Raíces transformadas

Texto completo

(1)
(2)

Metabolito

Género vegetal

Aplicación

Atropina

Hyoscyamus

Anticolinérgico

Berberina

Hydratis

canadensis

Antihemorrágico

uterino

Esteres

de

bornilo

Valeriana

Sedante

Ginsenósidos Panax ginseng

Tónico,

estimulante

Rotenona

Derris elliptica

Insecticida

Vincristina,

vinblastina

Catharantus

roseus

Antileucémico

Quinina,

quinidina

Cinchona

Antimalárico,

antirreumático

Reserpina

Rauwolfia

Antihipertensivo

(3)
(4)
(5)

El estudio de la bioquímica y la química

de las raíces ha estado siempre

acotado debido a las dificultades

técnicas derivadas de los hábitos

subterráneos de este órgano.

La posibilidad de contar con un sistema

de cultivo "in-vitro" se a tornado en una

herramienta sumamente útil a los fines

de investigación.

(6)

Agrobacterium rhizogenes …….

Bacteria del suelo gram negativa

(7)
(8)

La infección de muchas especies in-vitro con el

microorganismo patógeno Agrobacterium

rhizogenes permite obtener clones de raíces

estables y en condiciones axénicas

Mayoritariamente, los clones preservan la

capacidad biosintética de las raíces de las

plantas que les dieron origen

(9)

Las raíces neoplásicas producidas por A.

rhizogenes se caracterizan por :

su alto índice de crecimiento

y su estabilidad genética

Estos cultivos producen niveles de

metabolitos secundarios comparables a las

plantas intactas

(10)

Otra aplicación de los cultivos de raíces transformadas es

la

producción de proteínas bioactivas

Ej:

exoenzimas: peroxidasas en Brassica napus

quitinasas de acción antifúngica

glucanasas proteínas activantes de

ribosomas (RIPs)

También

es

posible

acumular

proteínas

de

almacenamiento

Ej:

sporamina en batata que también ha

demostrado jugar algún rol en procesos de

defensa.

(11)

Además los cultivos de raíces transformadas constituyen modelos

ideales para

realizar estudios metabólicos y regulatorios.

Por ejemplo con estos sistemas se ha demostrado que las raíces

pueden expresar capacidad fotosintética, llegando en algunos casos a

desarrollarse en ausencia de fuentes hidrocarbonadas, en total

fotoautotrofía.

Ya que la asimilación de carbono esta estrechamente afectada por la

producción de metabolitos secundarios estos sistemas son aptos para

analizar interacciones entre metabolismo primario y secundario.

(12)

Biología de la interación

Agrobacterium-planta

El único ejemplo conocido de

transferencia natural de ADN

(13)

•Can survive independent of plant host in the soil.

•Infects plants through breaks or wounds.

(14)
(15)

The genus Agrobacterium has a wide host

range:

n

Agrobacterium can transfer T-DNA to a broad group of plants

n

Individual Agrobacterium strains have a limited host range

n

The molecular basis for the strain-specific host range is

unknown

n

Many but

not all

the monocot plants can be transformed

n

Under lab conditions, T-DNA can be transferred to yeast,

(16)

Steps of Agrobacterium-plant cell

interaction

n

Cell-cell recognition

n

Signal transduction and transcriptional

activation of vir genes

n

Plasmidic DNA metabolism

n

Intercellular transport

n

Nuclear import

(17)
(18)

T-DNA

n

T-DNA carries genes involved in the synthesis of

plant growth hormones (

auxin

: auxin synthesis;

cyt

: cytokinin synthesis) and the production of

low molecular weight amino acid and sugar

phosphate derivatives called opines (

ocs

:

octopine;

mas

: mannopine; and

ags

: agropine).

n

Agrobacteria are usually classified based on the

type of opines specified by the bacterial T-DNA.

(19)

El T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped

Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb

esenciales para la transferencia

En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (

TR

) y la izquierda (TL)

Ambas codifican para

funciones rizogénicas

una vez integradas a la célula

huésped

La región

TR

especifica la síntesis de

agropinas y auxinas

Región

TL

porta cuatro loci que contienen los

genes rol (A,B,C y D)

implicados en el

desarrollo morfológico de las raíces

mediante la

sensibilización de las células al efecto auxínico

El gen

rol D

induce la formación de

tejido de callos

mientras que los

genes

rol A, B y C

regulan el

tamaño, grado de ramificación, alteraciones

de tropismo y demás características de las raíces en cabellera

(20)

Genes Rol A, B, C y D catabolismo de opinas Auxinas Opinas Región Vir Origen de Replicación

TL

TR

(21)

Los genes codificados en el T

Los genes codificados en el T--DNA presentan

DNA presentan

secuencias

secuencias

regulatorias

regulatorias eucarióticas

eucarióticas

que permiten su expresión en las

que permiten su expresión en las

plantas infectadas

plantas infectadas

En la región

En la región

Ti

Ti

hay también genes

hay también genes vir

vir cuya transcripción

cuya transcripción

induce la síntesis de compuestos

induce la síntesis de compuestos fenólicos

fenólicos como los que

como los que

liberan las plantas mecánicamente injuriadas como las

liberan las plantas mecánicamente injuriadas como las

acetosiringonas

acetosiringonas..

En ausencia de TR

En ausencia de TR--DNA los genes del TL

DNA los genes del TL--DNA dirigen la

DNA dirigen la

diferenciación hacia raíces en cabellera si hay suministro

diferenciación hacia raíces en cabellera si hay suministro

de auxinas exógenas.

(22)
(23)

Agrobacterium-host cell recognition

is a two-step process

1.Loosely bound step:

acetylated

polysaccharides are synthesized.

2.Strong binding step:

bound

bacteria synthesize cellulose

filaments to stabilize the initial

binding, resulting in a tight

association between

(24)

Plant Receptors are involved in initial binding

n

Plant vitronectin-like protein

(PVN, 55kDa) was found on the

surface of plant cell. This

protein is probably involved in

initial bacteria/plant cell binding.

n

PVN is only immunologically

related to animal vitronectin.

n

Animal vitronectin is an

important component of the

extracellular matrix and is also

an receptor for several bacterial

strains.

(25)
(26)

Plant signals

n

Wounded plants secrete sap with acidic pH (5.0 to 5.8) and a high

content of various

phenolic compounds

(lignin, flavonoid precursors)

serving as chemical attractants to agrobacteria and stimulants for vir

gene expression

n

Among these phenolic compounds,

acetosyringone

(AS) is the most

effective.

H3CO OCH3

OH COCH3

(27)

n

The plant phenolic compounds stimulate the

autophosphorylation of

a transmembrane receptor kinase VirA

at its His-474

n

It in turn

transfers its phosphate

group to the Asp-52 of the

cytoplasmic

VirG protein

(28)

n VirG then binds to the vir box

enhancer elements in the promoters of the virA, virB, virC, virD, virE and virG

operons, upregulating transcription.

(29)

Plant signals

n

Sugars

like glucose and galactose also stimulate vir gene expression

when

AS is limited or absent

n

Low opine levels

further enhance vir gene expression

in the

(30)

Structure of the T-DNA

n

Although

right border

and

left border

are

required to delimit the

transferred segments,

the T-DNA content

itself has no effect on

the efficiency of

transfer.

n

Therefore, researchers

replace most of the

T-DNA with T-DNA of

interest, making

Agrobacterium a vector

for genetic

transformation of

plants.

(31)

Production of T-strand

n Every induced Agrobacterium

cell produces one T-strand.

n VirD1 and VirD2 are involved

in the initial T-strand

processing, acting as site-and strand-specific

endonucleases.

n After cleavage, VirD2

covalently attaches to the 5’ end of the T-strand

(32)

Formation of the T-complex

n

The T-complex is composed of

at least three components:

n

one

T-strand DNA

molecule,

n

one

VirD2 protein

,

n

and around

600 VirE2 proteins

n

Whether VirE2 associates with

T-strand before or after the

intercellular transport is not

clear

.

(33)

Formation of the T-complex

n

Judging from the size of

the mature T-complex

(

13nm in diameter

) and

the inner dimension of

T-pilus (

10nm width

), the

T-strand is probably

associated with VirE2 after

intercellular transport.

(34)

Plant Nuclear Import

n

Because the large size of

T-complex (50,000 kD, ~13nm in

diameter), the nuclear import

of T-complex requires active

nuclear import.

n

The T-complex nuclear import

is presumably mediated by the

T-complex proteins,

VirD2

and

VirE2

. Both of them have

nuclear-localizing activities.

(35)

Nuclear Import

n VirD2 is imported into the cell

nucleus by a mechanism

conserved between animal, yeast and plant cells (bipartite

consensus motif).

n VirE2 has a plant-specific nuclear

localization mechanism. It does not localize to the nucleus of yeast or animal cells.

n In host plant cells VirD2 likely

cooperate with cellular factors to mediate T-complex nuclear import and integration into the host

(36)
(37)
(38)

T-DNA integration is not highly

sequence-specific

n

There are

no obvious site preference

for

integration throughout the genome.

n

About 40% of the integrations are in

(39)
(40)

Opinas sintetizadas por plantas infectadas con Agrobacterium rhizogenes serie octopina serie nopalina serie manopinas serie agropinas Derivan de Arg Derivan de Glu

(41)

Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el

Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el

Agrobacterium

Agrobacterium pero no por la planta

pero no por la planta

su síntesis determina una desviación energética del

su síntesis determina una desviación energética del

vegetal en provecho de la bacteria

vegetal en provecho de la bacteria

En muchos casos las opinas son el

En muchos casos las opinas son el metabolito

metabolito más

más

importante de las células afectadas, constituyendo hasta

importante de las células afectadas, constituyendo hasta

un 7 % del peso seco total

un 7 % del peso seco total

En un proceso de infección normal las opinas son

En un proceso de infección normal las opinas son

secretadas al suelo y son

secretadas al suelo y son catabolizadas

catabolizadas por los

por los

Agrobacterium

Agrobacterium de vida libre

de vida libre

(42)

Establecimiento de cultivos de raíces transformadas

•Se deben preparar suspensiones de A. rhizogenes de 48 h. de edad cultivado entre 25-26°C, puesto que a temperaturas mayores de 28°C pueden provocar la “cura” de la bacteria de su plásmido.

•Acondicionar los explantos a infectar que pueden ser órganos de plantas silvestres o preferentemente plántulas estériles.

•Provocar cortes con una jeringa hipodérmica conteniendo la suspensión de A.

rhizogenes sobre la superficie de los explantos y cultivar.

•A los 7-14 días, cuando las raíces emergentes tengan de 5-10 mm de longitud, seccionarlas, separarlas del explanto y colocarlas en medio de cultivo apropiado (B5, LS o MS de media fuerza (La mitad de la concentración salina) con 30g/l de sacarosa y 0.5 mg/ml de sulfato de ampicilina).

•Subcultivar cada dos semanas en el mismo medio utilizando inóculos de 3 a 4 cm de longitud con ramificaciones laterales.

(43)

The growth medium has a significant effect

on hairy root induction.

•High salt

media such as LS or MS favors

hairy root formation in some plants but not

in others.

•Low salt

media such as B5 favor excessive

bacterial multiplication in the medium and

therefore the explant needs to be

transferred several times to fresh antibiotic

containing medium before incubation.

(44)

•Suboptimal

concentrations may

result in lower availability of bacteria

for transforming the plant cells

•High

concentrations may decrease it

by competitive inhibition

(45)

Hairy roots induced from the leaf explants on growth regulator-free Murashige and Skoog medium (MS) 20 days after infection by

Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (scale bar

(46)

Detection of agropine(A) and mannopine (M) and neutral sugars (NS) by paper electrophoresis in extract of two hairy root cultures.

Lane 1 agropine and mannopine standards

Lanes 2 and 3 hairy root cultures

Lane 4 non-transformed control roots of sterile plants

(47)

PCR was performed with primers for the rooting locus genes rolC

(lanes 1–5) and rolB (lanes 6–11).

Lanes 1–4 and lanes 6–9 fragments from hairy roots Lanes 5 and 10 fragments from control roots

Lane 11 control without template DNA

Lane 12 marker (1 kb DNA ladder)

These results indicated that the rolB and rolC genes from the Ri plasmid of A.

rhizogenes ATCC15834 were integrated into the genome of P. phaseoloides

hairy roots.

(48)

A Sterile hairy roots of Pueraria phaseoloides cultured on solid, growth regulator-free MS medium for 18 days (scale bar 2.5 cm).

B Sterile hairy roots in liquid MS medium, cultured for 10 days (scale bar 2.2 cm)

(49)

Hairy roots are fast growing and plagiotropic

•They require no external supply of growth hormones

•The plagiotropic characteristic is advantageous as it

increases the aeration in liquid mediumand roots grown

in air have an

elevated accumulation of biomass.

(50)

Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se pueden desarrollar a partir de pequeños inóculos y obtener buenos índices de crecimiento.

El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales ya que la agitación mecánica causa injurias que conducen a la formación de callos.

(51)

Debido a las ramificaciones las raíces forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro de oxígeno.

En los medios líquidos se forman esferas de raíces con las raicillas jóvenes en

crecimiento sobre la periferia y un corazón de tejido viejo en el interior

La restricción nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxígeno da origen a un “bolsillo” de tejido senescente

(52)
(53)

Las principales

ventajas

de utilizar cultivos de raíces transformadas, en

cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar

de cultivos dediferenciados son:

•Con estos sistemas

no

son necesarios medios suplementados con

fitorreguladores para desarrollar biomasa

•Las raíces transformadas

crecen rápidamente, son robustas y

vigorosas

•Sintetizan metabolitos secundarios

característicos de las raíces de las

plantas de las cuales provienen

•La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles

puesto que, a diferencia de los cultivos de células indiferenciadas, son

genéticamente estables por períodos prolongados de cultivo

•El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y tiene

potencialidad para desarrollarse en biorreactores, ampliando la

posibilidad de aplicación industrial de estos procedimientos

(54)

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