Microbiología Ambiental Microbiología Ambiental
Practica de
Practica de LaboratorioLaboratorio
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Clara Omar Sánchez Castilla Clara Omar Sánchez Castilla
Código: 1124493459 Código: 1124493459 Ella Hernández Ella Hernández Código: 39461984 Código: 39461984 Andrés Daza Andrés Daza Código: 1065638850 Código: 1065638850 Grupo colaborativo Grupo colaborativo 358010_2 358010_2 Tutor Tutor
Francy Tatiana Peña Francy Tatiana Peña
Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD
Valledupar, Cesar Valledupar, Cesar
2017 2017
Practica N° 1. Bioseguridad en el laboratorio.
La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del área de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos, las cuales se describen a continuación:
Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente
cerrada.
Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica. Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del
laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.
Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estand o físicamente cómodo.
Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de
laboratorio.
Evitar llevar accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas). Recoger el cabello largo.
No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos
ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando
aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.
Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar éste desatendido. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de m anera
ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al profesor.
Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por
ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de Petri en las ollas de desecho, etc.
No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los
mismos y estar seguro de cómo emplearlo.
No devolver sustancias a sus envases originales. .
Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos
no autorizados.
Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado,
heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación
accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho.
Práctica N° 2. Reconocimiento del laboratorio y materiales de Microbiología.
Material Descripción Ilustración
Cajas de Petri Recipientes redondos que se usan para contener los medios de cultivo donde posteriormente se r ealiza la siembra.
Asas redondas Se usan para inocular muestras o bacterias puras en los medios de cultivo.
Tubos de ensayo Estos utensilios sirven para hacer experimentos o ensayos los hay en varias medidas y pueden ser de vidrio o de plástico.
Mechero Es un instrumento utilizado en los laboratorios científicos para calentar o esterilizar muestras o reactivos químicos.
Incubadora Se Usa para mantener a una temperatura constante los cultivos microbiológicos, y asegurar el crecimiento de los microorganismos.
Pipetas Se usan para tomar pequeños volúmenes de sustancias.
Microscopio Es un instrumento que nos permite observar entes demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.
Laminas y laminillas Se usan para depositar en ellos las muestras a observar al microscopio y para cubrir las m uestras que están sobre el portaobjetos.
Equipo de filtración por membrana (equipo millipore de
plástico)
Es un aparato que consiste de un disco incrustado (portafiltros) sostenido por soporte de goma o caucho y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado o una rampa múltiple de filtración.
Cuenta colonia Instrumento utilizado para contar colonias de
bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar
Práctica N° 3. Métodos de siembra
Procedimiento (parte A):
1. Desinfectamos el área de trabajo, prendimos el mechero y preparamos el material de trabajo. 2. Aislamos la bacteria en una agar nutritivo en caja Petri, con ayuda de un asa redonda, utilizando el
método de estría por agotamiento.
3. Incubamos a 37° por 24 horas para bacterias.
4. Terminado la siembra, marcamos las cajas en el borde de la base de la caja y envolvimos en papel vinipel.
5. Desinfectamos el área de trabajo, apagamos el mechero y entregamos el material. Procedimiento (Parte B: recuentos de ufc y diluciones)
La técnica utilizada hace referencia a los recuentos de microorganismos utilizando diluciones seriadas en base 10, donde se dispersa la población de microorganismos permitiendo conocer el número aproximado en una muestra.
1. Pesamos10 gramos de una muestra de agua residual, y la mezclamos con los 90 ml de agua peptonada.
2. Realizamos diluciones seriadas desde 10-1hasta 10-6. Esta técnica es simplemente una serie de diluciones simples que amplifican el factor de dilución rápidamente, comenzando con una pequeña cantidad inicial de muestra. La fuente del material para diluir en cada paso viene del
material diluido en el tubo anterior. En una dilución seriada el f actor de dilución total en cualquier punto es el producto del factor de dilución individual en cada uno de los tubos.
3. Tomamos las 6 cajas de Petri con agar y marcamos cada una con dilución 10-2 10-410-6 4. Sembramos las diluciones 10-2 10-410-6 tomando 0,1 ml de cada dilución por superficie, con
ayuda del rastrillo homogenizamos la microgota sobre la superficie del agar sin romperlo. 5. Incubar por 24 horas a 37°C y realizar el recuento.
6. Realizamos los cálculos y sacamos el promedio aplicando su respectiva formula.
Recuento
Nc (Numero de colonias) x fd (Factor de dilución) x 10 (Factor de corrección) = UFC (unidades formadoras de colonia). Muestra N° 1. (10-2) (116)(100)(10) = 116.000 UFC/ml muestra Muestra N° 2. (10-4) (248)(10.000)(10) = 24.800.000 UFC/ml muestra Muestra N° 3. (10-6) (638)(1.000.000)(10) = 638.0000.000 UFC/ml muestra
Practica N° 4. Técnicas de tinción
Procedimiento (Parte A Tinción de Gram para bacterias)
Para poder observar al microscopio los distintos tipos de microorganismos existen distintos tipos de coloraciones o tinciones que tienen afinidad con ciertas partes de la célula y permite diferenciarlas y observar algunos órganos de las células. Para el caso de bacterias la técnica más usada es la tinción de Gram, donde se permite clasificar las bacterias en Grampositivas (violetas) y Gramnegativas (Fucsias).
1. Tomamos una colonia de bacterias que los estudiantes y realizamos un frotis e n una lámina portaobjetos, colocando una gota de agua y con ayuda del asa redonda homogenizamos para
expandir el frotis en la lámina.
2. Secamos al aire libre la muestra y fijamos al calor la muestra en el mechero (se coloca 3 veces rápidamente sobre el fuego la lámina)
3. Una vez la muestra estuvo fijada colocamos varias gotas de cristal violeta, dejando por un minuto y luego lavamos en el grifo para quitar el exceso de colorante.
5. Colocamos una gota de alcohol acetona, dejamos por 15 segundos, lavamos.
6. Colocamos unas gotas de Fucsina de Gram, dejamos por un minuto, lavamos y dejamos secar la muestra.
7. Una vez seca la muestra agregamos una gota de aceite de inmersión y observamos en el microscópio en el objetivo de 100x.
8. Observamos las morfología:
Por sus características logramos identificar la bacteria como c ocos Gram (+), perteneciente al género Staphylococcus los cuales se agrupan en pares o racimos de uva, no móviles y no esporógenos, aerobios y facultativamente anaerobios. Su pared celular contiene dos principales componentes:
peptidoglicano y ácidos teicoicos, su crecimiento es rápido y abundante bajo condiciones aeróbicas, su temperatura óptimas es de 35 a 40ºC.
Procedimiento (Tinción de Azul de Lactofenol para hongos)
Para ver la morfología de los hongos filamentosos se utiliza la tinción de azul de lactofenol, la cual permite contrastar y ver las diferentes partes de un hongo (hifa, conidios, septos, etc.)
1. con las agujas de disección tomamos un trozo del hongo de un pan (tomamos micelio, parte algodonosa)
2. En una lámina portaobjetos colocamos una gota de azul de lactofenol.
3. Con ayuda de la aguja de disección, desglosamos la gota sobre las hifas, cubrimos con una lámina portaobjetos.
4. Observamos en el microscópio en el ob jetivo de 40x. 5. Observamos las estructuras:
En este hongo de pan, logramos identificar las hifas, la cual es la unidad vegetativa en la
estructura de los hongos, de forma filamentosa y de tipo tubular con paredes celulares, pudiendo presentar tabiques (hifas septadas) o no (hifas aseptadas) y que contienen en su interior citoplasma que viene a ser una sustancia similar a la clara de huevo junto con pequeñas estructuras con morfologías y funciones determinadas denominadas organoides.
En nuestro caso identificamos hifas aseptadas.
Práctica N° 5. Algunas técnicas aplicadas en microbiología ambiental.
La microbiología enfocada en la parte ambiental ha permitido diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrícola, en el ámbit o de la ingeniería ambiental y la industria.
Indicadores de contaminación de aguas potables
Los indicadores de contaminación son utilizados para medir el grado de contaminación o
afectación de cuerpos de agua. En Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un valor de 0 unidades formadoras de colonia en 10 0 ml de agua muestreada para el caso de Coliformes totales como indicador.
Procedimiento
1. Tomar 110 ml de agua del inodoro, la cual se inoculo con una asada de cultivo de E. coli, agitamos muy bien.
2. Colocamos la muestra en la parte superior de la campana de filtración permitiendo el paso del agua de un lado al otro.
3. Con unas pinzas estériles retiramos la membrana y colocaos sobre el agar nutritivo.
4. Incubamos por 24 horas a 37°C y observar el número de colonias con las características típicas de E. coli y Coliformes totales.
Los Coliformes son microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas. La mayoría de los
Coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los Coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas y contaminación de los cuerpos de agua.
La enzima característica de los Coliformes, ß-D-Galactosidasa se fija en el sustrato Salmon-GAL y es la causa del color rojo de los Coliformes.
La enzima característica de los E.coli, ß-D-Glucuronidasa se fija en el sustrato X-Glucuronida y es la responsable de que las colonias positivas E.coli presenten un azul oscuro o violeta.
Conclusiones
Esta práctica nos enseñó a diferenciar tipos de bacterias gracias a su coloración y por sus formas de agrupamiento, aprendimos a conocer su reacción ante los productos químicos, y conociendo sus propiedades ya que se puede diferenciar los tipos de bacterias a los de los hongos.
Referencias
Garces, A. (2008). Normas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiologia. Recuperado de, http://www.chlaep.org.uy/pdf/normas_de_bioseguridad.pdf
