Diferentes mecanismos de transporte de proteínas
Todos los mecanismos involucran señales de tránsito presentes en las proteínas y receptores
Existen dos clases de señales que dirigen a las proteínas
hacia el compartimento adecuado
Importancia de la regulación de la
localización
nucleo/citoplasmática
en sistemas biológicos
a- Como modo de controlar la activación de factores de transcripción b- Como modo de generar un retraso entre la síntesis de una proteína
y su capacidad de actuar en el núcleo
c- Para asegurar la maduración de moléculas antes de que estén
disponibles para su uso (control de calidad)
Mecanismos que controlan la localización nucleo/citoplasmática
1- La proteína a transportar sufre modificaciones que determinan su capacidad de interaccionar con los receptores de importación o exportación nuclear
2- Los complejos proteína receptor están secuestrados en un compartimento de la célula que lo torna insoluble impidiéndole interaccionar con el complejo del poro nuclear
3- Control a nivel de la actividad de la maquinaria soluble de transporte 4- Modificaciones en el complejo del poro nuclear
Transporte nuclear
-
Factores de transcripción (IN-OUT)
- Kinasas/Proteínas regulatorias (IN-OUT)
- Histonas (IN)
- mRNAs (OUT)
- tRNAs (OUT)
-Las membranas nucleares interna y externa tienen distinta composición proteica
Interna: Proteínas que anclan a la cromatina
Proteínas que interaccionan con la lámina nuclear
Externa: Sitios de anclaje para ribosomas (idem ER)
-Los complejos de poro nuclear regulan la importación y exportación de moléculas
El complejo del poro nuclear está compuesto por ~30 proteínas diferentes organizadas con simetría octogonal
Proteínas mayores de 40 Kda no difunden libremente a través del poro
Para proteínas mas pequeñas, la velocidad de difusión es proporcional al tamaño
Receptores de transporte nuclear (de importación
o de exportación)
- Interacción directa con moléculas a transportar o mediante adaptadores - Nucleoporinas tienen repeticiones FG que interactúan con los receptores de importación o exportación nuclear
Importina alfa Importina beta Receptor de Importación o exportación nuclear Ej CRM1 exportina-t
Identificación de los componentes necesarios
para la importación nuclear
RKRKESNRESARRSRYRK bipartita
MSERKRREKL monopartita
Estrategia: Sobre-expresion de Sima en líneas transgénicas
Sima se localiza en el núcleo
sólo en hipoxia
Normoxia
Hipoxia
-UAS GFPn.gal -UAS Sima{
Engrailed gal4Receptores de transporte nuclear (de importación
o de exportación)
- Interacción directa con moléculas a transportar o mediante adaptadores - Nucleoporinas tienen repeticiones FG que interactúan con los receptores de importación o exportación nuclear
Importina alfa Importina beta Receptor de Importación o exportación nuclear Ej CRM1 exportina-t
La Leptomicina B inhibe específicamente al receptor de Exportación nuclear CRM1
En mutantes para el exportador CRM1/Embargoed
Sima se exporta mas lentamente
Líneas que sobre-expresan al transportador
La GTPasa Ran determina la dirección del transporte
1- Ran se encuentra tanto en el citosol como en el núcleo
2- Ran puede tomar 2 conformaciones alternativas a) Unida a GTP; b) Unida a GDP 3- Existen proteínas regulatorias: Ran GAP + Ran BP (citosólicas) y Ran GEF (nuclear)
Ran GAP (GTPase activating protein) + Ran BP (Binding protein)
Ran GTP Ran GDP
Transporte a través del complejo del poro nuclear
1- Ran-GTP (nuclear) tiene afinidad por los receptores de importaciónnuclear cargados y provoca la liberación de la proteína importada
2- Ran GTP (nuclear) tiene afinidad por los receptores de exportación
nuclear cargados y favorece el pasaje a través del poro hacia el citosol
Importinas
Exportinas
RanGap
Ran GEF es activamente importada al núcleo a través del sistema dependiente de importina beta
Ran GAP y Ran BP son activamente exportadas por el sistema exportina beta/CRM1
Pero… para que esto ocurra se necesita distribución asimétrica
inicial de Ran GAP, Ran BP (citoplasmáticas) y Ran GEF (nuclear) ¿Cómo se las arregla la célula para generar estas diferencias
inmediatamente después de la mitosis?
¿Cómo se genera la distribución asimétrica de Ran GEF (nuclear), Ran GAP y Ran BP (citosólicas)?
Disociación y re-formación de la envoltura nuclear
durante la mitosis
¿ y qué pasa con Ran GEF, Ran GAP y
Ran BP durante la mitosis?
- Ran GEF queda asociada a la cromatina
- Ran GAP y Ran BP quedan asociadas a las proteínas de las
A/P: Sinsicio
DV: embrión celularizado
La proteína Dorsal entra al núcleo sólo en las células ventrales
Roth et al, 1989 Rushlow et al, 1989 Steward, 1989
wt Mutante dorsalizado Mutante ventralizado
Dorsal induce la transcripción de twist, snail y rhomboid y
NF-kappaB/Dorsal están anclados al citoplasma por IkappaB/Cactus
1- Pipe activa a Nudel (mecanismo desconocido). 2- Nudel inicia la activación de 3 serin-proteasas: Gastrulation defective, Snake y Easter
3- Easter cliva a Spatzle activándola. 4- Spatzle activa al receptor Toll.
______________________________________ 5- La estimulación de Toll activa a la kinasa Pelle (que necesita a Tube para asociarse a la membrana) 6- Directa o indirectamente, Pelle fosforila a
Cactus.
7- Una vez fosforilada, Cactus se degrada en el proteasoma y libera Dorsal para que ingrese al
núcleo (Kidd, 1992; Shelton and Wasserman, 1993; Walen and Steward, 1993; Reach et al, 1996).