UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA
B
ANCO DE
S
ANGRE DE
C
ORDÓN
U
MBILICAL
MEMORIAPARAOPTARALTITULO
DELICENCIADOENTECNOLOGÍAMÉDICA. ALUMNO:JOSÉVÁSQUEZMÉNDEZ
PROFESORAGUIA:TMMCS.MARCELAVÁSQUEZROJAS
TALCA-CHILE 2005
2
Dedicatorias.
A mis padres por su cariño, apoyo y sacrificio incondicional para darme esta gran profesión.
A mis hermanos, por nuestra gran amistad y cariño.
3
Agradecimientos.
A Dios por darme salud e inteligencia, por que sin ello es imposible realizar lo que nos proponemos.
A mis padres por su comprensión y paciencia mientras realizaba este trabajo.
A la profesora TM MgCs Marcela Vásquez por su paciencia, disposición, confianza y apoyo en el desarrollo de
este trabajo.
Al laboratorio de Genética y Transplante de la Clínica Alemana, en especial a la TM Teresa Dibarrart por su apoyo
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Índice de Contenidos
Páginas Capitulo I 9 Introducción. Capitulo II 10La Sangre de Cordón Umbilical. Antecedentes Históricos 10
Propiedades de las células de SCU 11
Propiedades biológicas 11
Propiedades inmunológicas 12
El transplante con SCU 13
Transplante con SCU versus medula ósea 15
Transplante relacionados con SCU 16
Transplante no relacionados con SCU 19
Factores que influyen en el injerto 19
Recuperación de neutrófilos y plaquetas post transplante con SCU 21
Recuperación del sistema inmune después del transplante con sangre de cordón 23
Transplante en el adulto utilizando SCU 24
Causas de muerte post transplante 26
Ventajas y desventajas del uso de Sangre de Cordón Umbilical como tratamiento 27
Capitulo III 30
Banco de Sangre de Cordón Umbilical. Selección del donante en el banco de sangre de cordón 33
Recolección de la sangre de cordón 33
Optimización de la recolección para mejorar la calidad del producto 36
5
Optimización de la colección 37
Pruebas serológicas de los donantes de SCU 41
Obtención de células progenitoras a partir de la SCU 42
Criopreservación 45
Descongelamiento 48
Capitulo IV 52
Expansión ex vivo de la SCU. Aplicaciones Clínicas 52
Cultivo de células progenitoras 53
Capitulo V 57
Implicaciones éticas en los bancos de SCU. El consentimiento informado 58
Fases del consentimiento 59
Pautas para el consentimiento informado 62
Privacidad y confidencialidad 64
Comercialización 65
Actitud de los padres post-donación 65
Anexo I 67
Descripción de algunas técnicas de laboratorio para la recuperación de células nucleadas desde SCU. Hidroxietil almidón (HES) 67
Sistema cerrado por centrifugación diferencial 68
Modificación de un sistema de triple bolsa 68
Sedimentación con dextran 69
Reducción del volumen utilizando penta-almidón 70
6
Índice de Tablas y Figuras.
Páginas
FIGURA 1: Proporción de sobrevida de pacientes transplantados con SCU de donantes relacionados
y no relacionados. 14
FIGURA 2: Algoritmo de selección de SCU o medula
ósea en transplantes no relacionados. 16
TABLA I: Clasificación del grado clínico de la GVHD. 17 TABLA II: Estudios de los transplantes con sangre de
cordón desde donantes relacionados (hermanos). 18
TABLA III: Enfermedades tratadas por transplante de
sangre de cordón. 27
TABLA IV: Ventajas de las células progenitoras provenientes
de SCU para su uso en reconstitución medular hematopoyetica. 28
TABLA V: Desventajas de las células progenitoras provenientes
de SCU para su uso en reconstitución medular hematopoyetica. 29
FIGURA 3: Numero de unidades de sangre de cordón según
los reportes de la BMDW desde 1993. 30
TABLA VI: Organizaciones que garantizan un producto
estándar y de alta calidad en los banco de SCU. 31
TABLA VII: Conteo celular entre sangre obtenida desde
7
TABLA VIII: Efecto del modo de colección de la sangre
de cordón en el conteo de células nucleadas. 38
TABLA IX: Comparación de diferentes parámetros en
sangre de cordón umbilical obtenida por dos tipos de colecciones. 39
TABLA X: Conteo de células CD 34+ en relación al número
de partos de las madres. 40
TABLA XI: Comparación entre dos métodos de criopreservación. 47 FIGURA 4: Bolsa comercial para lavado de las células
de las unidades de SCU posterior descongelación. 50
TABLA XII: Porcentaje de recuperación de células
de SCU luego de criopreservadas 10 y 15 años. 51
TABLA XIII: Aplicación potencial y desafíos de la
expansión ex vivo de células madres hematopoyéticas 53
TABLA XIV: Variables que afectan los resultados de
la expansión de cultivos hematopoyéticos. 54
TABLA XV: Resultado de pruebas pilotos de expansión
ex vivo usando SCU no relacionado. 55
TABLA XVI: Futura dirección de la expansión ex vivo
8
TABLA XVII : Criterios de referencia en la elección de madres que están en labor para el consentimiento de la
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I
INTRODUCCIÓN
El transplante de células progenitoras se ha utilizado por mucho tiempo para la reconstitución de la hematopoyesis en pacientes con una terapia mioeloablativa. La obtención de estas células ha evolucionado durante el tiempo y ya no solo se obtienen directamente de la medula ósea, sino también de sangre periférica y de sangre de cordón umbilical (SCU). La fácil obtención de este último recurso ha potenciado el desarrollo de los bancos de sangres de cordón umbilical a través del mundo.
Las diversas propiedades de las células provenientes de la SCU, su fácil obtención y almacenamiento, la posibilidad de almacenar células progenitoras para grupos étnicos determinados, son algunos de los beneficios que posee este recurso. Sin embargo, la fuente de células progenitoras para un determinado transplante va a depender de las necesidades del paciente, por lo que la SCU pasa a ser una nueva alternativa sin reemplazar a las otras fuentes de células progenitoras.
La estandarización de técnicas, la selección, colección, criopreservación y el problema ético de los bancos de SCU todavía se discute. Sin embargo los esfuerzos por estandarizar estos puntos ya ha dado frutos, surgiendo instituciones que velan por ello.
La importancia del establecimiento de un banco de SCU esta orientado a aliviar la falta de donantes y acortar el proceso de búsqueda. Sin embargo, en Chile existe poca experiencia sobre este tema, por lo que es importante crear los medios para avanzar en el conocimiento y desarrollo de este preciado recurso.
10
II
L
AS
ANGRE DEC
ORDÓNU
MBILICALAl momento del nacimiento la sangre que circula en el recién nacido es rica en células progenitoras hematopoyéticas, estas desaparecen en las primeras horas luego del nacimiento. La sangre que queda en la placenta y el cordón contiene estas células progenitoras, capaces de regenerar la medula ósea para reestablecer el proceso hematopoyético. La cantidad de células contenida en la sangre de cordón umbilical (SCU) es suficiente para reemplazar la medula ósea, al igual que si fuera un transplante de esta. (Rubinstein et al., 1998; Glukman et al., 2000; Ballen et al., 2001a).
Antecedentes históricos.
La presencia de precursores hematopoyéticos en la SCU fue descubierto en 1974, y diez años mas tarde se demostró la presencia de precursores primitivos (Nakahata et al., 1982). Sin embargo, hasta mediados de los años 80 la sangre de cordón umbilical se consideraba como un material de desecho luego de tomadas las muestras pertinentes para la realización de pruebas rutinarias de laboratorio. Desde el primer trasplante exitoso de células progenitoras provenientes de sangre de cordón umbilical (SCU) en 1988 en un paciente con anemia de Fanconi (Glukman et al., 1989) esta fuente ha causado gran interés como alternativa al transplante de medula ósea. De los cuatro transplantes que siguieron a continuación, tres de ellos nuevamente se realizaron en pacientes con Anemia de Fanconi (Broxmeyer et al., 1990; Broxmeyer et al., 1991; Kohlí-Kumar et al., 1993), y uno realizado a un paciente con leucemia mielomonocítica crónica juvenil (Wagner et al., 1992).
Los primeros transplantes se realizaron con células obtenidas desde un hermano HLA compatible o con solo una desigualdad antigénica. Actualmente se utilizan células con más de una disparidad HLA (Kurtzberg et al., 1994). El desarrollo de los bancos de SCU a través del mundo ha dado lugar a que los transplantes con células progenitoras de donantes
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no relacionados superen en número a los transplantes en que el donante proviene de la misma familia del paciente. (Glukman et al., 1997; Rubinstein et al., 1998).
Propiedades de las células de SCU.
Las propiedades de las células provenientes de SCU difieren de las provenientes del adulto. Los primeros estudios demuestran que posee una alto contenido de células progenitoras primitivas con gran potencial clonogénico y proliferativo, hecho que se demuestra por dar colonias de mayor tamaño (How et al., 1992; Lu et al., 1993). La inmadurez relativa que presentas las células de sangre de cordón les da ciertas propiedades biológicas e inmunológicas no encontradas en las células adultas.
Propiedades biológicas.
La inmadurez relativa que presentan las células de la SCU hace que estas tengan una ventaja en comparación con células de medula ósea o de sangre periférica. Esto se basa por la relativa inmadurez del sistema hematopoyético e inmunitario durante el periodo prenatal. Los progenitores hematopoyéticos de la SCU poseen una mayor proporción de células progenitoras primitivas con la capacidad de repoblación a largo plazo la medula de los pacientes infundidos. Se ha demostrado que las células de SCU poseen un potencial superior de implante en comparación con las células progenitoras provenientes de médula ósea adulta. En experimentos hechos en ratones se demostró que las células de SCU poseen una mayor capacidad de injertar y repoblar tejido hematopoyético de ratón sin tener que administrar citoquínas post-transplante (Voormor et al., 1994).
A través de experimentos de marcaje de genes y purificación celular, se ha reportado una forma mas primitiva de célula progenitora denominada como células repobladoras SCID (SRC). Estas células son capaces de injertar la medula ósea de ratones SCID (severe combined immunodeficient) que tienen una inmunodeficiencia por lo que no rechazan las células humanas que les son implantadas. Wang et al., 1997 reportaron que la SCU posee 1 célula repobladora de SCID por millón de células nucleadas, comparada con 1 en 3
12
millones encontrada en células de la medula ósea y 1 en 6 millones en células de sangre periférica.
Todas estas propiedades de la SCU deberían compensar la limitación en número de las células transplantadas y en consecuencia, ser suficientes para reconstruir la hematopoyesis después de un tratamiento mieloblastivo.
Por otro lado, podemos inferir que debido a la relativa inmadurez de los linfocitos encontrados en SCU provoca una menor frecuencia de la enfermedad injerto versus huésped (GVHD) , mientras que los linfocitos T de las células progenitoras adultas están mas activas, aumentando el riesgo del paciente de adquirir la enfermedad (Ballen et al., 2001a)
Otra propiedad biológica que se ha desarrollado en el ultimo tiempo y que ha tomado gran importancia es la relativa “plasticidad de las células progenitoras” (Jiang et al, 2002). En este mismo ámbito, el mayor enfoque de las investigaciones esta dado al potencial de transdiferenciación celular, a partir de células progenitoras humanas obtenidas desde adultos, y por lo que también se sugiere que la SCU puede contener células con la capacidad de obtener tejidos no hematopoyéticos (Goodwin et al, 2001).
Propiedades inmunológicas.
La principal consecuencia de la activación de las células T es la GVHD. La observación clínica en los transplantados con SCU a determinado que esta enfermedad es menos frecuente y menos severa lo que ha llevado a desarrollar muchos estudios para tratar de explicar los mecanismos de por que el sistema neonatal no es capaz de generar una respuesta de la magnitud con que responden las células adultas.
La cantidad promedio de células T (CD 3+) en la SCU es de 8 X 106/Kg, lo cual es similar a lo encontrado en medula ósea luego de un moderada depleción de células T. Esto
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indica que la dosis de células T es la adecuada para inducir la GVHD, particularmente cual no existe una igualdad HLA total (Barker et al, 2003).
Muchos reportes han comparado la función de las células inmunes presentes en la sangre de cordón con la sangre adulta o con células de la medula ósea, sugiriendo que las células de la SCU son más inmaduras, con poca funcionalidad activa que su contraparte adulta. Con ello, las diferencias funcionales reportadas de las células linfoides de la SCU puede ser la explicación. Por ejemplo, las células T de la sangre de cordón poseen baja actividad citotóxica comparadas con las células T provenientes de adultos, después de una primera, segunda y tercera estimulación alogénica. Además, las células T de la sangre de cordón responden igual que las células T adultas a la actividad de proliferación inducida por una estimulación alogénica primaria, las células T de sangre de cordón en contraste con las del adulto, se hacen insensibles a una estimulación alogénica secundaria. Las células T de adultos proliferan a una mayor magnitud después de una segunda estimulación alogénica (Ridson et al., 1995). Se ha determinado que los linfocitos encontrados en la SCU producen una baja cantidad de citoquínas inflamatorias como es el interferón gamma y factor de necrosis tumoral (Gluckman et al, 2000(a)).
También recientes estudios muestran que la SCU tiene pocos o ningún fenotipo de células T con CD8+ natural killer (NK). Esto seria crucial en la disminución de la frecuencia y severidad de la GVHD. Se ha demostrado que las células activadas de SCU tienen una expresión y producción disminuida de interleuquina (IL) 12. Tanto la, IL-12 y la IL-15 son cruciales para la inducción del desarrollo de células T NK CD8+. Este desarrollo esta asociado con la expresión de un receptor co-estimulante 41BBv (Ballen et al., 2001a).
El Transplante con SCU.
Los factores que influyen en el resultado final de transplantes usando SCU son muchos. Entre ellos podemos mencionar la edad y peso del paciente, el grado y tipo de malignidad, la cantidad de células nucleadas infundidas, el grado de compatibilidad entre el donante y receptor, entre otras. Muchos estudios se han realizado de los datos de registros
14
internacionales obtenidos de personas que han sido sometidas a transplante con SCU. De ellos se pueden sacar conclusiones valiosas de modo de mejorar los futuros transplantes con células progenitoras obtenida de SCU.
Los transplantes con SCU pueden ser relacionados, es decir, el donante tiene una relación familiar con el receptor del transplante; o no relacionado (no existe una relación familiar). Gluckman et al, 1997 realizo un estudio a 143 pacientes transplantados de diversos bancos de sangres en el mundo. Los resultados obtenidos muestran que la sobrevida a un año de los pacientes relacionados es mayor que los no relacionados (63% y 29% respectivamente) (Figura 1)
Fuente: Gluckman et al, 1997
FIGURA 1 : Proporción de sobrevida de pacientes transplantados con SCU de donantes relacionados y no relacionados
15 Transplante con SCU versus medula ósea.
La búsqueda simultanea de donantes de medula ósea y de SCU puede ser hecha para realizar un transplantes determinado. Si la búsqueda es satisfactoria para ambos recursos, ¿Cuál de ellos debemos elegir? Sin duda la elección correcta dependerá de la clínica individual de cada paciente, edad, peso, gravedad y tipo de la enfermedad, etc. La selección de SCU versus medula ósea también puede basarse en la urgencia del transplante , la disponibilidad de donadores de medula con igualdad HLA 6/6, la dosis celular de la SCU y el grado de desigualdad HLA de las unidades SCU (Figura 2). El tiempo promedio de búsqueda de un donante no relacionado de SCU que se obtuvo en la Universidad de Minnesota fue de 13,4 días versus 49 días para donadores no relacionados de medula ósea (Barker et al, 2002). De este modo si el transplante que se requiere es urgente, la SCU seria lo más favorable. Algunas instituciones estarían realizando transplantes con SCU con 1-2 desigualdades antigénicas HLA en forma rutinaria y con una desigualdad HLA de 1 antígeno para transplante con medula ósea en receptores pediátricos, siempre que la dosis celular de la SCU sea suficiente. Cuando se indica transplante medular en enfermedades no malignas, muchas instituciones prefieren el uso de medula ósea para el transplante, ya que existe la posibilidad de una segunda infusión en el caso del fracaso del transplante (Barker
16
* MO = Medula Ósea. ♠ SCU= Sangre de Cordón Umbilical. ♦ CN= células Nucleares Fuente: Barker et al, 2003.
FIGURA 2 : Algoritmo de selección de SCU o medula ósea en transplantes no relacionados.
Transplante relacionados con SCU.
En un estudio hecho por Rocha et al, 2000 comparo el resultado de 2052 transplantes de medula ósea relacionados (el donador es hermano) con HLA-idénticos versus 113 transplantes de SCU de donantes relacionados (hermanos) con compatibilidad HLA – idéntica entre 1990 y 1997. En este estudio los transplantados con SCU recibieron una dosis celular media de 4,7 X107 células nucleares/Kg. La recuperación medular después del transplante con SCU fue inferior a lo observado después del transplante con medula ósea con un tiempo promedio recuperación de neutrófilos de 26 días versus 18 días respectivamente. Además, el transplante con SCU fue asociado con una baja incidencia de una GVHD aguda.
17
El estudio de Rocha es el primero en ilustrar una diferencia entre el transplante de medula ósea y SCU. Este sostiene la práctica del transplante con SCU HLA-idéntico de donadores relacionados como una alternativa valida para pacientes pediátricos. De este modo, debido a la baja incidencia de la GVHD aguda y crónica, el riesgo de recaída con transplante de SCU no esta incrementado en comparación con el transplante de medula ósea (Barker et al, 2003).
La GVHD es una de las mayores complicaciones de en el transplante de medula ósea alogénico y es un determinante significativo del total éxito del transplante. La GVHD aguda se clasifica en 5 criterios clínicos que dependen de la afección de los 3 principales órganos afectados: piel, tracto gastrointestinal e hígado (TABLA I). Basado en la evaluación de la afección de estos tres órganos, se definieron de 0 a IV grados clínicos globales. De esta forma se considera que la GVHD aguda esta ausente con un grado 0, suave o moderada con grado I a II y severa en grado III a IV (Gratwolh et al, 1995).
TABLA I: Clasificación del grado clínico de la GVHD
I II III IV Piel Hígado Gastrointestinal 1-2+ 0 0 1-3+ 1 1 2-3+ 2-3+ 2-3+ 2-4+ 2-4+ 2-4+ Fuente: Beirana et al, 2000
La siguiente tabla muestra un análisis en que se compara los transplantes con SCU en pacientes relacionados (hermanos) de la década pasada a partir del Registro Internacional del Transplante de sangre de Cordón y el Registro de Eurocord. (TABLA II) (Ballen et al., 2001a)
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TABLA II: Estudios de los transplantes con sangre de cordón desde donantes relacionados (hermanos).
Registro Internacional del Transplante de Sangre de
Cordón
Registro de Eurocord
Numero de pacientes 62 102
Edad; media y rango ( ) (0,5-16) 5 (0,2-20)
Peso corporal en Kg; media y rango ( ) - 19 (5-50) Enfermedades, n - - Malignas (61) No malignas (61) N° de HLA desiguales, n 0 (51) 1-3 (11) 0 (80) 1 (5) 2 (6) 3 (10) 4 (10) Supervivencia global en 1 año - 64 % Supervivencia por el estado HLA 61 % con 2 y (Disparidad HLA 0-1) 73 %con I y (disparidad HLA 0) 50% con I y (disparidad HLA 1-4) Supervivencia en 1 año por enfermedad - 55 % (malignas)
67% (síndrome de fallo del transplante de medula) 100 % (hemoglobinopatias) 71% con I y (errores innatos) Incidencia de la GVHD 6/62 (grado 0-1) 3/62 (grado II-IV ) 3/62 (crónico) 24% (grado > II) 7% (grado II-IV) 3 de 43 pacientes con riesgo
(crónico) Recuperación de los neutrófilos, d (mediana)* 9-46 (22) 8-49 (28) Recuperación de las plaquetas, d (mediana)♦ 15-117(51) 4-180 (48)
* Recuperación de los neutrófilos definido como el tiempo en lograr un conteo absoluto de neutrófilos > 5 X 108/ L
♦ Conteo de plaquetas > 5 X 1010/L en transfundidos de 7 días.
19 Transplantes no relacionados con SCU.
El análisis de los registros de Eurocord (Ballen et al., 2001a) en pacientes con transplantes con SCU no relacionados muestran los siguientes datos:
Niños: De un total de 102 niños analizados, un 37 % muestra un rango de sobrevida sobre 1
año, un 74% de los pacientes tubo una recuperación de los neutrófilos, la incidencia de de una GVHD aguda ≥ II fue de 38% y la sobrevida en pacientes con enfermedades malignas fue de 35%, 10% en pacientes con síndrome de fallo del transplante de medula. Factores favorables a la sobrevida fue la igualdad ABO y serología negativa para citomegalovirus antes del transplante SCU. Los datos no fueron significativos entre la sobrevida y el peso, edad, número de células nucleares infundidas, sexo o la disparidad HLA. No hubo asociación entre la GVHD y el número de disparidad HLA.
Adultos: Solo 42 adultos con malignidades fueron analizados, con un 17% de
sobrevida sobre 1 año. Los factores favorables asociados con la sobrevida fueron la dosis celular (≥ 1 X 107/Kg) y con una condición de riesgo buena en el tiempo del transplante. El numero de células nucleadas infundida fue de 0,2 a 6 X 107/ Kg (media de 1,7 X 107/Kg). Los 6 pacientes que recibieron < 1X107/Kg murieron. La recuperación de los neutrófilos (>500/mm3) fue en promedio 35 días; el tiempo de recuperación de las plaquetas (≥ 20.000/mm3) fue en promedio 176 días. La GVHD aguda (> grado II), observada en 18 pacientes, no fue asociada con la disparidad HLA.
Factores que influyen en el injerto.
Ballen et al., 2001a llega a las siguientes conclusiones fundamentadas en datos analizados de transplantes con SCU:
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Dosis de células nucleares: La dosis adecuada de células nucleadas para transplante en
niños y adultos debe establecerse. Se ha observado una disminución significativa en la sobreviva de pacientes adultos infundidos con ≤1.5 X 107/ Kg de células nucleadas. El número de células nucleadas por kilogramo de peso del paciente se correlaciona con el injerto del transplante (Kurtzberg et al., 1996). Según los estudios del banco de sangre de Nueva York, Eurocord y las Universidades de Minnesota y Duke indican una fuerte relación entre la dosis de células nucleadas y el prendimiento del transplante.
Estado de la enfermedad e injerto: La influencia del estado de la enfermedad en la
demora o éxito del injerto no ha sido determinada. Estudios realizados en el Centro de Sangre de Nueva York determinaron que ciertas enfermedades, como la leucemia mieloide crónica y la anemia aplásica, están mayoritariamente ligadas a fallo en el injerto. En contraste, en un estudio combinado entre la Universidad de Minnesota y la Universidad de Duke encontraron una relación entre la anemia aplásica y la anemia de Fanconi y el fallo en el injerto. Además, estas dos últimas enfermedades también son asociadas con falla en el injerto después de un transplante de medula ósea no relacionado. La serología negativa para citomegalovirus (CMV) antes del transplante y la compatibilidad de grupo ABO también están asociados a una mejor supervivencia en los pacientes transplantados.
Locatelli et al., 1999 estudiaron el transplante con células progenitoras de SCU en niños con leucemia aguda. Examinaron a 40 pacientes con leucemia linfoblástica y 20 pacientes con leucemia mieloblástica pertenecientes a registros de Eurocord entre abril de 1990 y diciembre de 1997. En el grupo de pacientes existían ya transplantados en condiciones de bajo y alto riesgo, definidas como primera o segunda remisión completa y enfermedad avanzada. La supervivencia libre de eventos a los 2 años en estos grupos fue de 40% y 7%, respectivamente. Con este estudio se pudo concluir que el transplante utilizando SCU ya sea con donante relacionado o no relacionado es un procedimiento factible de realizar, capaz de curar un número relevante de niños con leucemia aguda.
21
Estado HLA y Enfermedad de injerto contra huésped (en ingles, GVHD): La enfermedad GVHD es una consecuencia de la activación de células T derivadas del donante que reconocen a los antígenos específicos del receptor.
La influencia del estado HLA en la incidencia de la GVHD debe establecerse. Rubinstein et al., 1998 estudiaron el resultado de 562 transplantados utilizando células progenitoras de SCU de donantes no relacionados. Encontraron que la severidad de la GVHD aguda se correlaciona con la edad del paciente, la magnitud de la incompatibilidad HLA, la presencia o ausencia de infección post-transplante (no relacionado a un microorganismo en particular) y el centro donde se efectuó el transplante. Un estudio hecho por Rocha et al., 2000 confirma que el riesgo de GVHD es mas bajo después de un transplante con SCU que el transplante con medula ósea. Esta diferencia entre la sangre de cordón y el transplante de medula puede deberse a que las propiedades inmunológicas de las células T de la SCU lo que reduce su capacidad para inducir la GVHD. Según Thomson
et al., 2000 la probabilidad de la GVHD aguda en transplante no relacionado pediátrico
utilizando SCU es de 37,2% al día 100 del transplante. Otros reportes indican un 32% a 46% de incidencia de GVHD un transplante no relacionado utilizando SCU. (Kurtzberg et
al., 1996; Rubinstein et al., 1998). En los pacientes analizados por Thomson et al., 2000 no
se encontraron evidencias de una GVHD crónica. Finalmente, Barker et al, 2001 determinaron que el transplante con SCU en niños puede tolerar una desigualdad de 1 a 3 antígenos HLA, sin un incremento de la GVHD.
Las características de los linfocitos T que se encuentran en la SCU y su menor capacidad para generar la GVHD se analizaron más detalladamente en las propiedades inmunológicas de la SCU.
Recuperación de neutrófilos y plaquetas post transplante con SCU.
La recuperación de los neutrófilos se define como el tiempo en lograr un conteo absoluto de neutrófilos > 5 X 108/ L (Ballen et al, 2001a). Thomson et al., 2000 estudiaron veintisiete pacientes transplantados con SCU con donantes no relacionados (14 hombres y
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13 mujeres), con una edad media de 4,85 años (rango de 0,4-17,1 años) y con un peso medio de 18,4 Kg (rango de 5,65-71,4 Kg), que recibieron un total de 30 transplantes entre Noviembre 1994 y Febrero 1999. Los resultados obtenidos muestran que, el promedio de los pacientes alcazo este conteo de neutrófilos a los 27 días. Esto puede ser comparado con otros reportes de transplantes no relacionados de SCU, en que el tiempo de recuperación un tubo un rango de 22-30 días (Wagner et al., 1996; Gluckman et al,1997, Rubinstein et al., 1998; Ballen et al, 2001a).
De la misma forma, la recuperación de las plaquetas se define como el tiempo (días) en lograr un conteo de plaquetas > 5 X 1010/L sin transfusión en 7 días (Ballen et al, 2001a). Sin embargo, en otros estudios se define como el tiempo necesario para alcanzar un conteo mínimo sostenido de 20X103/mm3 en 7 días consecutivos y con ausencia de transfusión de plaquetas (Benito et al, 2004). En el estudio de Thomson et al., 2000 obtuvo una media de 75 días en los pacientes analizados. Este valor es comparable con otros reportes donde obtuvieron un tiempo de 56 a 71 días en promedio (Wagner et al., 1996; Rubinstein et al., 1998; Ballen et al, 2001a). La tromboicitopenia observada en estos pacientes transplantados
con SCU puede ser explicada en parte, por la desaparición de las unidades formadoras de colonias megacariociticas (CFU-Meg) durante el proceso de criopreservación, siendo estas mas sensibles al stress de la criopreservación que las otras células (Xu et al, 2004).
Thompson et al., 2000 no encontraron una relación entre el tiempo de recuperación de los neutrófilos y las plaquetas y el numero de células nucleares infundidas por kilogramo en el transplante con SCU. Esto es comparable con la experiencia de Wagner et al., 1996 en transplantes no relacionado con SCU y se contrapone con lo publicado por Kurtzberg et al., 1996 y por Rubinstein et al., 1998 quienes encontraron una correlación directa entre la recuperación de los neutrófilos y la cantidad de células nucleares por kilogramo. También se determino que la edad del receptor y grado de desigualdad HLA no tiene una relación detectable en el tiempo de recuperación de los neutrófilos y las plaquetas.
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Recuperación del sistema inmune después del transplante con sangre de cordón. La inmadurez relativa de algunas células de SCU presenta un potencial problema para la recuperación de la inmunidad celular luego del transplante. En el mismo estudio hecho por Thomson et al., 2000 evaluaron la recuperación del conteo de células inmunes post transplante. Las células T CD4+ se recuperaron en promedio a los 12 meses, las células T CD8+ fue en promedio a los 9 meses, mientras que las células NK se recuperaron en promedio a los 2 meses post-transplante. La recuperación de la funcionalidad celular también fue diferente de cada célula; las células T se recuperaron de 9 a 12 meses, la recuperación de las células B (inmunoglobulinas) tuvieron un rango de tiempo de 1 y 3 meses, y las células NK se reestablecieron en 1 mes en todos los niños. Niegues et al, 2001 estudio 63 pacientes pediátricos transplantados (14 relacionados y 49 no relacionados) con SCU. La edad promedio de los pacientes era de 4 años, con una dosis celular media de 6,1 X107 células nucleares / Kg. La recuperación de las células NK fue a los 3 meses , 6 meses para células B, 8 meses para células T CD8+ y 12 meses para células T CD3+ y CD4+.
Moretta et al, 2001 compararon la reconstitución inmune en 23 pacientes pediátricos transplantados con SCU con 23 pacientes pediátricos transplantados con medula ósea. Los pacientes transplantados con SCU mostraron un marcado incremento en el número de linfocitos B en comparación con los pacientes sometidos a transplante con medula ósea. El conteo absoluto de células T Cd3+ y CD8+ y células NK se recuperaron en forma similar en los transplantados con SCU y con medula ósea. Finalmente los autores concluyen que los niños transplantados con SCU muestran una recuperación inmune muy similar a los que fueron transplantados con medula ósea.
Recuperación inmune celular y la dosis celular. La relación entre la recuperación de la
inmunidad celular y la dosis de células infundida en el transplante también fue estudiada por Thomson et al., 2000, estableciendo lo siguiente:
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1) No se encontró ninguna relación entre la recuperación del conteo de células T, B, NK y la cantidad de células nucleadas/ Kg infundidas y células CD34/Kg infundida.
2) No hubo relación entre el rango de recuperación numérica de células T, B, NK y el grado de desigualdad HLA.
4) Solo se encontró una leve relación entre la recuperación de células CD8 y el grado ≥ II de la GVHD
5) Hubo un total de 13 infecciones grado II y 3 infecciones grado IV en los primeros 100 días después del transplante.
6) No se encontró correlación entre el grado de infección y el tiempo de la recuperación inmune en esta serie.
Resumiendo las propiedades inmunológicas de la sangre de cordón (Ballen et al., 2001a), se puede establecer lo siguiente:
- Posee un bajo número de células T NK CD8+ en SCU comparada con sangre periférica adulta, lo que puede aportar para una débil citotoxicidad de células T en SCU.
- Una baja o ausente cantidad de células T NK CD8+ en SCU que puede estar involucrada en la disminución de la GVHD notada después del transplante con SCU.
- Son necesarias investigaciones que estudien las células T NK CD8+ después del transplante con SCU, considerando que la inducción de las células T NK CD8+ de la SCU puede estar asociada con una actividad antitumoral.
Transplante en el adulto utilizando SCU.
Como ya se menciono la menor cantidad de células progenitoras en la SCU en comparación con las obtenidas desde medula o sangre periférica han hecho que se restrinja el transplante de este recurso en niños con un peso menor de 40 Kgr. Sin embargo, existen variadas experiencias del uso de este recurso en personas adultas. Actualmente las investigaciones apuntan a buscar la optimización de la cantidad de células progenitoras en las unidades de SCU, con el objeto de que puedan ser utilizadas sin ningún problema en el adulto.
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Experiencias previas de transplantes en adulto, han relevado que la cantidad de células nucleadas requeridas en el transplante adulto debe ser por lo menos 107 células/ Kg y sobre 105 células CD34+/Kg para que ocurra el prendimiento del injerto (Liesveld, 2003(41). Eurocord ha realizado un largo estudio con pacientes adultos transplantados con SCU no relacionado. De los 108 pacientes analizados, 102 habían recibido SCU sin una igualdad HLA total. La media de células nucleadas y CD34+ infundida fue de 1,7 (0,2-6)X 107 y 0,8 (0,01-8,9) X 105/ Kg respectivamente. La recuperación de los neutrófilos y plaquetas fue de 81% al día 60 y de 65% al día 180 respectivamente. El prendimiento fue rápido en aquellos pacientes que recibieron una dosis de células nucleares ≥ 1,7 X107/Kg y sin leucemia mieloide crónica. El tiempo promedio de recuperación de los neutrófilos y plaquetas fue de 22 a 27 días y de 58 a 69 días, respectivamente (Benito et al, 2004). En el estudio de Sanz
et al, 2001 reporto una serie de 22 adultos con un peso promedio de de 69,5 Kg
transplantados con SCU de donadores no relacionados. Determinaron que si la dosis celular infundida estaba sobre 107 células/ Kg, se esperaba que el tiempo medio en que el conteo absoluto de neutrofilo fuera de 500/µl es de 22 días (rango de 13-52 días), y el tiempo medio para que el conteo de plaquetas fuera de 20.000/al esta alrededor de 70 días (rango de 49-153 días). Laughlin et al, 2001(b) realiza un estudio en 68 paciente adultos (17-58 años) que recibieron células progenitoras provenientes de SCU. De ellos un 90% tuvo una reconstitución hematopoyetica. Dos de los pacientes tuvieron una igualdad HLA 6 de 6. La probabilidad de una GVHD aguda (grado III a IV) del resto de los pacientes fue solo 20% (comparado con 35% a 55% en transplante de medula ósea), mientras que para la GVHD crónica fue de 38%. De este modo, esta aproximación puede ser utilizada en casos de pacientes adultos que poseen un donador no relacionado con una igualdad HLA total.
Diferentes métodos para la optimización de la colección de SCU han sido propuestos, con el fin de solucionar el problema del limitado número de células progenitoras. Diversas investigaciones han propuesto la posibilidad de la expansión de las células progenitoras de la SCU por métodos in vitro. Un ejemplo de ello es la combinación de diversas citoquínas, factores de estimulación de colonias granulociticas (G-CSF), factor de células tronco (stem
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cell factor como c-kit ligand/SCF) y trombopoyetina (TPO) junto con un medio de cultivo especial para el crecimiento de células progenitoras (Liesveld, 2003(41).
Otras soluciones propuestas es el uso de un pool de colecciones SCU para aumentar el numero de células progenitoras, propuesto como un dador universal para la reconstitución de la medula ósea (Ende et al, 2001). La Universidad de Minnesota uso dos unidades de SCU con igualdad HLA parcial y con una desigualdad de 1-2 antígenos HLA al receptor y las unidades a transplantar. Ocho adultos con una edad promedio de 47 años y peso de 81 Kg (63-109 Kg) fueron transplantados luego de utilizar un régimen mieloablativo. El promedio de células nucleares fue de 3,3 X107 /Kg. El tiempo promedio en que el conteo de neutrofilo fue ≥ 500/al fue de 25 días (rango de 21-28 días). No ocurrió ninguna falla del injerto y se obtuvo un 97-100% de quimerismo en el donador que se presento por el día 21 (Barker et al, 2001; Gryn et al, 2001).
Causas de muerte post transplante.
Comparado con el transplante de medula ósea, la demora en la recuperación de neutrófilos y plaquetas, el alto riesgo de falla del transplante y la alta incidencia de mortalidad relacionada al transplante son las principales causas de muerte post transplante que ocurre en los primeros 100 días luego del transplante con SCU (Benito et al, 2004). Rubinstein et al, 1998 evaluó el resultado de un total de 562 transplantados con SCU desde agosto 1992 a Enero de 1998 (218 murieron a los 100 días del transplante). Las causas de muertes post-transplante con SCU reportadas corresponden principalmente a infecciones (47 % de las muertes). Otras causas son la enfermedad pulmonar en 26%, falla multi-orgánica en un 12%, GVHD en un 11% y enfermedad veno-oclusiva del hígado en 7%. La magnitud de la igualdad HLA no fue asociada a una causa específica de muerte.
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Ventajas y desventajas del uso de
Sangre de Cordón Umbilical como tratamiento.
Algunas de las enfermedades que pueden ser tratadas usando células progenitoras hematopoyéticas han sido recopiladas por el Programa Nacional de donantes de medula de EEUU (Diseases Treatable by Stem Cell Transplantation(56). La tabla (III) muestra algunas de las diversas las enfermedades actualmente tratadas a través del transplante con SCU.
TABLA III : Enfermedades tratadas por transplante de sangre de cordón.
Enfermedades malignas. Leucemia linfocítica aguda. Leucemia mieloide aguda Leucemia mieloide crónica
Leucemia mieloide crónica juvenil Síndrome mielodisplásico Neuroblastoma Enfermedades no malignas. Adrenoleucodistrofia Trombocitopenia amegacariocitica Síndrome de Blackfan-Diamond Disqueratosis congénita Anemia de Fanconi Enfermedad de Gunther Síndrome de Hunter Síndrome de Hurler
Anemia aplásica idiopática Síndrome de Kostman Síndrome de Lesch-Nyhan Osteopetrosis
Inmunodeficiencia severa combinada Talasemia
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El tratamiento con SCU ha mostrado algunas ventajas en comparación con el transplante de medula ósea tradicional. El uso de este nuevo recurso de células progenitoras para la regeneración medular en los pacientes con tratamiento mieloablativos posee numerosas ventajas como también desventajas que son puntualizadas a continuación (tabla IV y V) (Rubinstein et al, 1998; Barker et al, 2003).
TABLA IV :Ventajas de las células progenitoras provenientes de SCU para su uso en reconstitución medular hematopoyetica
1. La SCU posee una cantidad suficiente de células progenitoras que pueden ser obtenidas sin ningún riesgo para la madre o recién nacido.
2. Manutención de SCU con un balance étnico en poblaciones heterogéneas, que puede ser controlado vía colección al momento del nacimiento en los centros maternos apuntando a la población minoritaria.
3. Baja incidencia de contaminación viral de la SCU incluyendo Citomegalovirus y virus de Epstein-Barr.
4. La SCU criopreservada, guardada y analizada en los bancos de sangre esta disponible rápidamente para pacientes que requieran transplantes en forma urgente, eliminando la gran demora en la búsqueda de donadores compatibles.
5. Baja incidencia de la enfermedad de injerto versus huésped (en ingles GVHD) en pacientes transplantado con este recurso.
6. La SCU criopreservada posee un largo tiempo de viabilidad y es descongelada fácilmente cuando tenga que ser utilizada, en comparación con las células progenitoras de sangre periférica, que poseen un tiempo de vida mas limitado por lo que requiere una coordinación de la recolección, transporte y equipo de transplante.
7. Baja restricción HLA de los donantes
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TABLA V: Desventajas de las células progenitoras provenientes de SCU para su uso en reconstitución medular hematopoyetica
1. El numero limitado de células progenitoras contenidas en una unidad de SCU, que restringe su uso en el transplante adulto.
2. Poca experiencia clínica por lo nuevo del recurso.
3. Potencial riesgo de transmisión de enfermedades genéticas.
4. No existe posibilidad de colectar del mismo donante más células progenitoras para pacientes que experimentan fracaso en el transplante.
Fuentes: Rubinstein et al, 1998; Laughlin 2001(a); Barker et al, 2003
Según lo descrito por Wagner et al., 1996 el uso de donadores de medula ósea no relacionado posee distintos obstáculos, en comparación al uso de SCU, como es:
1- El largo proceso de búsqueda de donante que requiere en promedio 3.5 meses (rango de 1 mes a 6 años).
2- Un número limitado de donadores para ciertas razas y etnias. 3- El donador queda indisponible en el periodo de extracción.
4- Posee un riesgo aumentado de rechazo al injerto, GVHD severa e infecciones oportunistas luego del procedimiento de transplante.
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III
B
ANCO DES
ANGRE DEC
ORDÓNU
MBILICAL.
Debido a la experiencia positiva de los transplantes con SCU, rápidamente se desarrollaron bancos de SCU a través del mundo. Los primeros bancos de SCU operacionales fueron establecidos en 1993 en Nueva York, Milán y Dusseldorf. Desde 1993 a la fecha el desarrollado de los bancos de SCU en el mundo ha tenido un aumento explosivo. En Diciembre del año 2003 la Bone Marrow Donors Worldwide (BMDW) mediante su reporte anual informo la cantidad de 155.254 unidades de SCU (Figura 3) correspondiente a los registros de 35 bancos de sangre de cordón de 21 países que participan en la BMDW (BMDW, Annual Report 2003).
Fuente: BMDW, Annual Report 2003
FIGURA 3 : Numero de unidades de sangre de cordón según los reportes de la BMDW desde 1993.
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Los problemas que se presentan en el establecimiento de los bancos de sangre de cordón umbilical son similares a los que involucran el establecimiento de un banco de sangre tradicional. La infraestructura, equipamiento, las técnicas a implementar en la selección de los donadores, colección, almacenamiento, procesamiento y distribución de las unidades de SCU a las áreas que sean necesarias son algunos de los obstáculos que se deben sobrepasar.
La calidad de los bancos de SCU esta dirigido a la calidad del producto y a la calidad de los sistemas usados para hacer sangre de cordón utilizable. Con ello se han desarrollado varias instituciones donde los bancos de SCU poseen el objetivo de obtener un producto estándar y de alta calidad, además de asegurar un intercambio y transporte nacional e internacional de la SCU (Ballen et al., 2001a) (TABLA VI).
TABLA VI: Organizaciones que garantizan un producto estándar y de alta calidad en los banco de SCU
American Association of Blood Banks (AABB) American Red Cross (ARC)
Bone Marrow Donors World (BMDW) Cord Blood Transplantation Study (COBLT)
European Blood and Marrow Transplant Group (EBMT) Eurocord
Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell Therapy (FAHCT)
Group for the Collection and Expansion of Hematopoietic Cells (GRACE)
International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE)
Joint Accreditation Committee of ISHAGE-Europe and EBMT (JACIE) NETCORD
National Bone Marrow Donor Program (NMDP)
Fuente: Ballen et al., 2001a
Las principales funciones de los bancos de SCU se pueden resumir en la recolección, procesamiento y criopreservación de la SCU, el almacenamiento con las óptimas condiciones para mantener su viabilidad y la búsqueda y envío de unidades compatibles para el transplante. La búsqueda de unidades compatibles implica la implementación de sistema de registros computarizados para acceder en forma rápida a los datos, como también el acceso a los datos de otros bancos de sangres en el mundo.
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El banco de SCU juega un rol importante en la implementación de un sistema de calidad con criterios de accesibilidad y seguridad del producto final. Es por ello la importancia de implementar sistemas estándares bien definidos que aseguren la calidad del producto independientemente del banco proveedor.
En 1998 se funda Netcord, es una red internacional de bancos cuyo objetivo es unificar globalmente el suministro y demanda de la sangre de cordón umbilical, estableciendo estándares a nivel mundial y sistemas de calidad en el área del banco de sangre de cordón umbilical. Netcord también ofrece un sistema de búsqueda en línea de unidades de SCU (Virtual Office) de los 14 principales bancos de SCU en el mundo (https://www.netcord.org). Esta red internacional ha desarrollado los estándares NETCORD/FACT (Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell Therapy), que actualmente dictan el funcionamiento de los BSCU en el mundo. Actualmente, según los bancos registrados por Netcord, las unidades de sangre de cordón umbilical recolectadas a nivel mundial hasta noviembre del 2004 son 86.944, de los cuales se ha efectuado un total de 3.095 trasplantes, 1.917 en niños y 1.094 en adultos.
El Registro Internacional de Sangre de Cordón Umbilical (ICBTR) y Eurocord son dos registros colaborativos, pero independientes entre si que coleccionan y analizan los datos de las transfusiones de SCU reportadas en muchos centros de transplantes. Actualmente, la ICBTR es parte del Registro Internacional de Transplante de Medula (IBMTR). La IBMTR es un grupo de trabajo de más de 300 centros de transplantes al rededor del mundo que contribuye con datos específicos de los transplantes de células progenitoras hematopoyéticas alogénicas al centro estadístico del Instituto de Política de Salud del Colegio Medico de Wisconsin. Eurocord es un registro internacional que opera en representación del grupo de Transplante de Medula y Sangre Europeo (EBMT). La participación de centros Europeos y no Europeos que realizan transplantes con SCU es abierta (Benito et al, 2004).
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Selección del donante en el banco de sangre de cordón.
Actualmente, los bancos de cordones poseen criterios establecidos para la elección del donante de la sangre del cordón umbilical. La AABB determino que la recolección de las unidades solo se debe realizar en partos no complicados y la sangre recolectada in útero de recién nacidos de 34 semanas de gestación.
Los criterios de selección para el donante establecido por el banco de sangre de Valencia son los siguientes: 1) El Consentimiento informado de la madre, por escrito; 2) Ausencia de enfermedades inherentes a la historia familiar con serología negativa para hepatitis B, C y VIH; y 3) criterios obstétricos como: tiempo de gestación igual o superior a 34 semanas, ruptura de membrana antes de 12 horas, ausencia de fiebre en la madre en el periodo intraparto y ausencia de anormalidades congénitas en el recién nacido (Solves et al, 2004).
Los diversos criterios establecidos para la selección de los donantes poseen fundamentos científicos y éticos. Estos últimos se analizan en forma mas detalla en el capitulo V.
Recolección de la sangre de cordón.
Existen dos metodologías para la recolección de sangre de cordón umbilical. La primera consiste en colectar la sangre cuando la placenta ya fue liberada en el proceso de parto, es decir ex utero. Debido a que la sangre que esta en la placenta y en el cordón umbilical coagula rápidamente, la colección ex utero debe hacerse lo mas pronto posible, generalmente dentro de 10 minutos. El otro método es colectar la sangre de cordón durante la tercera parte del parto, cuando el bebe ya ha nacido, pero antes que la placenta sea liberada, es decir con la placenta in utero. Una posible ventaja de este método es que la placenta es comprimida por el útero, de este modo mas sangre colectada (Lasky et al, 2002).
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Una vez pinzada o ligada la vena umbilical, la sangre es recolectada por punción directa en la vena umbilical, previamente limpiada con una solución de alcohol y yodo. Es esencial que la colección sea en completa asepsia debido al estado inmunitario de los receptores.
La metodología de recolección mas comúnmente utilizada cuando la placenta esta ex
útero, corresponde a la propuesta por Rubinstein et al., 1995. Esta consiste en insertar una
aguja calibre 16 de una bolsa de recolección de sangre estándar simple, que contiene solución CPDA (citrato/fosfato/ dextrosa/adenina), en el extremo de la vena umbilical de la placenta ya liberada, permitiendo que la sangre de cordón umbilical (SCU) drene por gravedad dentro de la bolsa de recolección. Para el facilitamiento de la colección y reducción de la probable contaminación con sangre materna y secreciones, la placenta es envuelta en un plástico con una almohadilla absorbente y es suspendida en un soporte especial. De los 63 ml de CPDA que son usados en una bolsa de colección de sangre estándar, calculada para 450 ml de sangre, es reducido a 23 ml por el drenaje de 40 ml dentro de un recipiente graduado, previo a la colección. Este volumen de anticoagulante es lo más adecuado al volumen de PCB recolectado (< 170 ml). Si se considera que el CPDA es un medio isotónico y posee un pH neutro, la proporción sangre-anticoagulante no es crítica, como lo es en el caso del ACD (ácido/citrato/dextrosa).
Una metodología de recolección de sangre de cordón con la placenta in útero fue publicada por M-Reboredo et al., 2000. Es una metodología simple que no entorpece el curso normal del nacimiento ni el periodo de posparto. Al igual que en la anterior se ocupa una bolsa de colección de sangre estándar con CPDA eliminando el exceso de esta solución en una bolsa satélite y solo dejando en su interior un volumen de 20 ml. Una vez que el cordón es ligado, cortado y el recién nacido es liberado, la vena umbilical es puncionada con la placenta in útero y la sangre es recolectada por gravedad en la bolsa de colección. Se debe recolectar el máximo volumen posible de cada cordón. El volumen de colección es calculado por el peso de la bolsa colectada menos el peso de la bolsa sola con CPDA.
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Harris et al., 1994 realizaron una comparación de diferentes métodos de extracción de SCU. Las técnicas analizadas para la colección fueron:
1- Obtención de la mayor cantidad de sangre posible por varias punciones con una jeringa directamente en la vena umbilical cuando la placenta esta todavía in útero.
2- Obtención de la sangre en una bolsa de colección estándar cuando la placenta ya fue liberada.
3- Colección con jeringa con la placenta in útero con inyección de una solución salina heparinizada (20-50 ml) al interior de la placenta y retiro de la sangre a través de una jeringa.
4- Al igual que el método tres pero luego de la inyección de la solución salina heparinizada, el final del cordón fue cortado y la sangre drenada al interior de un contenedor estéril.
5- Al igual que el método tres, exceptuando que después de la inyección de la solución salina hepartinizada la vena umbilical fue canulada con la aguja de una bolsa de donación estándar para la recolección de la sangre.
Los resultados de este estudio mostraron que la forma en que se obtiene un mayor volumen de sangre era por el método 5 (163 ml en promedio). También concluyen que independiente del método utilizado para la recolección, la cantidad promedio de células mononucleares por ml de sangre fue equivalente.
Antes de la recolección de la sangre de cordón umbilical por cualquiera de estos métodos, el cordón fue limpiado prolijamente con alcohol para asegurar la esterilidad en la colección.
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Optimización de la recolección para mejorar la calidad del producto.
El estudio de los factores que influyen en la calidad de la sangre de cordón permite optimizar la metodología de recolección, como también mejorar algunos factores obstétricos que puedan influir en la calidad y cantidad de la sangre recolectada, y de esta forma disminuir las unidades descartadas por tener un volumen inadecuado o un bajo conteo celular.
Como ya se menciono antes existen dos metodologías para la colección de la SCU. La colección ex utero es aquella que se hace con la placenta que ya ha sido liberada del útero, generalmente en procedimientos de cesárea. La colección in utero es la que se realiza en parto normal, luego del nacimiento del niño y la placenta todavía esta en el interior del útero.
Las características de la sangre en cuanto a conteo celular no se ven influenciada por el sitio de recolección a lo largo del cordón. Shelebak et al., 1999 compararon conteos de células nucleares (CN), células mononucleares (CMN) y de colonias de células progenitoras granulocíticas-monocíticas (CFU-GM) de sangre obtenida desde la vena umbilical y la vena en la base de la placenta luego de 7 días de incubación. (TABLA VII ) TABLA VII: Conteo celular entre sangre obtenida desde la vena umbilical y la vena en la base de la placenta.
Sangre de cordón Mediana (rango) Placenta Mediana (rango) CN x 107/ml 0,9 (0,3-1,3) 0,9 (0,3-1,6) CMN x 107/ml 0,6 (0,1-1,0) 0,5 (0,1-1,0) Día 7 CFU-GM x 103/ml 1,3 (0 – 2,5) 1,5 (0,2 – 2,3) Fuente: Shelebak et al., 1999
37 Optimización de la colección.
Debido a que la dosis de células progenitoras determinadas por la cantidad de células nucleadas o células CD34+ en la sangre de cordón es más baja que la obtenida en medula ósea o sangre periférica, se han estudiado los factores obstétricos que permitan mejorar la recolección de estas células. Muchos estudios han tratado de establecer la cantidad óptima de células nucleadas que se deben infundir al paciente para que el transplante tenga éxito. En el análisis de los datos del programa de SCU del Centro de Sangre de Nueva York (Rubinstein et al, 1999) establece que una dosis bajo los 5 X107 de células nucleares/Kg la probabilidad de falla del transplante incrementa. Actualmente, se recomienda que la cantidad de células nucleadas por unidad de sangre de cordón sea de 3,7 X 107/ Kg (Gluckman, 2000(a); Gluckman, 2000(c)) valor mas bajo que en el transplante de medula o de sangre periférica. Luego se comprobó que la dosis de CFC (unidades formadoras de colonias) era un parámetro más predictivo de la supervivencia post-transplante que la dosis de células nucleadas, observándose prendimiento y transplante libre de enfermedad a partir de una dosis de 5 X 104 CFCs/Kg (Migliaccio et al, 2000). Sin embargo, estudios hechos en registros internacionales de Eurocord (Gluckman et al, 1997), el Programa Nacional de Sangre de Cordón en Nueva York (Rubinstein et al, 2000) y la universidad de Minnesota (Wagner et al, 2002) sugieren que el valor mínimo limite de células nucleares debe ser de 1.5 X107 – 2,0 X107 células nucleares /Kg para el transplante con SCU. Debido a estas cantidades es recomendable que el transplante desde sangre de cordón se realice en pacientes con peso inferior a 40 Kg.
Grisaru et al, 1999 comparo el volumen de SCU recolectada por dos formas de colocar el recién nacido al momento del nacimiento. El primer grupo de colecciones de SCU provenían de recién nacidos colocados en el abdomen de la madre (“upper-position” group), mientras que el segundo grupo de colecciones provenían de recién nacidos que fueron colocados en la mesa de partos antes de cortar el cordón umbilical (“lower-position” group). La media del volumen de SCU obtenido desde el primer grupo fue de 108,1 ±19,1ml (22 colecciones); comparado con los 42,6±19,5ml del segundo grupo (27
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colecciones). Los niveles de hemoglobina y el conteo de glóbulos blancos en la SCU de ambos grupos fueron similares. El conteo absoluto de células CD34+ fue significativamente mayor en el primer grupo (P < 0.2) debido al mayor volumen colectado.
Análisis hechos al Banco de cordón de Galicia mostró que el volumen de sangre de cordón obtenida por procedimientos de cesárea (con la placenta ex útero) y parto normal (placenta in útero) no poseen una diferencia significativa (92,6 ± 20,4ml y 93,8 ± 25,2ml respectivamente). Sin embargo, el conteo de células nucleares fue 13 % superior en sangre obtenida desde la placenta in útero (M-Reboredo., et al 2000). Un valor similar obtuvieron Wong et al, 2001 donde demostraron que la concentración media de células nucleadas y la cantidad de unidades formadoras de colonias (CFU) están significativamente disminuidas en un 9,5% y 11,6% respectivamente, en muestras colectadas luego de la liberación de la placenta en comparación de aquellas colectadas cuando la placenta esta todavía in utero. Además, los partos con dificultades en que se obtuvo un volumen bajo de recolección, el conteo de células nucleadas no disminuyo. Por lo tanto, el valor promedio del conteo de células nucleadas no depende del aumento de volumen de sangre recolectada. (TABLA VIII ) (M-Reboredo., et al 2000).
TABLA VIII: Efecto del modo de colección de la sangre de cordón en el conteo de células nucleadas.
Tipo de colección Volumen Conteo de células nucleares ( x106)
Vaginal (in útero) 93,5 ± 25,2 1,01 ± 0,43 Cesárea (ex útero) 92,6 ± 20,4 0,87 ± 0,32 Nacimiento dificultoso
(ex útero)
88,8 ± 27,7 1,05 ± 0,61 Fuente: M-Reboredo., et al 2000
Para comparar la calidad de la sangre de cordón colectada in útero o bien una vez liberada la placenta, se debe minimizar al máximo otros factores que influyan en la calidad de la sangre. Solves et al., 2003 realizaron un estudio de comparación entre la colección in
útero y ex útero. Para ello, se hicieron conteos celulares de la sangre de cordón obtenida
con la placenta in útero por parto normal transvaginal, con la placenta ex útero posterior al parto normal transvaginal y con la placenta ex útero obtenida a través de cesárea. Los
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resultados demuestran que existe un aumento del volumen, de células nucleadas (CN), de células CD34+ y de CFU en la sangre obtenida in útero, comparada con la sangre ex útero en nacimiento por parto normal transvaginal o de la obtenida por de cesárea. Además de ello encontraron una correlación directa entre la cantidad de células nucleadas y células CD34+; entre la cantidad de células nucleadas y el total de CFUs y entre las células CD34+ y la cantidad de CFUs. (TABLA IX) Con ello se concluyo que el modo de recolección influye en la calidad del contenido hematológico de la sangre de cordón recolectada, siendo la mejor recolección la que se hace antes de que la placenta sea liberada en el proceso de parto.
TABLA IX : Comparación de diferentes parámetros en sangre de cordón umbilical obtenida por dos tipos de colecciones.
Parto normal Cesárea
Colección In útero Ex útero Ex útero
Volumen (ml) 108,82±28,6 98±28,47 102,5±21,65
Conteo glóbulos blancos X 106/ml 10,88±3,23 10,8±5,83 9,92±3,01 CN antes de procesamiento X 108 12,51±5,39 11,14±4.79 10,31±4,38 CN X 108 10,54±4,15 8,55±3,52 8,34±2,37 % recuperación CN 77,08±8,27 73,95±10,72 73,26±10,45 % células CD34+ 0,31±0,2 0,32±0,16 0,35±0,2 células CD 34+ X 106 3,65±3,38 2,96±2,25 3,08±1,97 CFUs X 104 154,14±141,61 121,13±113,98 152,92±153,31 % de viabilidad 89,19±6,75 89,08±8,99 90,52±5,72
Fuente: Solves et al., 2003
La calidad de la sangre de cordón obtenida puede ser influenciada por muchos factores, por ejemplo: 1)- El volumen y el conteo total de células nucleadas son afectadas por la duración de la gestación, el tiempo en que se demora la liberación del recién nacido del
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cordón umbilical y la duración de la labor de parto (Donalson et al.,1999); 2) – La duración del estrés en el proceso de liberación aumenta el numero de células nucleadas, granulositos, células CD34+ y precursores hematopoyéticos.
Ballen et al., 2001b estudiaron diversos factores en madres y recién nacidos que pueden influir en la calidad de la colección de sangre. Entre los factores analizados están la edad de la madre, si es fumadora, numero de partos previos, duración de la gestación, peso del recién nacido, sexo, entre otras. El análisis de los resultados demuestra que el conteo de células CD34+ provenientes de sangre de cordón recolectada de madres primerizas es mayor, en comparación con madres con más de tres partos. (TABLA X)
TABLA X : Conteo de células CD 34+ en relación al número de partos de las madres
Numero de partos previos células CD 34+ (X 106 ) Media ± D.S. 0 3,5 ± 3,1 1 2,9 ± 2,1 2 2,8 ± 2,8 3 o Más 1,9 ± 1,5
Fuente: Ballen et al., 2001b
En este estudio también se demostró que mientras mayor es el peso del recién nacido mayor es el volumen de la unidad colectada, y con mayor conteo de células CD34+ y CFU-GM (P < 0,05). Por el análisis estadístico de los datos por multivariante se sabe que por cada alumbramiento de la madre, existe la posibilidad de disminución de: el conteo celular (12%), células CD34 (17%), CFU-GM (18 %) y disminución del volumen a colectar (3%). Otros resultados destacables derivado de este estudio es que no se observan efectos por la edad de la madre o la raza en los parámetros de laboratorio, y que las madres fumadoras poseen un bajo conteo de células CD34.
Otro factor importante relacionado con el aumento del volumen final de la sangre de cordón es el peso de la placenta (Donaldson et al, 1999. Según Solves et al., 2004 existe una relación directa entre el recién nacido, el peso de la placenta y el volumen final de
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recolección. De acuerdo con sus resultados, el peso optimo de la placenta para una buena recolección debe ser igual o superior a 700 gramos, mientras que el peso del recién nacido debe ser superior a los 3200 gramos para la optimización de la colección de sangre de cordón.
También se ha estudiado la relación entre la edad gestacional y la calidad de la sangre colectada. Se determino que a mayor edad gestacional hay un aumento del volumen final y aumento de las células nucleadas. Sin embargo, el porcentaje de células CD34+ decrece, lo que debe ser considerado al determinar un criterio para la recolección de unidades de sangre de cordón en forma optima. ( Solves et al 2004)
En conclusión, los bancos de sangre de cordón pueden utilizar los diversos factores maternos y neonatales para mejorar u optimizar la calidad de la sangre de cordón a recolectar. Los datos sugieren que las unidades optimas no dependen de la raza, edad de la madre o sexo del bebe. Los resultados más óptimos se obtuvieron en la selección de madres primerizas o con su segundo alumbramiento, con edad gestacional menor o igual a 40 semanas y con un peso del recién nacido superior a los 3200 gramos.
Pruebas serologicas de los donantes de SCU.
La Circular para la Información del Uso de Productos Celulares para Terapia, que es preparada por un conjunto de instituciones competentes en el tema, entre ellas la American Association of Blood Banks y la American Society for Blood and Marrow Transplantation, propone una serie de pruebas a los donantes de SCU (American Association of Blood Banks(34).
Una muestra de sangre de la madre del recién nacido es sometida a pruebas serologicas para descartar una serie de agentes infecciosos, la que puede ser obtenida en el momento del parto o 7 días después de ello. Las pruebas son:
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• Virus de la inmunodeficiencia humana, tipo 1. • Virus de la inmunodeficiencia humana, tipo 2. • Virus de la hepatitis B.
• Virus de la Hepatitis C.
• Virus linfotropico de las células T Humano, tipo I. • Virus linfotropico de las células T humanas, tipo II. • Treponema pallidum (sífilis).
• Citomegalovirus.
La muestra de sangre de cordón alogénica es estudiada para:
• Grupo ABO y Rh.
• Antígenos HLA -A, -B y –DR.
• Electroforesis de hemoglobina solo en grupos étnicos con alto riesgo de hemoglobinopatias.
Obtención de células progenitoras a partir de la SCU.
Por largo tiempo, el mayor problema presentado por los banco de sangre de cordón umbilical fue el espacio requerido para el almacenamiento de cada unidad de sangre total no procesada. Los resultados de diversos métodos para reducir el volumen de la sangre total colectada han sido variados. Quillen et al., 1996 resumieron algunos de los métodos descritos en la literatura, ellos son:
- Uso de la separación por densidad por Ficoll/Hypaque (F/H), donde se ha demostrado recuperaciones sobre el 90 % de células mononucleares y células progenitoras ocupando rondas dobles de separación por densidad.
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- Separación basada en gelatina, donde los glóbulos rojos se dejan sedimentar y luego se sacan alícuotas del sobrenadante que son mezclados con igual volumen de gelatina al 3% repitiendo este procedimiento por lo menos 4 veces.
- Por selección de células CD34 +, donde se destaca: CEPRATE que en un sistema de inmunoadsorcion en donde las células CD34+ son capturadas por anticuerpos conjugados con biotína al pasar por una columna con avidína, estas reaccionan y las células son colectadas. AIS CELLector, las células mononucleares obtenidas por un gradiente de sedimentación son fijadas por acción de anticuerpos anti CD34 y por un proceso de lavado son colectadas, o bien, cultivadas en el AIS CELLector. ISOLEX es un sistema inmunomagnético con anticuerpos anti CD34 que se fijan a las células y cuando están cubiertas con partículas magnéticas son recolectadas a través de un separador magnético.
Rubinstein et al., 1995 reportaron una buena recolección de células progenitoras, usando la formación de rouleaux que es inducida por el hidroxietil almidón (HES) y posterior centrifugación para la reducción de los eritrocitos y el plasma. Estos investigadores mostraron que la recuperación celular a partir de la bolsa madre fue de un 91% de leucocitos y de un 98 % de células progenitoras. Una descripción detallada de esta técnica se encuentra en el ANEXO .
Un sistema cerrado para la reducción de volumen a través de la centrifugación diferencial es propuesto por Sousa et al.,1997. Los investigadores demostraron que con esta metodología se obtiene una buena recuperación de células mononucleares (81%) y de células CD34+ (87%) con una variación del volumen final entre 19 y 63 ml.
Armitage et al., 1999 publicaron un sistema cerrado semi-automatizado para la reducción de volumen de las unidades de sangre de cordón umbilical. El procedimiento consiste en la centrifugación a 3300 g por 12 minutos a 22 °C de una bolsa triple de colección. El buffy coat es separado por un equipo automático (Optipress II) a través de un protocolo programado en el equipo. La recuperación de células nucleadas fue de 91,6±16,8 %, células CD34+ de 96,2±13,9 % y CFU de 105,9±231,9 %. Es esencial que exista una buena separación en el proceso de centrifugación para una buena colección. El sistema
