Bases de aplicación de la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) en quimiotaxonomía de flavonoides - Sociedad Argentina de Botánica

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(1)

Bol. Soc. Argent. Bot. 26(3-4):163-172.1990

BASES DE APLICACION

DE LA

CROMATOGRAFIA

LIQUIDA

DE ALTA

RESOLUCION

(CLAR)

EN

QUIMIOTAXONOMIA

DE

FLAVONOIDES

PorENRIQUEM.ZALLOCCHI1,ALICIAB.POMILIO2’ yRAMONA.PALACIOS1'’

Summary Applicationsof high performance liquid chromatography(HPLC)on chemotaxonomical flavo-noid studies. This report shows that thehighperformance liquid chromatographic analysisof flavonoids in chemotaxonomic studies offersan accuratesensitivetechniquethat enablesarapidisolation and characteri¬ zationof thesecompounds when compared withanyother method. Theprocedureis illustrated by the identificationofelevenflavonoids in sixargentinespeciesof the tribe Phaseoleae (Papilionoideae-Legumino-sae).A comparative study was simultaneously carriedouton the same species using the classical standardi¬ zedtwo-dimensional paper chromatography. Althoughnomeaningfuldifferences in the number of detected

flavonoidsby both methodsareobserved,HPLCprovidesa more accurate correlationwithin species anda

rapididentificationofthe compoundsbytheir retention times. An appropriate methodforclean-up and sample preparationis described. The mainfactorsthataffectoptimizationof HPLCconditionsarealso discussed.

INTRODUCCION aprovechamientocuando exista la posibilidad de

uso.

La cromatografía líquida de alta resolución

Elobjetivode estetrabajoespresentarla

meto-CLAR (oHPLC

por

sussiglaseninglés)conside- dologíabásica

y

losprincipales parámetrosa tener

radadesdehacelargo tiempouno de los métodos más promisorios

para

la identificación de com¬ puestosfenólicos(K. Markham,1975)hapasadoa

convertirse en los últimos añosenel másempleado

por

los diversos autores

para

el aislamiento

y

puri¬

ficación de flavonoides dados los excelentes

resul-encuenta

para

encararestudios quimiotaxonómi-cos mediante esta técnica. Asimismo,como siste¬

made referenciarespecto a los métodosemplea¬

dosusualmenteenbotánica presentamosunestu¬ diocomparativo realizadopara6especiesargenti¬

nasde la tribu Phaseoleae (Leguminosae) en base a estatécnica

y,

paralelamente,elanálisis de las

mis-Una de lasprincipales ventajasde esta técnica mas mediantecromatografíadepartición líquido-radica en la relativamente pequeña cantidad de líquidobidimensional sobrepapel.

muestranecesariaparauna evaluaciónacertada de Sed¡scuten enforma comparativa los

resulta-ioscompuestos presentes,mientras

que

respecto a dos obtenidos

y

sepresentanlasprincipales aplica-cualquier otrosistema de cromatografía conven¬

cionalsobrepapelsucapacidadresolutivaesmuy superior(Wulf

y

Nagel,1976)permitiendoungran ahorrode tiempo

y

esfuerzo mediantesu empleo (Daigle

y

Conkerton,1982).

Si bienuna desventaja de

peso

sueleestardada La CLAResuntipodecromatografía líquidaen

por

el costo relativamente alto del equipamiento lacual la faseestacionaria(que puedeserunsólido

necesario, no son

pocos

los casos en

que

puede

poroso

como

por

ejemplo un adsorbente clásico, llegaradisponersedelequipo básicocompartién- una resina de intercambio iónico o un polímero

dolo temporalmente o aportando algún comple- poroso)sehallaencerradaenuna columna

metáli-mento adecuado,

por

lo

que

resultaimportante su

tadosobtenidos.

donesquelaCLARpuede presentaren quimiota-xonomía.

La técnica de la C.L.A.R.

ca mientras

que

la fasemóvilesunlíquidoquees forzado a atravesarla bajo una cierta presión

(Hamilton

y

Sewell,1982).

Eltérmino altaresolución("high performance")

tiendeaemplearseúltimamenteconpreferenciaal

2Departamento deQuímicaOrgánica, Fac. deCs.Exactasy

nombre propuesto originalmente decromatografía

Naturales-Universidad deBuenosAires.

.

J J ,

3Miembro de laCarreradel Investigador Científico del Consejo liquidade altapresión( high

pressure

)dado

que

NacionaldeInvestigaciones CientíficasyTécnicas(CONICET). el primero

expresa

conmayorexactitud la

princi-'Departamentode CienciasBiológicas, Facultad deCs.Exactas yNaturales-Universidad de BuenosAires-Cdad. Universitaria,

PabellónII,4,0piso-1428Buenos Aires.

(2)

Bol.Soc.Argent. Bot

.

26(3-4)(1990)

salida palcaracterística deesta técnica, mientras

que

el

segundosólo hacereferenciaaunparámetro

ope¬

racional.

En

CLARel término fase normalserefiere a la técnica cromatográfica en

que

la fase móvil es menos polar

que

la fase estacionaria.

El términofase reversa ofase invertida (o RP

por

"reversedphase") seutiliza

para

designarsis¬ temas de fase estacionaria no polar, en general silicagel tratada (RP08; RPC8), usándose una fase móvil más polar,como

agua

oalcoholes(H.

Engelhardt,1979).

A)

t

RESERVORIO

f

---

DETECTOR

solvente

=F¿

Éü

REGISTRADOR

COLUMNA |

-INYECTOR

BOMBA

muestra

Equipamiento

Si bien los distintos modelos decromatógrafos líquidosdealtapresiónpuedenalcanzargradosde sofisticación realmente notables

(y

enrelación di¬ rectaasucostoobviamente)laconfiguraciónbási¬ cadeun equipo

que

reúna las condicionesimpres¬ cindibles

para

su uso enquimiotaxonomía se es¬ quematiza enlafigura1-A.

Unsistemamáscomplejo apto

para

utilizar

gra¬

diente de solventes(comose observa en lafigura 1-B) ofrece la posibilidad de ir variandoen forma programadadurante el transcurso de la corrida la relación de loscomponentesde la fase móvil,es decirlapolaridadde lamezcla de elución.

Serequierenbombas de altapresión

para

hacer

.

pasar

el solvente

por

la columna

pues

el relleno ofreceunaalta resistencia.

Altrabajar conflavonoides loaconsejable es un

detectorUV de onda variableajustadoa unalongi¬ tud de onda entre 290

y

300 nm apropiada de

acuerdoala bandaIde absorción de los

flavonoi-B)

solvente solvente

I

|programa|

UNIDAD DE

CONTROL

DEFLUJO

A

F

CAMARA DE MEZCLADO

ídor

lujo de f

a inyector

Fig.1.

A)ConfiguraciónbásicaparaCLAR;B)Configu¬

raciónpara utilizargradientede solvente.

des

y que

no se

superponga

conel

rango

de absor¬

ción delsolvente. También sepueden utilizar de- cadaunode loscomponentesde lamuestra inyec-tectores UV de onda fija (en particular los

que

tada.

trabajan a256nm),fluorimétricos oelectroquími¬ cos(Lunte, 1987).

Laresolucióno efectividad delaseparación cro¬ matográfica está dada

por

la relación entre la Resulta

muy

convenienteenla prácticaelem- selectividad(odistancia entrepicos)

y

la

eficiencia

de pleodeguardacolumna (que seintercalaala entra- la columna(oancho debanda).

Cada una de las sustancias separadas queda da de lacolumna)

ya que

altrabajarcon derivados

de

extractos

naturales la vida útil de las columnas caracterizada

por

unparámetro

que

esel volumen se puede ver restringidasinosetomanprecaucio- de retención

(VR)

oflujototal de solventenecesario

para

eluir el centro dé una banda dada desde el momento delainyecciónhasta

que

alcanza suva¬ lor máximoen el detector.

nes enlapurificaciónde lasmuestras.

Desarrollocromatografía)

Sinembargo,elparámétromásutilizado

para

la Los

cromatogramas

resultantes del

proceso

de caracterización de cada una de los compuestos CLARseobtienengráficamentemediante lacone- separadoses eltiempoderetención

(tÿ)

dado

que

xiónde unregistradoradecuado al detector utiliza- esmuchomássencillo de medir

y

esconstantesi

doa la salida de la columna(Figura2). no sevarían las condiciones deflujo

y

temperatura. La graficacióna lolargodeltiempode lasvaria- La utilización de un registrador-integrador

cionesde absorbanciaenel detector determinan la (electrónico) brindará además del gráfico corres-aparicióndepicos

que

corresponden ala salida de pondiente

(cromatograma)

todos losdátos

(3)

Vigna

tuteóla

Vigna

candida

tn n o

S

5

s

2

CO

co

< rJ

3

si

s

8

-

5

in

I

\r¿ oo n

OJ

t

-

tR

(min)

Macroptilium prostra

turn

Vigna

tongifolia com r-'

5

5

to

13

S

m co

s

o» r-:

s

SHSt.l

5

Phaseolus

vulgaris

oí Vigna

adenantha

CO CO

(O

lio var

iri aborigineus

o £

to

LO

3

S

iA

S

ai

Fig.2.

Cromatogramasde alta resoluciónpara seisespeciesde laTribu Phaseoleae(Papilionoideae-Leguminosae).

ríos

para

un análisis cuali-cuantitativo de cada En casodeemplearseotro tipode registrador

muestra,correspondientesacadauno delospicos, (electromecánico)secalculaen forma gráficael

Inclusose podrácalcular(siseha calibradoprevia- de cadacomponentemidiendola distancia al ori-mentecon una muestra testigo de concentración gen(t )de cada,pico,

y

convirtiendo estevaloren

conocida)la concentración relativa de cada flavo- tiempo conociendo la velocidad del papel. Cada

noideaislado

por

integración del área bajo cada unade los

flavonoides.de

lamuestra puede

(4)

Bol.Soc.Argent. Bot

.

26(3-4)(1990)

resulta deenormeutilidad

para

suposteriordeter- crecientesenlacomposicióndelamezcla

para

el minaciónestructural osu empleo como testigos. solventemenos polardeterminan unaumentode la fuerza de elución.Se lograncambiossignificati¬ vosaumentandosu concentración oreemplazán¬ dolo

por

otro depolaridaddecreciente

que

lesiga

1)Tipode Columna:Lautilización de columnas en la lista.Paralaseparaciónde flavonoides,

traba-defasereversa es lo másindicado

para

trabajarcon jandocon una columnaRPC-18 se obtendrán bue-flavonoides.En general se empleanrellenos micro- nosresultadoscon mezclas Metanol:Agua en un

porosos

del tipo C-18 (Daigle

y

Conkerton,1982;

rango

de 35: 65a70:30segúnelgradode glicosida-Wulf

y

Nagel,1979;Lardy

y

col.,1978)oC-8(entre ción,pudiéndose

agregar

de 1 a 5% de Acido Acé-otros: Harborne

y

Boardley,1984;Niemann

y

Bre- tico(Harborne

y

Boardley,1984;Daigle

y

Conker-derode,1978).Eltamañodepartículaadecuadoes ton, 1982;Wulf

y

Nagel,1976) oAcido Fórmico de10pm, o5pm

para

separacionesmásfinas.Las (Casteele,Geiger

y

Van Sumere,1982)lo

que

en dimensiones de la columna se eligen en base al algunos casos mejorael ancho de las bandas, debi-equipo disponible

y

al tipode trabajoa realizar doala disminuciónoanulación dela ionización de

(analíticoo

preparativo).

Salvo

que

se dispongade los

grupos

OH fenólicos ácidos. unabomba dealtacapacidad seutilizarán colum¬

nas analíticas o semipreparativasconun diámetro de Metanolprácticamente conlosmismos

porcen-entre5

y

15 mm

y

unlargode150a 300 mmi Lavida útil’deunacolumnaRPdefase unidaes Principalesparámetros ateneren cuenta

Tambiénpuedeutilizarse Acetonitriloen lugar

tajes.

Lautilización devariacionesdelacomposición de 3a 6 meses de usocontinuoapropiado.Deben de la mezcla de elucióna lolargodel desarrollo

evitarse el uso de álcalis (pH > 8)o sales

pues

cromatográfico, o gradientede solventes,permite disminuyenla estabilidad de la fasefija. El

rango

reducir eltiempototal de corrida

y

mejorarla reso-detrabajo se fija

para

valores de

pH

entre2

y

8. lución.

-

En general seirá variando lapolaridad enforma

2)FaseMóvil: Altrabajar concolumnas defase decrecientea fin de disminuir los de los com-reversaelsolvente demáxima polaridad disponi- puestosmásretenidos,

aunque

en definitivala es-bleesel

agua.

Seutilizaenmezclas deproporcio- trategia a seguir dependede la naturaleza de cada nes variablescon un solvente misciblemenos polar muestraenparticular.

talcomoMetanol o Acetonitrilo.LaTabla1mues¬

traunaserieeluotrópica depolaridaddecreciente

con los solventes más usualmente empleados en valores deflujo

entre

0.5

y

2 ml/minuto, lo

que

implicaubicarseenun

rango

de presión detrabajo Dado

que

la selectividad

y por

ende la resolu- de entre 500

y

3000psi(14psiequivalenaproxima¬ cióndependendelsolvente al buscar las condido- damentea1atm).

nes

de mejor resolución cromatográfica se debe tener encuenta

que,

enfase reversa, variaciones

3) Velocidad deFlujo: En general se trabaja a CLAR.

4)

Temperatura:

La

temperatura

afecta lareso¬ lución

porque

al incrementarsedisminuyela reten¬ ción. Asimismodisminuyela viscosidad de la fase móvil mejorando la eficiencia de laseparación

y

aumentala solubilidad de lassustanciasen la fase móvil.Enfasereversa elmáximorendimiento se obtienetrabajando a temperaturas entre 40

y

60 grados,

aunque

si no se cuenta con un sistema

capaz

determostatizarlos solventes sepuedetra¬ bajarperfectamente a temperaturaambiente.

5) Desgasificaciónde solventes:

Luego

de

pro-

_

ceder al filtrado de los solventes o mezcla plear (lo

que

evita

que

penetren partículas a la

bomba

o al sistema de conductos

que

puedenlle¬

gar

a obstruir la columna) sedeben eliminar los gasesdisueltosenla fase móvil

por

calentamiento

y

agitación envacío(ousando

gas

inerte).

Esimportante enel

proceso

dedesgasificación noalterar lacomposiciónde la mezcla.En general

Tabla 1.

Serieeluotrópicadepolaridaddecreciente

Solvente E.(FuerzadelSV)

Agua

Metanol

Etanol n-Propanolol

Acetonitrilo

Acetatodeetilo

Acetona Dioxano THF Benceno* . Tolueno* n-Pentano*

muyalta

.

0,95

0,88 0,82 0,65

0,58 a

em-0,56 0,56 0,45 0,32 0,29 0,00

(5)

es conveniente

preparar

la cantidad de eluyente yectarsea la vez, o bien se efectúan dos corridas

necesaria

poco

antesde usarlo, sin mantenerloen sucesivas

y

se

comparan

los respectivos. el reservorio

por

períodosdetiempo prolongados.

3)Aislamiento desustanciasde interés:Se

pue-6) Volumen demuestra inyectado: Lamuestra detrabajaren formapreparativa

para

el aislamien-se debedisolverenel solventecon menorfuerza de tomasivodeun compuesto en particular.Sepuede elución

para

lograrelmenor volumen final

que

sea disponerdeuna columna preparativa adecuada a posible.Delmismomodo, la concentración(canti- lamasadelamuestra,o bien utilizar una columna

dad)de muestra es un factor

muy

importante

pues

semipreparativa

y

repetir la corrida un número afecta la resolución

por

saturacióndelacolumna, suficiente deveces.Las fracciones correspondien-provocando bandas asimétricas

y

con colas

pro-

tesal o lospicosde interésse

recogen

ala salida del nunciadasresultandotiemposde retenciónmeno- detector enrecipientesadecuadoso bien mediante uncolectorautomático de fracciones.Unavez reu-res.

Elcontrol adecuado de losparámetrosdecorri- nida la muestra seprocede a eliminar el solvente dapermitealcanzar conestatécnicauna reprodu- enun evaporadorrotativoobien

por

liofilización cibilidad

que

es

muy

superiorrespectoacualquier del

agua,

obteniéndose la sustancia

pura,

la cual

otradisponible

para

flavonoides.Su resolución

y

puedeser analizada

por

espectroscopiaUV,RMN

sensibilidadpermitendetectarhasta cantidades del protónico

y

de carbono13, hidrólisisácida

y espec¬

trometría de masa, determinándose la estructura

delflavonoide. orden delos 50

ng

(Wulf

y

Nagel,1976).

Apliaaonesdela C.L.A.R. enquimiotaxonomía

4)Elución

y

análisis de manchas de cromatogra-Lainclusión delaCLARen trabajos quimiota- masen papel: Se puede procederaunanálisis de

xonómicosno es nuevadado

que

sehaaplicadoa eluidos de manchas de

cromatogramas

en papel.

ya

diversos estudios de flavonoidesendiferentes es- seacon fines comparativos o bien

para

purifica-pecies (Daigle

y

Conkerton, 1982 citan varios ejem- ción.Esimportante

para

estouncorrectofiltrado píos;Asen

y

Griesbach,1983)

y

otrosdetipo filoge- (porlomenosdosveces)del eluido

para

evitarel nético(Meurer,Wiermann

y

Strack,1988)

aunque

ingresode fibras de celulosa a la bomba o columna

lamayoría sehan efectuadoconfinesfitoquímicos, del cromatógrafo. En general, una mancha dada

y

muchosdeestoscorrespondena la familia Legu- presentarámásdeun componentecuandose anali-minosae (Carlson

y

Dolphin,1980; West, Birac

y

za

por

CLAR, lo

que

demuestrala

mayor

resolu¬

ciónde este método.Deestemodopodrán

separar-Deacuerdoanuestraexperienciaexisten varias se

y

caracterizarse estoscompuestos. aplicacionesdelaCLAR

que

facilitan

y

permiten

lograr una

mayor

exactitudenlas determinaciones MATERIALESY METODOS quimiotaxonómicas:

Pratt,1978;Dorr

y

Guest,1987).

El material vegetal seco

y

molido,

preferente-1) Caracterización de patrones específicos: A mentedeorigenfoliar o tallosnoleñososfue ex-pa'rtir de extractos de material vegetal se puede traídoenunextractorSoxhletcon unsolventeno obtener elpatrón cromatográficoespecíficocorres- polar(éterdepetróleo,fracción 60-80grados) du-pondientea los flavonoidespresentes conla finali- rante 24 hsa reflujo. Serealizóa continuación de

dadde realizar unestudio quimiosistemático.La modo similar unasegundaextracciónempleando información obtenidapermiteunarápidacórrela- metanolcomosolventeconla finalidad de

separar

ción entrelas diversas muestrasen estudio dado lassustanciaspolares. En generalenesteextracto

que

cadaflavonoide está caracterizado

por

un sólo seobtendrán losflavonoides(salvoalgunos

muy

parámetro

que

eselTiempodeRetención

(t,,).

metiladosocon sustituyenteslineales

que

los tor¬ nan

muy

poco

polares

y que

son másafines al 2) Co-cromatografía contra testigo: Un com- solventeinicial).

puestoaislado previamentepuede sercorridoen

formaconjuntacon untestigoconocido,obienun cía

muy

compleja

y

enriquecida enotros

compues-segundo compuesto proveniente de otra fuente, tosde

poco

interés

para

elquimiotaxónomo(como

cuandoquieracorroborarse

que

se trata de la mis-

por

ej.clorofilas)

y

que

impediríanuna identifica-masustancia.Estoseráfácil de evidenciar cuando ción

y

separación apropiada de los flavonoides seobservaunúnicopico enelcromatogramaobte- (generalmentenotanmayoritarios), se' procedióa nido a partir de su inyección conjunta. Ambas efectuar un fraccionamientoapropiado

para,

ir

ob-muestrasse

preparan

por

separado

y

puedenin- teniendosubfracciones enriquecidas en flavonoi-Dado

que

este extracto crudo resultauna

(6)

Bol.Soc. Argent. Bot .26(3-4)(1990)

RESULTADOS OBTENIDOS des con el fin de lograr un máximo aprovecha¬

mientoen el

proceso

deCLAR.

Se realizó este fraccionamiento en dos

sucesivos:en primer lugar se procedióa utilizar cromatografía de permeación

por

geles, usando

Sephadex LH-20 comosoporte

y

metanol como eluyente.Posteriormente sereunieronlas fraccio¬ nesconflavonoides

y

secromatografiaronenco¬ lumna desilicagel60-H usando mezclas de cloruro

de metileno-metanol de polaridad creciente. Se

obtuvieronasíentre 4

y

7 fraccionescon flavonoi¬

des

para

cada extracto,algunasde las cuales se

representanen los cromatogramasde laFigura2. Las muestras asíobtenidasfueron recristaliza¬ dasen metanol degradoespectroscópicoyfiltra¬

das.

A partirdelas condicionespreviamenteobteni¬ das

para

las muestrasconflavonoidesseprocedea efectuar las corridas

para

las diversas especies en forma estandarizada.

La Figura2presenta algunosde loscromatogra¬ mas de alta resolución obtenidoscorrespondientes a las subfracciones más representativas de cada especie.

Con los tiempos de retención obtenidos

para

cada muestraseconfeccionauna matriz

bidimen-sional de datos,considerandolapresencia o node

cada unode los flavonoidesdetectados(caracteri¬

zados

por

susrespectivos

tÿ

para

cada unodelos

taxainvolucrados.

LaTabla 2presentalos datoscorrespondientesa lasseisespeciesdelosgéneros Vigna,Phaseolus

y

Macroptilium(Phaseoleae, Leguminosae)

que

fueron analizadas

por

cromatografía líquidadealta,reso¬

lución.

Pa

sos

El

proceso

defiltrado delamuestra previo asu inyeccióna uncromatógrafo líquidoes imprescin¬ dible

para

lograr unadecuado funcionamiento de las columnas.Se utilizó un filtro microporosode membranaMilliporetipoFGde0,2pmconectado

enserieauncartucho de filtradoSep-Pak

Waters-MilliporeNs 51910 con relleno de fase reversa C- Comparaciórt con otrastécnicascromatográficas

18.

Las corridas fueron efectuadas en un equipo WatersutilizandounacolumnauBondapack RP C-18analítica (diámetro:5 mm,largo:240 mm).Se utilizó un detector UV de onda variable en una longitudde ondade 291nm.

-Lamezcla de eluciónfueMetanol-Agua(58:42),

trabajándose en condiciones ¡socráticas. La co¬

rrientedeflujofue de0,7

ml/min.

Resultainteresante,

y

necesariocomopuntode

referencia, la comparación de esta metodología conlatradicionalmenteempleadaenbotánicapara

los estudios quimiotaxonómicos, esdecir la Cro¬ matografía deParticiónL-Lbidimensional en

pa¬

pel.

Seha realizadoparalelamenteun estudio

para

losextractosmetanólicos delas seisespecies

pre¬

viamenteconsideradas.Seprocedióa sembrar so-. brepapelWhatman 3MM una muestra dedicho

extracto

y

secorrió(enformadescendente)enuna dirección con una mezcla de Terbutanol-Agua-Acido Acético (3:1:1),

para

luegorepetir el

procedi¬

miento enel otro sentido usando como solvente Acido Acético al15%(Mabry,Markham

y

Thomas

1970). Material de laArgentinaanalizado:

Vignaluteola(Jacq.)Bentham

Peía,deEntreRíos,Depto. Gualeguaychú,Ceibas-15/V/

1984-R. A.Palacios 1378(BAFQ.

Vigna longifolia(Bentham)Verdcourt:

Peía,de Corrientes,Depto. Pasode los Libres,Pasode los

Libres- 28/11/1984 -R. A.Palacios 1297(BAFC).

Vignaadenantha(G.F. Meyer)Marechal,Mascherpa& Stainier:

Loscromatogramasasíobtenidos sepresentan en laFigura3.

Apartirdelanálisisde losmismosbajoluzUV en presenciade

vapores

de

NH3

se hancaracteriza¬ dolas manchascorrespondientesa flavonoidespor susrespectivosRf(Tabla 3).

LaTabla 4 presenta en forma comparativalos

resultados correspondientesal número de flavo¬ noides detectados

por

cada uno de los métodos

para

cada especie. Asimismo se muestran en la

Tabla5 los valorescorrespondientesalnúmero de flavonoides en común entre cada

par

deespecies

que

pudieron correlacionarse utilizando cada mé¬ todoen formaindependiente.

Peía, de Entre Ríos, Depto. Uruguay, Concepcióndel

Uruguay, Banco Pelay- 5/VII/1985

-

R. A.Palacios 1380 (BAFQ.

Vignacandida(Vellozo)Marechal,Mascherpa&Stai¬ nier:

Peía,de Misiones,Depto. San]avier, ruta 14, bifurcaciónS.

Javier-Itacaruré

-

25/11/1984

-

R. A.Palacios 1289(BAFQ.

Macroptiliumprostratum(Bentham)Urban:

Peía,deEntreRíos,Depto.Colón, cruce ruta 14y arroyoEl

Palmar-25/11/1982-R. A.Palacios1205(BAFQ. Phaseolusvulgaris L.varaborigineus(Burkart)Baudet:

Peía,de Salta,Depto. LaCaldera, Finca La Angostura

(7)

Tabla2.

Flavonoides determinadospor CLAR para6especiesargentinas de laTribuPHASEOLEAE

FLAVONOIDES 1 2 3 4 5 6

tg Vigna Vigna Vigna Vigna Macroptilium Phaseolus (min) lateóla longifolia adenantha candida prostratum vulgaris Ne

I 5,00 + + + +

II 5,56 + + + + + +

III 6,10 +

IV 6,51 + + + + + +

V 7,00 + +

VI 7,35 + + + +

VII 7,83 + + + + +

VIII 8,40 + +

IX 9,60 + + + +

X 10,50

11,10

+ + +

XI + +

+

=

peesente;

=

ausente

Tabla 3.

Flavonoidesidentificadospor CromatografíadeparticiónL-L

SP MANCHA RFx 100 UV UV/NH, SP MANCHA RF X100 UV

UV/NH3

19/78 35/36 54/80 56/60 59/40 58/15 74/41

PR PA

1 1 4 1 41/79

45/40

63/57 65/49 74/72 84/54 88/36

Vp V

BV

2 Vb 2 PR PA

3 PA A 3 Vp VA

BA

4 A 4 PR PA

5 V Vb 5 B BV

V

6 Vb 6 I Ap

V Vb

7 7 V . Vb

13/72 39/84 44/63 40/28 27/17 87/32 92/11

BV VA

2 1 5 13/68

.

21/72 28/83 30/77 35/90 90/38

BV

1 Vb

PR PA

2 2 P PA

BV VA

3 3 PA A

P VA

4 4 P PA

BV

5 VA 5 B V

PV

6 Vb 6 VA Vb

7 Ap VA

¡

B

3 1 14/68

41/57 72/44 84/48 39/38

V 6 1 11/69

41/61 86/57 87/38

I Vp

2 PR PA 2 PR PA

Vp

3 VA 3 I Ap

B

4 BV 4 B Vb

5 BV Vp

A

=

amarillo;B

=

blanco; b

=

brillante;I

=

incoloro;P

=

pardo;p

=

pálido; R

=

rojizo; V

=

verde

motilados

(Casteele,Geiger

y

VanSumere,1982).

En nuestro caso, se procesaron muestras con un

La CLAR resulta un excelentemétodo

para

la promediode entre 4

y

7 flavonoides

por

especie, determinacióndeperfiles

y

el aislamiento deflavo- tratándoseen todos' loscasosdeO-glicósidos,

ob-noides. En la práctica se han podido resolver

servándose

deacuerdoa lostiemposde retención muestrascon másde30flavonoidesglicosidadoso obtenidos

por

Harborne

y

Boardley(1984)

y

consi-DISCUSIONDE LOS RESULTADOS

(8)

Bol.Soc. Argent. Bot

.

26(3-4X1990)

Vigna luteola Vigna candida

©

3 1

ó

©

&

G<D>

cz>

¿P

4 2

Vigna longifolia Macroptilium prostraturr

cÿO

O

4

<3D

2 I,

0

6

CD

Vigna adenantha Phaseolus vulgaris

var aborigineus

0

0

<9

ai

0

Ac|%

TWA-*-Fig.3.

Cromatogramastridimensionalesen papelparaseisespeciesde laTribu Phaseoleae (Papilionoideae-Legumiriosae).

derando

que

noseutilizaron exactamente lasmis¬

mas condiciones

que

noshallamosenel

rango

de tiempode retención.Este valor

es

constante

para

mono, di

y

triglicósidos,

pues

elgradodeglicosi- cadacompuesto enlas condiciones

experimentales

dación está directamente relacionadoconeltiempo fijadas. Este parámetrode lectura inmediata

per-de retención(Harborne

y

Boardley,1984). miteun manejo simplede la información obtenida Cada flavonoide queda caracterizado

por

el

(9)

rangos

de característicossonsuficientemente es¬ trechoscomo

para

tenersuperposiciones enotras

sustancias,

pues

se trabaja enla banda de absor¬ cióncaracterística de flavonoidesen la detección del

compuesto.

Enelcasodelacromatografíaenpapella iden¬ tificaciónes menosprecisa

y

sujetaa

mayor

error,

pues

el

proceso

de detecciónes más

engorroso

e

inexacto(observaciónde color, mediciones de

R(,

recorte

y

elución de manchas, cálculo de

superpo¬

sición,etc.).Asimismo resulta más difícil controlar

las condiciones de corrida(temperatura, gradode hidratación delpapel,sembrado demuestras,satu¬ racióndelacuba)lo

que

afecta la relación de frente

y

eltamañode lasmanchas,dificultando lacorre¬ lación-entrecromatogramas.Esteaspecto creadifi¬ cultades de

gran

magnitud a medida

que

creceel númerode especiesconsideradas

que

buscan co¬ rrelacionarse.

Ennuestrocasoselogró una certeza decorre¬ lacióninmediatasuperior en un30a un50%,se¬ gúnlasespecies,

para

laCLAR (4-9

compuestos)

respectoa la cromatografíaen papelcomoseob¬ servaa partirde lacomparaciónentrelas tablas5a

y

5b.

Otro aspecto

muy

importantea favordelacro¬ matografíade alta resolución está dado

por

el he¬ cho de

que

esposiblecaracterizarloscompuestos encuantoasunaturalezaquímica enbaseasu tÿ Asíes posible diferenciar isoflavonas(Carlson

y

Dolphin,1980),glicoflavonasisoméricas(Becker

y

Wilking, 1977; West, Birac

y

Pratt, 1978; Lardy, Boulliant

y

Chopin,1984)

que

nopueden

separarse

por

otrosmétodos, flavonaspolimetoxiladas

(Rou-seff

y

Ting,1979;Bianchini

y

Gaydou,1980),flavo¬ noidessulfatados(Harborne

y

Boardley,1984),

iso-y

una prontacaracterización de cadaespecie,facili- flavonoides(Dorr

y

Guest,1987)o diversos com-tando elanálisis numérico estadístico inter oin- puestosfenólicos (Court, 1977; Vanhaelen

y

Van-traespecífico.

Lautilización de columnas defasereversa nos

Tabla 4.

Cantidadde Flavonoides Detectados

Papel CLAR Especie

1(V. luteola)

2(V.longifolia) 3(V. adenantha) 4(V. candida) 5(M.prostratum)

6(P.vulgaris)

7 7

7 7

5 6

7 9

6 6

4 4

Tabla5.

Correlaciónde flavonoides entre especies a)Cromatografíadepartición L-L

Especie 1 2 3 4 5 6

3 3 4 3 2

4 4 4 2

4 4 3

3 3

1

2

3 4

5 2

6

b)Cromatografía líquidadeAltaResolución

Especie 1 2 3 4 5 6

4 3 6 3 3

.6 6 5-4

5 5 4

4 3

1

2

3 4

5 3

6

haelen-Fastré,1980).

Debe tenerse encuenta

que

muchos de estos

permitióencarar un estudiocomparativo

y

relati- compuestos no puedendiferenciarseenelpapel, o

vamentesencillo,bajocondiciones estandarizadas, biensu caracterizaciónes ambigua(basada ensu de muestrasvegetales confinesquimiotaxonómi- coloración)

y

obliga a una serie de eluciones

y

nuevascorridascromatográficas.

Una

gran

ventaja de la CLARes

que

permite lución cromatográfica una vez determinadas las trabajarademásenformapreparativa, obteniéndo-condiciones de trabajo, nose hallaron diferencias se alfindel

proceso

sustanciasprácticamente

pu-demasiadosignificativas respectoa latécnicatradi- ras

y

en cantidades necesarias

para

encarar los cional de cromatografía líquida de partición L-L análisis químicos

y

espectroscópicos

para

una sobre papelen cuanto al número de flavonoides exacta determinación estructural del compuesto detectados

por

ambos métodos

para

cadauna de (Pomilio

y

Zallocchi,1989).

las seisespeciesestudiadas,aunqlieen dos de ellas

el númerofue inferior cuando se usó este último CONCLUSIONES eos.

SibienlaCLAR presentaun altogradode

reso-método.

Sinembargo, enelprimer caso(CLAR)lacorre- Larelación de costo delequipamientobásicoes lación entrecromatogramas esinmediata

pues

los uno de los factores de

mayor

peso

encontra de la

(10)

formancecompounds

/.

Chromatogr.130:287-291.

introducción de esta técnica,

pero

debetenerseen

cuenta

que

losgastosde funcionamientoson relati- DAIGLE,D.J.&E.J.CONKERTON.1982.High-perfor¬

mance liquid chromatography of 34 selected flavo-noids]. Chromatogr.240: 202-205.

DORR,K. K.&D. 1. GUEST.1987.Rapid,sensitive

high-performanceliquid chromatography assayfor isofla-vonoidsfromcowpea (Vigna unguiculata)]. Chroma¬

togr.387: 536-540.

(purificación,filtrado,etc.)lo

que

requiereuncier- ENGELHARDT,H.1979.Highperformance liquid

chromato-to tiempo detrabajo,

aunque

permite a su vez un

aumentodela resolución finallograda

y

es de fácil estandarización.

vamentesimilares a losdelos otros métodossise cuentao puede conseguirseel equipobásico.

Otroaspectodesfavorable estádado

por

elne¬

cesario

proceso

depreparación previaa

que

deben someterselasmuestrasantesdeefectuar la corrida

graphy (Chemical laboratory practice)

-

248 pp

-Springer Verlag (Berlin-Heidelbeg-N.York). GALENSA,R. & K. HERRMAN. 1980. Analysisof

flavo-noidsby high-performance liquid chromatography/.

Chromatogr. 189: 217-224.

HARBORNE,J.B. & M. BOARDLEY.1984.Useof high-performance liquid chromatographyin thesepara¬

tionof flavonolglycosidesandflavonolsulphates

J.

Chromatogr.299:377-385.

HAMILTON,R.J.&P.A.SEWELL.1982.Introductionto highperformance liquid chromatography-248pp.

-

2nd. Ed.Chapman&Hall(N. York-London).

Afavor cuentael altogradode resolución

que

puedealcanzarse,

que

se

pone

de manifiestocuan¬ dose tratan mezclas máscomplejas

que

lasaquí presentadas, o bien

para

la separación de com¬ puestos muy semejantes estructuralmente, tal como se mencionó anteriormente. Asimismo la

inmediata caracterizaciónde losperfilesesidealen

estudiosquimiotaxonómicosdado

que

laelucida¬

ción estructuralesel

paso

másengorroso respecto LARDY, C,M.L. BOULLIANT&J.CHOPIN.

1?84.

Sepa-ala obtención de los patronesespecíficos,queen este caso resultanclaros

y

de fácilcorrelación.

En últimainstancia creemos

que

ambosméto¬

dospueden complementarsebien dado

que

la cro¬ matografía en papel podría

emplearse

alternativa¬ mentecomo unprimer

paso

deseparaciónapartir

delcual lasmanchassean eluidas

para

luegocarac¬ terizarlas

por

CLAR. Delmismo modolosproduc¬

tos de hidrólisis pueden determinarse junto con

testigos

puros

disponibles mediante co-cromato- MARKHAM, K. R.1975. InJ.B.Harbome,T.J.Mabry &H.

grafía,obienempleandoflavonoides previamente

aisladosa partirde otrasespecies.

ration deC-glucosylflavonesisomeresparchroma to-graphieliquideahauteperformance enphaseinverse

J.

Chromatogr. 291:307-315.

LUNTE, S.M.1987.Structural classificationofflavonoids inbeveragesbyliquid chromatographywith ultra¬ violet-visibleandelectrochemical detection].Chro¬

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Deseamos expresar nuestroreconocimientoa la Uni- NIEMANN, G.J.&J.V. BREDERODE.1978.Separationof

glycoflavonesand their glycosides by high-perfor¬

mance liquid chromatography ]. Chromatogr. 152: 523-527.

AGRADECIMIENTOS

versidad deBuenosAiresyalConsejoNacionaldeInvesti¬ gacionesCientíficasy Técnicas

-

CONICET-de laRepúbli¬

caArgentina(PID3053200yPID3063700)porelsostenido

apoyoeconómico e institucional brindadoparael desarro¬ llo deeste trabajo.

POMILIO, A.B. & E. M.ZALLOCHI.1989.Twonew isor-hamninosides fromVignatuteóla]. Hat. Prod.52(3):

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acidsandflavonoidsby high-pressure liquidchroma¬

tography ].Chromatogr.116:271-279.

Separationofflavonoidsby reversed-phase

Figure

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