92 6.28±0.79 4.14±0.73 T4 40% 23-25 2.82±1.10 6.72±1.01 4.32±0.74 T5 45% 16-18 2.60±1.12 6.58±0.88 4.27±0.77 T6 45% 23-25 2.80±1.14 6.58±0.70 4.48±0.71
El Trabajo inicio con un sistema de biofiltración por acuario, el cual era retirado cada vez que se realizaba la medición de NAT, esto con el fin de no alterar los resultados del experimento, puesto que las bacterias que se encuentran alojadas en el biofiltro transforman el NAT a nitrito y nitrato, alterando los resultados. Este control se llevo a cabo durante cinco semanas, de manera discontinua, a partir de la segunda semana los biofiltros fueron retirados, debido a que se tomo el tiempo cero en la medición de excreción de NAT; luego de esta semana continuo el sistema de biofiltración durante otras tres semanas. Después de este tiempo se retiraron por completo los sistemas de biofiltración en todos los acuarios, debido a que se inicio con un tratamiento profiláctico de Sera-Backtopur y Sera-Costapur, a causa de la presencia de signos de patógenos en los peces de algunos tratamientos (Anexo, Figura 9)
De igual manera se mantuvo un control en la calidad de agua, manteniendo los rangos óptimos reportados para la especie (Dinara-FAO 2008): pH de 6,5-7,0; oxígeno disuelto (OD) > de 4mg/L y NAT <2mg/L, con el fin de disminuir el estrés y afectar el crecimiento de los peces. Para mantener el OD > 4mg/L se mantuvieron los acuarios en aireación constante por medio de una turbina (GF 250-280 Watt) y dos difusores por unidad experimental. Además para controlar el nivel de NAT, en las semanas de medición, se realizaron recambios del 50% de agua en los acuarios que presentaron un NAT >0.50mg/L y como correctivo a la anulación de los biofiltros (quinta semana) se llevaron a cabo recambios del 20% de agua cada dos días.
5.2. Medición de parámetros
5.2.1. Parámetros de Crecimiento.
Para evaluar el crecimiento de C. auratus se realizó un registro de peso, longitud total (LT) y longitud estándar (LS) al inicio del experimento de los 10 individuos/ acuario. Posteriormente, cada tres semanas (después de la medición de excreción de NAT) se llevo a cabo el seguimiento de estos datos por medio de la medición de 5 individuos/acuario de cada tratamiento. El registro de peso se realizó a través de una balanza gramera (OHAUS MODEL Adventurer Pro AV 2101) y la longitud total y estándar a través de un calibrador. Además de esto, se calcularon parámetros productivos (Tabla 2) al finalizar el experimento.
Tabla 3. Parámetros productivos para la evaluación del crecimiento de C. auratus.
Parámetros productivos Referencia
Ganancia de peso (GP) = Peso final (g) – Peso inicial (g)
Mercado et al., 2006
Tasa de crecimiento absoluto (TCA) = [(Peso final (g) – Peso inicial (g) / (Tiempo final – Tiempo inicial)
Pineda, 1999; Salazar & Ocampo, 2002
Crecimiento relativo (CR) = 100 * [(Peso final (g) – Peso inicial(g)
/ Peso inicial (g)
Pineda, 1999
Factor de condición K (K) =
(Peso/Longitud³) * 100 Mercado et al., 2006
Factor de conversión alimenticia (FCA) = Alimento consumido (g)
/ Incremento de peso (g)
Salazar & Ocampo, 2002
Tasa de eficiencia proteica (TEP) = Ganancia de peso (g )
/ Proteína consumida (g)
Mercado et al., 2006
Tasa de eficiencia alimenticia (TEA) = Incremento de peso (g)
/ Alimento consumido (g)
Mercado et al., 2006
Supervivencia (S) = 100 * (Número de peces final
/ Número de peces inicial)
Salazar & Ocampo, 2002; Mercado et al., 2006
5.2.2. Medición de excreción de NAT
Durante la primera semana de trabajo, los peces fueron alimentados al nivel de proteína correspondiente al tratamiento. Pasada esta semana, después de la adaptación de los organismos a las condiciones experimentales, se estableció el tiempo cero (t0), donde se midió durante tres días cada 24 horas la excreción de NAT; posteriormente se llevo a cabo un seguimiento de estos datos cada tres semanas por un periodo de tres meses -94 días- (con un total de cuatro mediciones).
Para obtener las mediciones se empleo el colorímetro Spectroquant® Multy y kits de amonio de alta sensibilidad (0.03-1.67 mg/L) MERK SK®, en el cual nos arrojaba la concentración en NAT. Con los valores obtenidos en todo el experimento se calculo la excreción total de NAT durante los tres días (Formula 1), la tasa de excreción/individuo (Formula 2) y la tasa de excreción por gramo de pez por hora (Formula 3).
NAT total= Ʃ(NAT final - NAT inicial)
3 Formula 1
Tasa de excreción de NAT = (Ʃ(NAT final - NAT inicial)/ Número de individuos Formula 2
Tasa de excreción por gramo de pez = 1 x (NAT final- NAT inicial) Biomasa total
Tasa de excreción por gramo de pez / hora = Tasa de excreción por gramo de pez 72 horas
Formula 3
Donde Ʃ(NAT final- NAT inicial) es la suma del NAT final (concentración NAT en mg/L al final del periodo de medición) con NAT inicial (concentración de NAT inicial en mg/L al comienzo del periodo de medición) durante los tres días (72h); y el número de individuos, es el número de individuos total o la supervivencia en el tiempo de muestreo.
5.2.3. Parámetros fisicoquímicos
Diariamente se registro el pH y la temperatura con un potenciómetro marca SCHOTT ®. Adicionalmente se midió semanalmente el oxigeno disuelto con un oxímetro modelo DO-700 de Extech Instruments® con ajuste de compensación a la altura; NAT, nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-) a partir del colorímetro spectroquant® Multy, con kits de alta sensibilidad MERK® y GH, KH por medio de kits comerciales (tetra test laborett).
5.3. Análisis estadístico
Las variables respuesta (tasa de excreción de NAT, peso, longitud total, longitud estándar y parámetros productivos de C. auratus) fueron evaluados con la prueba de normalidad Shapiro-Wilk. Se realizaron análisis de varianza, implementando la prueba ANOVA y Tukey-Kramer (individual para cada variable de respuesta), al nivel de significancia del 5% (p< 0.05, error tipo I), con el fin de determinar si hubo diferencias entre los tratamientos. También se realizaron pruebas de regresión múltiple para evaluar el efecto de peso, nivel de proteína bruta en la dieta y temperatura en el agua sobre la excreción de NAT. Todo esto se llevo a cabo implementando el paquete estadístico R versión 2.12.2, de libre distribución en internet (http://r-project.softonic.com/).
Adicionalmente con los datos de peso, longitud total y longitud estándar se calculo el promedio ± desviación estándar y se realizaron graficas en función del tiempo; y con los datos de excreción total de NAT se calculo el promedio ± error estándar y se realizó un histograma de dos ejes y, para determinar el efecto de la biomasa en la excreción de NAT en función del tiempo. Del mismo modo se evaluaron los modelos de crecimiento (lineal y exponencial) para definir cual describe mejor el crecimiento de los peces en los diferentes tratamientos evaluados.
6. RESULTADOS
A la tercera semana del experimento se encontró presencia del parásito
Gyrodactylus sp en los peces de todos los tratamientos (Anexo 1, Figura 8).
Además, los tratamientos de temperatura baja (16-18ºC) con proteína bruta en la dieta de 30% y 40% (T1 y T3), presentaron síntomas de tipo bacteriano (Austin & Austin, 1999; Noga, 2000): podredumbre de la aleta dorsal, anal y lateral, acompañado de la destrucción de las aletas, enrojecimiento o ulceras en algunas zonas de la epidermis y alta producción de mucus (Anexo 1, Figura 9). Debido a esto, se inicio un tratamiento profiláctico (intercalando el medicamento Sera-Backtopur y Sera-Costapur semanalmente)1 en los tratamientos 1 y 3, puesto que eran los únicos con sintomatología bacteriana y alta mortalidad. A la quinta semana se inicio en los demás tratamientos, como alternativa de precaución, anulando los sistemas de biofiltración en todos los acuarios.
Aunque se realizó el tratamiento profiláctico, la mortalidad en los individuos de los tratamientos 1 y 3 siguió aumentando, alcanzando una supervivencia del 63,3±5.57% en T1 y 50±7,51% en T3 (Tabla 5), lo que causo su terminación a los 40 días del experimento. Además dichos tratamientos seguían presentando síntomas de tipo bacteriano y presencia de parásitos. En el Anexo 1 (Figura 10) muestra algunos cortes de los principales órganos histopatológicos (bazo y riñón), donde se encontró grandes zonas con presencia de centros melanomacrófagos.
Por todo lo dicho, a continuación se ilustran los resultados de crecimiento y excreción de NAT en C. auratus, exponiendo los resultados hasta los 40 días (tiempo en el cual se terminaron los tratamientos 1 y 3), y 94 días del experimento.
_______________________________
1. El tratamiento Sera-Backtopur se aplico cada dos días, agregando 44gotas/acuario durante una semana. Después de la semana se empleo el tratamiento Sera-Costapur, en el cual se aplico cada dos días, agregando 22 gotas/acuario. Este procedimiento se realizo hasta finalizar el experimento, intercalando semanalmente Baktopur con Sera-Costapur.
6.1. Crecimiento
La prueba Shapiro-Wilk demostró que los datos en peso, longitud total y estándar presentaban una distribución normal y la prueba ANOVA y Tukey Kramer no arrojo diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos en peso y longitud estándar durante los 68 días de experimentación; sin embargo en el ultimo muestreo (94 días) se presentaron diferencias significativas (p<0.05) en peso entre el tratamiento 6 (TºC: 24.8±0.45ºC y PB 45%) con el tratamiento 2 (TºC: 24.0±0.2°C y PB 30%) (Figura 3) y en longitud estándar entre el tratamiento 6 sobre el tratamiento 2 (TºC: 24.0±0.2°C y PB 30%), 4 (TºC: 24.9±0.2ºC y PB 40%) y 5 (TºC: 17.3±0.2ºC y PB 45%) (Figura 4), siendo el tratamiento que alcanzo mayor peso promedio (10.61±4.07g) y longitud estándar (6.44±0.86cm) en un periodo de tres meses.
Adicionalmente, en longitud total, se presentaron diferencias significativas a los 40 días entre el tratamiento 6 (TºC: 24.8±0.45ºC y PB 45%) sobre el tratamiento 3 (TºC: 18±0.1ºC y PB 40%). También hubo diferencias a los 94 días entre el tratamiento 6 (TºC: 24.8±0.45ºC y PB 45%) sobre el tratamiento 5 (TºC: 17.3±0.2ºC y PB 45%) (Figura 5).
Figura 4. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30%, 40% y 45%) y la temperatura en el agua (16-18ºC y 23-25ºC) sobre el crecimiento en peso de C.
auratus. Los valores representan el valor promedio ± desviación estándar. Las
Figura 5. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30%, 40% y 45%) y la temperatura en el agua (16-18ºC y 23-25ºC) sobre el crecimiento en longitud estándar de C. auratus. Los valores representan el valor promedio ± desviación estándar. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0.05).
Figura 6. Efecto del nivel de proteína bruta en la dieta (30%, 40% y 45%) y la temperatura en el agua (16-18ºC y 23-25ºC) sobre el crecimiento en longitud total de C. auratus. Los valores representan el valor promedio ± desviación estándar. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0.05).
A partir de los datos de peso en C. auratus, el modelo de crecimiento que se ajusto mejor fue el modelo exponencial, presentando un R2 más cercano a 1 entre los tratamientos (Tabla 4).
Tabla 4. Modelos de crecimiento en peso de C. auratus, evaluados bajo el efecto de dos rangos de temperatura en el agua (16-18ºC y 23-25ºC) y tres niveles de proteína bruta en la dieta (30, 40 y 45%).
Modelo Lineal Modelo exponencial
TºC PB
(%)
Tratamiento Formula Y = a + bx R2 Formula Y = a ex R2
16-18 30 T1 Y = 0.0348x + 2.99 0.97 Y = 3.0108e0.0096x 0.95 40 T3 Y = 0.0162x 2.5669 0.57 Y = 2.5447e0.006x 0.57 45 T5 Y = 0.0702x + 2.2596 0.98 Y = 2.6594e0.0135x 0.99 23-25 30 T2 Y = 0.0547x + 2.1809 0.95 Y = 2.5154e0.0117x 0.98 40 T4 Y = 0.0611x + 2.3668 0.95 Y = 2.7422e0.0119x 0.99 45 T6 Y = 0.0831x + 2.288 0.95 Y = 2.873e0.0142x 0.98 6.2. Parámetros productivos
Los parámetros productivos fueron evaluados a los 40 días (tiempo en el cual se anulo el tratamiento 1 y 3) y a los 94 días del experimento. El análisis estadístico no presento diferencias significativas (p>0.05) en los primeros 40 días, solo en la supervivencia. A los 94 días se encontró diferencias significativas en ganancia de peso (GP), tasa de conversión alimenticia (TCA), crecimiento relativo (CR), factor de conversión alimenticia (FCA) y tasa de eficiencia alimenticia (TEA). Los tratamientos alimentados con el mayor porcentaje de proteína bruta (45%) presentaron los mejores parámetros productivos (Tabla 5).
Tabla 5. Parámetros productivos de C. auratus durante los 40 días y 94 días del experimento. Los valores representan el valor promedio ± desviación estándar. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0.05). Los espacios en blanco (-) indican datos no registrados, debido a que fueron los tratamientos anulados.
Tiempo %PB Temperatura (ºC) Tratamiento 30 18.4±0.39 T1 30 24.0±0.2 T2 40 18±0.1 T3 40 24.9±0.2 T4 45 17.3±0.2ºC T5 45 24.8±0.45 T6 40 DIAS Supervivencia (%) 63,3±5.57 ac 86,67±2,08 abc 50±7,51 a 86,67±2,08 bc 93,3±1,15 b 90,0±1,53 b GP (g) 1,46±0,19 a 1,17±0.37 a 0,68±0,37 a 1,35±0,95 a 2,16±1,17 a 2,46±0,68 a TCA (g/día) 0,04±0,0053 a 0,03±0,01 a 0.02±0,01 a 0,04±0,03 a 0,06±0,03 a 0,07±0,02 a CR (%) 54,45±23,34 a 43,57±13,84 a 113,54±52,32 a 47,08±31,40 a 79,55±34,86 a 88,49±14,96 a K 4,41±0,64 a 3,71±0,20 a 3,97±0,49 a 3,76±0,39 a 4,33±0,38 a 4,33±0,19 a FCA 3,09±1,39 a 3,83±1,44 a 6,52±3,19 a 4,50±2,31 a 2,25±1,35 a 2,04±0,3 a TEP (g) 0,05±0,0064 a 0,04±0,01 a 0,02±0,009 a 0,03±0,02 a 0,05±0,03 a 0,05±0,02 a TEA 0,37±0,17 a 0,28±0,09 a 0,18±0,07 a 0,30±0,22 a 0,54±0,24 a 0,50±0,07 a 94 DIAS Supervivencia (%) - 73,3±3,03 a - 70±3,67 a 93,3±1,10 a 86,7±1,53 a GP (g) - 5,07±0,55 a - 5,78±0,90 ab 6,63±1,01 ab 7,74±1,32 b TCA (g/día) - 0,05±0,01 a - 0,06±0,01 ab 0,071±0,01 ab 0,08±0,01 b CR (%) - 188,90±19,26 a - 204,60±24,66 ac 257,97±25,41 bc 279,91±25,96 b K - 4,48±0,47 a - 4,51±0,61 a 4,57±0,13 a 3,93±0,28 a FCA - 2,73±0,23 a - 2,61±0,12 ab 2,31±0,19 b 2,35±0,09 ab TEP (g) - 0,17±0,02 a - 0,14±0,02 a 0,15±0,02 a 0,17±0,03 a TEA - 0,37±0,03 a - 0,38±0,02 ab 0,43±0,03 b 0,43±0,02 ab
6.3. Excreción de NAT
El comportamiento de los datos de excreción de NAT fue diferente entre los tratamientos de temperatura alta (24.0±0.2°C - 24.9±0.2ºC) con los tratamientos de temperatura baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C). Se observo una disminución de excreción de NAT en los tratamientos de temperatura alta (24.0±0.2°C - 24.9±0.2ºC) a medida que aumentaba la biomasa, sin embargo en el tratamiento 2 (30% PB) y 6 (45% PB) se evidencio un aumento de excreción en el último tiempo de muestreo (94 días) (Figura 6). Mientras el comportamiento de los datos de excreción total de NAT en los tratamientos de temperatura baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C) con proteína alta (45%), presentaron una oscilación a lo largo del tiempo; durante los 65 días del experimento la excreción de NAT fue directamente proporcional a la biomasa (a medida que aumentaba la biomasa aumentaba la excreción) y hasta el último tiempo de muestreo (94 días) se evidencio una disminución de excreción de 2.09±0.095 a 1.04±0.10 mg/L NAT / 72h (Figura 7).
El comportamiento de excreción total de NAT en los tratamientos 1 (30% PB) y 3 (40% PB) de temperatura baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C) no se graficó, puesto que fueron pocos los datos obtenidos; sin embargo, la excreción total de NAT que presentaron durante el tiempo que permanecieron en el experimento fue: T1: 0.26±0.075 mg/L NAT / 72h a los 10 días y 0.10±0.035 mg/L NAT / 72h a los 35 días; T3: 0.19±0.072 mg/L NAT / 72h a los 10 días y 0.07±0.04 mg/L NAT / 72h a los 35 días.
Por otro lado, se observó mayor excreción total de NAT y tasa de excreción de NAT por individuo y por gramo de pez / hora en los tratamientos que fueron alimentados con proteína bruta alta (40% y 45%) tanto en los tratamiento de temperatura alta (24.0±0.2°C - 24.9±0.2ºC) y baja (17.3±0.2ºC - 18.4±0.39°C), presentando una mayor excreción los tratamientos con proteína bruta del 45% (Figura 6 y 7; Tabla 6 y 7).
Se realizó un análisis de regresión múltiple (R2= 0.3627; F= 10.62; P= 1.248e-05), (n=60) y se encontró que entre las variables de proteína bruta, temperatura y peso, la excreción de NAT está más relacionada o más influenciada por la proteína bruta, seguido por la temperatura y por último el peso en C. auratus.
Figura 7. Efecto de la temperatura (23-25ºC), el nivel de proteína en la dieta (30%, 40% y 45% PB) y la biomasa sobre la excreción total de NAT en C. auratus. Los valores representan el valor promedio ± error estándar. A. Tratamiento con 30% PB y 24.0±0.2°C (T2); B. Tratamiento con 40% PB y 24.9±0.2 (T4); C. Tratamiento con 45% PB y 24.8±0.45ºC (T6).
Figura 8. Efecto de la temperatura (16-18ºC), el nivel de proteína en la dieta y la biomasa sobre la excreción total de NAT en C. auratus. Los valores representan el valor promedio ± error estándar del tratamiento con 45% PB y 17.3±0.2ºC (T5).
Tabla 6. Efecto de la temperatura y el nivel de proteína bruta en la dieta sobre la tasa de excreción de amonio ó NAT (TEA) por individuo durante 72h (mg/L NAT / 72h / ind) en C. auratus. TRAT, significa tratamiento. Los valores representan el valor promedio ± error estándar y los espacios en blanco indican datos no registrados, debido a que fueron los tratamientos anulados. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0.05); el análisis estadístico se realizo por tiempo (columna).
TIEMPO (Días) 15 40 68 94 T ºC TRAT PB % PESO (g) TEA (mg/L/72h) PESO (gr) TEA (mg/L/72h) PESO (g) TEA (mg/L/72h) PESO (g) TEA (mg/L/72h) 16-18 T1 30 3.64±0.75 0.028±0.014 abd 4.38±0.38 0.016±0.014 a - - - - T3 40 3.14±0.59 0.03±0.02 abcd 3.04±0.67 0.009±0.009 a - - - - T5 45 3.29±0.33 0.093±0.015 abcde 4.75±0.98 0.17±0.015 b 6.79±0.63 0.22±0.0098 b 9.23±0.89 0.11±0.007 b 23-25 T2 30 2.87±0.06 0.037±0.0061 abd 3.87±0.32 0.028±0.011 a 5.60±0.64 0.013±0.003 a 7.76±0.45 0.027±0.019 a T4 40 3.32±0.24 0.125±0.023 ce 4.18±0.62 0.026±0.010 a 6.2±0.49 0.024±0.008 a 8.6±0.60 0.027±0.012 a T6 45 3.74±0.59 0.14±0.019 ce 5.27±0.75 0.056±0.002 a 7.91±0.61 0.060±0.020 a 10.55±1.15 0.098±0.015 b
Tabla 7. Efecto de la temperatura y el nivel de proteína en la dieta sobre la tasa de excreción de NAT por gramo de pez / hora (mg/L NAT / g / h) en C. auratus. Los valores representan el valor promedio ± desviación estándar. Los espacios en blanco indican datos no registrados, debido a que fueron los tratamientos anulados.
TIEMPO (Días) 15 40 68 94 T ºC TRAT PB % PESO (g) mg/L NAT /g /h PESO (gr) mg/L NAT /g /h PESO (g) mg/L NAT /g /h PESO (g) mg/L NAT /g /h 16-18 T1 30 3.64±0.75 0.00009±0.00007 4.38±0.38 0.00005±0.00004 - - - - T3 40 3.14±0.59 0.0001±0.0001 3.04±0.67 0.00003±0.00005 - - - - T5 45 3.29±0.33 0.0004±0.00004 4.75±0.98 0.0005±0.0002 6.79±0.63 0.0005±0.00004 9.23±0.89 0.0002±0.00002 23-25 T2 30 2.87±0.06 0.0002±0.00006 3.87±0.32 0.00009±0.00007 5.60±0.64 0.00003±0.000006 7.76±0.45 0.00004±0.00005 T4 40 3.32±0.24 0.0005±0.0001 4.18±0.62 0.00009±0.00005 6.2±0.49 0.00005±0.00004 8.6±0.60 0.00005±0.00004 T6 45 3.74±0.59 0.0005±0.00004 5.27±0.75 0.0001±0.0001 7.91±0.61 0.0001±0.00005 10.55±1.15 0.0001±0.00005
