Resúmenes de Tesis Doctorales

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Resúmenes de Tesis Doctorales

Tesis nº: 0837 Area: Biología

Caravelli, Alejandro Horacio. Desarrollo y evaluación de métodos para el control de microorganismos filamentosos en lodos activados

Director (es): Zaritzky, Noemí E.; Sarandón, Ramiro

La Plata: Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo, 2004.

Resumen

Uno de los problemas más comunes en plantas de tratamiento de efluentes líquidos por barros activados es la proliferación de microorganismos filamentosos, fenómeno denominado "bulking" filamentoso.

Los microorganismos filamentosos, presentes en grandes cantidades, sobresalen de la superficie de los flóculos de los barros activados originando una estructura en forma de red, que conduce a la formación de barros muy voluminosos y de difícil sedimentación y compactación. De esta forma, los barros pueden escapar de los sedimentadores secundarios de la planta de efluentes ocasionando un deterioro de la calidad del efluente final y produciendo contaminación y eutrofización de los cuerpos de agua receptores. Adicionalmente, el "bulking" filamentoso afecta el funcionamiento de la planta de efluentes y produce pobre desecación y espesamiento de los barros incrementando los costos implicados en la disposición final de los mismos.

Se han desarrollado métodos específicos y no específicos para el control de microorganismos filamentosos. Los primeros, que incluyen modificaciones en las condiciones operativas (concentración de oxígeno disuelto, nutrientes, pH, etc.) y en la configuración de la planta de tratamiento de efluentes, apuntan a eliminar las causas responsables del crecimiento de las bacterias filamentosas y favorecer el desarrollo de las floculantes. No obstante, estos métodos no siempre son efectivos y no en todas las situaciones pueden ser aplicados. En general implican altos costos para su implementación y además tardan demasiado tiempo en controlar el "bulking" filamentoso.

Por tales motivos, en el presente trabajo de tesis se ha propuesto estudiar diferentes métodos no específicos y de rápida acción para el control de bacterias filamentosas presentes en barros activados.

El objetivo general ha sido explorar en forma comparativa distintos métodos para realizar el control químico del “bulking” filamentoso mediante la utilización de agentes oxidantes como el cloro y el ozono y el empleo de un surfactante (Tritón X-100), modelando matemáticamente las cinéticas de tratamiento, y determinar las condiciones operativas óptimas (concentración, dosis y tiempo de contacto) y las ventajas y desventajas de cada compuesto químico utilizado.

Se han propuesto los siguientes objetivos específicos:

- Estudiar el efecto del surfactante sintético Tritón X-100 sobre la actividad respiratoria de cultivos puros del microorganismo filamentoso Sphaerotilus natans y del floculante Acinetobacter anitratus.

- Desarrollar y optimizar un ensayo de actividad INT-deshidrogenasa cuantificado por espectrofotometría y análisis de imágenes empleando cultivos puros de S. natans.

- Evaluar el efecto del ozono sobre la actividad respiratoria de cultivos puros de S. natans y de A. anitratus, y determinar la sensibilidad intrínseca de cada microorganismo al agente oxidante.

- Estudiar las reacciones químicas que tienen lugar durante los ensayos de cloración de los cultivos puros de ambas cepas microbianas, así como también evaluar el decaimiento de la concentración de cloro oxidante total debido a la demanda ocasionada por los microorganismos.

- Evaluar el efecto del cloro sobre la actividad respiratoria de cultivos puros de S. natans y de A. anitratus, y determinar la sensibilidad intrínseca de cada microorganismo al agente oxidante.

- Desarrollar un modelo matemático que permita predecir el decaimiento de cloro y la actividad respiratoria microbiana en función del tiempo para ambos microorganismos.

- Estudiar y modelar matemáticamente el efecto de diferentes condiciones de ozonización (dosis de ozono y tiempo de contacto) sobre la concentración de biomasa total de barros activados.

- Implementar el ensayo de actividad INT-deshidrogenasa cuantificado por análisis de imágenes para determinar la actividad respiratoria específica de los microorganismos filamentosos presentes en los flóculos de barros activados.

- Estudiar el efecto de diferentes condiciones de ozonización (dosis de ozono y tiempo de contacto) sobre barros activados.

- Estudiar el efecto de diferentes condiciones de cloración (concentración de cloro y tiempo de contacto) sobre barros activados

El microorganismo filamentoso utilizado correspondió a una cepa de Sphaerotilus natans ATCC #29329 obtenida de American Type Culture Collection.

La cepa floculante empleada fue aislada de una planta de tratamiento de efluentes por barros activados a escala laboratorio en el CIDCA e identificada como Acinetobacter anitratus.

El cultivo de microorganismos (S. natans y A. anitratus) fue realizado en un biorreactor constituido por un recipiente cilíndrico de vidrio borosilicato de 1,5 litros, con un volumen de trabajo de 1,0 litro que presenta electrodos de pH y oxígeno disuelto.

Los barros activados que se utilizaron en los ensayos de inactivación por acción de cloro y ozono fueron generados en una planta de tratamiento de efluentes a escala laboratorio que consiste de un tanque de aireación de 2,5 litros y un sedimentador secundario de 1 litro separados por un panel de acrílico que permite regular el espacio que conecta ambas secciones.

La concentración de biomasa de los cultivos puros y de los barros activados se determinó mediante medidas de demanda química de oxígeno (DQO), las cuales fueron transformadas a unidades de sólidos suspendidos volátiles (SSV) mediante curvas de calibración.

Para determinar la sensibilidad intrínseca de los cultivos puros de S. natans y A. anitratus frente a los agentes químicos empleados, se utilizó una técnica respirométrica debido a que la velocidad de consumo de oxígeno es un indicador de la actividad metabólica de microorganismos aeróbicos. Se empleó un respirómetro que consistió de un recipiente de 30 ml provisto de un electrodo de oxígeno (YSI Model 58), un aireador, agitación magnética y control de temperatura.

Utilizando cultivos puros se encontró que el surfactante Tritón X-100 es el único que presenta una acción bactericida específica sobre microorganismos filamentosos; es decir las bacterias floculantes no fueron prácticamente afectadas por el surfactante, mientras las filamentosas fueron notoriamente inhibidas en su actividad respiratoria y adicionalmente destruidas por actividad lítica del surfactante.

El efecto del Tritón X-100 sobre cultivos puros de S. natans dependió únicamente de la concentración de surfactante y no de la concentración de biomasa.

Se determinó que concentraciones de Tritón X-100 entre 100 y 120 mg l-1 resultaron óptimas para un rápido control del microorganismo filamentoso S. natans.

En el caso de los compuestos químicos oxidantes tales como el cloro y el ozono debe considerarse que a bajas concentraciones y tiempos de contacto cortos puede no ocurrir lisis celular. Sin embargo, si se aplican altas concentraciones o tiempos de contacto prolongados ocurre lisis de las células por oxidación de la biomasa microbiana como ha sido demostrado en el presente trabajo de tesis. Cuando se empleó ozono sobre cultivos puros y barros activados no solo se observó una inhibición de la actividad respiratoria microbiana sino también una reducción de la biomasa total por oxidación completa de los microorganismos.

Para monitorear la acción de agentes químicos oxidantes durante el control del "bulking" filamentoso se han empleado comúnmente ensayos no fisiológicos como aquellos que determinan la velocidad de sedimentación de los barros, entre ellos el índice volumétrico de barros (SVI, sludge volume index). Sin embargo, estos ensayos por estar basados en la determinación de parámetros físicos son algunas veces lentos para reflejar la inactivación de microorganismos filamentosos causada por agentes tóxicos. En cambio, los ensayos basados en la determinación de la actividad fisiológica microbiana permiten evaluar rápidamente el efecto inmediato de agentes químicos sobre los microorganismos filamentosos, antes que una mejora en las propiedades de sedimentación pueda ser detectada. En consecuencia, los ensayos basados en la determinación de parámetros de actividad fisiológica son los recomendados para el monitoreo del control del “bulking” filamentoso por compuestos químicos oxidantes ya que evitan una dosificación por períodos prolongados o una eventual sobredosis que destruiría completamente los flóculos de los barros activados.

El efecto tóxico de los compuestos oxidantes sobre los barros activados puede ser determinado por parámetros de actividad metabólica microbiana tales como velocidad de consumo de oxígeno (OUR, oxygen uptake rate), medición del contenido de adenosina trifosfato (ATP), utilización de sustrato, así como también mediante ensayos de reducción microbiana de sales de tetrazolium.

Los ensayos de reducción de sales de tetrazolium se fundamentan en el hecho de que las bacterias heterótrofas aeróbicas y anaeróbicas presentan sistemas de transporte de electrones que pueden emplear las sales de tetrazolium TTC (cloruro de trifenil tetrazolium), INT (cloruro de 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-fenil tetrazolium) y CTC (cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolium) como aceptores artificiales de electrones, de forma tal que la reducción de estas sales por bacterias activas es indicativo de actividad deshidrogenasa (ADH) y en consecuencia de actividad metabólica microbiana.

Las sales de tetrazolium incoloras y solubles en H2O son reducidas a cristales de formazán coloreados e insolubles en H2O que se depositan intracelularmente. Los depósitos insolubles de formazán pueden ser extraídos con solventes adecuados y cuantificados espectrofotométricamente. La sal de tetrazolium INT es reducida por bacterias metabólicamente activas formando cristales de formazán rojos, INT-formazán, que luego de su extracción y determinación colorimétrica sirven como una medida de la actividad metabólica total en barros activados.

Los métodos mencionados anteriormente (OUR, ATP y ADH cuantificada por espectrofotometría) permiten evaluar la actividad metabólica total de los barros activados luego

de la aplicación de agentes químicos oxidantes como el cloro o el ozono, sin embargo no pueden diferenciar el efecto tóxico específico sobre los microorganismos filamentosos presentes en los flóculos de aquel ocasionado sobre el barro activado considerado en su conjunto. Para este propósito, tampoco es posible la aplicación de técnicas de enumeración estándar tales como el recuento en placa o número más probable (NMP) ya que éstas pueden ser aplicadas únicamente a células que crecen en forma dispersa.

Por lo tanto, en barros activados el efecto de los agentes químicos oxidantes (cloro y ozono) sobre la actividad respiratoria global se evaluó mediante una técnica respirométrica y un ensayo de actividad INT-deshidrogenasa cuantificado por espectrofotometría (ADHa), mientras que para evaluar el efecto de los agentes oxidantes sobre la actividad respiratoria de las bacterias filamentosas presentes en los flóculos se desarrolló y optimizó un ensayo de actividad INT-deshidrogenasa cuantificado por observación microscópica acoplada a análisis de imágenes (ADHi).

El método de análisis de imágenes requirió la utilización de un microscopio Leica DMLB con cámara fotográfica incorporada. Las imágenes fueron registradas con el software Leica DC 100 Versión 2.51 y posteriormente analizadas con el software Global Lab Image Versión 2.10. El ensayo de actividad INT-deshidrogenasa cuantificado por espectrofotometría y análisis de imágenes fue optimizado utilizando cultivos puros de S. natans. Se determinaron las condiciones óptimas (concentración de INT= 0,08-0,15 g l-1, tiempo de contacto= 50 minutos) para favorecer la reducción microbiana de INT y la evaluación de la actividad INT-deshidrogenasa mediante ambas técnicas.

El ensayo ADHi considera el grado de actividad de los sitios de respiración de las bacterias filamentosas en la cuantificación del efecto de los agentes oxidantes sobre dichos microorganismos. Esta constituye una ventaja respecto a la técnica de cuantificación directa propuesta en la literatura, en la que la actividad respiratoria de los microorganismos filamentosos está determinada por el criterio de presencia/ausencia de gránulos de INT-formazán. Por lo tanto, el ensayo ADHi desarrollado en este trabajo de tesis resultó adecuado para determinar las condiciones óptimas de aplicación de los agentes oxidantes en barros activados.

Los agentes oxidantes, ozono y cloro, presentaron una acción bactericida no selectiva, es decir afectaron tanto a microorganismos filamentosos como a los floculantes cuando los experimentos se realizaron en cultivos puros.

En los ensayos de inactivación de los cultivos puros de S. natans y A. anitratus por los compuestos químicos oxidantes (cloro y ozono) se observó que el grado de inhibición de la actividad respiratoria microbiana depende de la dosis de cada compuesto oxidante, es decir de la relación entre las concentraciones del agente químico oxidante y la biomasa microbiana. En los ensayos de ozonización de cultivos puros, se encontró que el microorganismo floculante A. anitratus fue ligeramente más sensible al ozono que el filamentoso S. natans.

En el caso del cloro, que era dosificado como hipoclorito de sodio, se estudió la velocidad de formación de cloraminas debido a que el medio empleado en el cultivo de ambos tipos microbianos contenía amonio en su composición. Se encontró que el cloro reaccionaba rápidamente con el amonio para formar cloraminas, fundamentalmente monocloramina, de forma tal que luego de un minuto de contacto 85 a 90% del cloro oxidante total correspondió a cloro combinado. Debe considerarse que las cloraminas presentan menor poder bactericida que el cloro libre (cloro elemental, ácido hipocloroso e ion hipoclorito).

En los ensayos de cloración de los cultivos puros de S. natans y A. anitratus se encontró un decaimiento de la concentración de cloro en función del tiempo de contacto, debido a que el cloro reacciona con la biomasa microbiana. Pudo determinarse que la velocidad de decaimiento de cloro fue dependiente del tipo de microorganismo y de la concentración de

biomasa. La velocidad de decaimiento de cloro para S. natans fue de 2 a 4 veces mayor respecto a A. anitratus.

Se desarrolló un modelo que permitió describir simultáneamente la velocidad de decaimiento de cloro y la disminución de la actividad respiratoria microbiana en cultivos puros de S. natans y A. anitratus. A partir de este modelo cinético se determinó la dosis inicial más baja que produce la inhibición total de la actividad respiratoria de los microorganismos; para S. natans la dosis fue 11,9 mg Cl2 (g SSV)-1 mientras que para A. anitratus fue 4,5 mg Cl2 (g SSV)-1. De acuerdo a estos resultados se concluyó que S. natans resultaba 2 a 3 veces más resistente a la acción del cloro respecto a A. anitratus cuando se empleaban cultivos puros que no formaban agregados microbianos.

En barros activados se demostró que los microorganismos filamentosos dispuestos en la superficie de los flóculos quedan relativamente más expuestos a los agentes oxidantes respecto a los floculantes ubicados en la zona interna de los mismos. Con respecto a ello puede decirse que los agentes oxidantes tienen menor acción bactericida sobre las bacterias floculantes ya sea debido a la resistencia difusional del flóculo o por neutralización del biocida dentro de la matriz del flóculo constituida por células y sustancias poliméricas extracelulares. La aplicación de agentes químicos oxidantes en barros activados debe considerar diferentes aspectos concernientes al impacto que producen sobre el proceso de remoción de nutrientes y sobre la calidad del efluente final. En coincidencia con datos de literatura puede decirse que el cloro afecta el proceso de remoción de nitrógeno y fósforo, por lo tanto su aplicación como método de control del "bulking" filamentoso en sistemas de barros activados con remoción de nutrientes requiere de una adecuada dosificación y un monitoreo periódico de la eficiencia del tratamiento biológico de efluentes. Por otra parte, es aceptado que el ozono mejora la calidad del efluente final y no afecta la remoción de nutrientes.

Con respecto a esto último puede decirse que el ozono presenta la capacidad de eliminar precursores de trihalometanos. Esto debe considerarse en sistemas de tratamiento de agua potable que presentan una etapa final de desinfección con cloro, pues el cloro reacciona con determinadas sustancias químicas formando trihalometanos sumamente riesgosos para la salud humana. Por lo tanto, cuando un efluente presenta una alta concentración de compuestos precursores de trihalometanos, la aplicación de ozono en situaciones de ocurrencia de "bulking" filamentoso traería aparejado una notable mejora en la calidad toxicológica del efluente final. Asimismo, tanto el cloro como el ozono pueden afectar el proceso de remoción de DBO y en definitiva la capacidad depuradora del sistema de barros activados.

A partir de este análisis surge la necesidad de determinar las condiciones de dosificación adecuadas de los agentes oxidantes (dosis y tiempos de contacto óptimos) que logren un control efectivo del "bulking" filamentoso y ocasionen un mínimo impacto sobre la actividad metabólica de los microorganismos floculantes en el proceso de barros activados.

Una dosis de cloro de 4,75 mg Cl2 (g SSV)-1, durante 15 minutos de contacto, resultó adecuada para inhibir casi completamente (95%) la actividad respiratoria específica de los microorganismos filamentosos presentes en los flóculos, sin afectar notoriamente la actividad respiratoria total de los barros (Inhibición entre 30 y 55%). No obstante, a dicha dosis el cloro siguió actuando hasta los 20 minutos de contacto produciendo una inhibición entre 50 y 60% de la actividad metabólica total de los barros.

Una dosis de ozono de 37 µg O3 (g SSV)-1 obtenida por ozonización continua durante 20 minutos inhibió la actividad respiratoria de los microorganismos filamentosos presentes en los flóculos en más de 99%, mientras que la actividad respiratoria total de los barros fue inhibida aproximadamente 57%.

Por lo tanto, puede decirse que el cloro y el ozono presentarían similar efectividad en el control del "bulking" filamentoso y un impacto también semejante sobre la actividad metabólica total de los barros activados considerados en su conjunto.

Adicionalmente, se encontró que el ozono, a diferencia del cloro, presenta la capacidad de reducir la cantidad total de barros activados de un sistema de tratamiento biológico de efluentes por oxidación completa de la biomasa microbiana.

Esto constituye un aspecto importante a tener en cuenta cuando se pretende reducir la cantidad total de sólidos suspendidos en un sistema de barros activados para disminuir los costos implicados en el tratamiento de los barros generados en el proceso y los costos derivados de la disposición final de los mismos.