Revisión de la coevolución de sistemas micorrizas Ericoides-Ericaceae

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(1)UNIVERSIDAD DE LO S ANDES FACULTAD DE CIENCIAS. DEPARTAMENTO. DE CIENCIAS. BIO LÓGICAS. REVISIÓ N DE LA CO EVO LUCIÓ N DE SISTEMAS MICO RRIZAS ERICO IDES -ERICACEAE. OSCAR CAMILO BEDO YA REINA. BOGO TÁ D.C. 2005.

(2) UNIVERSIDAD DE LO S ANDES FACULTAD DE CIENCIAS ,. DEPARTAMENTO. DE CIENCIAS. BIO LÓGICAS. REVISIÓ N DE LA CO EVO LUCIÓ N DE SISTEMAS MICO RRIZAS ERICO IDES -ERICACEAE. OSCAR CAMILO BEDO YA REINA. T ESIS DE PREGRADO PARA OPTAR A LOS T ÍT ULOS DE BIÓLOGO Y MICROBIÓLOGO. DIRECT OR: SANT IAGO MADRIÑÁN. CO-DIRECT ORA: JENNY DUSSÁN. BOGO TÁ D.C. 2005.

(3) AGRADECIMIENTO S. A Santiago M adriñán y Jenny Dussán, personas a las cuales debo mucho de mi conocimiento, por creer en este proyecto y apoyarlo.. A mis padres por ser siempre apoyo y respaldo incondicional, y por la excelente educación que me han brindado.. A mis compañeros del Laboratorio de Botánica y Sistemática de la Universidad de los Andes, por las permanentes discusiones que forman el criterio.. A mi primo Alfonso Reina sin cuya ayuda no hubiera sido posible realizar eficientemente esta tesis..

(4) RESUMEN. Se realizó un análisis filogenético y datación para las secuencias almacenadas en Bases de Datos Electrónicas de hongos formadores de M icorrizas Ericoides. Se encontraron tres clados correspondientes a i) Hymenoscyphus y relativos, ii) Hongos Septados Oscuros, y iii) Oidiodendron y relativos. Según lo observado se estableció que la capacidad de formar M icorrizas Ericoides es una característica plástica y también, que diferentes asociaciones pueden establecerse entre los hongos que forman M icorrizas Ericoides y sus fitobiontes, probablemente dependiendo principalmente de la planta. Se determinó que Hymenoscyphus domina los bosques boreales del continente europeo, mientras que Oidiodendron domina bosques mediterráneos y canadienses de Ericaceae. Parece que entre los hongos que forman micorrizas Ericoides y sus fitobiontes de la familia Ericaceae hay una coevolución difusa, que varía en su intensidad en diferentes clados. El clado de Hymenoscyphus es probablemente parte central en la ecología de los bosques, siendo importante para el ensamble del ecosistema y para su distribución, más que para una familia de plantas en particular. En la datación, se encontró que los taxa del clado Oidiodendron se han originado en los últimos 15 millones de años, mientras que los Hymenoscyphus divergieron antes de 25 millones de años. Adicionalmente existió una divergencia al interior de los Hymenoscyphus que sigue la hipótesis M adrean-Tethyan..

(5) ABSTRACT. A phylogenetical analysis and molecular clock were made for the sequences recorded in electronic database of fungi forming ericoid mycorrhizae. There was found three clades corresponding to i) Hymenoscyphus and allies, ii) Dark Septate Fungi, and iii) Oidiodendron and allies. It was determined that fungi capacity to form Ericoid Mycorrhizae is labile, and also that different associations could be stablished between Ericoid M ycorrhizae fungi and their phytobionts, probably depending mainly on the plant. It was also determined that Hymenoscyphus dominains boreal forest of european continent, while Oidiodendron dominains M editerranean and Canadian Ericaceae forest. It seen that between the fungi that form Ericoid M ycorrhizae and their phytobionts of the Ericaceae family exist a diffuse coevolution, which varies its intensity in the different clades. The Hymenoscyphus clade is probably a main key in the ecology forest, being more important to the ecosystem assemblage and for its distribution than to a particular family of plants. In the molecular clock analysis, it was found that Hymenoscyphus clade diverged before 25 mya, and Oidiodendrion made it during the last 15 mya. Additionally, I found evidence of a divergence inside this clade that follows M adrean-Tethyan Hypothesis..

(6) TABLA DE CO NTENIDO S. INTRODUCCIÓN................................................................................................................... 6. OBJETIVOS........................................................................................................................... 7. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 9 ANTECEDENTES .................................................................................................................... 9 IMPORTANCIA EVOLUTIVA DE LAS MICORRIZAS.......................................................................... 11 T IPOS DE MICORRIZAS.......................................................................................................... 12 Ectomicorrizas ............................................................................................................... 13 Micorriza Vesículo-Arbusculares ....................................................................................... 14 Micorrizas Orquidiales .................................................................................................... 15 Micorrizas Arbutoide y Monotropoide................................................................................. 15 MICORRIZAS ERICOIDES........................................................................................................ 16 Ericaceae como fitobiontes ............................................................................................... 17 El género Oidiodendron y sus parientes .............................................................................. 18 El género Hymenoscyphus y sus parientes........................................................................... 19 Importancia ecológica de las micorrizas ericoides................................................................. 20 Consideraciones evolutivas de las micorrizas ericoides .......................................................... 20 METODOLOGÍA................................................................................................................. 22 T RATAMIENTO DE DATOS ...................................................................................................... 22 ALINEAMIENTO................................................................................................................... 22 ANÁLISIS F ILOGENÉTICO....................................................................................................... 23 Análisis de Máxima Pasimonia.......................................................................................... 23 Análisis de Máxima Verosimiltud....................................................................................... 24 Datación ....................................................................................................................... 24.

(7) RESULTADOS..................................................................................................................... 25 S ECUENCIAS....................................................................................................................... 25 C LADOGRAMAS................................................................................................................... 26 Clasificación del micobionte............................................................................................. 26 Ubicación geográfica del aislamiento................................................................................. 28 Taxonomía del fitobionte.................................................................................................. 32 EVOLUCIÓN DEL HÁBITO....................................................................................................... 38 DATACIÓN ......................................................................................................................... 39 DISCUSIÓN......................................................................................................................... 41 F ILOGENIA DE LOS HONGOS QUE FORMAN MICORRIZAS ERICOIDES ................................................ 41 Oidiodendron y sus parientes ........................................................................................... 41 Hymenos cyphus y sus parientes......................................................................................... 44 EVOLUCIÓN DE LA CONDICIÓN DE MICORRIZA ERICOIDE .............................................................. 47 INFERENCIAS B IOGEOGRÁFICAS.............................................................................................. 48 Evidencia de la hipótesis Madrean-Tethyan en el subclado 2 (Hymenoscyphus). ......................... 49 C ONSIDERACIONES FINALES................................................................................................... 50 CONCLUSIONES................................................................................................................. 53. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 55. FIGURAS............................................................................................................................... 6 F IGURA 1. ............................................................................................................................ 6 F IGURA 2. ............................................................................................................................ 7 F IGURA 3. ............................................................................................................................ 8 F IGURA 4............................................................................................................................. 9 F IGURA 5. .......................................................................................................................... 10 F IGURA 6. .......................................................................................................................... 11 F IGURA 7. .......................................................................................................................... 12.

(8) F IGURA 8. .......................................................................................................................... 13 F IGURA 9. .......................................................................................................................... 14 F IGURA 10.......................................................................................................................... 15 F IGURA 11.......................................................................................................................... 16 F IGURA 12.......................................................................................................................... 17 F IGURA 13.......................................................................................................................... 18 F IGURA 14.......................................................................................................................... 19 F IGURA 15.......................................................................................................................... 20 F IGURA 16.......................................................................................................................... 21 F IGURA 17.......................................................................................................................... 22 F IGURA 18.......................................................................................................................... 23 F IGURA 19.......................................................................................................................... 24 F IGURA 20.......................................................................................................................... 25 F IGURA 21......................................................................................................................... 80.

(9) I NTRO DUCCIÓ N. Las micorrizas ericoides tienen una vital importancia ecológica y evolutiva en ecosistemas que abarcan desde los cálidos “heath woodlands” del mediterráneo, hasta los sutiles bosques subparamunos colombianos Las bondades que la asociación concede a fitobiontes y micobiontes han sido largamente descritas, bajo un detalle en particular que interesa al estudiante de la macroevolución: morfológicamente, las características que permiten definir esta simbiosis se han observado restringidamente en un clado de plantas de la familia Ericaceae y unos pocos hongos ascomycota. Recientes estudios moleculares, han generado una gran cantidad de información que puede ser evaluada bajo diferentes ópticas con el objetivo de develar la historia de la asociación, para contribuir así al conocimiento de plantas, hongos, y ecosistemas, que redundaría en el aumento de los elementos de juicio para tomar decisiones sobre su conservación y manejo. El propósito del presente, es estudiar la evolución de plantas y hongos que forman micorrizas ericoides, bajo la perspectiva que ofrece la Sistemática Filogenética, para indagar las razones por las cuales la asociación se establece entre grupos tan reducidos de taxa.. 6.

(10) OBJETIVOS. Generales. 1. Estudiar, bajo un criterio filogenético, la evolución de los grupos de hongos y plantas que forman M icorrizas Ericoides, para determinar si han coevolucionado.. 2. Determinar si la capacidad de formar M icorrizas Ericoides es propia de un clado de hongos, teniendo así, un único origen monofilético.. Específicos. 1. Determinar si la distribución de los hongos capaces de formar M icorrizas Ericoides y su evolución, está correlacionada con su ubicación geográfica. 2. Determinar hasta qué jerarquía taxonómica de la familia Ericaceae, se puede rastrear la presencia monofilética de grupos hongos que forman micorrizas ericoides.. 7.

(11) 3. Datar y estudiar la divergencia de los diferentes grupos de hongos y su correlación con la ubicación geográfica, con base en una reconstrucción por M áxima Verosimilitud.. 8.

(12) MARCO TEÓ RICO. ANTECEDENTES. La gran diversidad de formas de vida actuales son producto de millones de años de evolución. Este proceso contínuo es tan universal e incluyente, que ha dado paso inclusive a organismos bien adaptados a nichos hostiles e inhabitables bajo las restricciones fisicoquímicas de las estructuras moleculares (grandes presiones y carencia de luz en simas oceánicas, temperaturas extremas en géisers, pHs ácidos en aguas amazónicas y marinas. Dada la diversidad de los caminos a los que conduce la evolución, y la versatilidad metabólica que se puede encontrar en ellos, múltiples interacciones ecológicas entre y dentro de clados de organismos distanciados se podrían establecer como un resultado evidente. Estas relaciones podrían ser beneficiadas por selección natural, perdurando, aunque fuera momentáneamente en el tiempo, resultando en el acoplamiento de sus historias evolutivas durante éste. En particular, cuando las presiones de selección hacen que esta interacción se vuelva rígida para el fitness adecuado de una o más partes (organismos), dado que son entre si los agentes selectivos más importantes (en relación a otras fuentes), y ante la posibilidad de adaptarse frente al medio cambiante, las especies coevolucionan (Vermeij, 1994).. Como fue tratado por Vermeij (1994), la coevolución es producto de una respuesta recíproca de carácter evolutivo a los cambios en especies que interactúan ecológicamente. 9.

(13) entre si, y que potencialmente son agentes importantes de selección (para una u otra parte). La única manera de estimular la evolución entre la especies que interactúan, es introducir cambios en las reglas que rigen la adaptación, mediante i) innovaciones claves que permitirían a trazos covariantes unidos previamente, variar independientemente, y/o ii) entrar en un mutualismo benéfico con otro organismo (Rosenzweig et al., 1987), que permitiría, por ejemplo, a los vertebrados digerir material lignificado, y a las traqueófitas tomar nutrientes de suelos (M alloch et al., 1980).. Las plantas han logrado colonizar los sitios geográficos más distantes, y en muchos casos inhóspitos de la tierra (Brundrett, 2002; Raven and Edwards, 2001; Sanderson et al., 2004). Como productores primarios, sostienen la productividad de los ecosistemas, y en su ausencia la capacidad de carga de éstos es nula. Para su crecimiento, las plantas vasculares adquieren carbono atmosférico por sus partes aéreas, y fósforo, nitrógeno, agua y otros micronutrientes del suelo, mediante raíces, que adicionalmente les dan soporte (Raven and Edwards, 2001). El fósforo y nitrógeno, a pesar de ser indispensables, no son elementos fácilmente asequibles a la planta, y por ello se desarrolla una simbiosis con microorganismos que se los suministren, y a quienes les resulte beneficiosa la relación, tendría una valiosa importancia evolutiva. Así, mucha de la capacidad que tienen las partes (plantas y microorganismos) para poderse establecer en los ecosistemas, es atribuible a la interacción que forman, la cual permite una notable adquisición de nutrientes de baja disponibilidad en el medio, garantizando el establecimiento exitoso de ambas partes (Brundrett, 2002; Cairney, 2000; Read and Perez-M oreno, 2003). La ruta evolutiva que condujo al acoplamiento ecológico de plantas y microorganismos, para. 10.

(14) obtener eficientemente elementos de baja disponibilidad en el suelo, reviste una gran importancia; sin embargo, entenderla no resulta tan sencillo.. IMPORTANCIA EVO LUTIVA DE LAS MICORRIZAS. Actualmente, los rizomas se definen como raíces (roots) y vástagos (shoots) Raven y Edwards (2001). Teniendo en cuenta que ninguno de estos dos existía en las plantas terrestres del Devónico, pareciera razonable que aparecieran posteriormente en la evolución de las plantas vasculares (Raven and Edwards, 2001). Las raíces se consideran órganos que cumplen las funciones de trasporte longitudinal de agua y nutrientes desde el suelo, y anclaje de las plantas. Sin embargo, componentes fúngicos a forma de micorrizas pudieran complementar o reemplazar los pelos radiculares como componentes de la raíz para incrementar el área de absorción, haciendo más eficiente la toma de nutrientes con baja concentración y bajos coeficientes de difusión en el suelo.. En investigaciones recientes (Redecker et al., 2000a; Redecker et al., 2000b), se encontraron fósiles de esporas del Ordoviciano medio, provenientes de un presumible estuario marino datado entre 455 y 460 millones de años, que presentaban características similares a las de los hongos glomales modernos (formadores de micorrizas). Este tiempo es previo a la aparición de las primeras plantas vasculares sobre la tierra, pudiendo haber sido importante para la formación primaria de los suelos y la producción de los cambios climáticos necesarios que conllevarían a un decrecimiento en el dióxido de carbono. 11.

(15) atmosférico (Wilkinson, 2001), fundamentales para el posterior establecimiento de las plantas en la superficie terrestre (Cairney and Ashford, 2002; Redecker et al., 2000a; Redecker et al., 2000b; Remy et al., 1994). Sin embargo, la presencia de las micorrizas no es universal a todas las familias de plantas (aunque se estima su presencia en un 90% de ellas según Redecker et al., 2000, y Cairney and Ashford, 2002), y muchos clados de hongos simbiontes no muestran una aparición monofilética única en ellas.. TIPOS DE MICO RRIZAS. Las micorrizas son asociaciones simbióticas entre hongos especializados y plantas (Brundrett, 2002). El mismo autor define por sus características morfológicas y fisiológicas cuatro grandes categorías de micorrizas: M icorrizas vesículo-arbusculares, ectomicorrizas, micorrizas orquidiales y micorrizas ericoides. Estas son agrupadas a su vez en dos grandes grupos: Endo y Ectomicorrizas. Las primeras caracterizadas por la introducción de hifas al interior de las células de las raíces, penetrando la pared celular más no su membrana, donde tienen un mayor contacto con las señales químicas de comunicación intracelular de la planta. Las segundas caracterizadas por cubrir la superficie de las raíces en estructuras que se conocen como mantos, y por la extensión de hifas entre las células del cortex (o redes de Harting), sin que ellas las penetren.. 12.

(16) ECTOMICORRIZAS. En las Ectomicorrizas, el hongo no penetra las células de la raíz sino que las rodea. Tiene un micelio que se extiende ampliamente fuera de la raíz y puede funcionar en la transferencia de nutrientes directamente desde el suelo de diferentes subtratos en descomposición, especialmente en suelos tropicales pobres en nutrientes (Bruns and Shefferson, 2004; Chapela et al. 2001; M alloch et al. 1980) . Se estima que cerca de 6000 especies de ectomicorrizas tienen simbiosis con plantas (M alloch et al., 1980). El único reporte en monocotiledóneas se ha hecho en Pandus de M adagascar. Dentro de las gimnospermas, son características de las Pinaceae y algunas Cupresaceae (Cupressus, Juniperus). En las eudicotiledonias, están presentes en todos los miembros de las familias Fagaceae, Betulaceae, Salicaceae, y Dipterocarpaceae. Adicionalmente son características a la mayoría de Myrtaceae, Polygonaceae y Nictaginaceae. Dentro del orden Fabales se encuentran en la subfamilia Caesalpinioideae en los géneros Afzelia, Anthonontha, Brachystegia, Eperua, Gilbertiodendron, Intsia, Julbernardia, Macrobium, Monopetalanthus, y Paramacrolobium, plantas abundantes en suelos poco fértiles de África y Suramérica. De igual manera se han encontrado en especies de las familias Aceraceae, Bignomiaceae en M adagascar, Combretaceae en Nueva Guinea, Euphorbiaceae en M adagascar y Nigeria, Juglandaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae, Tiliaceae, y Ulmaceae. Este tipo de micorrizas pueden absorber y utilizar nitrógeno tomado de la materia orgánica en descomposición (M alloch, 1980). Son formadas en su mayoría por basidiomicetes y también por algunos Ascomycetes, y Zygomicetes (Brundett, 2002; M alloch, 1980). Según M alloch (1980) coevolucionaron. 13.

(17) con las plantas terrestres y utilizan una de “dieta” completa de substratos orgánicos. Las Pinaceae, Cupressus, Juniperus, Betulaceae, Fagaceae y Salicaceae parecen haber coevolucionado ampliamente con el orden A garicales de los Basidiomycetes. Con base en estudios filogenéticos realizados con datos moleculares, se ha definido que los Agaricales tienen un ancestro común con los Poliporales, Boletales y Russulales (éstos dos los más grandes grupos de ectomicorrizas). Brundett (2002) indica que la capacidad de formar este tipo de asociaciones fue un paso clave en la evolución de los Agaricales. Su origen permanece incierto, pero se estima que hubo un periodo de rápida diversificación de los Basidiomycetes en el Cretaceo donde probablemente diversificaron los Cortinariaceae, Boletales, Amanitaceae y Rusulaceae. Los Basidiomycetes ectomicorrízicos son polifiléticos, con múltiples linajes que han perdido o adquirido la capacidad de formar micorrizas, exceptuando a los Amanitaceae, Boletaceae y Russulaceae.. M ICORRIZA VESÍCULO-ARBUSCULARES. En las micorrizas vesículo-arbusculares el hongo penetra las células de las raíces para formar vesículos y arbúsculos característicos. Son probablemente formadas por cuatro quintas partes de todas las plantas vasculares que incluyen Pilotopsida, Lycopsida, helechos, gymnospermas y angiopermas, extendiéndose a cerca de 200 familias y más de 1000 géneros (M alloch, 1980). Los géneros conocidos de micobiontes incluyen a Glomus, Acaulospora, Scutellospora, Gigaspora, Paraglomus y Achaeospora, del orden Glomales de los Zygomycetes. Son considerados de divergencia antigua, en razón a que. 14.

(18) i) pocas especies que le conforman están asociadas a una gran diversidad de plantas, y por ii) su carencia de reproducción sexual. Dado que el orden Glomales es uno de los grupos más antiguos, monofilético y hermano a lo dikaryomicetes (hongos “superiores”), resulta evidente que la aparición de las micorrizas vesículo-arbusculares data de un tiempo mucho más antiguo que el de las plantas terrestres (Brundrett, 2002; Cairney, 2000; Genney et al., 2001; M ichelsen et al., 1998; Raven and Edwards, 2001; Read and Perez-M oreno, 2003; Redecker et al., 2000a; Redecker et al., 2000b; Remy et al., 1994; Wilkinson, 2001).. M ICORRIZAS ORQUIDIALES. Las micorrizas orquidiales son endomicorrizas que se caracterizan por formar espirales intracelulares. Son formados por ascomycotas y probablemente basidiomycotas, y las plantas de la familia Orchidaceae. Aunque su grado de endofitismo no se ha estudiado profundamente, se cree, son esenciales para la germinación de las semillas y probablemente asisten el crecimiento de las plantas adultas. Claramente, los micobiontes que las forman, tienen un origen polifilético, y están, por lo general, asociados a hábitos saprófitos (Brundrett, 2002; Pennisi, 2004).. M ICORRIZAS ARBUTOIDE Y M ONOTROPOIDE. Las micorrizas arbutoides son identificadas por la presencia de coils intracelulares en adición a las características de colonización ectomicorrízica, manto, red de Harting y 15.

(19) haustorios intracelulares en la primera columna de células corticoides. Al seguir las mismas características, pero remplazando los coils intracelulares por estacas o "pegs", se identifican micorrizas monotropoides (Bergero et al., 2000; Brundrett, 2002; M ichelsen et al., 1998). Este tipo de asociaciones, generalmente tienen una mucha más alta especificidad al hospedero que muchas otras asociaciones de micorrizas, y generalmente están asociadas a las subfamilias Arbutoideae y M onotropoideae de la familia de las Ericaceae, pudiendo ser un intermedio morfológico entre las ectomicorrizas y las micorrizas Ericoides (Brundrett, 2002).. MICO RRIZAS ERICO IDES. Clásicamente, las M icorrizas Ericoides se describen como la asociación que se efectúa entre un hongo y la raíz de una planta perteneciente a las tribus Epacridaceae, Ericeae y Stypheliodeae de la Familia Ericaceae (según clasificación de Kron et al., 2002). Está caracterizada generalmente por una trama suelta de hifas externas que se extiende a lo largo, entre, y dentro de las células epidermales de los pelos radiculares, sin penetrar el estilo, para formar espirales al interior de la célula en diferentes cantidades (o densidades) (Allen et al., 2003; Bergero et al., 2000; Johansson, 2001; Liu et al., 1998; M cLean and Lawrie, 1996; M idgley et al., 2004; Sharples et al., 2000a; Usuki and Narisawa, 2005; Villarreal-Ruiz et al., 2004 ). Algunos reportes se han hecho en raíces de especies de Woollsia y Calluna de la tribu Epacridae, donde las características morfológicas son las. 16.

(20) mismas. Sin embargo, la clasificación morfológica de los aislamientos no es exitosa en todos los casos (Bergero et al., 2003; Cairney and Ashford, 2002), la mayoría de las veces en razón a que sólo se encuentran micelios estériles (M idgley et al., 2004). En otros casos se encuentran incongruencias taxonómicas en los caracteres, en donde algunas estructuras importantes como los espirales se pierden, y se encuentran estructuras modificadas en su reemplazo (Perotto et al., 2000; Stoyke and Currah, 1991). Para evitar estos problemas, en la mayoría de los estudios recientes se han aplicado técnicas moleculares para efectos de clasificación, en adición a las tradicionales morfológicas, con muy buenos resultados.. Los fitobiontes que forman micorrizas ericoides son un clado de plantas al interior de las Ericaceae, mientras que los micobiontes, han sido agrupados al menos en dos clados de ascomyecetes: Los Leotiomycetes, mayormente representados por especies del género Hymenoscyphus, y los Hyphomyecetes, representados por el género Oidiodendron y sus teleomorfos Myxotrichum y Byssoascus.. ERICACEAE COMO FITOBIONTES. Las Ericaceae son una gran familia de plantas con distribución cosmopolita de más de 125 géneros y cerca de 4500 especies, que habitan latitudes templadas y área montañosas en los trópicos, dominando ecosistemas con pHs ácidos y baja disponibilidad de nitrógeno (Kron et al., 2002; Luteyn, 2002). Sus hábitos varían de árboles a arbustos a hierbas aclorófilas (M onotropideae y Arbutoideae) (Kron et al., 2002; Luteyn, 2002). Las 17.

(21) Ericaceae son muy diversas en latitudes tropicales de Sudáfrica, Europa y América. Adicionalmente bajo condiciones de disturbio causadas por sucesos naturales o antropogénicos, esta familia de plantas ha mostrado ser una eficiente colonizadora (Luteyn, 1999; Luteyn, 2002; Luteyn and Churchill, 2000). Ellas se establecen en hábitats abiertos, siendo una clave en los eventos sucesionales que siguen los disturbios (Luteyn, 2002). La última revisión de la familia hecha por Kron et al., (2002) en base a caracteres morfológicos y moleculares establece en este clado, siete subfamilias. Enkianthoideae, M onotropoideae, Arbutoideae, Oxydendreae, Ericoideae, Sthyphelliodeae y Vacciniodeae, las tres últimas de las cuales, se han encontrado, son fitosimbiontes de las M icorrizas Ericoides (figura 1).. EL GÉNERO OIDIODENDRON Y SUS PARIENTES. La clasificación de los hongos del género Oididendron (Hyphomycetes, ascomycete) es complicada, debido a la escasez y variación de sus características morfológicas (Lacourt et al., 2001). Se caracteriza por tener conidióforos erectos dematiaceos, ramificados apicalmente en uno o más verticilos dando lugar a hifas fértiles, que forman cadenas de artroconidios con patrón de maduración basipétalo (Lacourt et al., 2001). La presencia de conidióforos no es obligada, y los conidios también pueden originarse en hifas vegetativas no diferenciadas. Como sus teleomorfos, se han identificado a Myxotrichum, y se han propuesto a Gymnoascus (estos dos pertenecientes a los Myxotrhicaceae), Byssoascus y Gymnascella (Gymnoascaceae, ascomycete) (Lacourt et al., 2001; M cLean et al. 1999). Los caracteres que se han tratado en monografías y claves taxonómicas, para. 18.

(22) llevar el género hasta especie, son el color de la colonia, las longitudes de los conidióforos, las ondulaciones de las cadenas de conidios, y su forma y ornamentación (Lacourt et al., 2001). De igual manera, se han realizado estudios moleculares que han contribuido a la clasificación del género, en particular con una tendencia hacia el "spliting" de los taxa (Lacourt et al., 2001).. EL GÉNERO HYMENOSCYPHUS Y SUS PARIENTES. Los ascomycete del orden Helotiales incluyen una gran diversidad ecológica de patógenos de plantas, saprófitos, endófitos y simbiontes. Sus teleomorfos están caracterizados por asci inoperculados y discoides, ascocarpos turvinados o clavados de diferente tamaño, que abarcan desde los más difíciles de ver (de los Hyaloscyphaceae) hasta los más notorios (de Geoglossaceae y Sclerotiniaceae) (Vralstad et al., 2002a). Este clado agrupa a algunos endófitos oscuros septados llamados DSE por las siglas en inglés de “dark septate endophyte” (Bergero et al., 2000; M idgley et al., 2004; Treu et al., 1995; Villarreal-Ruiz et al., 2004; Vralstad et al., 2002a). Estos DSE son hongos ascomycetes con hifas septadas pigmentadas que colonizan raíces de plantas sin causar un aparente efecto negativo (Vralstad et al., 2002b). Tienen una amplia distribución y son frecuentemente aislados de muchos tipos de plantas (Vralstad et al., 2004). El orden Helotiales, incluye de igual manera, la clase Leotymecetes, uno de los grupos más problemáticos dentro de los Ascomycota (Lutzony, 2004), probablemente parafilético, que incluye todos los ascomycetes con apotecio que poseen asci inoperculado, y producen gymnotecios.. 19.

(23) IMPORTANCIA ECOLÓGICA DE LAS MICORRIZAS ERICOIDES. Se ha demostrado concluyentemente que las micorrizas ericoides son importantes por cuanto permiten a sus fitobiontes establecerse en nichos inhóspitos, principalmente: i) en ambientes saturados de metales pesados, en especial arsénico (Cairney, 2000; Cairney and M eharg, 2003; Sharples et al., 2000a; Sharples et al., 2000b; Sharples et al., 2001), hierro (Cairney and M eharg, 2003), aluminio, zinc (Straker, 1996; Vralstad et al., 2002a; Vralstad et al., 2002b), y cobre (Sharples et al., 2000), y ii) en hábitats donde la disponibilidad de nitrógeno, fosfatos y aminoácidos es mínima, por las bajas tasas de mineralización (como climas boreales y páramos), donde los suelos son ácidos (Cairney and M eharg, 2003; Genney et al., 2000; M cLean et al., 1999; M ichelsen et al., 1998; M onreal et al., 1999; Straker, 1996). De igual manera es posible que la capacidad saprófita de los hongos, determine la posibilidad del establecimiento exitoso de su fitobionte, siendo clave para los eventos sucesionales en las comunidades donde las Ericaceae hacen parte importante de la flora (Briggs and Ashford, 2001; Brundrett, 2002).. CONSIDERACIONES EVOLUTIVAS DE LAS MICORRIZAS ERICOIDES. Dado que se ha encontrado un grupo estrecho de hongos y plantas que pueden formar simbiosis a forma de M icorrizas Ericoides, en este tipo de relaciones (Cairney and Ashford, 2002; Liu et al., 1998; M cLean et al., 1999; M onreal et al., 1999), es probable que los clados de hongos y plantas hayan coevolucionado (Cullings, 1996); sin embargo,. 20.

(24) esta hipótesis no ha sido suficientemente estudiada (Cairney and M eharg, 2003). Alternativamente, es probable que la presencia de hongos y Ericaceae esté correlacionada con la localización geográfica (Berch et al., 2002; Bergero et al., 2003; M idgley et al., 2002; M idgley et al., 2004). De igual manera, los hongos que forman micorrizas Ericoides, han sido encontrados en asociaciones con Fagaceae, Pinaceae y otras coníferas (Bergero et al., 2003; Bergero et al., 2000; Cairney and Ashford, 2002; Villarreal-Ruiz et al., 2004), donde forman morfologías características de ectomicorrizas (M cLean and Lawie, 1996; Villarreal-Ruiz et al., 2004; Vralstad, 2004).. 21.

(25) METO DO LOGÍA. TRAT AMIENTO DE DATOS. Se realizó una búsqueda en el banco de datos moleculares GenBank de: i) todas las secuencias de Hymenoscyphus, Oidiodendron, ii) todas aquellas a las cuales hacían referencia los artículos que estudiaban micorrizas ericoides, y iii) todas aquellas que hicieran referencia a micorrizas ericoides relacionadas a artículos no publicados. El total de las secuencias obtenidas fue de 374. Posteriormente, con esta matriz se realizó una búsqueda rápida de secuencias similares (M EGABLAST), obteniendo un total de 3703 secuencias. Éstas se filtraron seleccionando sucesivamente las secuencias bajo los siguientes criterios: i) aquellas que se ajustaran a la descripción de asociado, endófito, saprófito, parásito o mycorrhiza; ii) aquellas secuencias no repetidas; iii) sólo una secuencia por hábito por autor seleccionada aleatoriamente; para obtener un total de 257 secuencias.. A LINEAMIENTO. La matriz de 374 secuencias fue alineada en Dialign 2 (M orgenstern, 1999), y editada y corregida a ojo. Alternativamente se construyó una matriz robusta, exluyendo todas aquellas secuencias que no alinearan claramente, para obtener una matriz robusta de 161 secuencias. Los editores utlizados en este proceso fueron M acClade 4.06 (M adison and M adison, 2000) y BioEdit (Hall, 1999) . La matriz obtenida de 257 secuencias, por un 22.

(26) filtro del Blast, fue alineada utilizando el programa Clustal X (Thompson et al., 1997) con los parámetros por defecto y posteriormente fue alineada a ojo utilizando el programa BioEdit (Hall, 1999).. A NÁLISIS FILOGENÉTICO. ANÁLISIS DE M ÁXIMA PASIMONIA. Para cada una de las tres matrices elaboradas se realizó un análisis de M áxima Parsimonia, utilizando la estrategia Parimony Ratchet . El análisis se corrió en PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002), con bloque generado por PAUPRat (Sikes and Lewis, 2001), con parámetros por defecto y semilla aleatoria. Para la matriz de 161 secuencias se realizaron 10 réplicas, de 101 iteraciones, cada una de ellas con diferentes números de caracteres, pesados de diversas maneras en cada caso. Para la matriz de 257 secuencias filtradas de un Blast, se realizaron tres réplicas de 201 iteraciones. Con los resultados de los análisis se elaboraron consensos de Adams con base a los árboles más parsimoniosos encontrados. En ellos se rastrearon a forma de caracteres: i) el hábito (asociado, endófito, saprófito, o micorrizas) para la matriz de 257 secuencias; y, i) la clasificiación del micobionte, ii) la localización geográfica del aislamiento, y iii) tres jerarquías taxonómicas (especie, tribu, y subfamilia) de los fitobiontes (en base a la clasificación de Kron et al. 2004), para la matriz de 161 secuencias. Los seguimientos de los mismos se realizaron utlizando M acClade 4.06 (M adison and M adison, 2000).. 23.

(27) ANÁLISIS DE M ÁXIMA VEROSIMILTUD. Para la matriz de 161 secuencias, con el uso del programa M odelTest (Posada and Crandall, 1998), se realizó un “hierarchical likelihood ratio tests”, seleccionando como óptimo el modelo GTR+G+I. En la reconstrucción del filograma de máxima verosimilitud que se empleó como árbol inicial para las posteriores búsquedas heurísticas, se utilizó la estrategia de Likelihood Ratchet (Vos, 2003) usando los parámetros determinados por M odelTest, con 1 réplica y 200 iteraciones. Optando por este árbol como inicial, se realizaron búsquedas heúristicas con los parámetros por defecto en PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002), con un tiempo límite de trecientosmil segúndos. Para determinar si las tasas de evolución eran iguales en todo el árbol, una de éstas se hizo forzando el reloj molecular. Con los filogramas obtenidos, se realizó un "likelihood ratio test", determinando que las tasas de evolución eran diferentes a lo largo de la topología (P=0.627920), por lo cual se utilizó el filograma forzado, cuyo puntaje de likelihood (-ln L) fue de 10633.94208.. DATACIÓN. Para datar, se utilizó el programa TreeEdit (Rambaut and Charleston, 2002), empleando el algoritmo "non parametric rate smoothing" (Sanderson, 1997) para suavizar el enforzamiento. El punto de calibración se estableció en el Cretaceo, hace 140 millones de años (Cairney, 2000), en el nodo desde el cual divergen todos los clados de micobiontes que forman micorrizas ericoides.. 24.

(28) RESULTADO S. S ECUENCIAS. Se obtuvieron 374 secuencias: 152 con los genes 18S, ITS1, 5.8S,I TS2, 26S; 36 con los genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2; 3 con los genes 18S, ITS1, 5.8S; 16 con los genes ITS1, 5.8S, ITS2, 26S; 24 con los genes ITS1, 5.8S, ITS2, 102 con los genes 5.8S, ITS2, 26S; 3 con los genes 5.8S, ITS2; 28 con el gen 26S, y 10 con los genes ITS2, y 26S. A ellas están asociadas 16 Fitobiontes, 2 en la subfamilia Cassiopideae, 40 en la Tribu Ericeae de la subfamilia Ericoideae, 27 en la Tribu Empetrae de la Subfamilia Styphelioideae, 18 en la Tribu Styphelieae de la subfamilia Styphelioideae, 148 en la Tribu Gaultherieae de la subfamilia Vaccinioideae, y 26 en la tribu Vaccinieae de la subfamilia Vaccinioideae. Los sitios de obtención abarcan 13 países, y 30 ubicaciones.. Las referencias totales (374 secuencias) fueron alineadas en M align y corregidas a ojo (figura 2a). Este alineamiento muestra la presencia de 16 regiones hipervariables. Paralelamente; se excluyeron del análisis aquellas secuencias que no alinearan fácilmente, con el objetivo de construir una matriz robusta de 161 secuencias. El alineamiento de éstas, se muestra en la figura 1c.. 25.

(29) CLADOGRAMAS. Con la matriz de 161 secuencias se realizó una búsqueda bajo el criterio de Parsimony Ratchet, obteniéndose un total de de 1608 árboles, de ellos, 704 no se repetidos. De éstos, 167 cladogramas de 1985 pasos (CI = 0.3446, HI = 0.6554, RI = 0.8465, RC = 0.2917) fueron los más parsimoniosos, con los cuales se reconstruyó un consenso de Adams.. A continuación se describen los resultados obtenidos bajo el criterio de máxima parsimonia, rastreando en el árbol de consenso de Adams los siguientes caracteres: i) Jerarquía hasta género o la más puntual que se le haya asignado al micobionte, ii) localización de donde fueron obtenidos los aislamientos, y iii) jerarquía taxonómica del fitobionte.. CLASIFICACIÓN DEL MICOBIONTE. En el consenso de Adams (figura 3), se observa que hay dos grandes clados definidos (Clado 1 y Clado 2), el primero constituído mayormente por Oidiodendron, siete de sus teleomorfos Myxotrichum y un Helotial sin clasificar; y el segundo, dividido en dos partes, un subclado conformado por Helotiales sin clasificar mayormente (Subclado 1) y otro integrado por hongos del género Hymenoscyphus (S ubclado 2). En el primer clado se agrupan 40 secuencias clasificadas como Oidiodendron (representando el 24% de las. 26.

(30) totales, y el 83% de las que en este clado se agrupan), 7 clasificadas como Myxotrhicum, y una como un Helotial sin clasificar (figura 4).. Adjunto al clado 1, se encuentran dos grados que forman un grupo monofilético con el clado 2 (figura 7). El primero de ellos está conformado por seis hongos sin clasificar, tres de los cuales son micorrízicos (Usuki et al., 2002); una especie del género Geomyces, una del género Gymnostellatospora, y una del género Pseudogymnoascus, no micorrízicas. El otro grado, corresponde a un Myxotrichum no micorrízico (M idgley, 2004).. El segundo clado es más heterogéneo, estando constituído por 96 secuencias (el 64% del total). Dentro de él hay dos subclados. El primero de ellos, que en este estudio se denominará S ubclado 1 (figura 5), agrupa 44 secuencias sin clasificar (el 27% del total), de ellas, 18 (el 11%) son clasificadas hasta un grado jerárquico de Ascomycota, 7 hasta fungi (el 4%), y las 19 restates (el 12%) hasta Helotiales. Es notable indicar que la mayoría de estos últimos aparecen ensamblados a forma de cluster divergiendo en los cuatro nodos basales del subclado.. En el segundo subclado, que de aquí en adelante se denominará S ubclado 2 (figura 6), se encuentran agrupadas un total de 52 secuencias (el 32% del total), 26 del género Hymenoscyphus (el 16% del total), 17 Ascomycota sin clasificar (el 11% del total), 5 clasificadas hasta fungi, y 6 Helotiales. Los Hymenoschyphus aparecen formando un clado con cuatro Ascomycotas, los demás taxa, la mayoría de ellos Helotiales sin. 27.

(31) clasificar, aparecen en la parte basal de este subclado, formando a su vez un grupo que incluye a un Hymenoscyphus.. UBICACIÓN GEOGRÁFICA DEL AISLAMIENTO. Se puede observar una tendencia difusa y aparentemente no correlacionada con la evolución de los micobiontes a lo largo del cladograma reconstruido: la mayoría de las secuencias del clado 1 fueron obtenidas de ubicaciones americanas y mediterráneas, mientras que la mayoría de las del clado 2 fueron obtenidas de localizaciones europeas (figura 8).. De 49 secuencias que se agrupan en el clado 1, 25 (el 15% del total de las secuencias) son de origen canadiense (incluyendo una extraída de Alaska), 2 de origen estadounidense, 4 Japonesas, 5 noruegas, 2, suecas, 5 italianas, 1 española (de las islas canarias) ,1 inglesa, 3 polacas y 1 cuyo origen no fue codificado. Dentro de este clado no hay grupos monofiléticos relativos a un sitio geográfico específico. En el nodo Terminal que aparece en la parte izquierda de la figura 9, se encuentra un grupo monofilético compuesto por dos secuencias japonesas y dos canadienses, quienes se agrupan según su ubicación geográfica, éstos están unidos a una politomía que completa un taxa de origen canadiense. A su vez, este pequeño grupo está unido con otras secuencias conformando una politomía, de éstas, dos italianas y dos polacas aparecen en dos clusters (relativos al la ubicación geográfica de donde fueron extraídos), al igual que una italiana y un polaca; esta politomía es cerrada por una secuencia aislada de suelo ligurianos (Italia). 28.

(32) En sentido basal, del siguiente nodo diverge un grupo relativamente definido cuya secuencia basal es canadiense, ésta se sigue por un aislamiento italiano y finalmente uno noruego y otro un japonés, éstos dos hermanos. En el siguiente nodo se ubica otro grupo monofilético que está casi definido; el clado ubicado en su parte terminal, está compuesto por dos taxa hermanos, uno de origen noruego y otro de origen canadiense, que son seguidos por una secuencia proveniente de Alaska, y luego por cuatro canadienses, divergiendo en pares en los dos nodos consecutivos. Este pequeño grupo, conformado por secuencias en su gran mayoría americanas, continúa (en dirección basal) a forma de politomía, con un cluster canadiense y otro italiano. En el siguiente nodo (con la misma direccionalidad), se encuentra una secuencia de origen español (de las Islas Canarias), y posteriormente una estadounidense. En el siguiente nodo diverge un grupo monofilético que en su parte basal tiene una secuencia de origen noruego, y en la parte terminal una politomía constituída por dos secuencias noruegas y una japonesa; cerrando este segundo, ubicado en la parte central de la figura 9, se encuentra un clado conformado en su totalidad por secuencias americanas. De los siguientes cuatro nodos basales del clado 1, divergen tres taxa y un clado, que en orden terminal-basal corresponde a una secuencia Sueca, una de origen Noruego (formando un clado con 3 americanas), y luego dos secuencias canadienses (figura 9).. El subclado 1 contiene la mayoría de las secuencias de origen australiano, unas cuantas de origen no establecido y otras de origen japonés. Realizando una descripción desde la parte basal del subclado se encuentra en el primer nodo, un grupo monofilético que diverge, éste, totalmente definido, está constituido por un clado de dos grupos de taxa. 29.

(33) hermanos, el primero de ellos conformado por una secuencias de origen australiano y otra de origen canadiense; el segundo, está conformado por secuencias de origen no conocido (figura 10). Del UTH basal que sigue al de estos dos grupos diverge una secuencia de procedencia italiana. Después de este clado, de los dos siguiente nodos en dirección terminal, divergen dos clados compuestos cada uno por tres secuencias, cinco de ellas sin procedencia geográfica, y la restante, con origen inglés, quien diverge en la parte más basal del primero de estos grupos. Al siguiente nodo en dirección terminal, se unen dos clados, el primero de ellos está constituido por cinco secuencias de origen japonés, seguido hacia el UTH basal del subclado, por cuatro nodos, del primero, segundo y cuarto de ellos divergen organismos sin origen geográfico establecido, y del tercero diverge un aislamiento de origen australiano. El segundo clado tiene en su parte más terminal una politomía constituida por cuatro secuencias de origen australiano y tres de origen desconocido. En el nodo basal que le sigue (a esta politomía) divergen dos taxa hermanos de origen australiano, y en el siguiente, lo hace una secuencia de origen desconocido. Al siguiente UTH se une un clado constituido por dos taxa hermanos de origen inglés, y finaliza, en el siguiente nodo, una divergencia de un hongo de origen desconocido (figura 10).. El subclado 2 está conformado casi en su totalidad por secuencias obtenidas del continente europeo, en su nodo más basal hay un grupo monofilético conformado por 5 secuencias inglesas, una secuencia de origen australiano y tres cuyo origen no fue codificado, una de ellas se encuentra en el nodo más terminal y su taxón hermano es un aislamiento de origen australiano (figura 11). En el nodo que sigue a este pequeño grupo. 30.

(34) (en dirección a la parte terminal del subclado), se encuentra un hongo cuyo origen no está codificado, y en el siguiente, diverge una politomía constituida por tres taxa de origen inglés. A continuación, en el siguiente nodo en dirección terminal, se encuentra un clado a forma de politomía, constituído por tres clados australianos. Continuando en la línea central del subclado 2, en el siguiente nodo en dirección terminal, diverge una secuencia cuyo sitio de obtención fue Inglaterra, y en el siguiente, se forma un clado constituido mayormente por secuencias de origen inglés, aunque en su parte más basal divergen dos taxa hermanos, uno de origen americano y otro obtenido de suelos ingleses. Retomando la línea central, se encuentran a continuación una gran cantidad de secuencias (14 en total) provenientes de Noruega. En la parte más basal de este clado diverge una con el mismo origen, encontrándose a continuación una gran politomía que agrupa a tres clados y dos secuencias individuales, éstas, de origen noruego. El primer grupo monofilético de esta gran politomía contiene cinco secuencias de origen japonés, el segundo está constituído por dos secuencias, una de origen canadiense y la otra sin un origen establecido. El tercer, y último clado de esta politomía está conformado a su vez por tres grupos monofiléticos y una secuencia de origen noruego. El primero de estos grupos está formado por tres aislamientos ingleses, el segundo grupo está conformado por seis secuencias de origen noruego, y el tercero tiene un politomía de tres taxa, dos del mismo origen (Noruega) y uno de origen americano (figura 11).. En los grados ubicados entre los clados 1 y 2, se encuentran 3 secuencias de origen japonés unidas en una politomía terminal. Del siguiente nodo en dirección basal divergen dos secuencias de origen no codificado. Haciendo parte del mismo grado, se encuentran. 31.

(35) formando un grupo monofilético dos secuencias de origen canadiense y una de origen italiano. La secuencia que conforma el grado basal, tiene proveniencia australiana (figura 12).. T AXONOMÍA DEL FITOBIONTE. No aparenta haber una correlación evolutiva estrecha entre ningún grado jerárquico de los fitobiontes y los clados de micobiontes de ellos aislados, salvo por alguna evidencia que podría indicar una coevolución difusa (figura 13).. En el clado 1 se encuentran agrupadas una gran cantidad de secuencias obtenidas de muestras ambientales (el 63% de las presentes en este clado, sumando 30 aislamientos), y tan sólo unos cuantos micobiontes asociados a la familia Ericaceae (el 37% de las presentes en este clado, sumando 18 aislamientos). Todas las secuencias que divergen de los cuatro nodos basales de este clado son muestras ambientales. En el nodo que sigue en dirección terminal, divergen dos clados. En el primero de ellos (parte superior de la figura 14), se encuentra en el tercer nodo (yendo de la parte basal a la terminal) un hongo micorrízico aislado de Wollsia pungens, Ericaceae de la tribu Epacrideae, y subfamilia Styphlliodeae, seguido éste por una gran politomía, donde hay dos secuencias y cuatro clusters, uno de ellos compuesto en su parte terminal de dos aislamientos provenientes de Rhododendron obtusum, una Ericaceae perteneciente a la tribu Rhodoreae de la subfamilia Ericoideae, un cluster con secuencias de aislamientos ambientales, y finalmente, un aislamiento de Vaccinium myrtillus, una Ericaceae de la subfamilia 32.

(36) Vacciniaeae y la tribu Vaccineae. En el nodo que le sigue en dirección basal, diverge un aislamiento hecho de Vaccinium vitis-idaea, quien al igual que el anterior, pertenece a la tribu Vaccineae (figura 14). El segundo clado dentro de la politomía, está compuesto por dos taxa hermanos aislados de Vaccinium corymbosum pertenece a la tribu Vaccinae, el tercer clado está compuesto por dos grupos monofiléticos, integrados cada uno por dos aislamientos, el primero, por hongos extraídos de Erica arborea y Calluna vulgaris, pertenecientes ambas a la tribu Ericeae de la subfamilia Ericoideae, y el segundo por un par de fitobiontes extraídos de Vaccinium myrtillus, tribu Vaccineae. El tercer clado dentro de la politomía está compuesto por dos secuencias, una obtenida como muestra ambiental, y otra obtenida de Calluna vulgaris. De igual manera, se encuentran tres taxa que están incluidos en esta politomía obtenidos de Erica arborea de la tribu Ericeae, Gaultheria shallon de la tribu Gaultheriae, perteneciente a la subfamilia Vaccinioideae, y de una muestra ambiental (figura 14).. Dentro de este subclado, ocurre en el nodo inmediato (en dirección basal) otro clado (ubicado en la parte central de la figura 14), compuesto mayormente por secuencias aisladas de muestras ambientales. De los primeros cuatro nodos basales divergen aislamientos obtenidos de muestras ambientales, y del siguiente nodo en dirección terminal diverge un genotipo aislado de dos fitobiontes: Quercus ilex (una Fagaceae) y de Erica arborea (Bergero, 2000). En el siguiente nodo (en dirección terminal) ocurre una politomía, en la cual se encuentran tres aislamientos de fitobiontes de plantas, uno perteneciente a Erica arborea, otro a Vaccinium myrtilloides y, el último aislamiento. 33.

(37) quefue hecho de Pinus contorta (parte de la familia Pinaceae), y se encuentra dentro de un clado constituído, con su excepción de muestras ambientales (figura 14).. En los grados que se establecen entre los clados 1 y 2, se encuentran secuencias que divergen formando grupos monofiléticos. Del nodo más cercano al clado 1 diverge una secuencia individual aislada de Leucopogon parviflorus (tribu Styphelieae, subfamilia Stypheliodeae). En el siguiente nodo (en dirección terminal siguiendo la línea central que conduce al clado 2), diverge un clado conformado por un aislamiento de Rhododendron obtusum y por Epacris mycrophylla una Ericaceae de la tribu Epacrideae, perteneciente a la subfamilia Stypheliodeae. En el siguiente nodo del este grupo monofilético, diverge un clado conformado por dos aislamientos, uno de ellos de obtenido de Epacris microphylla. Como grupo hermano de éste pequeño cluster aparece un grupo monofilético, de cuyo nodo basal diverge un taxón aislado de Gaultheria shallon, Ericaceae perteneciente a la Tribu Gaultherieae, subfamilia Vacciniodeae. En el siguiente nodo (en dirección terminal) diverge un aislamiento de Abies lasiocarpa (una Pinaceae), y en el nodo terminal divergen una muestra ambiental y un aislamiento hecho de suelos en proximidades de Erica arborea (Bergero. 2000) (figura 17).. Siguiendo la línea central del cladograma, el siguiente nodo (en dirección terminal) corresponde al nodo basal del clado 2. En términos generales, este gran clado, está compuesto por un alto número de aislamientos de Ericaceae, pertenecientes a la subfamilia Styphelideae, y en menor cantidad por micobiontes aislados de plantas de las tribus Rhodoreae, Ericaceae, y Gaultheriaeae. En el subclado 1 hay una gran cantidad de 34.

(38) aislamientos (sumarizando un total de 25) de Ericaceae pertenecientes a la subfamilia Stypheliodeae, aislamientos de las tribus Rhodoreae y Ericeae, y un gran número de aislamientos de Woolsia pungens (11 secuencias en total). Describiendo desde el nodo basal hasta el nodo terminal de este subclado, diverge en primera posición un clado definido, compuesto en su parte basal por un aislamiento hecho en Quercus ilex (Fagaceae), agrupado con un clado compuesto por dos grupos hermanos; uno de ellos formado por un aislamiento de Gaultheria shallon (de la tribu Gaultherieae, subfamilia Vacciniodeae), y por otro micobionte de Astroloma pinifolium, Ericaceae perteneciente a la tribu Sthyphelieae de la subfamilia Styphelioideae (figura 15).. Continuando con la linea central del subclado 1, del siguiente nodo diverge un clado conformado en su totalidad por aislamientos de Calluna vulgaris, Ericaceae perteneciente a la tribu Ericeae de la subfamilia Ericoideae. Del siguiente nodo se desprende un clado, integrado por tres aislamientos, de ellos, dos de Gaultheria shallon (taxa hermanos), y uno de Calluna vulgaris. En el siguiente nodo (en dirección terminal), se encuentra un clado definido, conformado en su totalidad por tres aislamientos de Woolsia pungens, Ericaceae de la tribu Epacrideae y la subfamilia Stypheliodeae. En esta misma línea, del siguiente UTH divergen dos clados en los cuales se encuentran la gran mayoría de aislamientos, de este subclado. El primero de ellos está compuesto por cinco grupos monofiléticos, en el nodo más basal, diverge un grupo compuesto por dos aislamientos de Calluna vulgaris (Tribu Ericeae), del nodo que le sigue (en dirección terminal), se desprende un taxón aislado de Epacris microphylla (Tribu Epacrideae). En el siguiente nodo diverge un grupo compuesto por dos aislamientos, uno de Epacris microphylla y el. 35.

(39) otro de Astroloma pinifolium ambos de la subfamilia Stypheliodeae. Del siguiente, divergen dos clados, uno a forma de politomía que agrupa cinco aislamientos de Rhododendron obtusum (Subfamilia Ericoideae, tribu Rhodoreae), y otro que agrupa a dos aislamientos de Epacris microphylla. El grupo hermano al clado antes descrito, tiene en su parte basal dos nodos de los cuales divergen dos secuencias obtenidas del fitobionte Gaultheria shallon (Tribu Ericeae, Subfamilia Ericoideae) y un aislamiento de Epacris microphylla. Del UTH que sigue al anterior, divergen dos politomías, la primera constituída enteramente de aislamientos de Woollsia pungens, y la segunda integrada por micobiontes aislados de similar fitobionte y tres de Epacris microphylla (figura 15).. El subclado 2 está conformado por aislamientos de la tribu Ericeae, algunos de la tribu Vaccinieae, y otros de las demás tribus. Partiendo desde el nodo basal hasta el terminal, se encuentra en el primer nodo un clado conformado por un hongo aislado de Epacris microphylla (Tribu Epacrideae), seguido por una politomía compuesta por tres aislamientos de Calluna vulgaris perteneciente a la tribu Ericeae (subfamilia Ericoideae). Estas cuatro últimas secuencias se encuentran en la parte basal de un grupo compuesto por dos aislamientos: uno de Calluna vulgaris (Tribue Ericeae) y otro de Epacris mycrophylla (Tribu Epacrideae); en los nodos subsiguientes divergen una secuencias cuyo hospedero es Gaultheria shallon y un par de aislamientos de Woolsia pungens y Leucopogon parviflorus, Ericaceae de la tribu Epacrideae y la subfamilia Stypheliodeae. Siguiendo en la línea central del subclado 2, se encuentra un organismo aislado de Calluna vulgaris (Tribu Ericeae, Familia Ericoideae), en el nodo (en sentido terminal) que sigue, diverge un clado casi completamente definido. En su parte basal, divergen dos. 36.

(40) hongos hermanos, uno aislado de Calluna vulgaris (tribu Ericeae, subfamilia Ericoideae), y el otro aislado de Vaccinium angustifolium (tribu Vaccineae, Subfamilia Vacciniodeae). En el nodo que sigue en posición terminal al anterior, diverge un taxón aislado de Gaultheria shallon, que es seguido por uno obtenido de Calluna vulgaris, y finaliza una divergencia de cinco secuencias obtenidas de Gaultheria shallon, agrupadas en un clado de dos taxa y una politomía (figura 16).. Retomando el nodo más basal del grupo monofilético anteriormente descrito (la linea central de este subclado), en los siguientes dos nodos (en dirección terminal), divergen dos hongos obtenidos de raíces de Vaccinium myrtillus (tribu Vaccineae, Subfamilia Vacciniodeae). Concluyendo este grupo se encuentra una politomía que agrupa a tres grupos monofiléticos y dos secuencias aisladas de Calluna vulgaris. El primero de éstos, está conformado en su totalidad por aislamientos de Rhododendron obtusum (Tribu Rhodoreae, Subfamilia Ericoideae), el segundo por dos secuencias de hongos aislados de Calluna vulgaris. Cerrando el cladograma, el siguiente grupo monofilético es una politomía compuesto por tres clados y dos secuencias aisladas de raíces de Calluna vulgaris, el primero de estos clados está compuesto es su totalidad por secuencias obtenidas de este fitobionte, el que le sigue agrupa a dos secuencias: un aislamiento de Gaultheria shallon y otro de proveniencia no codificada. El clado restante forma una politomía de tres aislamientos Calluna vulgaris y tres de Woollsia pungens (subfamilia Stypheliodeae, tribu Epacrideae), este último está unido a su vez en una politomía de tres aislamientos, uno de Vaccinium angustifolium, otro de Vaccinium vitis-idaea, y otro de Calluna vulgaris (figura 16).. 37.

(41) EVO LUCIÓN DEL HÁBITO. Se obtuvo un total de 603 cladogramas, de los cuales 588 eran únicos y 49 eran los más parsimoniosos con 10442 pasos (CI = 0.1875, HI = 0.8125, RI= 0.7265, RC = 0.1362).. Se puede observar en los resultados (figura 18), que hay una progresión de clados bien definidos cuyos hábitos son altamente lábiles. La agrupación general de las secuencias se da en dos grupos monofiléticos que divergen en un nodo basal. En necesario aclarar que hay hábitos que agrupan a otros: el hábito "micorriza" agruparía a los diferentes tipos de micorriza, el hábito "endófito" podría agrupar a patógenos y micorrizas, y el hábito asociado podría agrupar a todos los anteriores. Esta clasificación se hizo con base en la información disponible que para algunos casos era incompleta.. En apariencia todos los hábitos son lábiles (figura 19), pero hay algunos que varían en su representación a medida que progresa en el cladograma. Los hábitos de ectomicorriza, micorriza orquidiode, y endófito no muestran ninguna correlación con la evolución de los micobiontes y parientes, mientras que los hábitos de micorriza ericoide y patógeno parecieran tener una leve progresión en su representatividad a lo largo de la topología. Asi, las micorrizas ericoides aumentan en número en dirección terminal del cladograma, mientras que los patógenos disminuyen en la misma dirección.. Los clados con un número alto de secuecias, muestran una mayor cantidad de hábitos en relación a los clados pequeños. Así, los clados pequeños ubicados en la parte terminal del 38.

(42) cladograma, muestran una representación alta de endófitos, micorrizas ericoides y patógenos.Es interesante ver que gran parte de los hongos ascomycota que forman ectomicorrizas, se agrupan en un clado con aquellos que forman micorrizas ericoides, uniéndose casi monofiléticamente (figura 20).. DATACIÓN. Con base en la información suministrada por Carney (2000), el punto de calibración se estableció en el Cretaceo, hace unos 140 millones de años, en el nodo siguiente al basal del cladrograma. La fecha propuesta, es anterior a la de la divergencia de las subfamilia Arbutoideae (Hileman et al., 2001), y la tribu Rhodoreae (M ilne, 2004), de la familia Ericaceae. Se seleccionó este nodo como punto de calibración porque de él divergen los clados de hongos que se encontraron y han descrito ampliamente en la literatura por formar micorrizas ericoides, reuniendo hasta el más basal de los hongos que son comúnmente aceptados como simbiontes.. La fecha de divergencia de los clados 1 y 2 se puede datar hace unos 129 millones de años. Los taxa del clado 1 divergieron hace 110, 100, 90, 80, 70, 65, 58, 49, 38, 35, y 32 millones de años, pero mayormente lo han hecho durante los últimos 15 millones de años. Es de resaltar que hace unos 50 millones de años divergieron los dos clados que agrupan la mayoría de las secuencias. Los grupos producto de este evento tuvieron fechas subsecuentes de especiación hace 33, 28, 22, y 15 millones de años, y especialmente la. 39.

(43) politomía que agrupa a la mayoría de secuencias obtenidas de fitobiontes de la familia Ericaceae, divergió hace unos 10 millones de años.. Los subclados 1 y 2 divergieron hace aproximadamente 113 millones de años. El subclado 2, no aparenta tener muchas fechas de rápida especiación, salvo una que se ubica hace unos 8 millones de años de Helotiales de origen australiano. El subclado 1 tiene una fecha de altísima especiación establecida hace unos 23 millones de años, y extrañamente tiene proveniencia americana y europea.. Después de este evento, los subclados diversificaron lentamente de unos 100 a unos 23 millones de años, y tan sólo unas pocas especiaciones se dieron durante los últimos 20 millones de años. La divergencia de los linajes al interior del subclado 1 está distribuída en eventos desde los 95 hasta los 13 millones de años, fecha en la cual se encuentra una politomía de secuencias enteramente australianas. Similar situación se puede encontrar en la mayoría de los linajes del subclado 2 habiendo diversificado mayormente en la misma ventana de tiempo, con una particularidad: la politomía que agrupa una gran cantidad de secuencias, cuyo sitio geográfico de extracción es variado, diversificó hace unos 25 millones de años.. 40.

(44) DISCUSIÓN. FILOGENIA DE LOS HONGOS QUE FORMAN MICORRIZAS ERICO IDES. OIDIODENDRON Y SUS PARIENTES. Los grandes clados en este estudio definidos han sido descritos clásicamente como aquellos que forman micorrizas ericoides, tanto morfológica como molecularmente (Berch et al., 2002; Bergero et al., 2003; Cairney and Ashford, 2002; Johansson, 2001; Lacourt et al., 2001; Liu, 1998; Liu et al. 1998; M cLean et al., 1999; M idgley et al., 2004; M onreal et al., 1999; Straker, 1996; Vralstad, 2004). El clado uno, está conformado por el género Oidiodendron y sus teleomorfos Myxotrichum y Byssoascus, todos capaces de formar micorrizas ericoides, lo cual confirma las relaciones teleomórficas que entre ellos ocurren, sugeridas anteriormente en la literatura (Lacourt et al., 2001; M cLean et al., 1999; M idgley et al., 2004; M onreal et al., 1999; Straker, 1996). La mayoría de estos taxa fueron obtenidos de muestras ambientales, y tan sólo unos pocos lo fueron de fitobiontes, lo que al menos en número muestra que es más probable encontrarlos como saprófitos que como simbiontes.. Se ha reportado en la parte nórdica del viejo continente, que los aislamientos de Oidiodendron en sistemas radiculares son poco frecuentes en relación a los de Hymenoscyphus (Johansson. 2001); sin embargo, en América, Oidiodendron es igualmente aislado en cantidades bajas, aunque con una mayor representatividad; ésto. 41.

(45) probablemente sea debido a una exclusión competitiva, en un esquema que podría estar dado por uno o la totalidad de las siguientes circustancias: i) Oidiodendron podría estar mejor adaptado a condiciones que ofrecen climas normalmente algo más cálidos que los que ofrecen los países boreales del continente europeo, prueba de lo cual sería que la mayoría de linajes del clado divergieron durante los últimos 15 millones de años, en los cuales ha habido un progresivo calentamiento global; ii) Hymenoscyphus podría estar mejor adaptado a condiciones que ofrecen climas boreales, prueba de lo cual sería que la mayoría de linajes del clado divergieron antes de 15 millones de años; iii) una de las dos partes es mejor competidora que la otra en condiciones estándar, como fue propuesto por Johansson et al., (2001) quienes indican que la baja cantidad de aislamientos de Oidiodendron sería atribuible a sus pocas habilidades de competencia en suelos y en sistemas radiculares, siendo así desplazado por la presencia de Hymenoscyphus; iv) hay un sesgo real en el muestreo por a) la asociación ocurre bajo circustancias especiales que no siempre se podrían reproducir en laboratorio (Berch et al., 2002), o b) el hábito de algunas de las dos partes sería tremendamente plástico, de tal forma que aunque se encuentre ampliamente distribuida en un área geográfica particular, su asociación con las plantas sea circustancial. Esto es probable que ocurra para Oidiodendron cuyo número de aislamiento es mayormente proveniente de muestras ambientales, siendo saprófito, y quien además podría ser patógeno (Lacourt et al., 2001) teniendo así un hábito plástico.. Dados los resultados del estudio, es probable que la aptitud darwiniana de Oidiodendron, dependa mayormente de otros factores diferentes a su simbiosis con las plantas, que circunstancialmente le podrían brindar un nicho ecológico para su especiación. De igual. 42.

(46) manera la plasticidad del hábito de los hongos de este clado impediría que la distribución y abundancia de las Ericaceae dependiera de ellos.. Sin embargo, prueba de que cuando la simbiosis ocurre, la aptitud darwiniana de los hongos es favorecida por su asociación con las plantas, parecería encontrarse en uno de los nodos terminales del clado (figura 14), donde se forma una politomía de la cual divergen la mayoría de linajes de hongos aislados de Ericaceae. Siendo así, hace 10 millones de años, probablemente se dio una radiación adaptativa en respuesta a: i) la nueva disponibilidad de fitobiontes por el arribo espacial de hongos y/o plantas, y/o ii) la ventaja ecológica que la asociación brindaría en ese momento y a futuro en climas fluctuantes a los simbiontes. Dada esta evidencia circunstancial, es probable que Oidiodendron y sus fitobiontes hayan coevolucinado, o puedan coevolucionar, de forma muy asimétrica (o difusa).. Oidiodendron es clasificado como un Onygenial (Lutzoni et al. 2004), dentro de los Eurotiomycetidae. Este es el mismo grupo monofilético (Pezizomycotina) que agrupa a Hymenoschyphus, aunque no son grupos hermanos. Para futuros estudios se recomienda la caracterización molecular de marcadores específicos que identifiquen a las diferentes especies de este grupo Oidiodendron, dadas las complicaciones relativas a su clasificación con base en características morfológicas (Lacourt et al. 2001).. 43.

(47) HYMENOSCYPHUS Y SUS PARIENTES. Hongos Septados Oscuros (Subclado 1). El subclado 1 muestra una gran cantidad de secuencias sin identificar. Todas ellas obtenidas de hongos estériles, pero con capacidad de formar micorrizas ericoides. En la literatura, han sido identificados como hongos septados oscuros (“dark septate fungi”) grupo probablemente parafilético- quienes, según Jumpponen y Trappe (1998), se encuentran distribuídos ampliamente en las plantas terrestres. Se ha hipotetizado que puedan jugar algún rol en el establecimiento y funcionamiento de la simbiosis micorrízica, actuando como accesorios mutualistas que garantizan el acceso de las plantas a nutrientes y agua, cuando las condiciones ambientales son desfavorables para los hongos micorrízicos o patógenos débiles (Bergero et al., 2000; Treu et al., 1995). Comúnmente se encuentran asociados a endo y ectomicorrizas, y hasta el momento no se han hecho estudios filogenéticos sobre ellos. La totalidad de los hongos aquí incluidos, fueron identificados como M icorrizas Ericoides y adicionalmente son monofiléticos. Según varios autores , estos hongos han sido asociados con el género Phialocephala, que forma esclerocios intracelulares en vez de espirales (por lo cual no es considerado un formador de micorrizas ericoides sensu stricto), y su distribución aparentemente depende sólo de factores edáficos (Johansson, 2001; M onreal et al., 1999; Straker, 1996) .. A diferencia de los otros clados, todos estos hongos fueron obtenidos de fitobiontes de la familia Ericaceae en la mayoría de las ubicaciones geográficas estudiadas, estando. 44.