Bol. Soc. Argent. Bot. 26(3-4):163-172.1990
BASES DE APLICACION
DE LA
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA
DE ALTA
RESOLUCION
(CLAR)EN
QUIMIOTAXONOMIA
DE
FLAVONOIDES
PorENRIQUEM.ZALLOCCHI1,ALICIAB.POMILIO2’ yRAMONA.PALACIOS1'’
Summary Applicationsof high performance liquid chromatography(HPLC)on chemotaxonomical flavo-noid studies. This report shows that thehighperformance liquid chromatographic analysisof flavonoids in chemotaxonomic studies offersan accuratesensitivetechniquethat enablesarapidisolation and characteri¬ zationof thesecompounds when compared withanyother method. Theprocedureis illustrated by the identificationofelevenflavonoids in sixargentinespeciesof the tribe Phaseoleae (Papilionoideae-Legumino-sae).A comparative study was simultaneously carriedouton the same species using the classical standardi¬ zedtwo-dimensional paper chromatography. Althoughnomeaningfuldifferences in the number of detected
flavonoidsby both methodsareobserved,HPLCprovidesa more accurate correlationwithin species anda
rapididentificationofthe compoundsbytheir retention times. An appropriate methodforclean-up and sample preparationis described. The mainfactorsthataffectoptimizationof HPLCconditionsarealso discussed.
INTRODUCCION aprovechamientocuando exista la posibilidad de
uso.
La cromatografía líquida de alta resolución
—
Elobjetivode estetrabajoespresentarlameto-CLAR (oHPLC
por
sussiglaseninglés)conside- dologíabásicay
losprincipales parámetrosa tenerradadesdehacelargo tiempouno de los métodos más promisorios
para
la identificación de com¬ puestosfenólicos(K. Markham,1975)hapasadoaconvertirse en los últimos añosenel másempleado
por
los diversos autorespara
el aislamientoy
puri¬ficación de flavonoides dados los excelentes
resul-encuenta
para
encararestudios quimiotaxonómi-cos mediante esta técnica. Asimismo,como siste¬made referenciarespecto a los métodosemplea¬
dosusualmenteenbotánica presentamosunestu¬ diocomparativo realizadopara6especiesargenti¬
nasde la tribu Phaseoleae (Leguminosae) en base a estatécnica
y,
paralelamente,elanálisis de lasmis-Una de lasprincipales ventajasde esta técnica mas mediantecromatografíadepartición líquido-radica en la relativamente pequeña cantidad de líquidobidimensional sobrepapel.
muestranecesariaparauna evaluaciónacertada de Sed¡scuten enforma comparativa los
resulta-ioscompuestos presentes,mientras
que
respecto a dos obtenidosy
sepresentanlasprincipales aplica-cualquier otrosistema de cromatografía conven¬cionalsobrepapelsucapacidadresolutivaesmuy superior(Wulf
y
Nagel,1976)permitiendoungran ahorrode tiempoy
esfuerzo mediantesu empleo (Daigley
Conkerton,1982).Si bienuna desventaja de
peso
sueleestardada La CLAResuntipodecromatografía líquidaenpor
el costo relativamente alto del equipamiento lacual la faseestacionaria(que puedeserunsólidonecesario, no son
pocos
los casos enque
puedeporoso
comopor
ejemplo un adsorbente clásico, llegaradisponersedelequipo básicocompartién- una resina de intercambio iónico o un polímerodolo temporalmente o aportando algún comple- poroso)sehallaencerradaenuna columna
metáli-mento adecuado,
por
loque
resultaimportante sutadosobtenidos.
donesquelaCLARpuede presentaren quimiota-xonomía.
La técnica de la C.L.A.R.
ca mientras
que
la fasemóvilesunlíquidoquees forzado a atravesarla bajo una cierta presión(Hamilton
y
Sewell,1982).Eltérmino altaresolución("high performance")
tiendeaemplearseúltimamenteconpreferenciaal
2Departamento deQuímicaOrgánica, Fac. deCs.Exactasy
nombre propuesto originalmente decromatografía
Naturales-Universidad deBuenosAires.
.
J J ,3Miembro de laCarreradel Investigador Científico del Consejo liquidade altapresión( high
pressure
)dadoque
NacionaldeInvestigaciones CientíficasyTécnicas(CONICET). el primero
expresa
conmayorexactitud laprinci-'Departamentode CienciasBiológicas, Facultad deCs.Exactas yNaturales-Universidad de BuenosAires-Cdad. Universitaria,
PabellónII,4,0piso-1428Buenos Aires.
Bol.Soc.Argent. Bot
.
26(3-4)(1990)salida palcaracterística deesta técnica, mientras
que
elsegundosólo hacereferenciaaunparámetro
ope¬
racional.
En
CLARel término fase normalserefiere a la técnica cromatográfica enque
la fase móvil es menos polarque
la fase estacionaria.El términofase reversa ofase invertida (o RP
por
"reversedphase") seutilizapara
designarsis¬ temas de fase estacionaria no polar, en general silicagel tratada (RP08; RPC8), usándose una fase móvil más polar,comoagua
oalcoholes(H.Engelhardt,1979).
A)
t
RESERVORIO
f
---
DETECTORsolvente
=F¿
Éü
REGISTRADORCOLUMNA |
-INYECTOR
BOMBA
muestra
Equipamiento
Si bien los distintos modelos decromatógrafos líquidosdealtapresiónpuedenalcanzargradosde sofisticación realmente notables
(y
enrelación di¬ rectaasucostoobviamente)laconfiguraciónbási¬ cadeun equipoque
reúna las condicionesimpres¬ cindiblespara
su uso enquimiotaxonomía se es¬ quematiza enlafigura1-A.Unsistemamáscomplejo apto
para
utilizargra¬
diente de solventes(comose observa en lafigura 1-B) ofrece la posibilidad de ir variandoen forma programadadurante el transcurso de la corrida la relación de loscomponentesde la fase móvil,es decirlapolaridadde lamezcla de elución.
Serequierenbombas de altapresión
para
hacer.
pasar
el solventepor
la columnapues
el relleno ofreceunaalta resistencia.Altrabajar conflavonoides loaconsejable es un
detectorUV de onda variableajustadoa unalongi¬ tud de onda entre 290
y
300 nm apropiada deacuerdoala bandaIde absorción de los
flavonoi-B)
solvente solvente
I
|programa|
UNIDAD DE
CONTROL
DEFLUJO
A
F
CAMARA DE MEZCLADO
ídor
lujo de f
a inyector
Fig.1.
—
A)ConfiguraciónbásicaparaCLAR;B)Configu¬raciónpara utilizargradientede solvente.
des
y que
no sesuperponga
conelrango
de absor¬ción delsolvente. También sepueden utilizar de- cadaunode loscomponentesde lamuestra inyec-tectores UV de onda fija (en particular los
que
tada.trabajan a256nm),fluorimétricos oelectroquími¬ cos(Lunte, 1987).
Laresolucióno efectividad delaseparación cro¬ matográfica está dada
por
la relación entre la Resultamuy
convenienteenla prácticaelem- selectividad(odistancia entrepicos)y
laeficiencia
de pleodeguardacolumna (que seintercalaala entra- la columna(oancho debanda).Cada una de las sustancias separadas queda da de lacolumna)
ya que
altrabajarcon derivadosde
extractos
naturales la vida útil de las columnas caracterizadapor
unparámetroque
esel volumen se puede ver restringidasinosetomanprecaucio- de retención(VR)
oflujototal de solventenecesariopara
eluir el centro dé una banda dada desde el momento delainyecciónhastaque
alcanza suva¬ lor máximoen el detector.nes enlapurificaciónde lasmuestras.
Desarrollocromatografía)
Sinembargo,elparámétromásutilizado
para
la Loscromatogramas
resultantes delproceso
de caracterización de cada una de los compuestos CLARseobtienengráficamentemediante lacone- separadoses eltiempoderetención(tÿ)
dadoque
xiónde unregistradoradecuado al detector utiliza- esmuchomássencillo de medir
y
esconstantesidoa la salida de la columna(Figura2). no sevarían las condiciones deflujo
y
temperatura. La graficacióna lolargodeltiempode lasvaria- La utilización de un registrador-integradorcionesde absorbanciaenel detector determinan la (electrónico) brindará además del gráfico corres-aparicióndepicos
que
corresponden ala salida de pondiente(cromatograma)
todos losdátosVigna
tuteóla
Vigna
candida
tn n o
rí
S
5
s
2
CO
co
< rJ
3
si
s
8
-
5
in
I
\r¿ oo nOJ
t
-
tR
(min)Macroptilium prostra
turn
Vigna
tongifolia com r-'
5
5
to
13
S
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s
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s
SHSt.l
5
Phaseolus
vulgaris
oí Vigna
adenantha
CO CO
(O
lio var
iri aborigineus
o £
tó
to
LO
3
S
iAS
ai
Fig.2.
—
Cromatogramasde alta resoluciónpara seisespeciesde laTribu Phaseoleae(Papilionoideae-Leguminosae).ríos
para
un análisis cuali-cuantitativo de cada En casodeemplearseotro tipode registradormuestra,correspondientesacadauno delospicos, (electromecánico)secalculaen forma gráficael
Inclusose podrácalcular(siseha calibradoprevia- de cadacomponentemidiendola distancia al ori-mentecon una muestra testigo de concentración gen(t )de cada,pico,
y
convirtiendo estevalorenconocida)la concentración relativa de cada flavo- tiempo conociendo la velocidad del papel. Cada
noideaislado
por
integración del área bajo cada unade losflavonoides.de
lamuestra puedeBol.Soc.Argent. Bot
.
26(3-4)(1990)resulta deenormeutilidad
para
suposteriordeter- crecientesenlacomposicióndelamezclapara
el minaciónestructural osu empleo como testigos. solventemenos polardeterminan unaumentode la fuerza de elución.Se lograncambiossignificati¬ vosaumentandosu concentración oreemplazán¬ dolopor
otro depolaridaddecrecienteque
lesiga1)Tipode Columna:Lautilización de columnas en la lista.Paralaseparaciónde flavonoides,
traba-defasereversa es lo másindicado
para
trabajarcon jandocon una columnaRPC-18 se obtendrán bue-flavonoides.En general se empleanrellenos micro- nosresultadoscon mezclas Metanol:Agua en unporosos
del tipo C-18 (Daigley
Conkerton,1982;rango
de 35: 65a70:30segúnelgradode glicosida-Wulfy
Nagel,1979;Lardyy
col.,1978)oC-8(entre ción,pudiéndoseagregar
de 1 a 5% de Acido Acé-otros: Harborney
Boardley,1984;Niemanny
Bre- tico(Harborney
Boardley,1984;Daigley
Conker-derode,1978).Eltamañodepartículaadecuadoes ton, 1982;Wulfy
Nagel,1976) oAcido Fórmico de10pm, o5pmpara
separacionesmásfinas.Las (Casteele,Geigery
Van Sumere,1982)loque
en dimensiones de la columna se eligen en base al algunos casos mejorael ancho de las bandas, debi-equipo disponibley
al tipode trabajoa realizar doala disminuciónoanulación dela ionización de(analíticoo
preparativo).
Salvoque
se dispongade losgrupos
—
OH fenólicos ácidos. unabomba dealtacapacidad seutilizarán colum¬nas analíticas o semipreparativasconun diámetro de Metanolprácticamente conlosmismos
porcen-entre5
y
15 mmy
unlargode150a 300 mmi Lavida útil’deunacolumnaRPdefase unidaes Principalesparámetros ateneren cuentaTambiénpuedeutilizarse Acetonitriloen lugar
tajes.
Lautilización devariacionesdelacomposición de 3a 6 meses de usocontinuoapropiado.Deben de la mezcla de elucióna lolargodel desarrollo
evitarse el uso de álcalis (pH > 8)o sales
pues
cromatográfico, o gradientede solventes,permite disminuyenla estabilidad de la fasefija. Elrango
reducir eltiempototal de corriday
mejorarla reso-detrabajo se fijapara
valores depH
entre2y
8. lución.-
En general seirá variando lapolaridad enforma2)FaseMóvil: Altrabajar concolumnas defase decrecientea fin de disminuir los de los com-reversaelsolvente demáxima polaridad disponi- puestosmásretenidos,
aunque
en definitivala es-bleeselagua.
Seutilizaenmezclas deproporcio- trategia a seguir dependede la naturaleza de cada nes variablescon un solvente misciblemenos polar muestraenparticular.talcomoMetanol o Acetonitrilo.LaTabla1mues¬
traunaserieeluotrópica depolaridaddecreciente
con los solventes más usualmente empleados en valores deflujo
entre
0.5y
2 ml/minuto, loque
implicaubicarseenun
rango
de presión detrabajo Dadoque
la selectividady por
ende la resolu- de entre 500y
3000psi(14psiequivalenaproxima¬ cióndependendelsolvente al buscar las condido- damentea1atm).nes
de mejor resolución cromatográfica se debe tener encuentaque,
enfase reversa, variaciones3) Velocidad deFlujo: En general se trabaja a CLAR.
4)
Temperatura:
La
temperatura
afecta lareso¬ luciónporque
al incrementarsedisminuyela reten¬ ción. Asimismodisminuyela viscosidad de la fase móvil mejorando la eficiencia de laseparacióny
aumentala solubilidad de lassustanciasen la fase móvil.Enfasereversa elmáximorendimiento se obtienetrabajando a temperaturas entre 40
y
60 grados,aunque
si no se cuenta con un sistemacapaz
determostatizarlos solventes sepuedetra¬ bajarperfectamente a temperaturaambiente.5) Desgasificaciónde solventes:
Luego
depro-
_
ceder al filtrado de los solventes o mezcla plear (lo
que
evitaque
penetren partículas a labomba
o al sistema de conductosque
puedenlle¬gar
a obstruir la columna) sedeben eliminar los gasesdisueltosenla fase móvilpor
calentamientoy
agitación envacío(ousandogas
inerte).Esimportante enel
proceso
dedesgasificación noalterar lacomposiciónde la mezcla.En generalTabla 1.
—
SerieeluotrópicadepolaridaddecrecienteSolvente E.(FuerzadelSV)
Agua
Metanol
Etanol n-Propanolol
Acetonitrilo
Acetatodeetilo
Acetona Dioxano THF Benceno* . Tolueno* n-Pentano*
muyalta
.
0,950,88 0,82 0,65
0,58 a
em-0,56 0,56 0,45 0,32 0,29 0,00
es conveniente
preparar
la cantidad de eluyente yectarsea la vez, o bien se efectúan dos corridasnecesaria
poco
antesde usarlo, sin mantenerloen sucesivasy
secomparan
los respectivos. el reservoriopor
períodosdetiempo prolongados.3)Aislamiento desustanciasde interés:Se
pue-6) Volumen demuestra inyectado: Lamuestra detrabajaren formapreparativapara
el aislamien-se debedisolverenel solventecon menorfuerza de tomasivodeun compuesto en particular.Sepuede eluciónpara
lograrelmenor volumen finalque
sea disponerdeuna columna preparativa adecuada a posible.Delmismomodo, la concentración(canti- lamasadelamuestra,o bien utilizar una columnadad)de muestra es un factor
muy
importantepues
semipreparativay
repetir la corrida un número afecta la resoluciónpor
saturacióndelacolumna, suficiente deveces.Las fracciones correspondien-provocando bandas asimétricasy
con colaspro-
tesal o lospicosde interésserecogen
ala salida del nunciadasresultandotiemposde retenciónmeno- detector enrecipientesadecuadoso bien mediante uncolectorautomático de fracciones.Unavez reu-res.Elcontrol adecuado de losparámetrosdecorri- nida la muestra seprocede a eliminar el solvente dapermitealcanzar conestatécnicauna reprodu- enun evaporadorrotativoobien
por
liofilización cibilidadque
esmuy
superiorrespectoacualquier delagua,
obteniéndose la sustanciapura,
la cualotradisponible
para
flavonoides.Su resolucióny
puedeser analizadapor
espectroscopiaUV,RMNsensibilidadpermitendetectarhasta cantidades del protónico
y
de carbono13, hidrólisisáciday espec¬
trometría de masa, determinándose la estructura
delflavonoide. orden delos 50
ng
(Wulfy
Nagel,1976).Apliaaonesdela C.L.A.R. enquimiotaxonomía
4)Elución
y
análisis de manchas de cromatogra-Lainclusión delaCLARen trabajos quimiota- masen papel: Se puede procederaunanálisis dexonómicosno es nuevadado
que
sehaaplicadoa eluidos de manchas decromatogramas
en papel.ya
diversos estudios de flavonoidesendiferentes es- seacon fines comparativos o bien
para
purifica-pecies (Daigley
Conkerton, 1982 citan varios ejem- ción.Esimportantepara
estouncorrectofiltrado píos;Aseny
Griesbach,1983)y
otrosdetipo filoge- (porlomenosdosveces)del eluidopara
evitarel nético(Meurer,Wiermanny
Strack,1988)aunque
ingresode fibras de celulosa a la bomba o columnalamayoría sehan efectuadoconfinesfitoquímicos, del cromatógrafo. En general, una mancha dada
y
muchosdeestoscorrespondena la familia Legu- presentarámásdeun componentecuandose anali-minosae (Carlsony
Dolphin,1980; West, Biracy
zapor
CLAR, loque
demuestralamayor
resolu¬ciónde este método.Deestemodopodrán
separar-Deacuerdoanuestraexperienciaexisten varias se
y
caracterizarse estoscompuestos. aplicacionesdelaCLARque
facilitany
permitenlograr una
mayor
exactitudenlas determinaciones MATERIALESY METODOS quimiotaxonómicas:Pratt,1978;Dorr
y
Guest,1987).El material vegetal seco
y
molido,preferente-1) Caracterización de patrones específicos: A mentedeorigenfoliar o tallosnoleñososfue ex-pa'rtir de extractos de material vegetal se puede traídoenunextractorSoxhletcon unsolventeno obtener elpatrón cromatográficoespecíficocorres- polar(éterdepetróleo,fracción 60-80grados) du-pondientea los flavonoidespresentes conla finali- rante 24 hsa reflujo. Serealizóa continuación de
dadde realizar unestudio quimiosistemático.La modo similar unasegundaextracciónempleando información obtenidapermiteunarápidacórrela- metanolcomosolventeconla finalidad de
separar
ción entrelas diversas muestrasen estudio dado lassustanciaspolares. En generalenesteextractoque
cadaflavonoide está caracterizadopor
un sólo seobtendrán losflavonoides(salvoalgunosmuy
parámetro
que
eselTiempodeRetención(t,,).
metiladosocon sustituyenteslinealesque
los tor¬ nanmuy
poco
polaresy que
son másafines al 2) Co-cromatografía contra testigo: Un com- solventeinicial).puestoaislado previamentepuede sercorridoen
formaconjuntacon untestigoconocido,obienun cía
muy
complejay
enriquecida enotroscompues-segundo compuesto proveniente de otra fuente, tosde
poco
interéspara
elquimiotaxónomo(comocuandoquieracorroborarse
que
se trata de la mis-por
ej.clorofilas)y
que
impediríanuna identifica-masustancia.Estoseráfácil de evidenciar cuando cióny
separación apropiada de los flavonoides seobservaunúnicopico enelcromatogramaobte- (generalmentenotanmayoritarios), se' procedióa nido a partir de su inyección conjunta. Ambas efectuar un fraccionamientoapropiadopara,
irob-muestrasse
preparan
por
separadoy
puedenin- teniendosubfracciones enriquecidas en flavonoi-Dadoque
este extracto crudo resultaunaBol.Soc. Argent. Bot .26(3-4)(1990)
RESULTADOS OBTENIDOS des con el fin de lograr un máximo aprovecha¬
mientoen el
proceso
deCLAR.Se realizó este fraccionamiento en dos
sucesivos:en primer lugar se procedióa utilizar cromatografía de permeación
por
geles, usandoSephadex LH-20 comosoporte
y
metanol como eluyente.Posteriormente sereunieronlas fraccio¬ nesconflavonoidesy
secromatografiaronenco¬ lumna desilicagel60-H usando mezclas de clorurode metileno-metanol de polaridad creciente. Se
obtuvieronasíentre 4
y
7 fraccionescon flavonoi¬des
para
cada extracto,algunasde las cuales serepresentanen los cromatogramasde laFigura2. Las muestras asíobtenidasfueron recristaliza¬ dasen metanol degradoespectroscópicoyfiltra¬
das.
A partirdelas condicionespreviamenteobteni¬ das
para
las muestrasconflavonoidesseprocedea efectuar las corridaspara
las diversas especies en forma estandarizada.La Figura2presenta algunosde loscromatogra¬ mas de alta resolución obtenidoscorrespondientes a las subfracciones más representativas de cada especie.
Con los tiempos de retención obtenidos
para
cada muestraseconfeccionauna matrizbidimen-sional de datos,considerandolapresencia o node
cada unode los flavonoidesdetectados(caracteri¬
zados
por
susrespectivostÿ
para
cada unodelostaxainvolucrados.
LaTabla 2presentalos datoscorrespondientesa lasseisespeciesdelosgéneros Vigna,Phaseolus
y
Macroptilium(Phaseoleae, Leguminosae)
que
fueron analizadaspor
cromatografía líquidadealta,reso¬lución.
Pa
sosEl
proceso
defiltrado delamuestra previo asu inyeccióna uncromatógrafo líquidoes imprescin¬ diblepara
lograr unadecuado funcionamiento de las columnas.Se utilizó un filtro microporosode membranaMilliporetipoFGde0,2pmconectadoenserieauncartucho de filtradoSep-Pak
Waters-MilliporeNs 51910 con relleno de fase reversa C- Comparaciórt con otrastécnicascromatográficas
18.
Las corridas fueron efectuadas en un equipo WatersutilizandounacolumnauBondapack RP C-18analítica (diámetro:5 mm,largo:240 mm).Se utilizó un detector UV de onda variable en una longitudde ondade 291nm.
-Lamezcla de eluciónfueMetanol-Agua(58:42),
trabajándose en condiciones ¡socráticas. La co¬
rrientedeflujofue de0,7
ml/min.
Resultainteresante,
y
necesariocomopuntodereferencia, la comparación de esta metodología conlatradicionalmenteempleadaenbotánicapara
los estudios quimiotaxonómicos, esdecir la Cro¬ matografía deParticiónL-Lbidimensional en
pa¬
pel.
Seha realizadoparalelamenteun estudio
para
losextractosmetanólicos delas seisespecies
pre¬
viamenteconsideradas.Seprocedióa sembrar so-. brepapelWhatman 3MM una muestra dedichoextracto
y
secorrió(enformadescendente)enuna dirección con una mezcla de Terbutanol-Agua-Acido Acético (3:1:1),para
luegorepetir elprocedi¬
miento enel otro sentido usando como solvente Acido Acético al15%(Mabry,Markham
y
Thomas1970). Material de laArgentinaanalizado:
Vignaluteola(Jacq.)Bentham
Peía,deEntreRíos,Depto. Gualeguaychú,Ceibas-15/V/
1984-R. A.Palacios 1378(BAFQ.
Vigna longifolia(Bentham)Verdcourt:
Peía,de Corrientes,Depto. Pasode los Libres,Pasode los
Libres- 28/11/1984 -R. A.Palacios 1297(BAFC).
Vignaadenantha(G.F. Meyer)Marechal,Mascherpa& Stainier:
Loscromatogramasasíobtenidos sepresentan en laFigura3.
Apartirdelanálisisde losmismosbajoluzUV en presenciade
vapores
deNH3
se hancaracteriza¬ dolas manchascorrespondientesa flavonoidespor susrespectivosRf(Tabla 3).LaTabla 4 presenta en forma comparativalos
resultados correspondientesal número de flavo¬ noides detectados
por
cada uno de los métodospara
cada especie. Asimismo se muestran en laTabla5 los valorescorrespondientesalnúmero de flavonoides en común entre cada
par
deespeciesque
pudieron correlacionarse utilizando cada mé¬ todoen formaindependiente.Peía, de Entre Ríos, Depto. Uruguay, Concepcióndel
Uruguay, Banco Pelay- 5/VII/1985
-
R. A.Palacios 1380 (BAFQ.Vignacandida(Vellozo)Marechal,Mascherpa&Stai¬ nier:
Peía,de Misiones,Depto. San]avier, ruta 14, bifurcaciónS.
Javier-Itacaruré
-
25/11/1984-
R. A.Palacios 1289(BAFQ.Macroptiliumprostratum(Bentham)Urban:
Peía,deEntreRíos,Depto.Colón, cruce ruta 14y arroyoEl
Palmar-25/11/1982-R. A.Palacios1205(BAFQ. Phaseolusvulgaris L.varaborigineus(Burkart)Baudet:
Peía,de Salta,Depto. LaCaldera, Finca La Angostura
Tabla2.
—
Flavonoides determinadospor CLAR para6especiesargentinas de laTribuPHASEOLEAEFLAVONOIDES 1 2 3 4 5 6
tg Vigna Vigna Vigna Vigna Macroptilium Phaseolus (min) lateóla longifolia adenantha candida prostratum vulgaris Ne
I 5,00 + + + +
II 5,56 + + + + + +
III 6,10 +
IV 6,51 + + + + + +
V 7,00 + +
VI 7,35 + + + +
VII 7,83 + + + + +
VIII 8,40 + +
IX 9,60 + + + +
X 10,50
11,10
+ + +
XI + +
+
=
peesente;—
=
ausenteTabla 3.
—
Flavonoidesidentificadospor CromatografíadeparticiónL-LSP MANCHA RFx 100 UV UV/NH, SP MANCHA RF X100 UV
UV/NH3
19/78 35/36 54/80 56/60 59/40 58/15 74/41
PR PA
1 1 4 1 41/79
45/40
63/57 65/49 74/72 84/54 88/36
Vp V
BV
2 Vb 2 PR PA
3 PA A 3 Vp VA
BA
4 A 4 PR PA
5 V Vb 5 B BV
V
6 Vb 6 I Ap
V Vb
7 7 V . Vb
13/72 39/84 44/63 40/28 27/17 87/32 92/11
BV VA
2 1 5 13/68
.
21/72 28/83 30/77 35/90 90/38
BV
1 Vb
PR PA
2 2 P PA
BV VA
3 3 PA A
P VA
4 4 P PA
BV
5 VA 5 B V
PV
6 Vb 6 VA Vb
7 Ap VA
¡
B
3 1 14/68
41/57 72/44 84/48 39/38
V 6 1 11/69
41/61 86/57 87/38
I Vp
2 PR PA 2 PR PA
Vp
3 VA 3 I Ap
B
4 BV 4 B Vb
5 BV Vp
A
=
amarillo;B=
blanco; b=
brillante;I=
incoloro;P=
pardo;p=
pálido; R=
rojizo; V=
verdemotilados
(Casteele,Geigery
VanSumere,1982).En nuestro caso, se procesaron muestras con un
La CLAR resulta un excelentemétodo
para
la promediode entre 4y
7 flavonoidespor
especie, determinacióndeperfilesy
el aislamiento deflavo- tratándoseen todos' loscasosdeO-glicósidos,ob-noides. En la práctica se han podido resolver
servándose
deacuerdoa lostiemposde retención muestrascon másde30flavonoidesglicosidadoso obtenidospor
Harborney
Boardley(1984)y
consi-DISCUSIONDE LOS RESULTADOSBol.Soc. Argent. Bot
.
26(3-4X1990)Vigna luteola Vigna candida
©
3 1
ó
©
&
G<D>
cz>
¿P
4 2Vigna longifolia Macroptilium prostraturr
Oí
cÿO
O
4<3D
2 I,0
6CD
Vigna adenantha Phaseolus vulgaris
var aborigineus
0
0
<9
ai
0
Ac|%
TWA-*-Fig.3.
—
Cromatogramastridimensionalesen papelparaseisespeciesde laTribu Phaseoleae (Papilionoideae-Legumiriosae).derando
que
noseutilizaron exactamente lasmis¬mas condiciones
que
noshallamosenelrango
de tiempode retención.Este valores
constantepara
mono, di
y
triglicósidos,pues
elgradodeglicosi- cadacompuesto enlas condicionesexperimentales
dación está directamente relacionadoconeltiempo fijadas. Este parámetrode lectura inmediataper-de retención(Harborne
y
Boardley,1984). miteun manejo simplede la información obtenida Cada flavonoide queda caracterizadopor
elrangos
de característicossonsuficientemente es¬ trechoscomopara
tenersuperposiciones enotrassustancias,
pues
se trabaja enla banda de absor¬ cióncaracterística de flavonoidesen la detección delcompuesto.
Enelcasodelacromatografíaenpapella iden¬ tificaciónes menosprecisa
y
sujetaamayor
error,pues
elproceso
de detecciónes másengorroso
einexacto(observaciónde color, mediciones de
R(,
recorte
y
elución de manchas, cálculo desuperpo¬
sición,etc.).Asimismo resulta más difícil controlarlas condiciones de corrida(temperatura, gradode hidratación delpapel,sembrado demuestras,satu¬ racióndelacuba)lo
que
afecta la relación de frentey
eltamañode lasmanchas,dificultando lacorre¬ lación-entrecromatogramas.Esteaspecto creadifi¬ cultades degran
magnitud a medidaque
creceel númerode especiesconsideradasque
buscan co¬ rrelacionarse.Ennuestrocasoselogró una certeza decorre¬ lacióninmediatasuperior en un30a un50%,se¬ gúnlasespecies,
para
laCLAR (4-9compuestos)
respectoa la cromatografíaen papelcomoseob¬ servaa partirde lacomparaciónentrelas tablas5a
y
5b.Otro aspecto
muy
importantea favordelacro¬ matografíade alta resolución está dadopor
el he¬ cho deque
esposiblecaracterizarloscompuestos encuantoasunaturalezaquímica enbaseasu tÿ Asíes posible diferenciar isoflavonas(Carlsony
Dolphin,1980),glicoflavonasisoméricas(Becker
y
Wilking, 1977; West, Birac
y
Pratt, 1978; Lardy, Boullianty
Chopin,1984)que
nopuedensepararse
por
otrosmétodos, flavonaspolimetoxiladas(Rou-seff
y
Ting,1979;Bianchiniy
Gaydou,1980),flavo¬ noidessulfatados(Harborney
Boardley,1984),iso-y
una prontacaracterización de cadaespecie,facili- flavonoides(Dorry
Guest,1987)o diversos com-tando elanálisis numérico estadístico inter oin- puestosfenólicos (Court, 1977; Vanhaeleny
Van-traespecífico.Lautilización de columnas defasereversa nos
Tabla 4.
—
Cantidadde Flavonoides DetectadosPapel CLAR Especie
1(V. luteola)
2(V.longifolia) 3(V. adenantha) 4(V. candida) 5(M.prostratum)
6(P.vulgaris)
7 7
7 7
5 6
7 9
6 6
4 4
Tabla5.
—
Correlaciónde flavonoides entre especies a)Cromatografíadepartición L-LEspecie 1 2 3 4 5 6
3 3 4 3 2
—
4 4 4 2—
4 4 3—
3 31
2
3 4
5 2
6
b)Cromatografía líquidadeAltaResolución
Especie 1 2 3 4 5 6
4 3 6 3 3
—
.6 6 5-4—
5 5 4—
4 31
2
3 4
5 3
6
haelen-Fastré,1980).
Debe tenerse encuenta
que
muchos de estospermitióencarar un estudiocomparativo
y
relati- compuestos no puedendiferenciarseenelpapel, ovamentesencillo,bajocondiciones estandarizadas, biensu caracterizaciónes ambigua(basada ensu de muestrasvegetales confinesquimiotaxonómi- coloración)
y
obliga a una serie de elucionesy
nuevascorridascromatográficas.
Una
gran
ventaja de la CLAResque
permite lución cromatográfica una vez determinadas las trabajarademásenformapreparativa, obteniéndo-condiciones de trabajo, nose hallaron diferencias se alfindelproceso
sustanciasprácticamentepu-demasiadosignificativas respectoa latécnicatradi- ras
y
en cantidades necesariaspara
encarar los cional de cromatografía líquida de partición L-L análisis químicosy
espectroscópicospara
una sobre papelen cuanto al número de flavonoides exacta determinación estructural del compuesto detectadospor
ambos métodospara
cadauna de (Pomilioy
Zallocchi,1989).las seisespeciesestudiadas,aunqlieen dos de ellas
el númerofue inferior cuando se usó este último CONCLUSIONES eos.
SibienlaCLAR presentaun altogradode
reso-método.
Sinembargo, enelprimer caso(CLAR)lacorre- Larelación de costo delequipamientobásicoes lación entrecromatogramas esinmediata
pues
los uno de los factores demayor
peso
encontra de laformancecompounds
/.
Chromatogr.130:287-291.introducción de esta técnica,
pero
debetenerseencuenta
que
losgastosde funcionamientoson relati- DAIGLE,D.J.&E.J.CONKERTON.1982.High-perfor¬mance liquid chromatography of 34 selected flavo-noids]. Chromatogr.240: 202-205.
DORR,K. K.&D. 1. GUEST.1987.Rapid,sensitive
high-performanceliquid chromatography assayfor isofla-vonoidsfromcowpea (Vigna unguiculata)]. Chroma¬
togr.387: 536-540.
(purificación,filtrado,etc.)lo
que
requiereuncier- ENGELHARDT,H.1979.Highperformance liquidchromato-to tiempo detrabajo,
aunque
permite a su vez unaumentodela resolución finallograda
y
es de fácil estandarización.vamentesimilares a losdelos otros métodossise cuentao puede conseguirseel equipobásico.
Otroaspectodesfavorable estádado
por
elne¬cesario
proceso
depreparación previaaque
deben someterselasmuestrasantesdeefectuar la corridagraphy (Chemical laboratory practice)
-
248 pp-Springer Verlag (Berlin-Heidelbeg-N.York). GALENSA,R. & K. HERRMAN. 1980. Analysisof
flavo-noidsby high-performance liquid chromatography/.
Chromatogr. 189: 217-224.
HARBORNE,J.B. & M. BOARDLEY.1984.Useof high-performance liquid chromatographyin thesepara¬
tionof flavonolglycosidesandflavonolsulphates
J.
Chromatogr.299:377-385.
HAMILTON,R.J.&P.A.SEWELL.1982.Introductionto highperformance liquid chromatography-248pp.
-
2nd. Ed.Chapman&Hall(N. York-London).Afavor cuentael altogradode resolución
que
puedealcanzarse,
que
sepone
de manifiestocuan¬ dose tratan mezclas máscomplejasque
lasaquí presentadas, o bienpara
la separación de com¬ puestos muy semejantes estructuralmente, tal como se mencionó anteriormente. Asimismo lainmediata caracterizaciónde losperfilesesidealen
estudiosquimiotaxonómicosdado
que
laelucida¬ción estructuralesel
paso
másengorroso respecto LARDY, C,M.L. BOULLIANT&J.CHOPIN.1?84.
Sepa-ala obtención de los patronesespecíficos,queen este caso resultanclaros
y
de fácilcorrelación.En últimainstancia creemos
que
ambosméto¬dospueden complementarsebien dado
que
la cro¬ matografía en papel podríaemplearse
alternativa¬ mentecomo unprimerpaso
deseparaciónapartirdelcual lasmanchassean eluidas
para
luegocarac¬ terizarlaspor
CLAR. Delmismo modolosproduc¬tos de hidrólisis pueden determinarse junto con
testigos
puros
disponibles mediante co-cromato- MARKHAM, K. R.1975. InJ.B.Harbome,T.J.Mabry &H.grafía,obienempleandoflavonoides previamente
aisladosa partirde otrasespecies.
ration deC-glucosylflavonesisomeresparchroma to-graphieliquideahauteperformance enphaseinverse
J.
Chromatogr. 291:307-315.LUNTE, S.M.1987.Structural classificationofflavonoids inbeveragesbyliquid chromatographywith ultra¬ violet-visibleandelectrochemical detection].Chro¬
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mance liquid chromatography ]. Chromatogr. 152: 523-527.
AGRADECIMIENTOS
versidad deBuenosAiresyalConsejoNacionaldeInvesti¬ gacionesCientíficasy Técnicas
-
CONICET-de laRepúbli¬caArgentina(PID3053200yPID3063700)porelsostenido
apoyoeconómico e institucional brindadoparael desarro¬ llo deeste trabajo.
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