Modulo II Unidad 1 Control microbiologico acabados 2016.pdf

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MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 1 de 51

MÓDULO II: UNIDAD 1

CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL PRODUCTO ACABADO

Y SEMIELABORADO

Introducción y Objetivos de la Unidad

Según el Reglamento 1223/2009 sobre productos cosméticos, el fabricante de dichos productos es el responsable de su seguridad. Esto significa que, desde el punto de vista microbiológico, el producto situado en el punto de venta debe tener un número bajo de microorganismos y estar libre de algunos específicos. Por otra parte, debe asegurarse de que los microorganismos que puedan llegar al producto cosmético durante su uso habitual no proliferarán afectando adversamente a su calidad y seguridad, es decir, de que esté bien conservado.

El riesgo dependerá de la capacidad que tenga el producto de albergar un crecimiento microbiano; como veremos en el Módulo IV, la probabilidad de que algunos productos cosméticos se contaminen es extremadamente baja, debido a características fisicoquímicas como una baja actividad de agua, un pH extremo, etc. En estos casos el producto estaría exento de análisis microbiológico. Sin embargo, la mayoría de cosméticos ofrece condiciones óptimas para la proliferación microbiana, como agua, nutrientes y otros factores de crecimiento. Además, las condiciones de fabricación y almacenamiento a temperatura ambiente, el pH alrededor de la neutralidad, la humedad relativa a la cual pueden almacenarse y las condiciones de utilización por parte de los consumidores hacen que sean un medio óptimo para el crecimiento microbiano, lo que puede suponer un peligro para el consumidor y un deterioro de las características del producto. Para evitarlo, la calidad del producto acabado se debe asegurar mediante la aplicación de unas Buenas Prácticas de Fabricación (BPF, Módulo III) durante la producción – además del control de las materias primas, la utilización de conservantes y estrategias de conservación adicionales (Módulo IV) y el control microbiológico del producto semielaborado y acabado, que es el objetivo que ahora nos ocupa.

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En esta Unidad nos centraremos en el control microbiológico utilizando las técnicas clásicas de Microbiología y en base a la Normativa UNE-EN-ISO. Haremos un especial énfasis en la comprobación de la idoneidad o aptitud de los métodos de recuperación de microorganismos, aspecto imprescindible en cualquier análisis microbiológico en Cosmética. Además, conoceremos los límites de contenido microbiano que recomiendan diferentes Organizaciones, ante la carencia de legislación en este aspecto.

Los objetivos de esta Unidad son, por tanto:

- Conocer los principales tipos de microorganismos que pueden contaminar un producto cosmético según sus características.

- Saber cómo se realiza un muestreo para el análisis microbiológico.

- Saber cómo se lleva a cabo el análisis microbiológico completo de una muestra cosmética y cuáles son los requerimientos aconsejados en cuanto a contenido microbiano para comercializar los productos acabados.

- Saber cómo se realizan los ensayos de aptitud de los métodos descritos y reconocer la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización de los conservantes.

Índice de la Unidad

1. Generalidades ... 3

2. Normativa aplicable ... 6

3. Muestreo ... 9

Producto semielaborado (granel) ... 9

Producto elaborado (unidades envasadas) ... 10

Preparación de las muestras ... 12

4. Recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras ... 15

Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad) ... 16

En superficie o por extensión ... 17

Filtración a través de membrana ... 18

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5. Detección de microorganismos aerobios mesófilos (enriquecimiento) ... 21

6. Detección de microorganismos patógenos ... 22

Detección de Escherichia coli ... 23

Detección de Staphylococcus aureus ... 24

Detección de Candida albicans ... 26

Detección de Pseudomonas aeruginosa ... 27

7. Comprobación de la idoneidad del método (neutralización y recuperación) ... 28

Validación y neutralización. Generalidades ... 28

Idoneidad del método de siembra por inclusión ... 31

Idoneidad del método de la siembra en superficie ... 35

Idoneidad del método de filtración a través de membrana ... 35

Idoneidad del método de detección de bacterias mesófilas aerobias y hongos por enriquecimiento... 36

Idoneidad del método de detección de microorganismos patógenos ... 37

Interpretación de los resultados de los ensayos de idoneidad ... 40

Validación de un método alternativo ... 40

8. Límites ... 41

UNE-EN ISO 17516:2014. ... 41

SCCS, Scientific Committee on Consumer Safety- Europa ... 42

USA (PCPC, Personal Care Product Council) ... 42

Farmacopea Europea / USA ... 42

España. Ministerio de Sanidad y Consumo. ... 43

9. Bibliografía ... 44

Anexo 1... 46

Anexo 2... 49

Anexo 3... 51

1. Generalidades

El control microbiológico de los productos cosméticos es de suma importancia para garantizar la seguridad del consumidor y también para mantener la calidad del cosmético, sobre todo de cara a la imagen de la empresa que los comercializa.

En los años 60 los problemas microbiológicos se centraban en evitar el crecimiento visible de mohos en la superficie de los productos, pero en 1969 un informe de la FDA (Food and Drug Administration - USA) mostraba que el 25% de los cosméticos estaban contaminados y que predominaban las bacterias Gram negativas. A partir de

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ahí, la CTFA (Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association) en el mismo país creó comités para la garantía de calidad microbiológica de los productos cosméticos para estudiar la situación y redactar guías sobre Microbiología y también sobre Buenas Prácticas de Fabricación para la industria.

En la segunda mitad de los años 70, la atención se focalizó en los cosméticos que se aplican alrededor de los ojos, después de que hubiera habido casos de ceguera producidos por máscaras de pestañas contaminadas con Pseudomonas aeruginosa. Debido a ello, se desarrollaron los ensayos de eficacia conservante (Challenge Tests), que veremos en el Módulo IV. Actualmente, se han dado casos de infecciones en hospitales debidas a colutorios contaminados por Burkholderia en personas inmunodeprimidas.

Los microorganismos más habituales que pueden contaminar los productos cosméticos de base acuosa (champús, geles de baño, lociones, acondicionadores capilares, etc.) son bacterias Gram negativas, tanto si el origen es el entorno de fabricación como si es en su utilización por el consumidor (ver Tabla I), ya que habitan principalmente en lugares con presencia de agua. Entre las bacterias Gram negativas, son de especial importancia las que pertenecen a la familia de las pseudomonadáceas (géneros Pseudomonas, Burkholderia, Xanthomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, etc.). Son microorganismos que se adaptan fácilmente a cualquier ambiente, siempre que éste sea acuoso. Su principal origen es el agua de fabricación o materias primas diluidas en agua, como las soluciones de tensioactivos, opacificantes, polímeros, etc. Pueden metabolizar virtualmente casi cualquier sustrato; como ejemplo, Burkholderia cepacia es capaz de metabolizar hasta 100 moléculas orgánicas conocidas. También, dentro del grupo de Gram negativas, es fácil aislar enterobacterias como las del género Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, Klebsiella, etc. No son tan flexibles metabólicamente como las anteriores, pero también se encuentran frecuentemente en ambientes acuosos.

Los microorganismos Gram positivos no son tan versátiles como las bacterias Gram negativas y en productos con tensioactivos (aniónicos y particularmente catiónicos) es difícil encontrarlos, puesto que sus formas vegetativas son muy sensibles a ellos, así como a los conservantes más comúnmente utilizados en cosmética. Pueden aparecer como esporas (bacilos esporulados) en productos que no se han fabricado en

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condiciones higiénicas o con materias primas contaminadas y, sobre todo, en productos pulverulentos, que pueden ser fuente de infección por Clostridium. Por otra parte, la presencia de estafilococos o micrococos (microorganismos de la piel) indicaría una manipulación humana deficiente.

Tabla I. Microorganismos aislados, de mayor a menor frecuencia, en los productos

cosméticos dependiendo del origen.

Origen: consumidor Origen: fabricación

Bacterias

Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Pseudomonas spp B. picketti Stenotrophomonas maltophilia Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Pseudomonas spp Moraxella spp Acinetobacter spp Enterobacter spp Moraxella spp Citrobacter freundii Enterobacter spp Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii

K. oxytoca Klebsiella pneumoniae

Serratia spp K. oxytoca

Staphylococcus aureus Serratia marcescens S. epidermidis Serratia spp

Sarcina spp Salmonella spp

Propionibacterium spp Ochrobacterium anthropi Corynebacterium spp Proteus spp

Streptococcus mutans Aeromonas sobria

Bacillus spp Bacillus spp

Clostridium perfringens C. tetani

Hongos

Candida albicans Candida lipolytica Rhodotorula spp Saccahromyces

cerevisiae Penicillium spp Penicillium spp

Aureobasilium pullulans Aureobasidium pullulans Scopulariosis spp Paecilomyces variotii

Tras las bacterias Gram negativas, los mohos y levaduras son la causa más frecuente de contaminación de productos cosméticos. Estos microorganismos los encontraremos en productos con una baja actividad de agua, como pomadas, ceras, etc. y serán indicativos de un ambiente poco higiénico o de materias primas/material de acondicionamiento contaminados. Los mohos crecen siempre en la superficie de los productos de una forma característica (requieren oxígeno para su crecimiento) y es

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una de las causas que peor imagen generan de la empresa cosmética. Los hongos, además, siempre prefieren un ambiente ácido para su proliferación.

La Tabla II recoge una lista de los productos cosméticos retirados del mercado europeo en el periodo 2005-2008. Como se puede observar, las bacterias Gram negativas, y en concreto P. aeruginosa, son las más frecuentemente aisladas.

En general, los productos con un pH alrededor de la neutralidad será donde podamos encontrar microorganismos patógenos, mientras que en productos de pH entre 3 y 10 podremos encontrar también microorganismos alterantes.

Tabla II. Productos retirados del mercado europeo por contaminación microbiana en el periodo

2005-2008. Lundov and Zachariae, 2008.

2. Normativa aplicable

Los métodos de control microbiológico aquí descritos se basan en el recuento de bacterias aerobias mesófilas y hongos (mohos y levaduras), y en la detección de los patógenos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y

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Candida albicans. En según qué casos, además de determinar cuántos microorganismos hay en una muestra, es necesario detectar cualquier microorganismo que esté presente (patógeno o no) aun a niveles muy bajos, por lo que se aconseja el método de enriquecimiento. No existe ningún método oficial de control microbiológico de cosméticos a día de hoy; los métodos descritos en esta Unidad están basados en las siguientes Normas ISO (International Standard Organization), a su vez Normas UNE-EN, aunque se pueden seguir otros (Farmacopeas, Ministerio de Sanidad, etc.).

- UNE-EN ISO 21148:2010 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

- UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. Microbiología. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas.

- UNE-EN ISO 16212:2011. Cosméticos. Microbiología. Enumeración de levaduras y mohos. - UNE-EN ISO 18415:2012 Cosméticos. Microbiología. Detección de microorganismos

específicos y no específicos.

- UNE-EN ISO 18416:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Candida albicans. - UNE-EN ISO 21150:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Escherichia coli.

- UNE-EN ISO 22717:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Pseudomonas aeruginosa.

- UNE-EN ISO 22718:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Staphylococcus aureus. - UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. Microbiología. Directrices para la evaluación del

riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico.

En el Cuadro 1 se explica la importancia de cada grupo de Normas y lo que han aportado al campo de la Microbiología Cosmética, ya que hasta su publicación no había un consenso acerca de cómo realizar los ensayos microbiológicos a nivel global. Dos de las premisas que siempre marcan las Normas es que puedan ser llevadas a cabo por cualquier empresa, por limitados recursos que tenga, y estandarizar las técnicas microbiológicas. Se intenta, a su vez, que todas las Normas estén coordinadas entre sí.

Cuando se realizan los ensayos para determinar la contaminación microbiológica es indispensable asegurar que cualquier conservante presente en la muestra ha sido inactivado. En caso contrario, llegaríamos a interpretaciones erróneas de los recuentos

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o detecciones obtenidos. Por ello, debe confirmarse previamente la validez del método de recuento y de la detección de patógenos mediante una comprobación de la idoneidad de los neutralizantes y del método utilizado (ver apartado 7).

Cuadro 1

Los objetivos de las Normas ISO de Microbiología Cosmética y algunas de las aportaciones a este campo se listan a continuación:

UNE-EN ISO 21148:2010. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

El objetivo es asegurar que las técnicas generales que se utilizan para llevar a cabo los exámenes microbiológicos en productos cosméticos sean las mismas en todos los laboratorios que las adopten. Algunas de las aportaciones importantes que se encuentran en el texto son:

- Recomendación de cómo tienen que ser las instalaciones y equipamiento.

- Preparación de los equipos y del material de laboratorio, esterilización, almacenamiento.

- Prevención de Riesgos Laborales del personal del laboratorio y de prevención de contaminación del medio ambiente.

- Obtención de resultados homogéneos. Exigencia de rigor en el cálculo. - Exige la formación del personal.

- Es factible utilizar procedimientos alternativos siempre que se demuestre su equivalencia. - Anexos referentes a técnicas de identificación, recuento y siembra y estandarización de inóculos.

UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. Microbiología. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas. UNE-EN ISO 16212:2011. Cosméticos. Microbiología. Enumeración de levaduras y mohos

Muestran las directrices generales para la detección y enumeración de microorganismos mesófilos aerobios (bacterias, hongos) presentes en los productos cosméticos:

- Mediante el recuento de colonias en agar no selectivo después de la incubación aeróbica o bien,

- Mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después de un enriquecimiento. Las aportaciones más importantes de estas dos Normas son:

- Importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización. - Se pueden utilizar otros métodos (rápidos) siempre que se validen.

- Aconseja llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico con el fin de determinar si la Norma es aplicable. - Incluye un capítulo de ejemplo de cálculo de resultados, ejemplos de diluyentes y medios de cultivo y un Anexo de

los neutralizantes de moléculas antimicrobianas.

UNE-EN ISO 18416:2015; UNE-EN-ISO 21150:2015; UNE-EN ISO 22717:2015; UNE-EN ISO 22718:2015; UNE-EN ISO 18415:2012: Normas acerca de la detección de patógenos y microorganismos específicos y no específicos.

Al igual que las dos Normas anteriores, este grupo incluye la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización, la premisa de pueden utilizarse otros métodos siempre que se validen y el consejo de llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico previo, con el fin de determinar si las Normas son aplicables.

UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. Microbiología. Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico.

Esta Norma era necesaria, ya que asesora a la industria y a las autoridades reguladoras en la definición de productos acabados que presentan un bajo riesgo de contaminación durante su producción y/o uso, después de efectuar un análisis de riesgos y a juicio de un profesional. Incluye también la premisa de poder evaluar el riesgo en base al historial del producto, por experimentos que lo demuestren o por referencias bibliográficas.

El resultado del análisis de riesgos permite determinar qué nivel de análisis es necesario para asegurar la calidad del producto, o incluso concluir que la aplicación de rutina de las Normas Internacionales de Microbiología para cosméticos no es necesaria. Esta Norma no la desarrollaremos en esta Unidad, sino en el Módulo IV.

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Para el recuento de microorganismos aerobios y detección de patógenos puede utilizarse el método de siembra en placa o el método de filtración a través de membrana. Este último método es útil si la muestra presenta propiedades inhibidoras del crecimiento microbiano que no pueden neutralizarse o diluirse adecuadamente, o bien para muestras que presentan una contaminación microbiana muy baja. Es aconsejable también para el análisis del agua como materia prima (Módulo II, Unidad 3).

En el anexo 1 se detallan los diluyentes y medios de cultivo aconsejados para los análisis y en el anexo 2 los neutralizantes recomendados, ambos según Normativa ISO. La Normativa también contempla la utilización de cualquier otro medio de cultivo, diluyente, medio neutralizante, etc., siempre que se haya demostrado previamente su idoneidad en la recuperación de los microorganismos para el método escogido.

Para la realización de los ensayos es muy aconsejable tomar como referencia, para el trabajo en el laboratorio microbiológico, la Norma UNE-EN-ISO 21148: Instrucciones generales para el examen microbiológico.

3. Muestreo

La empresa cosmética debe tener definido, por escrito y aprobado un plan de muestreo, dependiendo del tipo de producto y condiciones de fabricación y envasado. Además, debe tener establecida la caducidad de los análisis del producto semielaborado y un plan de actuación en caso de obtener Resultados Fuera de Especificaciones (OOS) o, específicamente en Microbiología, Microbial Data Deviations (MDD), en graneles y producto acabado. También es muy importante guardar muestras representativas del producto acabado en la muestroteca, pero también de graneles, ya que nos puede ayudar posteriormente a la investigación de alguna desviación. Estos temas los estudiaremos en el Módulo III (Buenas Prácticas de Fabricación).

Producto semielaborado (granel)

Algunas de las instrucciones que deben seguirse para conseguir una muestra representativa de un granel serían las siguientes:

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- La extracción de muestras se debe realizar con utensilios limpios (espátulas, cucharas, sacamuestras, etc.), de material inerte (acero inoxidable, plástico o vidrio) y estéril.

- La cantidad de muestra a extraer debe ser la suficiente como para realizar los análisis por triplicado de forma separada.

- Se debe tomar una muestra por cada partida de producto granel y la toma se debe

realizar por las válvulas o bocas de acceso al reactor o depósito fijo o móvil, siempre que esté asegurada la homogeneidad del producto. En el caso de que la homogeneidad no esté asegurada o se requiera un nivel exhaustivo de control microbiológico (definido más adelante para el producto acabado) debería analizarse muestras de la parte inferior y superior del reactor o depósito.

- Si la muestra se ha extraído de un contenedor, éste debe señalizarse colocándole un adhesivo de muestreo.

- Las muestras extraídas se deben identificar convenientemente, indicando como mínimo el nombre o referencia interna, lote, parte del contenedor de donde se ha extraído, fecha de muestreo y firma de la persona que realiza el muestreo.

Producto elaborado (unidades envasadas)

En el anexo 3 se muestra una tabla de unidades a muestrear dependiendo del tamaño del lote, según UNE-ISO 2859-1:2012. Procedimientos de muestreo para la inspección por atributos. Parte 1: Planes de muestreo para las inspecciones lote por lote, tabulados según el nivel de calidad aceptable (NCA). En la práctica, en lotes de producción formados por un número elevado de unidades, no es posible realizar el número de análisis que se muestra en dicha tabla, por lo que, en general, se establecen diferentes niveles de muestreo que dependen de varios factores o de niveles de actuación previamente establecidos.

A la hora de realizar el muestreo se debe tener en cuenta que es necesario disponer de unidades tomadas en diferentes momentos del envasado para que éstas sean lo

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más representativas posibles de un lote. Basándonos en esta premisa y únicamente como ejemplo, podríamos definir un nivel mínimo de muestreo, de la siguiente forma:

- Toma de 2 unidades al inicio del envasado del lote, 1 unidad a la mitad y 1 unidad al final.

Sin embargo, factores como el volumen del lote, proceso de fabricación en continuo, paros o averías en la línea durante el envasado de un producto, hacen recomendable incrementar el nivel de muestreo de la siguiente manera:

- Cuando el envasado de un lote de producto puede durar más de 1 turno (8 h), por ejemplo, en un lote de producto de gran volumen almacenado en depósito de elevado tonelaje o fabricaciones en continuo, se recomienda tomar 2 unidades al inicio, 1 unidad cada 2 h y 1 unidad al final del envasado.

- Si el producto a granel que se va a envasar está almacenado en varios depósitos/recipientes de baja capacidad (por ejemplo, contenedores de 100, 200 o 1000 kg), y siguiendo el mismo criterio definido anteriormente, se recomienda tomar unidades que proceden de cada uno de los depósitos que forman parte del mismo lote.

- Cuando se está envasando y se produce un paro/avería en la línea durante un periodo de tiempo superior a 2 h, al reiniciar de nuevo el envasado se recomienda tomar 2 unidades y seguir con la pauta establecida.

En caso de un nivel exhaustivo pueden multiplicarse las muestras por dos. Dicho control más exhaustivo estaría justificado cuando:

- Es una primera fabricación de un producto o se ha cambiado algún ingrediente relevante.

- Es un producto destinado a población especialmente sensible (bebés, personas inmunodeprimidas (hospitales), pieles atópicas, ancianos, higiene íntima, etc.).

- Ha habido problemas de contaminación previos.

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- Se ha realizado alguna actuación en la maquinaria de producción/envasado.

Por el contrario, ciertos productos no requieren un control tan exhaustivo, como los clasificados de bajo riesgo microbiológico. Este tema lo estudiaremos en el Módulo IV, Unidad 2.

Preparación de las muestras

Todas las operaciones de toma de muestra y de homogenización de la misma deben realizarse en las máximas condiciones de asepsia, con el fin de evitar contaminaciones externas:

- La muestra debe procesarse en una cabina de seguridad biológica (CSB) y llevar guantes.

- Debe desinfectarse la parte externa del envase de la muestra con etanol preparado al 70% antes de la toma de muestra.

- En todas las operaciones posteriores, deben utilizarse materiales estériles o asépticos (jeringuillas, espátulas, cuchillas, etc.) y condiciones que aseguren que no se contamina la muestra durante el ensayo.

En este punto, cabe decir que, si el procedimiento de análisis implica la combinación o mezcla de muestras, este proceso sólo se debe realizar en el laboratorio y utilizando material nuevo y estéril para cada muestra. Este procedimiento es necesario sobre todo en el caso de productos de un volumen pequeño, como máscaras, monodosis etc. pero también puede realizarse con las muestras que provienen de un mismo momento de envasado.

Acondicionamiento

La gran cantidad de tipos de muestras que existen en la industria cosmética hace que el acondicionamiento y la dilución, suspensión o dispersión de la muestra sean tareas en algunos casos no muy sencillas, ya que, sean cuales sean las características de la muestra, ésta debe poderse procesar de modo que no dañe a los posibles

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microorganismos presentes y, por supuesto, en condiciones de máxima asepsia. Algunas de las acciones que se pueden realizar son las siguientes:

- Los líquidos, geles, cremas y polvos se deben agitar bien dentro de su envase primario con ayuda, si es necesario, de espátulas estériles.

- Los polvos compactos deben disgregarse antes de mezclarlos, en un mortero estéril con bolas de vidrio estériles.

- Las pastillas de jabón y otras muestras moldeadas se cortan con cuchilla estéril.

- En el caso de aerosoles, se desecha la primera parte de la muestra, se pulveriza directamente dentro de un recipiente estéril y se diluye posteriormente.

- En el caso de espumas, se deja reposar la muestra después de pulverizarse en un recipiente estéril para que desaparezca el gas y se diluye posteriormente.

- En el caso de toallitas cosméticas o parches, éstos se extraen de su envase y se sumergen en el caldo neutralizante. Puede realizarse, en paralelo, un análisis del líquido escurrido si estos soportes se encuentran humedecidos.

Dilución

Consiste en pesar o medir la muestra y diluir, disolver o suspender en el diluyente estéril apropiado, es decir, que no tenga actividad biocida, y siempre en condiciones asépticas. La muestra diluida debe procesarse, por cualquiera de los métodos que luego se describen, antes de 45 min.

En el caso de que sospechemos que existe una elevada contaminación, se deben realizar diluciones decimales sucesivas en el diluyente escogido, con el fin de obtener un número de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) comprendido entre los límites recomendados (30-300 UFC/placa).

La dilución 1/10 es la recomendada para el análisis. Sin embargo, puede suceder que esta dilución no sea la idónea para neutralizar las moléculas antimicrobianas del producto y recuperar los microorganismos que pueden estar presentes en la muestra,

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por lo que se deberá aumentar el volumen de diluyente (o reducir la cantidad de muestra) o probar diferentes neutralizantes. Este hecho se determina tras efectuar los ensayos de idoneidad (apartado 7), que deben realizarse antes de los análisis de recuentos o detecciones de microorganismos. También puede ser necesario realizar una dilución más alta cuando la muestra no permita, por su naturaleza, una dilución 1/10. Por otra parte, puede realizarse una composición de muestras, por ejemplo las tres unidades del inicio del proceso de envasado y así sucesivamente, siempre en condiciones de asepsia, como hemos visto antes.

Muestras miscibles en agua

El proceso sería como sigue:

- Diluir a una concentración 1/10 en un diluyente con neutralizantes y agitar hasta su completa solubilización. Es recomendable que la cantidad de muestra sea de, al menos, 1 g. Para pesar la muestra pueden utilizarse espátulas estériles, o jeringas desechables. A veces es útil disgregar la muestra aspirando con la propia jeringa varias veces la muestra en el diluyente.

- Dejar la muestra en contacto de 15 a 20 minutos (el que se haya determinado) para asegurar la completa inactivación de los conservantes. Los compuestos neutralizantes recomendados figuran en el anexo 2, aunque en general todos los caldos neutralizantes que se comercializan contienen ya los neutralizantes más usuales.

- Si la muestra no presenta conservantes, puede diluirse directamente en agua de peptona tamponada estéril.

Muestras grasas

Mezclar la muestra inicial con 5 g de polisorbato 80 estéril precalentado a una temperatura de 40ºC. En este punto, puede mantenerse esta temperatura hasta obtener una mezcla homogénea no más de 10 minutos, removiendo con una espátula estéril. Añadir la cantidad de diluyente (por ejemplo, agua de peptona tamponada) necesaria para completar un volumen final para una dilución 1/10, calentada previamente a 40ºC, y formar una emulsión.

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Muestras pulverulentas

Tomar la cantidad de muestra necesaria y suspender en el diluyente apropiado. Antes de realizar la siembra, agitar de nuevo la muestra.

Otro tipo de muestras

En el caso de otro tipo de muestras, por ejemplo toallitas o parches, suspenderlos en el peso adecuado de diluyente neutralizante para conseguir una dilución 1/10. Si la muestra no contiene conservantes, es aconsejable añadir un tensioactivo no iónico, como el polisorbato 80, para facilitar el desprendimiento de los posibles microorganismos de la muestra.

4. Recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras

Las bacterias mesófilas aerobias son microorganismos que pueden desarrollarse en un medio nutritivo a 30-35ºC en condiciones aerobias. Dentro de este grupo podemos encontrar microorganismos patógenos, ya que pueden crecer en estas condiciones. Sin embargo, lo más habitual es que se detecten microorganismos no patógenos para el ser humano pero que pueden alterar las características organolépticas del producto cosmético. Dentro de este grupo de microorganismos encontramos bacterias de la familia de las psedomonadáceas, enterobacterias, estafilococos coagulasa negativos, especies de Bacillus, etc.

En el caso del recuento de mesófilos aerobios pueden detectarse colonias de hongos además de bacterias en el medio de cultivo para el recuento. En el caso del recuento específico de hongos, ya que los medios aconsejados contienen cloranfenicol, detectaremos éstos de forma selectiva.

La metodología para el recuento de estos microorganismos dependerá del tipo de muestra a analizar y la sensibilidad que escojamos. Cada una de estas metodologías se describe a continuación.

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MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 16 de 51 Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad)

La siembra en masa consiste en mezclar una alícuota de la muestra (o de una dilución de la misma) con un medio nutritivo no selectivo que contenga agar (ver medios sólidos para el recuento en el anexo 1). Se deja solidificar y se incuba el tiempo suficiente para que se desarrollen colonias microbianas, que indicarán el número de microorganismos cultivables presentes en la muestra. Brevemente, el método es como sigue:

- De la muestra diluida, tomar 1 ml y depositarlo en una placa Petri vacía, previamente rotulada en su base con el número de referencia de laboratorio, la dilución sembrada y la fecha de análisis. Deben sembrarse, como mínimo, dos placas por dilución.

- Añadir unos 20-25 ml del medio sólido para el recuento adecuado, fundido y mantenido a 48±3º C.

- Mezclar por rotación la muestra con el agar, evitando mojar la tapa de la placa, y dejar solidificar.

- Incubar las placas en posición invertida a 32,5 ± 2,5ºC durante 72 h ± 6 h. En general, a las 48 h podemos observar colonias, pero en el caso de control microbiológico de tensioactivos aniónicos diluidos y productos con un elevado contenido en agua como son geles de baño, champús y acondicionadores capilares, es aconsejable prolongar la incubación 24 h más, para permitir el crecimiento de colonias de posibles microorganismos como Burkholderia. Este microorganismo, habitual en los productos cosméticos, forma colonias muy pequeñas y difíciles de visualizar.

- En el caso de recuento de hongos, incubar de 3 a 5 días a 25 ± 2,5ºC.

- Control de esterilidad del medio con agar nutritivo: depositar en una placa de Petri 20-25 ml del medio de cultivo elegido. Dejar solidificar e incubar como se describe anteriormente.

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- Control de esterilidad del diluyente: depositar en una placa de Petri 1 ml del diluyente sin muestra problema y añadir el medio con agar de igual forma. Incubar como se describe anteriormente.

- Después de la incubación, contar el número de colonias que se han desarrollado en cada placa. Calcular el número de UFC/g ó ml de muestra, teniendo en cuenta la dilución efectuada y el volumen sembrado (ver apartado “cálculo de resultados”). El límite de sensibilidad de este método es de <10 UFC/ g ó ml de muestra, si se ha realizado una dilución 1/10 del producto.

Cuadro 2

Hay ocasiones en las que, por la propia naturaleza de la muestra, es difícil distinguir entre partícula de muestra o colonia. En estos casos, se recomienda:

a) Prolongar la incubación 24 h más y observar si ha habido un crecimiento de la colonia.

b) Sembrar alguna placa más y guardarla a 4ºC. La comparación visual entre las placas incubadas en la estufa y las guardadas en la nevera puede aclarar si se está en presencia de crecimiento microbiano o de restos de producto.

c) Detección de colonias por la reducción de resazurina (descrito seguidamente):

Método de reducción de resazurina

Una vez incubadas las placas y antes de proceder a su lectura, verter sobre ellas 10 ml de una solución al 0,01% de resazurina recién preparada y esperar 15 minutos. Las colonias microbianas toman una coloración rosada por reducción de la resazurina.

En superficie o por extensión

Se basa en repartir homogéneamente una alícuota de la muestra por toda la superficie de la placa de medio de cultivo. Mediante este método, las colonias crecidas quedan en la superficie de la placa, por lo que es mucho más fácil aislarlas y observar su morfología que en el método de siembra en masa.

- Preparar previamente placas con el medio sólido para el recuento de elección. Es aconsejable haberlas preparado con 48 h de antelación para comprobar que no están contaminadas y para que la superficie no tenga demasiada agua, lo que dificultaría este tipo de siembra. Si hay agua en la superficie, las placas pueden

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abrirse dentro de la Cabina de Seguridad Biológica conectada y mantenerlas así unos minutos.

- Rotular las placas en su base con el número de referencia de laboratorio y la fecha de análisis, junto con la dilución sembrada.

- Depositar, mediante una micropipeta, 100 µl de la dilución inicial en la superficie de la placa. Realizar el ensayo por duplicado.

- Mediante un asa de Drigalsky esterilizada (flameada con alcohol) y fría o bien un asa de Drigalsky desechable, repartir el inóculo por toda la superficie mediante un movimiento de rotación, hasta que el líquido quede completamente absorbido.

- Dejar 10 minutos a temperatura ambiente e incubar las placas de forma invertida, tal y como se explica en el apartado anterior.

- Realizar los controles de esterilidad sembrando 100 µl del diluyente.

- Tras la incubación, contar las colonias crecidas y calcular las UFC/g ó ml de muestra, teniendo cuenta que se han sembrado 100 µl (ver apartado “cálculo de resultados”). La sensibilidad de este método es de <100 UFC/g ó ml si se ha realizado una dilución 1/10 de la muestra.

Filtración a través de membrana

Este método se recomienda en aquellos casos en los que la contaminación microbiana de las muestras es muy baja (<10 UFC/g ó ml) o cuando sea imposible la neutralización de los agentes conservantes presentes en la muestra mediante dilución (dato obtenido en el ensayo previo de idoneidad). No se recomienda para aquellos productos que puedan colmatar el filtro aun muy diluidos, para los que puedan formar espuma o para los productos que puedan dañar el filtro debido a su composición (por ejemplo aquellos con disolventes. En este caso, se debe comprobar con el proveedor de filtros la compatibilidad de las membranas). En la Unidad 3 de este módulo veremos un esquema del proceso de filtración, en ese caso para el agua desionizada.

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Brevemente, el método es como sigue:

- Tomar 10 ml de muestra diluida previamente y diluir en 90 ml de agua de peptona tamponada.

- Filtrar a través de un filtro de membrana estéril de 0,45 µm de diámetro de poro.

- Lavar tres veces el filtro con 100 ml de líquido de lavado estéril (ver anexo 2).

- Con ayuda de unas pinzas estériles, transferir el filtro a la superficie de una placa de Petri que contenga unos 20-25 ml del medio sólido apropiado para el recuento. Asegurarse de que toda la superficie del filtro se queda en contacto con el agar. Para evitar que queden burbujas, es aconsejable depositar el filtro en la superficie suavemente, empezando por un extremo.

- Realizar el proceso por duplicado. Tapar las placas e incubar en posición invertida, a las condiciones que se explican en los apartados anteriores.

- Realizar el control de esterilidad del diluyente, filtrando la cantidad correspondiente.

- Después de la incubación, contar el número de colonias que se han desarrollado en cada placa. Calcular el número de UFC/g ó ml de la muestra (ver apartado “cálculo de resultados”). El límite de sensibilidad de este método es de ausencia de UFC en los g ó ml de muestra filtrados.

Cálculo de resultados

- Contar el número de UFC obtenidas en las placas, desechando aquellas que presenten número superior a 300 (100 en el caso de filtración a través de membrana) o superior a 150 (en el caso de hongos). Desechar aquellas que tengan menos de 30 colonias, excepto si provienen de la única y mínima dilución efectuada.

- Hacer una media del número de colonias de las placas correspondientes a la misma dilución.

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- Multiplicar el resultado obtenido por la inversa de la dilución efectuada.

- Expresar el resultado como UFC/g ó ml de la muestra.

- En el caso de la técnica de siembra en placa en masa, si no se observan colonias en las placas correspondientes a la dilución inicial, se expresará el resultado como < 10 UFC/ g ó ml, si se había realizado una dilución 1/10 del producto.

- En el caso de la técnica de siembra en superficie, si no se observan colonias en las placas correspondientes a la dilución inicial, se expresará el resultado como <100 UFC/g ó ml, si se había realizado una dilución 1/10 del producto.

- En el caso de la técnica de filtración a través de membrana, si no se observan colonias en las placas, el resultado se expresa como ausencia en X gramos o mililitros de muestra (aquellos de la muestra inicial que se hayan filtrado).

- El resultado siempre se expresará en notación exponencial con un número entero y una cifra decimal, redondeando al número superior en el caso del número 5.

- Un recuento de 2 colonias en las placas de control negativo (control del diluyente y control del medio de cultivo con agar) invalida los ensayos efectuados.

Ejemplo:

- Obtenemos 43 y 40 colonias en las dos placas correspondientes a una dilución de 10-2 (ó 1/100), de la que hemos sembrado 1 ml en el medio sólido.

- La media de las dos placas será: 2

40 43 +

= 41,5

- Redondear a 42.

- Multiplicar por la inversa de la dilución efectuada.

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5. Detección de microorganismos aerobios mesófilos (enriquecimiento)

Mediante este método pueden detectarse menos de 10 UFC/g ó ml de muestra de, virtualmente, cualquier microorganismo aerobio mesófilo cultivable presente en ella, pero no permite el recuento. Este método es aconsejable utilizarlo en los siguientes casos (como mínimo):

- Es una primera fabricación de un producto o se ha cambiado algún ingrediente relevante.

- Es un producto destinado a población especialmente sensible (bebés, personas inmunodeprimidas (hospitales), pieles atópicas, ancianos, higiene íntima, etc.)

- Ha habido problemas de contaminación previos.

- Se ha cambiado alguna etapa en la producción.

- Se ha realizado alguna actuación en la maquinaria de producción/envasado.

De esta forma detectamos cualquier microorganismo que haya accedido al producto y no haya sido inhibido inicialmente por el sistema conservante. Es importante que estos microorganismos se identifiquen, ya que la detección y la identificación generan una información muy valiosa que nos puede orientar sobre:

- Las condiciones de producción (higiene de las instalaciones o del procesado).

- La calidad de las materias primas.

- La eficacia del sistema conservante.

- Qué microorganismos son habituales (house) en la planta (Módulo III).

Aunque los límites recomendados por diferentes Organismos sobre contaminación microbiológica en el producto acabado sitúan ésta como 100-1000 UFC/g de microorganismos no considerados patógenos (ver apartado 8), la presencia de microorganismos, detectada por este método, nos indica un riesgo que no tenemos controlado y que podría ser un problema importante si no actuamos en consecuencia. Un valor de UFC/g ó ml por debajo del límite recomendado no implicaría, en teoría, el

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rechazo del lote, pero sí que nos está advirtiendo de que las condiciones de producción no son las mejores o bien que el sistema conservante de la fórmula, si las condiciones productivas son óptimas, no es el adecuado. En el caso de productos cosméticos que, por su naturaleza, siempre presentan una contaminación basal, este método no sería aconsejable, ya que se detectarían siempre microorganismos.

El método es como sigue:

- Incubar la dilución 1/10 en diluyente neutralizante a 32,5 ± 2,5ºC durante 24 h. Si se ha diluido la muestra en agua peptonada, inocular 10 ml de esta dilución en 90 ml de un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) e incubar siguiendo las mismas condiciones de tiempo y temperatura.

- Sembrar en masa 1 ml en agar nutritivo o bien realizar una siembra mediante asa de Kolle en una placa de medio nutritivo no selectivo.

- Incubar las placas a 32,5 ± 2,5ºC durante 48-72 h. En ausencia de crecimiento, expresar el resultado como ausencia de microorganismos en X g ó ml (dependiendo de los gramos o mililitros que se hayan analizado).

- También puede realizarse este método filtrando la muestra inicial e incubando en las mismas condiciones el filtro sumergido en un caldo nutritivo. Este método se aconseja, como hemos visto antes, en aquellos casos en los que no podemos neutralizar por ningún otro medio las propiedades antimicrobianas de la muestra.

6. Detección de microorganismos patógenos

Para los cosméticos, y otros productos tópicos, la detección de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans puede ser relevante puesto que pueden producir infecciones en la piel y ojos. La detección de otro tipo de microorganismos (incluyendo los indicadores de contaminación fecal, como Escherichia coli) podría ser de interés dado que estos microorganismos pueden sugerir condiciones higiénicas inadecuadas durante el proceso de fabricación.

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MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 23 de 51 Detección de Escherichia coli

E. coli es un microorganismo de la familia de las enterobacterias. Es un bacilo Gram negativo, móvil, no esporulado, oxidasa negativa. Se encuentra en el intestino del ser humano principalmente y, debido a su origen, su presencia en un producto cosmético indica que éste ha tenido contacto con, y por tanto está contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios fuera del natural es limitada, por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes y, aunque existen algunas cepas de E. coli infecciosas y toxigénicas para el ser humano, la importancia de su detección en la mayoría de cosméticos es la indicada en primer término. Para cosméticos cuyo uso pueda implicar una ingestión accidental (dentífricos, colutorios, etc.) la presencia de E. coli podría indicativo de otras bacterias de transmisión fecal-oral.

El método se basa en la detección de E. coli en un medio líquido no selectivo (caldo de enriquecimiento), seguido de un aislamiento en un medio de agar selectivo y ensayos de identificación posteriores.

Se debe neutralizar la posible inhibición del crecimiento microbiano en la muestra, para permitir la detección de los microorganismos viables, por lo que, previamente al análisis, se debe comprobar y validar la neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto (ver apartado 7).

El método para la detección de E. coli es como sigue:

- Si la muestra presenta conservantes, diluir o suspender 10 g de muestra en 90 ml de diluyente neutralizante Alternativamente, se pueden diluir los 10 g de muestra en dicho diluyente neutralizante, dejar unos minutos en contacto y transferir 10 ml de esta mezcla a 90 ml de un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja).

- Si la muestra no presenta conservantes, de forma alternativa se puede diluir o suspender directamente 10 g en 90 ml de caldo triptona y soja.

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- Incubar la dilución o suspensión descrita a 32,5 ± 2,5 ºC durante 20 h como mínimo y 72 h como máximo.

- Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar McConkey. Como control positivo del crecimiento, sembrar una placa de McConkey con una cepa de referencia de E. coli.

- Incubar a 32,5 ± 2,5 ºC durante 24-48 h.

Las colonias de E. coli en agar McConkey son granates con un halo de precipitación alrededor. Las colonias están formadas por bacilos Gram negativos oxidasa negativa. Para confirmar los resultados, realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado.

Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de E. coli en 10 g ó ml de producto.

En el caso de productos filtrables, se puede filtrar la muestra diluida, y tras el lavado de la membrana, sumergir el filtro en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba.

Detección de Staphylococcus aureus

S. aureus es un microorganismo Gram positivo catalasa positiva, en forma de coco, que aparece al microscopio óptico en agrupaciones irregulares. Son inmóviles, no esporulados y son capaces de multiplicarse a altas concentraciones de cloruro sódico.

En medios no selectivos forma colonias lisas generalmente pigmentadas en amarillo debido a la producción de un pigmento carotenoide, por lo que comúnmente se conoce a esta especie como estafilococo dorado. A diferencia de otras especies de estafilococos, S. aureus produce el enzima coagulasa, que es una de las características que definen a las especies patógenas de estafilococos.

(1) Las principales características para la identificación de E. coli son: bacilos Gram negativos, catalasa positiva, oxidasa negativa, fermentación de lactosa, producción de indol, crecimiento en medio selectivo que contenga sales biliares formando colonias características (por ejemplo medio EMB-Levine Eosina-Azul de metileno).

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El principal reservorio de S. aureus es el ser humano (especialmente en las fosas nasales de portadores sanos así como en los pacientes infectados). La colonización puede darse sobre la mucosa nasal, orofaringe, epidermis íntegra, úlceras crónicas cutáneas, heridas en fase de cicatrización, etc.

S. aureus posee una gran capacidad para sobrevivir en un ambiente adverso y, por la acción de sus determinantes de patogenicidad (cápsula mucoide polisacárida, componentes antigénicos de la pared, producción de enzimas como catalasa, coagulasa, hialuronidasa, estafiloquinasas, lipasas, β-lactamasas, o la secreción de diversas toxinas como la exotoxina epidermolítica, enterotoxinas o la toxina del síndrome de shock tóxico), acaba produciendo infección.

Además, S. aureus interacciona con múltiples receptores del hospedador a través de diversos componentes de superficie. Presenta asimismo un elevada capacidad de adherencia a diversos sustratos in vitro. Es un importante patógeno de la piel y puede provocar infecciones como el impétigo, el síndrome de la piel escaldada, forúnculos, foliculitis, celulitis, etc. por lo que es muy importante su detección en los productos cosméticos, que en buena parte se aplican en este órgano.

Al igual que en el caso de E. coli, debe validarse la detección de este microorganismo en el producto en cuestión (ver apartado 7).

El método para su detección es como sigue:

- Proceder de igual forma que en apartado anterior (detección de E. coli) en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial.

- Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Baird Parker. Como control positivo del crecimiento, sembrar una placa del medio selectivo con una cepa de referencia S. aureus. Pueden utilizarse otros medios selectivos, como Manitol Hipersalino o Vogel Johnson.

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Las colonias de S. aureus en Baird-Parker son negras, brillantes y rodeadas por un halo claro con precipitación. Las colonias están formadas por cocos Gram positivos en grupos irregulares y catalasa positiva.

Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado.

En el caso de productos filtrables, se puede filtrar la muestra diluida y tras el lavado del filtro, sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba.

Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de S. aureus en 10 g ó ml de producto.

Detección de Candida albicans

C. albicans es una levadura que forma colonias blancas a beige, cremosas y con forma convexa en la superficie de un medio no selectivo.

Además de otras zonas corporales, como las mucosas, C. albicans puede producir infecciones en la piel. La infección puede comprometer casi cualquier superficie en el cuerpo, pero se presenta con mayor frecuencia en áreas cálidas, húmedas y con pliegues como las axilas y la ingle. Sin embargo, las candidiasis más graves (candidiasis diseminadas) se observan en personas inmunodeprimidas o con enfermedades subyacentes que predisponen a la infección. También es responsable de la candidiasis vaginal y de infecciones en la mucosa bucal.

- Proceder de igual forma que en los apartados anteriores en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial. Como en los casos anteriores, previamente debe validarse la detección de este microorganismo en el producto en cuestión (apartado 7).

(1) Las principales características para la identificación son: cocos Gram positivos, agrupados irregularmente, catalasa positiva, coagulasa positiva.

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- Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Sabouraud-cloranfenicol. Como control positivo del crecimiento, sembrar una placa de cada medio con una cepa de referencia C. albicans.

- Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado.

Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de C. albicans en 10 g ó ml de producto.

En el caso de productos filtrables, se puede filtrar la muestra diluida y tras el enjuague del filtro, sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba.

Detección de Pseudomonas aeruginosa

Es un bacilo Gram negativo oxidasa positiva. P. aeruginosa es un patógeno oportunista y raramente provoca infecciones en personas sanas. Pseudomonas puede causar infección en la córnea, el humor acuoso y el vítreo de los ojos, y es una causa frecuente de queratitis bacteriana, abscesos de la esclerótica y endolftalmia. También puede causar infecciones en heridas y de las uñas, sobre todo en aquellas personas cuyas manos están frecuentemente sumergidas en el agua. P. aeruginosa es también causa de sepsis en pacientes con graves quemaduras.

Es un microorganismo que se puede aislar a partir de una gran variedad de fuentes ambientales, especialmente del agua, y tiene un gran potencial para contaminar diferentes substratos. Por tanto, su presencia es indeseable en los productos cosméticos, tanto por su potencial patogenicidad como por su capacidad de afectar algunas propiedades fisicoquímicas de la fórmula cosmética.

(1) Las colonias de C. albicans en agar Saboraud son blancas (como el color del yeso). Al microscopio, tras la tinción Gram, se pueden observar células ovoides, muy grandes respecto a las de bacterias, de color violeta, a veces con células en gemación. Forma colonias características en medios como el agar Biggy o Nickerson.

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- Proceder de igual forma que en los apartados anteriores en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial.

- Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Cetrimide. Como control positivo del crecimiento, sembrar una placa del medio con una cepa de referencia P. aeruginosa.

Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado. Las colonias de P. aeruginosa en agar Cetrimide son pigmentadas (de color amarillo-verdoso-marrón) con fluorescencia bajo la luz UV. Las colonias están formadas por bacilos Gram negativos oxidasa positiva.

Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de P. aeruginosa en 10 g ó ml de producto.

En el caso de productos filtrables, se puede filtrar la muestra diluida y tras el lavado del filtro, sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba.

7. Comprobación de la idoneidad del método (neutralización y recuperación)

Validación y neutralización. Generalidades

Validar significa confirmar, mediante evidencias objetivas (es decir, mediante datos que verifiquen la veracidad, como un ensayo por ejemplo) que se cumplen los requisitos para una aplicación o utilización prevista (ISO 9000:2000). Es decir, el proceso de validación tiene por objeto comprobar que un método es aceptable para el uso que se ha previsto. En Microbiología es particularmente importante para evitar obtener falsos negativos y para no poner en riesgo la salud de los consumidores.

(1) Las principales características para la identificación son: bacilos Gram negativos, oxidasa positiva. Forma el pigmento piocianina en el agar P Pseudomonas.

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Sin embargo, el término “validación” se recomienda para aquellos métodos no normalizados, los desarrollados internamente, los normalizados aplicados fuera de su alcance o si hay ampliaciones o modificaciones (UNE-EN-ISO 17025:2000. Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración). Como en este tema desarrollamos métodos normalizados, es recomendable hablar de idoneidad o aptitud del método, más que de validación estricta.

En nuestro caso, el proceso de comprobación de la idoneidad corrobora si nuestro método es capaz de detectar y recuperar el número de microorganismos conocido que habremos inoculado previamente. De esta manera, comprobamos la idoneidad del método, la no toxicidad del diluyente y la neutralización de los conservantes del producto que puedan estar inhibiendo el crecimiento microbiano. No debemos olvidar que trabajamos con organismos vivos, que poseen una gran variabilidad inherente a su naturaleza, además de que se dispersan de forma no homogénea en la muestra. Además, nos encontraremos con una gran diversidad de productos a analizar y con la variabilidad y diferentes concentraciones de los ingredientes conservantes y otros antimicrobianos en las muestras. Por eso, la comprobación de la aptitud del método debe realizarse siempre ante un nuevo producto/reformulación, materia prima, etc.

Esta prueba también permite comprobar que el método funciona en nuestro laboratorio, con nuestros medios de cultivo, equipos, analistas, etc. Además, se evidencia que el procesado de la muestra no afecta a los microorganismos, sobre todo en el caso de utilizar un solubilizante o una temperatura un poco elevada en aquellas muestras difíciles de disolver o suspender, como hemos visto anteriormente. Nos ayuda, también, a conocer más el producto al que haremos el Control de Calidad rutinario posterior respecto a la dilución a aplicar y diluyente, forma de dispersar la muestra (solubilizante, temperatura…), el aspecto en el medio sólido de las colonias formadas, el tiempo de incubación, etc. Es decir, nos ayuda a familiarizarnos con el producto a analizar.

En el análisis microbiológico de productos cosméticos trabajamos básicamente con dos tipos de comprobación de la idoneidad del método:

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- Cuantitativa: permite cuantificar el número de microorganismo presentes en la muestra. Para ello, inoculamos un número de microorganismos conocido en la muestra problema, diluida en el caldo neutralizante, y comprobamos si el método es capaz de recuperarlos.

- Cualitativa: nos permite detectar la presencia o ausencia de un determinado microorganismo o grupo de microorganismos.

Neutralizar los conservantes de la muestra a ensayar es de vital importancia, ya que si éstos están aún activos cuando permitamos desarrollarse a los microorganismos en una placa (o, de la misma manera, los vayamos a detectar mediante un método rápido) seguirán con su acción sobre los microorganismos presentes, por lo que, probablemente, no podrán formar colonias.

La neutralización puede conseguirse por tres métodos:

- Dilución: hay moléculas que se inactivan rápidamente en dilución, debido a su coeficiente de dilución (

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) elevado. Un ejemplo son los alcoholes. Este tema lo veremos con más detalle en el Módulo IV.

- Filtración: el proceso de filtración con filtros de 0,45 µm excluye cualquier sustancia inhibitoria del crecimiento microbiano. Sin embargo esta técnica no es aplicable a todo tipo de muestras, como hemos visto anteriormente.

- Adición de compuestos neutralizantes al diluyente de la muestra: es el método más empleado y se explica en el Cuadro 3.

Los caldos neutralizantes que se comercializan, bien deshidratados o bien listos para usar, tienen en su composición tres o cuatro moléculas neutralizantes (tiosulfato de sodio, polisorbato 80, cisteína, lecitina, etc.) que, junto con la propia dilución que se efectúa (1/10 como mínimo), hace que la neutralización sea, en la mayoría de casos, efectiva. Además de estas moléculas, los caldos neutralizantes llevan en su composición todos aquellos requerimientos nutritivos que se necesitan para realizar un

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enriquecimiento de la muestra y permitir que los microorganismos puedan multiplicarse. Para el método de recuento también son válidos, puesto que sus componentes revivifican a los microorganismos de la muestra, que se encuentran en condiciones de estrés debido a los ingredientes cosméticos.

Cuadro 3

Neutralización química

Existen moléculas (ver anexo 2) que neutralizan las sustancias antimicrobianas, bien por reacciones químicas (como el tiosulfato de sodio) o bien por la disposición de las moléculas, como sucede en el caso de los tensioactivos no iónicos (sobre todo aquellos muy etoxilados, como el polisorbato 80), que engloban o forman complejos con los conservantes (ver Figura 1).

Figura 1. Posibles interacciones de los tensioactivos no iónicos con los conservantes

La relación de un conservante con una molécula inactivadora, en este caso un tensioactivo no iónico como el polisorbato 80, puede definirse por la siguiente ecuación:

R=SC+1 donde:

R: relación conservante total: conservante libre (no unido al tensioactivo). S: concentración de tensioactivo.

C: constante de unión del conservante al tensioactivo.

Si representamos R en función de la concentración de polisorbato, se genera una gráfica como la que se muestra en la Figura 2, tomando como ejemplo conservantes como los parabenos.

Figura 2. Relación entre parabeno total y parabeno libre (R) en función de la concentración de agente neutralizante (polisorbato 80).

La Tabla III recoge una comparación de valores cualitativos de R con diferentes conservantes cosméticos y el polisorbato 80.

Tabla III. Valor cualitativo de R de diferentes conservantes cosméticos y el polisorbato 80.

Conservante R

Metilparabeno Alto

Etilparabeno Alto

Propilparabeno Alto

Butilparabeno Alto

Amonios cuaternarios Alto

Clorhexidina Alto

Fenoxietanol Medio

Bronopol Bajo

Quaternium 15 Bajo

Diazolidinil urea Bajo

Clorfenesina Bajo

Alcohol bencílico Bajo

Triclosán Bajo

Yodopropinil butil carbamato Bajo

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MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 32 de 51 Idoneidad del método de siembra por inclusión

Microorganismos

Para ensayar la eficacia de los neutralizantes y la recuperación de microorganismos, se utilizan dos cepas bacterianas, una representativa de bacterias Gram negativas y otra de Gram positivas, y un hongo (para validar el método de recuento de mohos y levaduras):

- Pseudomonas aeruginosa ATCC(1) 9027 (o cepa equivalente, por ejemplo CECT(2) 111).

- Staphylococcus aureus ATCC 6538 (o cepa equivalente, por ejemplo CECT 239).

- Candida albicans ATCC 10231 (o cepa equivalente, por ejemplo CECT 1394).

Alternativamente, se puede usar como especie Gram negativa Escherichia coli ATCC 8739 (CECT 516).

Para el ensayo de idoneidad se aconseja utilizar cepas que no sean particularmente resistentes a los conservantes o las condiciones impuestas por el producto, es decir, trabajar en el “peor caso” posible o con los microorganismos en principio más sensibles, como son las cepas de colección, pero también puede ser útil validar el método con aquellas cepas de microorganismos que hayamos aislado de productos, instalaciones, etc.

La Normativa ISO recomienda trabajar con el segundo o tercer subcultivo a partir del stock de microorganismos. En el caso de bacterias, recomienda una incubación de estos subcultivos de 18-24 h y en el caso de C. albicans, el segundo o el tercero debe ser de 36-48 h (UNE-EN-ISO 21148).

Método

Un esquema del proceso se muestra en la Figura 3.

- Antes del ensayo, se siembra cada cepa en la superficie de agar nutritivo no selectivo. Se incuba a 32,5ºC ± 2,5ºC durante 18 a 24 h.