Item Type Theses and Dissertations
Authors Massa, A.E.
Download date 13/06/2021 17:27:36
Tesis para optar al título de Doctor en Ciencias, área Biología
“Cambios bioquímicos post-mortem en músculo
de diferentes especies pesqueras. Determinación
de la vida útil de las mismas en frío”
Mar del Plata, 2006
Autor: Agueda Elena Massa
Dirección: Dr. Marcos Crupkin
Co-dirección: Dra. M. Elida Paredi
Lugar de Trabajo: INTI - Mar del Plata.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Biología
Lic. Agueda Elena Massa
Directores:
Dra Maria Elida Paredi Dr. Marcos Crupkin
Co-directora Director
Lugar de Trabajo:
INTI – Mar del Plata –Instituto Nacional de Tecnología Industrial
Departamento de Biología
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad Nacional de Mar del Plata
dado la posibilidad de realizar este trabajo, por su generosidad al brindarme la oportunidad de recurrir a su capacidad y experiencia científica en un marco de
confianza y afecto;
ª
A el Lic. Diego Palacios por su permanente ayuda y acertados aportes durante el desarrollo de este trabajo;ª
A las autoridades del INTI-MAR DEL PLATA por permitirme realizar el presente trabajo;ª
A las empresas Centauro S.A. y Coomarpes Coop. Ltda. y al INIDEP por colaborar en la obtención de las muestras;ª
A mis compañeras de laboratorio, Dra. Mariana Pagano y Lic. Lorena Mignino, por su presencia incondicional y amistad;ª
A mis compañeros del Instituto por su continuo y afectuoso aliento;ª
A la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC), al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y al Instituto de Investigación de Tecnología Industrial (INTI) por haberme otorgado las becas queme permitieron realizar esta tesis;
ª
A todos mis amigos: “los viejos”, los que conocí y me acompañaron en esta carrera y a todos aquellos que encontré gracias a la realización del presente trabajo por supaciencia y apoyo constante;
ª
y..., por último, a todos aquellos que hicieron posible la realización del presente trabajo, a mi familia y especialmenteResumen
Se investigaron los cambios bioquímicos post-mortem y se determinó la vida útil comercial de tres especies pesqueras, muy valoradas por el sector industrial pesquero de nuestro país, durante el almacenamiento en frío: lenguado (Paralichthys patagonicus), corvina rubia (Micropogonias furnieri) y la vieira patagónica (Zygochlamis patagónica). Los cambios bioquímicos relacionados con el ATP y sus productos de degradación, la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo del ATP y el pH fueron investigados. En base a los contenidos de los compuestos relacionados con la degradación del ATP se establecieron distintos índices químicos para evaluar la frescura y/o la calidad de estos productos. Por otro lado, se monitorearon los niveles de aminas biógenas y se evaluó la utilidad de las mismas como índice de deterioro. Los cambios en las propiedades texturales, el crecimiento de los microorganismos y la evolución de los grupos deteriorantes más significativos también fueron determinados. Asimismo se desarrollaron esquemas sensoriales específicos para cada una de las especies evaluadas.
Lenguado (P. patagonicus)
En P. patagonicus almacenado en hielo por 12 días no se detectó la presencia de ATP ni ADP. El contenido inicial de AMP decreció rápidamente a cero. El IMP disminuyó un 60% durante los 2 primeros días de almacenamiento y luego descendió gradualmente. La HxR estuvo presente en pequeñas cantidades durante todo el almacenamiento. La Hx se incrementó hasta el séptimo día y posteriormente permaneció sin grandes cambios El pH se mantuvo próximo a 6,6 durante la mayor parte del almacenamiento, aumentando a 7 al finalizar el mismo. En extracto muscular
de lenguado se observó una alta actividad de la AMP-deaminasa, y no se detectó actividad de adenosina deaminasa, sugiriendo que la degradación de ATP ocurre vía IMP. La actividad de la nucleósido fosforilasa aumentó significativamente luego del segundo día de almacenamiento, lo cual indicaría un papel primordial de los microorganismos en el deterioro. El valor K mostró un incremento lineal con el tiempo de almacenamiento. En cambio, las aminas biógenas presentaron un perfil muy irregular. Los niveles de histamina no superaron los límites establecidos por las normas fijadas por los organismos internacionales. La firmeza del pescado entero decreció significativamente los dos primeros días de almacenamiento y luego disminuyó gradualmente hasta el séptimo día en la región caudal y se mantuvo sin cambios en la región central. La dureza, cohesividad y elasticidad del filete mostraron un comportamiento similar al de la firmeza. Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron durante el almacenamiento, siendo la flora proteolítica el grupo deteriorante predominante. Bajo las condiciones experimentales de este estudio, Shewanella putrefacies y Pseudomonas fluorescens fueron identificadas como los microorganismos deteriorantes específicos dominantes. El esquema sensorial QIM desarrollado para P. Patagonicus resultó adecuado para evaluar la frescura. El QI presentó una alta correlación con el tiempo de almacenamiento, lo que sugiere su posible utilización como un sistema de valoración objetivo de la calidad. De acuerdo a los distintos índices de frescura evaluados P. Patagonicus almacenado en hielo podría considerarse como aceptable para el consumo hasta el séptimo día.
Corvina rubia (M. furnieri)
12 días. Los perfiles de degradación de nucleótidos en ejemplares en pre y posdesove difirieron solamente en el contenido de HxR. A tiempo 0 de almacenamiento no se detectó la presencia de nucleótidos de adenina (ATP, ADP, AMP). La concentración de IMP fue baja durante todo el periodo de almacenamiento. La HxR fue el metabolito predominante. Este se incrementó alrededor de un 100% durante los dos primeros días de almacenamiento en corvina rubia de ambos estadios biológicos, posteriormente los niveles de HxR de los ejemplares en predesove aumentaron significativamente hasta el quinto día de almacenamiento y luego descendieron levemente, mientras que los individuos en posdesove mantuvieron los valores alcanzados al segundo día sin grandes variaciones hasta finalizar el experimento. El contenido de Hx resultó adecuado para monitorear los cambios de frescura en corvina almacenada, ya que presentó una relación lineal con una alta correlación con el tiempo de guarda. En extracto muscular de corvina rubia se observó una alta actividad de la AMP-deaminasa, y no se detectó actividad de adenosina deaminasa, lo cual sugiere que la degradación de ATP ocurre vía IMP. La actividad de la nucleósido fosforilasa aumentó a lo largo del almacenamiento. El valor K’ alcanzó valores máximos a los primeros días de almacenamiento y posteriormente permaneció constante, por lo que no puede ser considerado como un índice de calidad confiable para esta especie. Bajo las condiciones experimentales de este estudio, el valor H (definido como la relación entre el contenido de Hx y la suma de todos los nucleótidos presentes en los extractos musculares) presentó una alta correlación con el tiempo de almacenamiento y resultó adecuado para monitorear la calidad de M. furnieri. La putrescina fue la única amina biógena que aumentó durante el almacenamiento en la corvina rubia, sin embargo podría ser prematuro proponerla como un índice del grado de frescura. La firmeza del pescado entero y la dureza del filete decrecieron a lo largo del almacenamiento. La cohesividad y la elasticidad del filete no presentaron cambios
significativos. Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron durante el almacenamiento, las bacterias psicrótrofas predominaron durante la refrigeración, siendo la flora productora de H2S y las bacterias proteolíticas
los grupos deteriorantes más importantes. Los valores establecidos por ICMSF como límites máximos recomendados para pescado fresco refrigerado se alcanzaron luego del quinto día de almacenamiento. El esquema sensorial (QIM) desarrollado para la corvina rubia almacenada en hielo resultó adecuado para evaluar la vida útil El QI presentó una relación lineal con el tiempo de almacenamiento, lo cual sugiere que dicho índice podría utilizarse como un sistema de valoración objetivo de la calidad de la corvina. Los miembros del panel sensorial consideraron inaceptables a la corvina luego del quinto día de almacenamiento. De acuerdo a los distintos índices de frescura evaluados la corvina rubia almacenado en hielo podría considerarse como aceptable para el consumo hasta el quinto día.
Vieira patagónica (Z. patagónica)
Los cambios bioquímicos post-mortem y la determinación de la vida útil comercial de músculos aductores de viera patagónica almacenados a 2-4ºC fueron determinados por 9 días. Inmediatamente después de la muerte, la concentración de ATP aumentó alcanzando un valor máximo (5,6 ± 0,2 µmoles/g) a las 2 hs post-mortem. Posteriormente, la concentración de ATP descendió bruscamente hasta las primeras 48 hs y luego lentamente hasta el final del almacenamiento. Los niveles de ADP descendieron un 50% los dos primeros días postmortem, y posteriormente permanecieron sin mayores cambios, mientras que el AMP mostró una lenta
fueron observadas a todos los tiempos. Contrariamente adenosina no fue detectada. La concentración de HxR aumentó significativamente con el tiempo de almacenamiento. El contenido de Hx se incrementó rápidamente hasta el cuarto día de almacenamiento, luego permaneció constante hasta el día 7, incrementándose nuevamente hasta los 9 días. La baja actividad de AMP-deaminasa en comparación con la de adenosina deaminasa sugiere que la degradación de AMP a HxR podría proceder en la viera patagónica tanto por reacciones de desaminación del AMP formando IMP, como por reacciones de desfosforilación formando Ade. El pH decreció significativamente durante los dos primeros días de almacenamiento y al finalizar el mismo aumentó posiblemente por la actividad microbiana. El valor K, la acumulación de Hx y Hx/AMP resultaron índices adecuado para monitorear los cambios de frescura de Z. patagónica, ya que presentaron una alta correlación con el tiempo de guarda. La carga energética de adenilato (CEA) y la relación 260/250 resultaron índices eficaces para monitorear la condición biológica de los ejemplares. Las aminas biógenas no resultaron adecuadas para determinar el grado de frescura en la vieira patagónica. Bajo las condiciones experimentales ensayadas no se detectó la presencia de histamina. La gran variación observada en la firmeza y en la dureza las primeras 24 hs de almacenamiento, podría asociarse con el comienzo del rigor mortis, ya que en este período también tiene lugar la mayor disminución de ATP y del pH. La cohesividad y la elasticidad no presentaron cambios significativos. Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron durante el almacenamiento de Z. patagónica a 2-4 ºC. El crecimiento de los microorganismos psicrótrofos fue superior al desarrollo de la flora mesófilas. Las bacterias productoras de H2S crecieron significativamente durante el almacenamiento, presentando un claro
predominio Shewanella spp. Las bacterias fluorescentes fueron caracterizadas como Pseudomonas fluorescens. Los valores establecidos por ICMSF como límites
máximos recomendados para productos pesqueros frescos refrigerados, se alcanzaron a los nueve días de almacenamiento. Los principales cambios sensoriales en los callos se observaron en el color, olor y la apariencia. Los atributos de frescura permanecieron durante los dos primeros días de almacenamiento, posteriormente y hasta el quinto día a 2-4 ºC los ejemplares se mantuvieron aceptables y luego presentaron un estado avanzado de deterioro. Estos resultados presentaron una gran correlación con los criterios de aceptabilidad establecidos por los índices químicos mencionados, pero no se relacionaron con los límites de aceptabilidad microbiológicos. De acuerdo a los resultados descriptos, el músculo aductor de Z. patagónica permanecería fresco hasta el segundo día de almacenamiento a 2-4°C y alcanzaría el límite de rechazo luego del quinto día (inaceptable para el consumo).
Indice General
Resumen... i
Índice General... vii
Abreviaturas Utilizadas... xi
1. INTRODUCCION 1.1. LA INDUSTRIA PESQUERA ARGENTINA... 2 1.1.1. Lenguado patagónico (Paralichthys patagonicus)... 4
1.1.2. Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)... 5
1.1.3. Vieira Patagónica (Zygochlamys patagónica)... 7
1.2. CALIDAD Y DETERIORO DE LOS PRODUCTOS PESQUEROS... 8
1.2.1. Cambios autolíticos... 9
1.2.1.1. Cambios post-mortem relacionados con el metabolismo energético... 9
1.2.1.2. Consecuencia del agotamiento de ATP... 14
1.2.1.3. Cambios autolíticos y catabolismo del ATP... 15
1.2.1.4. Cambios relacionados con la fracción lipídica... 18
1.2.1.5. Cambios autolíticos que involucran enzimas proteolíticas... 19
1.2.1.6. Formación de aminas biógenas... 23
1.2.2. Cambios Microbiológicos... 26
1.3. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL PESCADO... 28
1.3.1. Métodos Químicos. ... 29
1.3.1.1. Métodos basados en la degradación del ATP. ... 30
1.3.1.2. Métodos relacionados con cambios en la fracción nitrogenada básica... 32
1.3.1.3. Métodos relacionados con los cambios en la fracción lipídica... 35
1.3.2. Métodos físicos... 36
1.3.2.1. Determinación del pH muscular... 36
1.3.2.2. Determinación de las propiedades de textura... 37
1.3.2.3. Resistencia eléctrica de la carne del pescado... 40
1.3.3. Métodos microbiológicos... 41 1.3.4. Métodos sensoriales. ... 42 1.4. OBJETIVOS... 45 1.4.1. Objetivo General... 46 1.4.2. Objetivos Particulares... 46 2. MATERIALES Y METODOS 2.1. MUESTRAS Y MUESTREO... 49 2.1.1. Lenguado patagónico... 49
2.1.2. Corvina rubia... 50
2.1.2.1. Determinación del estadio gonadal de la corvina rubia... 50
2.1.3. Vieira patagónica... 50
2.2. METODOLOGÍA ANALÍTICA... 51
2.2.1. Determinación de nucleótidos... 51
2.2.1.1 Preparación de las muestras y extracción... 51
2.2.1.2. Procedimiento y condiciones cromatográficas... 52
2.2.2. Actividad de las enzimas involucradas en el catabolismo del ATP... 53
2.2.2.1. Preparación del extracto enzimático... 53
2.2.2.2. Determinación de la actividad de la AMP-deaminasa... 53
2.2.2.3. Determinación de la actividad de la Adenosina deaminasa... 54
2.2.2.4. Determinación de la actividad de la Nucleósido fosforilasa... 54
2.2.3. Índices químicos para evaluar la frescura... 55
2.2.4. Relación 260/250... 56
2.2.5. Determinación de aminas biógenas... 56
2.2.5.1. Extracción de las muestras... 56
2.2.5.2. Preparación de los patrones... 57
2.2.5.3. Derivatización de las muestras y patrones... 57
2.2.5.4. Procedimiento y condiciones cromatográficas... 58
2.2.6. Determinación del pH... 59
2.2.7. Medidas de textura ... 59
2.2.7.1. Determinación de textura en el lenguado patagónico y en corvina rubia... 59
2.2.7.2. Análisis del perfil de textura (TPA) realizado en filete crudo... 61
2.2.7.3. Determinación de textura en la vieira patagónica... 62
2.2.8. Análisis microbiológicos... 63 2.2.8.1. Preparación de la muestra... 63 2.2.8.2. Medios de cultivos... 63 2.2.8.3. Identificación de microorganismos. ... 65 2.2.9. Análisis Sensorial... 66 2.3. ANÁLISIS ESTADISTICOS... 67 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. CAMBIOS POSTMORTEM EN LENGUADO (P. Patagonicus) DURANTE EL ALMACENAMIENTO EN HIELO. ... 70
3.1.1 Cambios en el contenido de los nucleótidos... 70
3.1.2. Cambios en el valor de pH... 76 3.1.3. Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo
3.1.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura... 80
3.1.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas... 82
3.1.6. Cambios en la características texturales... 89
3.1.6.1 Determinación de textura en pescado entero... 90
3.1.6.2. Determinación de las propiedades texturales de filete crudo (Análisis de perfil de textura, TPA). ... 91
3.1.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y el deterioro... 95
3.1.8. Cambios en las características sensoriales... 98
3.1.9. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados... 102
3.1.10. Conclusiones parciales... 104
3.2. CAMBIOS POSTMORTEM EN CORV INA RUBIA (M. Furnieri) DURANTE EL ALMACENAMIENTO EN HIELO. ... 107
3.2.1. Cambios en el contenido de los nucleótidos... 107
3.2.2. Cambios en el valor de pH... 111
3.2.3.Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo del ATP (AMP-deaminasa, adenosina deaminasa y nucleósido fosforilasa) ... 112 3.2.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura... 114
3.2.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas... 116
3.2.6. Cambios en la características texturales... 118
3.2.6.1. Determinación de textura en pescado entero... 118
3.2.6.2. Determinación de las propiedades texturales de filete crudo (Análisis de perfil de textura, TPA). ... 120
3.2.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y el deterioro... 123
3.2.8. Cambios en las características sensoriales... 125
3.2.9. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados... 129
3.2.10. Conclusiones parciales... 131
3.3. CAMBIOS EN EL MUSCULOS ADUCTORES DE VIEIRA PATAGÓNICA ALMACENADOS A 2-4 ºC 3.3.1. Cambios en el contenido de los nucleótidos... 134
3.3.2. Cambios en el valor de pH... 137
3.3.3. Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo del ATP (AMP-deaminasa, y adenosina)... 139
3.3.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura... 141
3.3.5. Relación 260/250... 145
3.3.6. Cambios en el contenido de aminas biógenas... 147
3.3.7. Cambios en la características texturales... 150
3.3.9. Cambios en las características sensoriales... 158
3.3.10. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados... 159
3.3.11. Conclusiones parciales... 162
4. CONCLUSIONES GENERALES ... 166
5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS... 168
Abreviaturas Utilizadas µm Micrómetro(s) µmoles Micromoles Ade Adenosina ADP Adenosina-5-difosfato AMP Adenosina-5-monofosfato ATP Adenosina-5-trifosfato
CEA Carga energética de adenilato cm Centímetro(s)
DMA Dimetilamina
g Gramo(s)
HPLC Cromatografía líquida de alta presión
h Hora(s)
Hx Hipoxantina HxR Inosina
IAB Índice de aminas biógenas IMP Inosina-5-monofosfato K2HPO4 di-potasio hidrogenofosfato
KClO4 Perclorato de potasio
KgF Kilogramo(s) fuerza
KH2PO4 Mono-potasio hidrogenofosfato
KOH Hidróxido de potasio l Litro(s) m Metro(s) M Molar mg Miligramo(s) min Minuto(s) ml Mililitro(s) mm Milímetro(s) mM Milimolar n Numero de observaciones NaCl Cloruro de Sodio
N-BVT Nitrógeno básico volátil total
nm Nanómetro
ºC Grado(s) Celsius
OED Organismos específicos del deterioro OTMA Oxido de trimetilamina
QI Índice de calidad
QIM Método del índice de calidad (Quality Index Method) TBA-SR Sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico
TMA Trimetilamina
TPA Análisis del Perfil de Textura UFC Unidades formadoras de colonias
UV Ultravioleta
1.1. La Industria Pesquera Argentina
La plataforma continental Argentina tiene una superficie de aproximadamente un millón de kilómetros cuadrados. Las aguas que bañan dicha plataforma se originan en dos corrientes: la "Corriente Fría de Malvinas" que transporta aguas subantárticas a través del talud continental con dirección sur-norte, entre los 55°S y los 39°-36°S y la "Corriente del Brasil", que transporta aguas subtropicales hasta los 36°-38°S, con dirección norte-sur (Guerrero y Piola, 1997). Estas dos corrientes le confieren al Atlántico Sur las características de un ecosistema templado-frío, que sostiene una gran diversidad biológica, con altas biomasas en muchas de sus especies (Guerrero y Piola, 1997; Cousseau y col., 2004).
A nivel internacional la Argentina se encuentra entre los principales productores mundiales de pescado. Las estadísticas nacionales de desembarques en los últimos 15 años indican una tendencia creciente hasta 1997, año en el que se alcanza el valor más alto de captura, con 1.300.000 toneladas. A partir de ese momento se produce una importante caída hasta el año 2000 y posteriormente las capturas se estabilizan, con un promedio de 865.000 toneladas en el período 2000-2004 (FAO, 2005). En el último año las capturas alcanzaron las 765.472 toneladas (SAGPyA, 2005), el 55,56% de este volumen se desembarcó en la Provincia de Buenos Aires, principalmente en el puerto de la ciudad de Mar del Plata.
En la región costera bonaerense, que se extiende desde la línea de costa hasta la isobata de 50 m y desde el “Chuy” (Uruguay) al norte (34 °LS) hasta el límite sur de la Provincia de Buenos Aires (41°LS), se desarrolla una pesquería multiespecífica conformada por diversos recursos de gran valor comercial como: corvina rubia (Micropogonias furnieri), pescadilla común o de red (Cynoscion guatucupa), lenguados (Paralichthys patagonicus, P. orbignyanus, Xystreuris rasiles), rayas costeras (Familia Rajidae), gatuzo (Mustelus schmitti), besugo (Parus pagrus), palometa (Parona
signata), pez palo (Percophis brasilianus), pez ángel (Squatina spp.), brótola
(Urophysis brasiliensis), mero (Acanthistius brasilianus), salmón (Pseudopercis
semifasciata), pescadilla real (Macrodon ancylodon), pargo (Umbrina canosai), entre
las más importantes (Prenski y Sanchez, 1988, Lasta y col., 1999; Fernández Araóz y col., 2004). Históricamente, los desembarques del conjunto de éstas especies alcanzaban las 80.000 toneladas por año. Entre 1993 y 1997 se observó un marcado incremento de las capturas debido a la apertura de mercados asiáticos dirigido principalmente a la corvina rubia (Carozza y col., 2004) y a un aumento en el esfuerzo pesquero evidenciado por el gran número de barcos que ingresaron a ésta pesquería (Carozza y col., 2001, 2004). A partir de 1998 las capturas disminuyeron alcanzando nuevamente los niveles históricos (Fernandez Araóz y col., 2004). En el año 2004, el desembarque del conjunto costero fue de 81.435,5 toneladas, siendo las principales especies desembarcadas: corvina rubia, pescadilla de red, lenguados, rayas costera, pez palo, gatuzos y otros tiburones (Fernandez Araóz y col., 2005). Dentro de estas especies, la corvina rubia y los lenguados han despertado gran interés en el sector pesquero industrial debido a la alta calidad de sus carnes (Cousseau y Perrotta, 1998) y
En los últimos años, otra especie que ha despertado gran atención debido a su gran valor comercial es la de la vieira patagónica (Zygochlamis patagónica) (Lasta y Bremec, 1998). Los desembarques (en callos) de esta especie se incrementaron de 836 toneladas en 1989 a 6.151 toneladas en el año 2004 (FAO, 2005; SAGPyA, 2005). Datos de exportaciones del año 2001 indican la venta de 5.274 toneladas de callos en 28 millones de dólares (Redes, 2002).
La creciente demanda de los productos pesqueros para consumo humano y la crítica situación presente de algunas pesquerías tradicionales, hace necesario incrementar la información referente a recursos alternativos presentes en nuestras costas. Como se ha mencionado, el lenguado, la corvina rubia, y la vieira patagónica son especies muy valoradas en el sector industrial pesquero de nuestro país. Para alcanzar la sustentabilidad de estos recursos pesqueros no solo se requiere un plan de manejo adecuado y especifico para cada especie sino también incorporar tecnología adecuada de captura y procesamiento que permita formular y racionalizar estrategias efectivas para mantener la calidad de estos productos y prolongar su vida útil comercial.
1.1.1. Lenguado (Paralichthys patagonicus)
El lenguado Paralichthys patagonicus es una especie asociada al fondo que pertenece a la familia Paralichthyidae (Figura 1.1). Esta especies habita desde Cabo Frío, Brasil (22° S) hasta los 43° S en Argentina, en profundidades que llegan alrededor de los 120 metros. Es capturado por la flota costera de la provincia de Buenos Aires, por buques de rada o ría, costera y de altura que utilizan como arte de pesca redes de
arrastre de fondo (Cousseau y Perrotta, 1998). Los desembarques en el 2004 alcanzaron las 2.957,6 toneladas(Fernandez Araóz y col., 2005). Si bien este valor engloba las tres especies de lenguado (Paralichthys patagonicus; P orbignyanus y Xystgreuris rasile) presentes en nuestras costas, P. patagonicus es aparentemente la más abundante (Cousseu y col., 2004).
Figura 1.1. Lenguado (Paralichthys patagonicus)
El lenguado patagónico alcanza un tamaño promedio en las hembras de 48 cm y 62 cm machos, longitud total (Cousseau y Perrotta, 1998; Cosseau y col., 2004). El período reproductivo se extiende entre los meses de septiembre y febrero, con la máxima intensidad en noviembre (Macchi y Díaz de Astarloa, 1996). Esta especie es comercializada en el mercado interno como filete fresco y se exporta fundamentalmente como filete congelado interfoliado.
1.1.2 Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)
La Corvina Rubia (Micropogonias furnieri) es una especie demersal, perteneciente a la familia Sciaenidae (Figura 1.2). Está presente en la costa este americana desde Veracruz (20° 20´ N, México) hasta El Rincón, en Argentina (42° S) y
esporádicamente en la costa Norte del Golfo San Matías (41° 10´ S) (Isaac, 1988). En Argentina, la corvina rubia es capturada con el conjunto de especies demersales costeras, con redes de arrastre de fondo por la flota de ría o rada y costera, con la modalidad “a la pareja” (dos buques arrastrando una misma red). La captura total desembarcada en el 2004 alcanzó 10.289,7 toneladas (Fernandez Araóz y col., 2005) En las costas bonaerense las talla más frecuentes en los desembarques comerciales oscilan entre 30 y 50 cm (longitud total), siendo la talla máxima observada de 74 cm (Carozza y col., 2004).
Figura 1.2. Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)
La corvina rubia es una especie eurihalina, que se adapta a ambientes muy diferentes en cuanto a la salinidad y temperatura (Guerrero y col., 1997). Se reproduce en una amplia franja costera, desde la primavera hasta el inicio del verano (octubre-diciembre) (Acha y col., 1999). Se la comercializa entera, congelada en el mercado externo y fresca en el interno. Los productos obtenidos son: enteros y filetes, congelados enteros en bloques, tronco, eviscerados, filetes interfoliados. Los principales destinos de exportación son los países asiáticos (Carozza y col., 2004).
1.1.3. Vieira Patagónica (Zygochlamys patagónica)
La vieira patagónica (Zygochlamys patagónica) es un molusco bivalvo (Figura 1.3), que se distribuye geográficamente desde Tierra del Fuego hasta los 35°S, se lo encuentra a profundidades de entre 40 y 200 m (Lasta y Zampatti, 1981; Waloszek y Waloszek, 1986) Las concentraciones más importantes, denominadas bancos, se localizan entre 39° 30’ S y 42° 30’ S entre profundidades de 80 y 120 metros (Lasta y Bremec, 1998). Para su captura se utiliza una red de arrastre de fondo (tipo tangonera), denominada “rastra”.
Figura 1.3. Vieira patagónica (Zygochlamys patagónica)
La vieira patagónica es una especie dioica con dos pulsos de reproducción, en primavera y a fines del verano (Waloszek y Waloszek, 1986; Orensanz y col., 1991). La talla mínima de captura establecida por las autoridades pesqueras es de 55 mm de alto total. Dicha talla se alcanza entre los tres a cinco años, dependiendo la misma de la latitud (Lasta y Bremec, 1999). Las principales formas de comercialización son los músculos aductores aislados (callos) frescos y/o congelados (Lasta y Bremec, 1999). Estos productos marinos se consumen, en general, como pescado crudo (en forma de
sushi y sashimi), además se han desarrollado tecnologías que permiten la producción de hamburguesas a partir de los callos.
1.2. CALIDAD Y DETERIORO DE LOS PRODUCTOS PESQUEROS
Los productos pesqueros son considerados alimentos muy perecederos debido a su composición química y al pH poco ácido de su carne. La pérdida de la frescura de estos alimentos ocurre por la acción de enzimas endógenas presentes en las vísceras y en los músculos (“autolisis”) y/o por el desarrollo de microorganismos deteriorantes (Uchiyama y Ehira, 1974; Pedrosa-Menabrito y Regenstein, 1988; Haard, 1992). La flora contaminante se asienta básicamente en la piel, las branquias y el intestino y se extiende a otros tejidos donde existen sustancias nutritivas adecuadas y un pH relativamente elevado que favorece el desarrollo de dichos microorganismos (Huss, 1995). La degradación bacteriana de componentes solubles de bajo peso molecular produce metabolitos volátiles (trimetilaminas, amoníaco, etc.) responsables del olor y sabor desagradables, que conducen al rechazo sensorial del pescado (Huss, 1995; Ababouch y col., 1996; Elotmani y col., 2004). Por otro lado, la acción de proteasas endógenas y/o bacterianas provoca cambios en las propiedades texturales que afectan la calidad de estos productos (Haard, 1992; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual, 2000).
La velocidad de los procesos de descomposición que ocurren en el pescado depende de factores intrínsecos de las especies tales como la edad, el tamaño, la composición química de los tejidos, el estado nutricional y las condiciones fisiológicas de los ejemplares. Asimismo depende de la composición cualitativa y cuantitativa de la microflora inicial asociada al ambiente de procedencia. Factores extrínsecos como las
condiciones de captura y los métodos de conservación son también determinantes (Murray y Shewan, 1979; El-Marrakchi y col., 1992; Gennari y col., 1999).
El método más utilizado para conservar los productos pesqueros, desde su captura hasta la llegada al consumidor es la aplicación del frío. En función de la temperatura empleada se puede clasificar al pescado en: refrigerado, congelado y ultracongelado (Madrid y col., 1999). El pescado refrigerado es el que desde su captura esta conservado en hielo. Habitualmente, este se distribuye cubriendo todo el pescado, en una proporción que varia entre 1:1 y 1:4, respecto al pescado, con lo que se garantiza temperaturas entre 1 ºC y 6 ºC. Dichas condiciones no detienen los procesos autolíticos y microbiológicos implicados en el deterioro, pero producen una fuerte inhibición de los mismos (Madrid, y col., 1999; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual, 2000).
1.2.1. Cambios autolíticos
1.2.1.1. Cambios post-mortem relacionados con el metabolismo energético
El músculo es un tejido altamente especializado y su funcionamiento representa un ejemplo clásico de la conversión de energía química en energía mecánica en los sistemas vivos. Este tejido necesita una gran cantidad de energía para poner en marcha el aparato contráctil. Esta energía es suministrada por el adenosina trifosfato (ATP), que es un compuesto altamente energético. En general, el contenido total de ATP en el músculo no es suficiente para una contracción larga y sostenida; por lo que este compuesto debe ser resintetizado a partir de varias fuentes de energía. La primera
músculo de los vertebrados) o la fosfoarginina (en algunos invertebrados marinos) (Beis y Newsholme, 1975; Pörtner, 1993; Ellington, 2001). Estos compuestos contienen un enlace fosfato de alta energía que se transfieren rápidamente al adenosin difosfato (ADP), reconstituyendo al ATP
Creatina + ATP Creatina Fosfato + ADP
En general, el contenido de compuestos fosfágenos es reducido. Distintos estudios indican que la cantidad de creatina en el músculo de pescado varia dependiendo de la especie y del tipo de músculo (Beis y Newsholme, 1975; Ikeda, 1980). La merluza, el congrio chileno y la corvina presentan cantidades relativamente bajas de creatina (valores que promedian los 250 mg/100g de tejido), mientras que los escómbridos (atún, bonito, caballa, etc.) presentan valores más altos, alrededor de 500 mg/100 g de músculo (Contreras-Guzmán, 2002). Estos valores concuerdan con el concepto de que las especies veloces tienen niveles altos de creatina. Por otro lado, se estableció una relación entre el contenido de creatina y la función muscular. Los músculos oscuros (adaptados para actividades continuas y prolongadas) contienen un promedio de 316 ± 19,1 mg/100g de creatina mientras que los músculos blancos (adaptados a contracciones musculares rápidas y explosivas) presentan 420 ± 38,2 mg/100g, (Beis y Newsholme, 1975; Kawashima y Yamanaka, 1992; Contreras-Guzmán, 2002). Como se ha mencionado, en los invertebrados y crustáceos marinos la función fosfatógeno es realizada principalmente por la arginina, hallándose cantidades que promedian los 300 mg/100 g. de tejido (Kawashima y Yamanaka, 1995).
La fuente energética principal para mantener el nivel fisiológico de ATP en el tejido muscular es la degradación del glucógeno almacenado. Dicha degradación ocurre a través de la ruta del ciclo del ácido cítrico y el transporte de electrones mitocondrial (respiración aerobia) y proporciona una gran cantidad de moléculas de ATP por molécula de sustrato utilizado (Figura 1.4). Cuando el músculo esta sometido a un estrés intenso y la cantidad de oxígeno disponible no es suficiente para mantener la función mitocondrial, la glúcolisis anaerobia es la que predomina. Durante la misma, se produce una degradación incompleta de los sustratos y la acumulación de lactato siguiendo la ruta de Embden Meyehoff (Tarr, 1966). Gran parte del lactato formado atraviesa la membrana del músculo y vía sanguínea llega al hígado donde es utilizado para la resíntesis de glucosa. La glucosa resintetizada vuelve nuevamente al músculo para finalmente formar glucógeno (Tarr, 1966). Otra fuente de energía es la que proviene de otros sustratos (grasas y aminoácidos) y es utilizada para mantener contracciones prolongadas.
Tras la captura y muerte del pescado, la interrupción de la circulación sanguínea priva al músculo del aporte de oxígeno y de toda una serie de nutrientes celulares. El sistema mitocondrial deja de funcionar en todas las células y el ATP se agota gradualmente por la acción de diversas ATPasas, algunas propias de las proteínas contráctiles y otras de los sistemas de membrana. Como se ha descripto, una pequeña cantidad de ATP es resintetizado temporalmente por la conversión de la fosfocreatina en creatina y la trasferencia del fosfato al ADP (Nazir y Magar, 1963, Beis y Newsholme, 1975; Iwamoto y col., 1987). Posteriormente tiene lugar la glucólisis anaerobia, acumulándose lactato como producto final, con la concomitante disminución
del pH muscular (Love, 1980; Kramer y Peter, 1981; Haard, 1992; Izquierdo-Pulido y col., 1992; Huss, 1995). Resulta interesante notar que en los invertebrados marinos, la octopina y ácido láctico son los productos finales del metabolismo anaeróbico muscular (Hiltz y Dyer, 1971; Kawashima y Yamanaka, 1995), todos los cambios descriptos precedentemente se resumen en la Figura 1.4 (extraída de Huss, 1995). El grado de acumulación post-mortem de estos metabolitos depende de las temperaturas de almacenamiento (Hiltz y Dyer, 1973; Kawashima y Yamanaka, 1995).
Figura 1.4. Descomposición aeróbica y anaeróbica del
glucógeno en el músculo de peces e invertebrados marinos (Huss, 1995)
Distintos estudios indican que el contenido de glucógeno, la velocidad de degradación y consecuentemente el pH final del músculo varia según la especie, el tipo de músculo, el estado nutricional del pez, la condición gonadal y el grado de
agotamiento al momento de la muerte (Huss, 1995; De Vido de Mattio y col., 1992, 2001; Ocaño-Higuera, 2003).
Un factor clave que limita la magnitud de la degradación del glucógeno muscular es el pH, cuando este es demasiado bajo, son inhibidas ciertas enzimas críticas y la glucólisis se detiene (Newbold y Scopes, 1967; Hiltz y Dyer, 1970). Ikeda (1980) determinó una mayor acumulación de glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato en camarón y ostión almacenados en hielo, mientras que en bonito observó un incremento de fructosa-di-fosfato. Por otro lado, se observó un aumento de ácido láctico en camarón y bonito mientras que en ostión el compuesto acumulado fue el ácido pirúvico (Ikeda, 1980). Estos resultados sugieren que, en moluscos, algunas enzimas glucolíticas intermediarias faltan o están desactivadas debido a el pH ácido o a las bajas temperaturas de almacenamiento (Shibata, 1977). Ikeda, (1980) observó también que la deshidrogenasa láctica se inhibe a pH 5,4 - 5,5. Con respecto a la temperatura de almacenamiento, estudios realizados en camarón (Penaeus japonicus) mostraron una acumulación de 50 mg de ácido láctico/ 100 g de músculo luego de almacenarlo por un día a 5 ºC, por 7 días a 0 ºC y por 9 días a -1 ºC (Matsumoto y Yamanaka, 1990).
Cabe destacar que el descenso del pH que acompaña la glucólisis del músculo de las especies pesqueras post-mortem tiene un efecto determinante en la calidad, ya que afecta a las propiedades físicas de la carne (Tomlinson y Geiger, 1962; Love, 1988; Izquierdo-Pulido y col., 1992; Færgemand y col., 1995; Ólafsdottir y col., 1997). A medida que el pH disminuye, se reduce la carga neta de la superficie de las proteínas musculares, causando su desnaturalización parcial y disminuyendo su capacidad de
retener agua. La pérdida de agua tiene un efecto perjudicial en la textura del músculo. Distintos autores demostraron que existe una relación inversamente proporcional entre la dureza del músculo y el pH (Love, 1975; Izquierdo-Pulido y col., 1992).
1.2.1.2. Consecuencia del agotamiento de ATP
La consecuencia del agotamiento del ATP en las células es la detención de las reacciones biosintéticas y la pérdida de la capacidad para mantener la integridad celular. En las fibras musculares, cuando la concentración de ATP cae por debajo de un determinado valor critico (en general valores < 1,0 µmoles/g de músculo) se produce un fenómeno singular, denominado rigor-mortis o rigidez cadavérica. Este fenómeno se caracteriza por la pérdida de la extensibilidad y la flexibilidad muscular, debido a la unión irreversible de los filamentos de actina y miosina (Iwamoto y col., 1987; Watabe, y col., 1989; 1991). El estado de rigidez en el pescado se mantiene durante uno o más días y luego se resuelve por la acción de enzimas proteolíticas que degradan ciertos componentes del tejido muscular (Bremner y Hallet, 1985; Koohmaraie, 1994; Kolodziejska y Sikorski, 1995; Kubota y col., 2001; Ladrat y col., 2003).
El tiempo entre el inicio y la resolución del rigor-mortis dependen de diversos factores, tales como la especie, la talla, las condiciones fisiológicas antes del sacrificio, la forma de sacrificio, la manipulación y la temperatura de almacenamiento. Se han publicado numerosos estudios sobre el efecto de cada uno de estos factores en la evolución del rigor de las especies marinas (Johnston y Moon, 1980; Botta y col., 1987; Iwamoto, y col., 1987; Watabe, y col., 1989). En pescado exhausto, como las especies capturadas por arrastre, la fase de rigor pasa rápidamente. En especies pequeñas,
veloces y fatigadas sucede lo mismo (Huss, 1995). El efecto de la temperatura sobre el
rigor no es uniforme. Generalmente se acepta que el comienzo y la duración del rigor-mortis en pescado resultan más rápidos a mayor temperatura, pero se ha observado en
ciertas especies tropicales un efecto opuesto (Curran y col., 1986; Parry y col., 1987). En estas especies el inicio del rigor es más rápido a 0 °C que a 10 °C. Este comportamiento se atribuye al hecho de que a bajas temperaturas parece haber una cierta incapacidad del retículo sarcoplasmático para reabsorber el calcio, acelerando la contracción (Pöulter y col., 1982; Iwamoto y col., 1987; 1991).
El conocimiento de las etapas del rigor-mortis es de importancia cuando el pescado es fileteado antes o procesado. Durante el rigor el cuerpo del pescado está completamente rígido, el rendimiento del fileteado resulta muy bajo y una manipulación tosca puede causar el desgarramiento de los filetes. Si los filetes son removidos antes del rigor, el músculo puede contraerse libremente y se encogerá al comenzar el rigor. Si el pescado es cocido antes del rigor, la textura será muy suave y pastosa. Por el contrario, la textura es dura cuando el pescado es cocido durante el
rigor. Posterior al rigor la carne se torna firme, exhudativa y elástica (Tomlinson y col.,
1965, Huss, 1995).
1.2.1.3. Cambios autolíticos y catabolismo del ATP
Otra secuencia importante de la pérdida de ATP en el músculo post-mortem es su degradación. El ATP es convertido, por reacciones de desfosforilación, primero en adenosina difosfato (ADP) y posteriormente en adenosina monofosfato (AMP). El AMP es a su vez desaminado a inosina monofosfato (IMP) y este se degrada a inosina
(HxR) e hipoxantina (Hx) (Saito y col., 1959; Kassemsarn y col., 1963 Ehira y Uchiyama, 1986) (Figura 1.5). En general, esta degradación procede de la misma forma en la mayoría de las especies marinas, sin embargo, en invertebrados marinos la vía degradativa de los nucleótidos no ha sido claramente establecida. Diversos estudios proponen para estos organismos un mecanismo alternativo, que considera una secuencia de desfosforilaciones hasta adenosina (Ade), la que posteriormente se degrada a HxR e Hx y en algunos casos puede formarse xantina y ácido urico (Saito y col., 1958; Arai, 1960; Hiltz y Dyer, 1970; Sakaguchi y col., 1990) (Figura 1.5).
Figura 1.5. Secuencia de la degradación post-mortem del ATP en
En general, después de la muerte de pez, las moléculas de ATP se hidrolizan rápidamente hasta IMP por la acción de enzimas endógenas (Tarr, 1966; Surette y col., 1988; Okuma y col., 1992). La posterior degradación del IMP a HxR e Hx es más lenta y participan tanto enzimas autolíticas como microbianas (Surette y col., 1988; Ryder y col., 1993; Ólafsdóttir y col., 1997). Distintos estudios han determinado que la velocidad de estas reacciones enzimáticas varía ampliamente entre especies (Ryder, 1985; Sakaguchi y col., 1990), con el tipo de músculo (Obatake y col., 1988), con la condición biológica de los ejemplares (sexo, estadio gonadal, etc.) (De Vido de Mattio y col., 1992, 2001; Sagedhal y col., 1997) y con el tipo de almacenamiento (Surette y col., 1988).
Los contenidos de los metabolitos de degradación de ATP durante el almacenamiento en hielo de los distintos productos pesqueros, han sido ampliamente utilizados como indicadores biológicos del grado de frescura (Saito y col., 1959; Ehira y Uchiyama, 1973; Yokoyama y col., 1994). Se ha demostrado que el IMP es el principal responsable del aroma y del sabor del pescado fresco; incluso en Japón es usado como un agente saborizante (Kuninaka y col., 1964). Por el contrario, la Hx imparte un sabor amargo típico del pescado en deterioro (Hughes y Jones, 1966). Saito y col., (1959) fueron los primeros en desarrollar un índice para el análisis de la calidad del pescado basados en las concentraciones de todos los productos de degradación de ATP, dicho índice es conocido como el valor K. Otros índices no tan difundidos son el valor H, basado en la formación de Hx (Loung y col., 1991) y el índice G que da mayor importancia a la formación de HxR (Burns y Ke, 1985).
1.2.1.4. Cambios relacionados con la fracción lipídica
El contenido graso de los pescados y mariscos es muy variable, depende de la especie, de la edad, del estado nutricional y del desarrollo gonadal, entre otros factores (Love, 1975; Hazel, 1979; Brown, 1986, Contreras-Guzman 2002). Las características tecnológicas de las especies pesqueras se ven afectadas principalmente por el contenido de lípidos (Huss, 1995) y por tal razón resulta sumamente útil clasificar las especies según el porcentaje de grasa en: magras (menor al 2,5%), semi-grasas (entre 2,5 y 9,5%), y grasas cuando contienen un porcentaje mayor al 9,5% (Jacquot, 1961, Murray y Burt, 1969, Contreras-Guzmán 2002). En la mayoría de las especies pesqueras los depósitos grasos consisten principalmente en triglicéridos compuestos de ácidos grasos de cadena larga (14-22 átomos de carbono) con un alto grado de instauración, tales como el ácido linoleico (LA 18:2 ω6), ácido linolénico (LLA18:3 ω3) ácido araquidónico (AA, 20:4 ω6) ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 ω3) y ácido decosahexaenoico (DHA, 22:6 ω3) (Stansby y Hall, 1967; Haard, 1992; Huss, 1995).
Las modificaciones más importantes que tienen lugar en la fracción lipídica, durante el almacenamiento post-mortem de las especies pesqueras están relacionadas con procesos de hidrólisis y con reacciones de oxidación (Deng, 1978; Shewfelt, 1981; Ladikos y Lougovois, 1990). Ambas reacciones son de gran importancia para la vida útil de estos productos, ya que dan como resultado distintas sustancias, las cuales algunas tienen sabores y olores desagradables (rancio) y otras pueden contribuir a cambios en la textura (Haard, 1992; Huss, 1995). Los ácidos grasos poliinsaturados presente en los lípidos del pescado son oxidados mediante un mecanismo autocatalítico
dando hidroperóxidos, compuestos inodoros e insípidos (Ladikos y Lougovois, 1990). Estos hidroperóxidos continúan degradándose formándose aldehídos, cetonas, alcoholes, pequeños ácidos carboxílicos y alcanos que originan un extenso espectro de olores y en algunos casos decoloración (Fuijii y col., 1989). Estas reacciones autocatalíticas pueden ser iniciadas y aceleradas por calor, luz (especialmente luz UV) y diversas sustancias orgánicas e inorgánicas (tales como Cu y Fe). Los hidroperóxidos también pueden ser formados enzimáticamente, por lipoxigenasas presentes en diferentes tejidos del pescado en cantidades variables (German y Kinsella, 1985; German y col., 1991).
Por otra parte, durante el almacenamiento, aparece una cantidad considerable de ácidos grasos libres. Los triglicéridos presentes en los depósitos de grasas son escindidos principalmente por lipasas del tracto digestivo o lipasas excretadas por ciertos microorganismos, mientras que las lipasas musculares desempeñan un papel menor (Liston, 1965; Deng, 1978; Shewfelt 1981).
1.2.1.5. Cambios autolíticos que involucran enzimas proteolíticas
El proceso de ablandamiento en el músculo, llamado resolución del rigor-mortis es extremadamente importante y ha sido ampliamente estudiado en carnes rojas pero aún no ha sido claramente establecido en pescado (Ladrat y col., 2003). La causa principal de dicho proceso es la pérdida de la regulación biológica de las proteasas que funcionan en el recambio de las proteínas del músculo en el animal vivo. Durante el
debilitando la estructura miofibrilar y promoviendo el ablandamiento (Asghar y Bhatti, 1987; Yamashita y Konnagaya, 1992; Koohmaraie, 1994, Jiang, 2000; Ladrat y col., 2003).
Las proteasas son enzimas que están distribuidas en diferentes tejidos del pescado, siendo principalmente abundantes y variadas en el aparato digestivo y en el músculo esquelético. Las enzimas proteolíticas del aparato digestivo causan grandes defectos en la calidad, particularmente cuando el pescado se alimenta abundantemente antes de la captura (Haard, 1992). Las enzimas de los apéndices pilóricos e intestino presentan actividad máxima entre pH 7,0 y 9,0; mientras que las enzimas del estomago y del hígado son activas a pH ácidos (Haard y col., 1979; Nip y col., 1985).
Diversas proteasas se han aislado del músculo de pescado. La actividad de las mismas depende de la integridad de la célula, de la cantidad de enzima nativa, de la presencia de inhibidores, activadores y cofactores adecuados y del pH de la disolución (Ladrat y col., 2003). Se han establecido dos grandes líneas degradativas intracelulares: una de origen lisosomal (catepsinas) y otra de origen citosolica calcio-dependiente (calpaínas). Otras proteasas, tales como las metaloproteinasas presentan un importante papel en el ablandamiento de la matriz extracelular muscular, específicamente sobre proteínas del tejido conectivo (Bremner y Hallett, 1985;. Sato y col., 1991; Kubota y col., 2001, Ladrat y col. 2003). La contribución de cada sistema proteolítico descripto no es clara, pero se ha sugerido que actúan sinergicamente en el tiernizado post-mortem del pescado.
Como se ha mencionado, las catepsinas son enzimas lisosomales que se encuentran en casi todos los tejidos animales (Goll y col., 1989, 1992). Estas muestran actividad optima a pH ácidos (Etherington, 1984). En el tejido vivo, las catepsinas son responsables de la degradación proteica en áreas de tejido dañado. Se han aislado alrededor de 13 catepsinas (Kolodziejska y Sikorski, 1995), entre ellas la B, D y L han sido observadas en tejido muscular de pescado (Jiang y col., 1996; Aoki y Ueno, 1997; Ogata y col., 1998). Después de la muerte, la disminución del pH debilita la membrana lisosomal, liberando las captesinas a los fluidos celulares. En relación a sus efectos sobre la degradación del tejido muscular, estudios realizados in vitro demostraron una gran susceptibilidad de varias proteínas miofibrilares. La cadena pesada de miosina, α-actinina, desmina, actina, troponina T, y tropomiosina son degradadas por las catepsinas B, D y L (Makinodan e Ikeda, 1969; Doke y col., 1980; Reedi y col., 1992; Aoki y Ueno, 1997; Aranishi y col., 1998; Ogata y col., 1998; Ladrat y col., 2003). Por otra parte, se ha demostrado que estas enzimas presentan la capacidad de degradar proteínas de alto peso molecular (titina, proteína C y proteína M), lo que sugiere que su principal acción podría estar dirigida al filamento grueso (Zeece y col., 1986; Zeece y Katoh, 1989).
El segundo grupo de proteasas musculares mencionados, son las proteasas neutras activadas por calcio, denominadas calpaínas (µ-calpaína que requieren para su actividad 50-70 µM de Ca2+ y m-calpaína que requieren 1-5 mM Ca2+). Muchas de estas enzimas han sido aisladas y caracterizadas de músculos de especies marinas como: carpa, langosta americana y vieiras (Toyohara y col., 1983; Taneda y col., 1983; Mykles y Skinner, 1986; Maeda y col., 1992a,b). Distintos estudios señalan que las
calpaínas juegan un rol principal en la proteólisis post-mortem durante los primeros días de almacenamiento (Muramoto y col., 1989; Goll y col., 1992; Haard, 1992), en particular, se ha sugerido que degradan las proteínas de la línea Z (Astier y col., 1991; Papa y col., 1996, 1997; Ladrat y col., 2003).
Otras enzimas importantes en los cambios texturales que ocurren en el pescado durante el almacenamiento son las colagenasas (Huss, 1995) La carne de los peces teleósteos está dividida en bloques de células musculares separadas en miotomas, mediante tejido conectivo denominado miocomata. Cada célula muscular o fibra está rodeada por tejido conectivo que se une a la miocomata al final de la célula mediante finas fibrillas de colágeno. Durante el almacenamiento refrigerado, estas fibrillas se deterioran (Bremner y Hallett, 1985). Sato y col. (1991) demostraron en trucha refrigerada una solubilización del colágeno tipo V de los miotomos, debido a la actividad de colagenasas autolíticas.
Los péptidos de bajo peso molecular y los aminoácidos libres producidos por las enzimas proteolíticas descriptas no sólo disminuyen la aceptación comercial del pescado, sino también se ha demostrado que acelera el crecimiento de bacterias deteriorantes, ya que proporciona un medio de crecimiento propicio para su desarrollo (Aksnes y Brekken, 1988). La mayoría de estas bacterias presentan la capacidad de descarboxilar aminoácidos libres, produciéndose una gran variedad de aminas biógenas que disminuyen significativamente el valor nutritivo y comercial de estos productos.
1.2.1.6. Formación de Aminas Biógenas
Las aminas biógenas son compuestos orgánicos nitrogenados de carácter básico, presentes en animales, plantas y microorganismos como consecuencia de distintos procesos metabólicos (Brink y col., 1990; Halász y col., 1994). Mariné-Font y col. (1995) clasificaron a las aminas biógenas encontradas en los alimentos, en base a su estructura química: aminas aromáticas: (histamina, β-feniletilamina, tiramina, triptamina); diaminas alifáticas: putrescina y cadaverina; y poliaminas alifáticas: agmatina, espermina y espermidina (Figura 1.6).
En función de su origen las aminas pueden dividirse en dos grupos: biogénas y naturales (Bardócz, 1995). Las aminas biógenas se forman por la descarboxilación microbiana de los aminoácidos precursores. Estas incluyen: tiramina β-feniletilamina, histamina y triptamina, que resultan de la descarboxilación de la tirosina, fenilalanina, histidina y triptófano respectivamente. Las aminas naturales (de origen fisiológico), que se forman como consecuencia de distintos procesos metabólicos celulares normales de los seres vivos. Dentro de este grupo se incluyen putrescina, cadaverina, espermina, espermidina y agmatina. Algunas de estas aminas, como la putrescina, la cadaverina y la agmatina, también se pueden formar como consecuencia de la actividad descarboxiladora de los microorganismos (Bardócz, 1995; Bardócz, 1999).
Figura 1.6. Estructura química de las aminas biógenas
Las aminas biógenas se pueden encontrar en una amplia gama de alimentos, tanto de origen animal como vegetal, en especial en aquellos alimentos proteicos o con un cierto contenido de aminoácidos libres, que se encuentra expuesto a condiciones que permiten el desarrollo y la actividad microbiana (Eitenmiller y De Souza, 1984). En pescado fresco los contenidos de aminas biógenas son muy bajos; sin embargo, a medida que avanza su deterioro, aumenta debido a la descarboxilación de los aminoácidos precursores por acción de enzimas bacterianas (Halász y col., 1994). Para que se formen las aminas biógenas, además de microorganismos, es necesaria la disponibilidad de sustratos (aminoácidos libres y péptidos) y la presencia del cofactor
piridoxal 5’-fosfato. Asimismo, son necesarias condiciones de pH y actividad de agua óptimas para la expresión de la actividad microbiana responsable de la descarboxilación de los aminoácidos precursores (Behling y Taylor, 1982; Brink y col., 1990).
El interés del estudio de las aminas biógenas en los productos pesqueros radica tanto en las posibles implicancias toxicológicas de estos compuestos para la salud humana, como en su significado higiénico-sanitario durante las etapas del procesado o almacenamiento (Mariné-Font y col., 1995). La intoxicación por aminas biógenas, denominada habitualmente “intoxicación histamínica” se trata del trastorno asociado a la ingesta de alimentos que contienen niveles anormales de aminas biógenas, especialmente de histamina y tiramina (Taylor, 1986). Históricamente esta afección ha sido denominada “intoxicación por escómbridos” debido a la frecuente asociación de la misma con el consumo de pescado deteriorado de las familias Scomberesocidae y
Scombridae, que incluyen a los atunes y las caballas (Taylor y Bush, 1988; Yeannes y
Casales, 1995; Maher y col., 2000). Sin embargo, también se han dado casos de este tipo de trastorno por el consumo de otras especies pesqueras, e incluso de otros alimentos como quesos, vinos y productos cárnicos (Mariné-Font y col., 1995; Lehane y Olley, 1999, 2000). Los síntomas más frecuentes de esta intoxicación son: trastornos gastrointestinales (náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal y digestión pesada), neurológicos (cefalea), circulatorios (hipotensión y palpitaciones) y cutáneos (erupción, rubor, prurito, ardor, urticaria, edemas e inflamación local) (Stratton y col., 1991). Desde una perspectiva legal, la FDA (Food and Drug Administration) propuso en 1995 como nivel máximo permitido de histamina un valor medio de 50 mg/kg en productos de la pesca (FDA, 1995). La Unión Europea, por su parte, establece para los pescados
de las familias de los escómbridos y clupeidos, un límite más elevado, un valor promedio máximo de 100 mg/kg (CEE/493/91).
1.2.2. Cambios Microbiológicos
Es de aceptación generalizada que la alteración del pescado de mar tiene como causa principal el crecimiento bacteriano (Liston, 1980; Gram y Huss, 1996). El músculo de peces vivos y sanos normalmente no presenta microorganismos. Las bacterias del pescado fresco se encuentran localizadas en la superficie externa (piel y branquias) y en las vísceras (Shewan, 1977; Ababouch y col., 1996). La flora predominante refleja el medio ambiente que circunda el pez vivo y su alimentación (Shewan, 1977). En pescados procedentes de aguas templadas predominan las bacterias Gram-negativas psicrótrofas, mientras que en especies de aguas tropicales se observa un alto predominio de flora mesófila Gram-positiva (Shewan, 1977; Huss, 1995)
El crecimiento bacteriano depende de distintos factores tales como la especie, la edad, el tamaño del ejemplar, la alimentación, el estado fisiológico y las composiciones cualitativas y cuantitativas de la microflora inicial. Asimismo, depende del arte de pesca, de la manipulación y de las temperaturas de almacenamiento (Murray y Shewan 1979; El-Marrakchi y col., 1992; Abgrall, 1994; Gennari y col., 1999). El método de captura es con frecuencia el factor que más influye en el número y en el tipo de bacterias presentes en el pescado. Ejemplares obtenidos por arrastre presentan usualmente una carga bacteriana mayor que los capturados con línea (Ward y Baj, 1988).
Durante el almacenamiento del pescado, las bacterias de la superficie, branquias y del intestino se desarrollan e invaden la masa muscular, llegando a alcanzar valores de 108 –109 unidades formadoras de colonias por gramo de carne (UFC/g) cuando el deterioro es evidente (Gram, 1989; Ababouch y col., 1996).
La flora contaminante habitual del pescado refrigerado está representada por distintos géneros de bacilos psicrótrofos Gram-negativos, no esporógenos:
Achromobacter spp., Pseudomonas spp., Flavobacterium spp., Shewanella spp., Cytophaga spp. En distintas circunstancias se aislaron otros grupos como Vibrio spp., Clostridium spp., Micrococcus spp., Alteromonas spp., Moraxella spp., enterobacterias,
microorganismos coliformes (Eschearichia spp., Proteus spp. Serratia spp.
Enterobacter spp. Citrobacter spp.), Bacillus spp. y Listeria spp. También se han
encontrado bacterias ácido-lácticas, mohos y levaduras (Shewan, 1961, Horsley, 1977; Shewan, 1977; Gram y col., 1987; Huss, 1995; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual, 2000). Pero no todos los géneros presentes en el pescado son responsables de los olores y sabores anormales asociados con el deterioro. Estos varían en función de las condiciones de almacenamiento y la composición del producto (Huss, 1995). Los microorganismos específicos del deterioro (OED) son en su mayoría organismos que presentan la capacidad de producir H2S y reducir oxido de trimetilamina (OTMA).
Dichos metabolitos se forman debido a la utilización de moléculas relativamente pequeñas e hidrosolubles (mucopolisacáridos, aminoácidos libres, péptidos, OTMA y otros compuestos, como nutrientes durante las etapas activas del crecimiento bacteriano (Shewan y col. 1960; Shewan, 1977; Huss, 1995 Ababouch y col., 1996).
Los principales microorganismos deteriorantes identificados en el pescado almacenado en hielo son: Shewanella putrefaciens que produce H2S, N-TMA e
hipoxantina (Gram y col., 1987); Pseudomonas spp. que producen compuestos volátiles como aldehídos, cetonas, ésteres y sulfuros no-H2S (Gram y col., 1990); Photobacterium phosphoreum que forma N-TMA e hipoxantina (Dalgaard y col.,
1997). Además, otras bacterias identificadas como deteriorantes son Vibrio spp.,
Alteromonas spp. y Aeromonas spp (Shewan, 1977; Gram y col., 1987; Huss, 1995).
1.3. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL PESCADO
En industria pesquera, el término "calidad” puede tener distintas acepciones. Frecuentemente, esta palabra se relaciona con especies costosas o con el tamaño de la pieza, con la ausencia de agentes nocivos tales como parásitos, compuestos químicos y organismos patógenos, o es usada como sinónimo de frescura y apariencia, refiriéndose al grado de deterioro que ha sufrido el pescado por la acción de enzimas autolíticas endógenas y/o por el desarrollo de una flora de contaminación variada (Huss, 1995)
Se han propuesto numerosos métodos de evaluación de la frescura y calidad del pescado: químicos, físicos, microbiológicos y sensoriales. Ningún método aislado suele ser suficiente para evaluar la calidad de los productos marinos, por lo que frecuentemente se aconseja realizar al menos dos pruebas, una para determinar la pérdida de frescura y otra para detectar el deterioro microbiano (Morales y col., 1996).
1.3.1. Métodos Químicos
El interés de los métodos químicos en la evaluación de la calidad de los productos pesqueros, está relacionado con la capacidad para establecer estándares cuantitativos. En general, estos métodos aportan resultados más objetivos, fiables y seguros, pero requieren en muchos casos de personal experimentado e instrumentación que, a veces, tiene un costo elevado. La mayoría de los métodos químicos utilizados en la evaluación de la calidad del pescado implican el análisis de una sola sustancia o de diferentes sustancias que pertenecen a la misma familia (Huss, 1995). Para el análisis de los parámetros relacionados con el deterioro o la pérdida de frescura, existen técnicas de tipo general que son aplicables a la mayoría de las especies de pesqueras. Dichas técnicas se pueden clasificar en:
ª Métodos basados en la medida de la degradación del ATP
ª Métodos relacionados con cambios en la fracción nitrogenada básica ª Métodos relacionados con cambios en la fracción lipídica
También se han propuesto métodos con aplicación específica a determinados grupos o especies pesqueras. Así, la determinación del amoníaco evalúa el grado de deterioro de peces elasmobranquios, en los que se forman grandes cantidades de esta substancia debido a la descomposición bacteriana de urea (Huss, 1995). En el caso de crustáceos, la determinación del indol, producto de degradación del triptófano, se usa como alternativa al examen organoléptico, ya que se acepta que su formación es debida a una acción bacteriana (Chang y col., 1983).
1.3.1.1. Métodos basados en la degradación del ATP
Dentro de los cambios bioquímicos post-mortem que ocurren en el pescado, la degradación de ATP ha sido ampliamente estudiada con el propósito de monitorear la frescura y la vida útil de estos productos. Si bien, el catabolismo del ATP procede de la misma manera en la mayoría de las especies marinas (Figura 1.5), la velocidad de las distintas reacciones intermediarias de transformación de un catabolito a otro, varía considerablemente por factores tales como: la especie, el método de captura, la manipulación a bordo, la temperatura de almacenamiento y condiciones físicas del pescado, entre otros (Ryder, 1985; Surette y col., 1988; Sakaguchi y col., 1990; De Vido de Mattio y col., 1992, 2001; Sagedhal y col., 1997). En los últimos años, distintas investigaciones coincidieron en que el IMP y otros 5´nucleotidos funcionan como fuertes mejoradores del sabor, la HxR es más o menos insípida y la Hx imparte un sabor agrio o amargo al pescado. En este contexto, se ha propuesto a la acumulación de HxR e Hx como una medida de la perdida de calidad dada su alta correlación con paneles de evaluación sensorial en muchas especies marinas.
Varios índices han sido sugeridos para determinar el grado de deterioro a partir de los catabolitos del ATP. El valor K, descripto por Saito y col., (1959), definido como el cociente entre las concentraciones de HxR e Hx y la suma de las concentraciones de ATP y de todos sus compuestos de degradación (expresado como porcentaje), constituye un indicador ampliamente utilizado en este tipo de estudios. Los valores obtenidos tras la aplicación del índice K permiten clasificar a algunas especies comerciales en:
- K < 20 %: pescados muy frescos, apto incluso para su consumo crudo.
- 20 < K <40 %: pescados que se puede considerar frescos, pero que debe cocerse antes de ser consumido.
- K > 40 %: pescados no frescos, no apto para el consumo humano.
Karube y col. (1984) propusieron utilizar el valor K’. Dicho índice no tiene en cuenta las concentraciones de ATP, ADP o AMP, ya que el ATP se degrada rápidamente a IMP después de la muerte. En algunas especies el valor K y/o K’ no reflejan de forma adecuada los cambios de frescura ya que aumentan en forma muy rápida y luego se mantienen más o menos constantes. Esto se debe a una rápida acumulación de HxR e Hx. Para estas especies se utiliza el valor H que se basa en la concentración de Hx (Loung y col., 1991). En invertebrados marinos, Ohashi y col. (1991), determinaron que la relación entre el contenido de Hx y AMP es un buen indicador de frescura. Por otro lado, la carga energética de adenilato o valor CEA, que es un índice propuesto por Atkinson (1968) como un parámetro del control metabólico, se ha utilizado como un índice de frescura en distintos moluscos marinos (Yokoyama y col., 1994).
La concentración de Hx en extractos desproteinizados puede determinarse por: mediciones fotométricas, después de la reacción con un indicador de la oxidación-reducción, generalmente el 2,6 diclorofenol-indofenol (Burt y col., 1968); o después de su conversión en ácido urico por tratamiento con xantina oxidasa (Jones y col., 1964). Más recientemente se han adaptado métodos basados en cromatografía líquida de alta performance (HPLC). Este último método separa todos los componentes del
catabolismo de ATP y permiten su cuantificación (Murray y Thomson, 1983, Ryder 1985). Además se han desarrollado algunos instrumentos rápidos que utilizan sensores enzimáticos basados en electrodos de oxígeno y en enzimas inmovilizadas (Watanabe y col., 1983; Karube y col., 1984; Gill, 1990; Loung y col., 1992).
1.3.1.2. Métodos relacionados con cambios en la fracción nitrogenada básica
Nitrógeno Básico Volátil Total (N-BVT). Como se ha mencionado previamente, la
actividad bacteriana es principalmente responsable de la formación de una serie de compuestos nitrogenados básicos como el amoníaco, la trimetilamina (TMA), la dimetilamina (DMA), monometilamina y propilaminas (Reay y Shewan, 1949; Hollingworth y col., 1990; Huidobro y Tejada, 1990). Estas sustancias son conocidas en su conjunto como Nitrógeno Básico Volátil Total (N-BVT). El componente mayoritario de la fracción del N-BVT es la TMA. En pescado fresco la TMA, se encuentra en cantidades muy pequeñas y se va acumulando durante el deterioro como resultado de la reducción bacteriana del óxido de trimetilamina (OTMA). El OTMA esta presente en el tejido vivo de muchas especies de peces marinos, dicho compuesto desempeña un papel sustancial en los procesos de osmoregulación (Stenberg y col., 1984). La formación de TMA, a lo largo del deterioro, presenta gran variabilidad entre distintas especies marinas, principalmente por las diferencias en el contenido inicial de OTMA que presentan en su músculo (Rodríguez y col., 1997). Asimismo el contenido de TMA depende del crecimiento de la flora deteriorante, y del modo de captura, conservación y almacenamiento.
La determinación de N-BVT como índice de descomposición del pescado, ha sido ampliamente usada ya que presenta una elevada correlación con el grado sensorial de aceptación del mismo (Connell, 1995; Contreras-Guzmán 2002). Por otro lado, algunos autores han establecido buenas correlaciones entre los niveles de N-TMA y el recuento total de microorganismos (Wong y Gill, 1987; Wong y col., 1988; Pastoriza y col., 1996) por lo que propusieron a la determinación del N-TMA como método objetivo para evaluar la calidad higiénico-sanitaria del pescado de aguas saladas (Dyer, 1959; Castell y col., 1973). En general, el límite de aceptabilidad para el consumo humano se encuentra, para la mayoría de las especies, entre 10-15 mg N-TMA/100 g de músculo en pescado almacenado aeróbicamente (Connell, 1995). Este limite de aceptabilidad es solo aplicable al pescado conservado en hielo, ya que durante el almacenamiento a elevadas temperaturas se forman cantidades mayores de TMA (Ababouch y col., 1996; Baixas-Nogueras y col., 2001).
Existen muchos métodos y adaptaciones de los mismos para la estimación del N-TMA. Entre ellos se pueden mencionar los de microdifusión, colorimétricos, por electrodos específicos, enzimáticos, cromatográficos y por inyección de flujo.
Aminas biógenas. Como ya hemos mencionado, las aminas biógenas son bases
orgánicas de bajo peso molecular, presentes en animales, plantas y microorganismos como consecuencia de diversos procesos metabólicos. En pescado se acepta que el origen de contenidos elevados de aminas biógenas es fruto de la actividad aminoácido descarboxilasa que presentan algunos microorganismos y es por ello que su determinación se ha usado como un índice de calidad higiénico-sanitario del pescado
