Vias de supervivencia celular activadas por la infección con virus rabia en neuronas sensoriales

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(1)VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES. JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR. Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de Microbiólogo. Director JAIME EDUARDO CASTELLANOS MSc, PhD Codirectores HELENA GROOT DE RESTREPO MSc MYRIAM LUCÍA VELANDIA MSc. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PREGRADO EN MICROBIOLOGÍA. Bogotá D.C Febrero 27 de 2006.

(2) VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES. JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR. APROBADO. ______________________________ Jaime Eduardo Castellanos MSc, PhD Director. _________________________ Helena Groot De Restrepo MSc Codirectora. _________________________ Alejandro Malagón PhD Universidad de los Andes. ______________________________ Myriam Lucía Velandia MSc Codirectora.

(3) A Mi Padre, Heliodoro García Ángel y a Mi Madre, María Lucydalba Betancur Cardona; Por Ser Mis Amigos, Mis Héroes, Mis Fuerzas, Mis Consejeros y Mi Infinito Apoyo. Su incalculable amor ha hecho posible todo en mi vida… y que todo sea posible valioso y sagrado..

(4) AGRADECIMIENTOS. Ante todo a Myriam Lucía Velandia del Instituto de Virología, mi mejor jefa, maestra y compañera. Por brindarme abiertamente su amistad, su consejo y su conocimiento. Al Doctor Jaime Eduardo Castellanos, por abrirme las puertas del Instituto de Virología bajo su dirección, por su valiosa crítica y consejo para la realización de este trabajo. A la Doctora Helena Groot de Restrepo, la Doctora Nhora Rodríguez de Sánchez y la Doctora Marina Ordóñez del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de los Andes quienes depositaron su confianza en mí y en este trabajo y cuya enorme colaboración, compromiso y consejo lo hizo posible. A todos mis compañeros del Instituto de Virología de la Universidad El Bosque pues de cada uno de ellos aprendí no solo lecciones académicas, sino lecciones para mi vida. Finalmente, a cada una de las personas que estuvo al tanto de la realización de este trabajo y cuyo ánimo y compromiso me permitió no desfallecer en los momentos difíciles, especialmente a María Angélica Vargas, a quien más que un agradecimiento le dedico con todo mi corazón este trabajo. A todos ustedes, mil gracias..

(5) TABLA DE CONTENIDO Página RESUMEN INTRODUCCIÓN LISTA DE ABREVIATURAS 1. VIRUS RABIA. 1. 1.1. ENTIDADES VIRALES. 1. 1.2. RABDOVIRUS. 1. 1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA. 1. 1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR. 7. 1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN 1.2.2.2. REPLICACIÓN. 8 12. 1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES. 16. 1.2.3.1. PROTEÍNA N. 16. 1.2.3.2. PROTEÍNA P. 17. 1.2.3.3. PROTEÍNA M. 19. 1.2.3.4. PROTEÍNA G. 20. 1.2.3.5. PROTEÍNA L. 21. 1.3. VIRUS RABIA (RABV). 22. 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN. 22. 1.3.2. DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO. 26. 1.3.3. PATOGÉNESIS. 30. 1.3.3.1. ADSORCIÓN DEL VIRUS. 34. 1.3.3.2. ENTRADA. 36. 1.3.3.3. ENSAMBLAJE Y GEMACIÓN. 37. 1.3.3.4. RESPUESTA INMUNE. 40. 2. LA APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA. 42. 2.1. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES. 42. 2.2. LA APOPTOSIS Y LA HOMEOSTASIS CELULAR. 44. 2.3. RUTAS CELULARES DE ACTIVACIÓN APOPTÓTICA. 47. 2.3.1. RUTA EXTRÍNSECA. 58. 2.3.2. RUTA INTRÍNSECA. 53. 2.4. PROTEÍNAS PRINCIPALES EN LA APOPTOSIS. 55.

(6) 2.4.1. ASPECTOS GENERALES DE LAS CASPASAS. 55. 2.4.1.1. CASPASA 8. 58. 2.4.1.2. CASPASA 3. 60. 2.4.1.3. CASPASA 9. 61. 2.4.2. Bcl-2 PRO Y ANTI APOPTOSIS. 64. 2.4.3. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nk-β. 68. 2.5. REMOCIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS. 70. 2.5.1. TRANSPORTADORES ABC. 70. 2.5.2. RECONOCIMIENTO Y REMOCIÓN. 72. 2.6. LA APOPTOSIS Y LAS INFECCIONES. 75. 2.6.1. ARN COMO INDUCTOR DE APOPTOSIS. 77. 2.6.1. REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR VIRUS. 78. 3. NEURONAS SENSORIALES. 84. 3.1. NEURONAS DEL GANGLIO DE LA RAIZ DORSAL. 85. 3.2. CLASIFICACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES. 86. 3.2.1. CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA. 88. 3.2.2. CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA. 89. 3.2.3. CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA. 91. 3.2.3.1. NEUROFILAMENTOS. 91. 3.2.3.2. NEUROPÉPTIDOS. 92. 3.2.3.2. ENZIMAS. 96. 3.2.3.3. RECEPTORES Y OTRAS MOLÉCULAS 3.3. DESARROLLO DE LAS NEURONAS SENSORIALES. 99 103. 3.3.1. BASES CELULARES Y MOLECULARES. 103. 3.3.2. REGENERACIÓN Y PLASTICIDAD IN VITRO. 104. 4. VIAS APOPTÓTICAS Y DE SUPERVIVENCIA NEURONAL ACTIVADAS POR INFECCIÓN CON VIRUS RABIA. 106. 4.1. FENÓMENOS DE APOPTOSIS EN LA INFECCIÓN POR RABV. 108. 4.2. FENÓMENOS INMUNES EN LA INFECCIÓN POR RABV. 115. 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 121 122.

(7) RESÚMEN. El Virus Rabia (RABV) es un virus ARN con sentido negativo perteneciente a la familia de los Rabdovirus. Es altamente neurotrópico y produce una parálisis focal y/o ceguera así como una encefalitis de carácter letal. Los mecanismos de transcripción y replicación de este virus junto con la interacción de proteínas virales con factores celulares específicos encierran características especiales de regulación que le permiten llevar a cabo un proceso de evasión de la apoptosis. De igual manera, la interacción de estas proteínas virales con componentes específicos de las neuronas hospederas genera mecanismos altamente eficientes de evasión de la respuesta inmune. Como resultado, el RABV infecta neuronas sensoriales de los Ganglios de la Raíz Dorsal y motoras de la Médula Espinal (ME) sin influir aparentemente en la fisiología neuronal y se transporta de forma retrógrada hasta el SNC donde causa daño fisiológico en prácticamente todas las subpoblaciones neuronales. La apoptosis o muerte celular programada es un proceso autoregulatorio de las células eucariotas que responde a diferentes tipos de estímulos tanto de carácter interno como externo. La activación de la apoptosis es un proceso multifactorial que encierra la proteólisis de la mayoría de los compuestos extracelulares y que se diferencia de la necrosis por la ausencia de respuesta inflamatoria. Fenómenos durante el desarrollo, selección inmune e infecciones son los estímulos más comunes para este tipo de control celular. Los GRD son agregados celulares ubicados en los espacios intervertebrales a lo largo y a cada lado de la médula.. Estas neuronas. constituyen junto con las neuronas de la raíz ventral la base de la comunicación a través de la columna vertebral. Teniendo en cuenta el papel crítico que las neuronas del GRD juegan en el proceso de captura y transporte del RABV desde la periferia hasta el SNC, se plantea la participación de las diferentes rutas involucradas en los procesos de apoptosis y supervivencia neuronal, así como la participación de las células satélite no neuronales en este proceso. Las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de las diferentes subpoblaciones neuronales presentes en el GRD pueden ser las determinantes en conjunto con las proteínas virales en el comportamiento antiapoptótico y la subversión inmune que desencadena este virus..

(8) INTRODUCCIÓN. La enfermedad rábica continúa siendo un problema de salud pública considerable. Según estimaciones de la OMS,. en el mundo anualmente cerca de un millón de personas. reciben tratamiento antirrábico post-contacto con el virus y alrededor de 50000 personas mueren anualmente como resultado de la infección. La fase aguda de la enfermedad es generalmente intratable y finalmente los mecanismos exactos de patogénesis y la biología molecular de la interacción virus-hospedero no están descritos por completo. Como parte del proyecto investigativo que se inició en el Instituto de Virología de la Universidad El Bosque, esta revisión abordará los temas más relevantes asociados a la inmunopatogénesis del virus. Contar con una descripción exacta sobre los conceptos básicos del problema (biología molecular del virus y sus interacciones con la célula hospedera, el programa de muerte celular y el modelo de neuronas sensoriales) brinda una perspectiva preeliminar mucho más amplia y una base teórica fuerte que permite focalizar el problema de transporte viral y evasión de la respuesta apoptótica e inmune y proponer soluciones innovadoras. Dividida en 4 Capítulos fundamentales, esta revisión abordará a profundidad y basada en artículos originales, revisiones especializadas y bibliografía actualizada, todos los aspectos relacionados con los Rabdovirus haciendo especial énfasis en el Virus Rabia, con los procesos y mecanismos a nivel celular que determinan la apoptosis, las características principales de la neuronas sensoriales del GRD y finalmente una revisión de los avances en el entendimiento del procesos apoptóticos e inmunes que rigen la patogénesis del Virus Rabia..

(9) LISTA DE ABREVIATURAS AIF. Factor Inductor de Apoptosis.. CD. Células Dendríticas.. CMH. Complejo Mayor de Histocompatibilidad.. CPA. Células Presentadoras de Antígenos.. CTL. Linfocitos T Citotóxicos.. CVS. Cepa viral Challenge Virus Standard del RABV.. ERA. Cepa viral Evelyn Rotkitniki Abelset del RABV.. GRD. Ganglios de la Raíz Dorsal.. IFN. Interferón.. L. Neuronas Grandes.. MCP. Muerte Celular Programada.. nAChR. Receptor Nicotínico Acetilcolina.. NCAM. Molécula de Adhesión Neuronal.. NF. Neurofilamento.. NGF. Factor de Crecimiento Nerviosos.. ORF. Marcos de Lectura Abiertos.. p75NTR. Receptor de baja afinidad de Neutrofinas p75.. PV. Cepa viral Pasteur del RABV.. RABV. Virus Rabia (Según la nueva nomenclatura de la ICTV).. RE. Retículo Endoplasmático.. RIG. Regiones Intergénicas.. RNP. Complejo Ribonucleoprotéico.. SAD. Cepa Viral Street Alabama Dufferin del RABV.. SD. Neuronas Oscuras y Pequeñas.. SHBRV. Cepa viral Silver Haired Bat Rabies Virus del RABV.. SNC. Sistema Nervioso Central.. SNP. Sistema Nervioso Periférico.. SP. Sustancia P.. STAT. Transductor de Señales y Activador de la Transcripción 1.. TNF. Factor de Necrosis Tumoral.. TNFR. Receptores del Factor de Necrosis Tumoral.. TRAIL. Ligando Inductor de Apoptosis Relacionado con TNF.. UFP. Unidades Formadoras de Placa..

(10) 1. VIRUS RABIA 1.1. ENTIDADES VIRALES Los virus son entidades submicroscópicas cuyo tamaño varía entre los 0,1 y los 0,00001 um3. Son cuerpos parasitarios compuestas por proteínas, algunos por bicapa de fosfolípidos (obtenidas de la membrana celular de su hospedero), un solo tipo de ácido nucleico que forma genomas entre los 3 y 300 kb -sea de cadena sencilla o doble- (Heller et al., 2000) y que se caracterizan por ser parásitos intracelulares altamente infecciosos, acelulares, no cultivables en medios sintéticos y filtrables (Beijirinick, 1988); cuyo proceso de replicación solo se puede llevar a cabo dentro de una célula hospedera, debido a que utilizan su maquinaria de replicación, transcripción y traducción. Aunque la gran mayoría de su ciclo replicativo requiere la maquinaria molecular de su hospedero, el genoma viral posee la información genética necesaria para redireccionar dicha maquinaria a la generación de nuevos viriones, así como macromoléculas específicas y ausentes en una célula:. sea ARN polimerasa dependiente de ARN,. proteínas de iniciación para la replicación de su genoma y/o proteínas que interfieren con el mecanismo de defensa celular, sea respuesta inmune o apoptosis (Strauss, 2002). Con orígenes evolutivos presuntamente independientes, los virus se han clasificado en tres grandes clases: virus de DNA con replicación a DNA, virus de ARN con replicación de su genoma a ARN y finalmente virus de ARN con replicación a DNA (o retrovirus). Dentro de estas tres clases encontramos gran cantidad de familias, las cuales están definidas por el tamaño, sentido (dirección 5´ - 3´ o viceversa) y número de fragmentos de su genoma (Strauss, 2002). El Comité Internacional para la Taxonomía de Virus (ICTV por sus siglas en inglés) estableció la taxonomía y nomenclatura viral según el tipo y sentido de su material genético, como se observa en la Tabla 1.. 1.2. RABDOVIRUS 1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA La familia Rabdoviridae (de la raíz griega Rabdo, que significa en forma de bala), perteneciente al grupo de los virus con genoma ARN de cadena sencilla y sentido negativo (orden Mononegavirales) evocan evolutivamente al genoma de la familia Paramyxoviridae y esta formada por aproximadamente 200 diferentes especies virales caracterizadas por su morfología tubular, como se observa en la Figura 1. Sin embargo, su estructura no suele ser muy regular, debido en parte a que la envoltura lipídica no está en contacto directo con la nucleocápside y tanto esta membrana lipídica como la proteína. 1.

(11) antigénica de superficie G se unen al complejo de la ribonucleoproteína (RNP) por medio del “puente” que forma entre ellas la proteína de matriz, o proteína viral M. Los viriones están compuestos por una membrana externa que se deriva de la célula hospedera donde el virus gema, por un núcleo interno conocido como la ribonucleoproteína -compuesto por tres diferentes proteínas-, una única glicoproteína que atraviesa la membrana y que en arreglos. triméricos forma aproximadamente 400 prolongaciones extramembranales. alrededor del virus y finalmente alrededor de 1800 moléculas de la proteína de matriz, o proteína M, cuyo papel fundamental es la unión entre el complejo ribonucleoprotéico (RNP) y la membrana viral.. Tabla 1. Principales Fam ilias Virales Tipo de Ácido Nucleico DNA de Cadena Doble ds DNA. DNA de Cadena Sencilla ss DNA ARN de Cadena Doble ds ARN ARN de Cadena Sencilla Sentido 5´- 3´ ss (+) ARN. ARN de Cadena Sencilla Sentido 3´- 5´ ss (-) ARN. ARN de Cadena Sencilla Transcriptasa Reversa ss ARN RT DNA de Cadena Doble Transcriptasa Reversa ds DNA RT. Tamaño del Genoma. Segmentos del Genoma. 5 a 400 kpb. 1. 4 a 6 kb. 1. 4,6 a 30 kpb. 1 a 12. 8 a 33 kb. 1. 6 a 23 kpb. 1a8. 7 a 10 kb. Dímero. 3 a 8 kpb. 1. Familias Poxviridae Asfariviridae Iridoviridae Herpesviridae Adenoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Parvoviridae Reoviridae Birnaviridae Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae Flaviviridae Piconarviridae Astroviridae Calciviridae Paramyxoviridae Filoviridae Rabdoviridae Bornaviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae Retroviridae. Hepadnaviridae Caulimoviridae. Tabla acorde y modificada de Granoff and Webster (1999).. 2.

(12) Dentro del núcleo ribonucleoprotéico se aloja el genoma viral que consta de una sola molécula de ARN de sentido negativo con un tamaño entre los 11 y 12 kb, dependiendo del género y especie dentro de la familia.. Todos los miembros de esta familia poseen. genomas sumamente similares, que codifican para las proteínas N, P, M, G y L en el sentido 3´ a 5´.. Las proteínas N, P y L están involucradas con la transcripción y. replicación del genoma viral, siendo L una ARN polimerasa dependiente de ARN con función 5´-capping y 3´-poliadenilación e involucrada fuertemente en el reconocimiento, iniciación y regulación de la transición replicación-transcripción. La proteína nominal P es la fosfoproteína del virus y con la proteína de la nucleocápside N, sirven. como. transcriptasa y replicasa viral (Harty et al., 2003. Ruigrok et al., 2004). Por otro lado están las proteínas de membrana: la G o Glicoproteína y la M o proteína de Matriz. La proteína G está dirigida hacia la parte más exterior del virus, es de carácter trimérico como peplómeros-, se encuentra intercalada entre la bicapa lipídica y es la responsable de la unión a los receptores de la célula hospedera, de allí su gran carácter antigénico. La proteína M es bien conocida por se la proteína de puente entre la envoltura del virus (tanto G como la bicapa lipídica) y la proteína de Nucleocápside, así como por ser la unidad estructural responsable de la invaginación del virus dentro de la bicapa lipídica de su hospedero en el momento de la gemación (Fields 2001. Whitt et al., 2000. Wills et al., 1999. Cupp et al., 1999). Aunque las funciones son completamente conservadas entre todos los miembros de la familia Rabdoviridae, existen variaciones significativas en la estructura de los genomas, especialmente dependiendo de la especie hospedera. Es así que los Rabdovirus que infectan peces poseen un pequeño gen extra entre los genes G y L, los que infectan plantas pueden tener un gen extra entre los genes P y M y los virus sigma que infectan Droshopila tienen tres genes extra entre N y G así como una región sobrelapada de 33 nts entre el gen G y el gen que le precede (Fields, 2001). La partícula viral es de aproximadamente 180 nm de largo por unos 75 nm de ancho, a excepción de los Rabdovirus baciliformes, generalmente virus cuyos hospederos son plantas y cuyo tamaño es de aproximadamente el doble (Fields, 2001). El ARN genómico se dispone de una forma muy particular, cuya organización ha sido vislumbrada a través de técnicas de cuantificación bioquímica y microscopía electrónica. Básicamente el genoma viral se encuentra envuelto dentro de un complejo estrecho con aproximadamente 1200 moléculas de la proteína de nucleocápside (N) que se organiza a manera de esferas a lo largo del ARN, cada molécula N cubriendo exactamente 9 nucleótidos.. Esta organización forma una hélice con aproximadamente 35 giros dentro. 3.

(13) del virion.. Adicionalmente, la ARN polimerasa dependiente de ARN, compuesta por la. proteína viral L y su cofactor conocido como la fosfoproteína (P), se asocian con la proteína N formando el complejo RNP y se encuentran 50 y 500 moléculas por virion, respectivamente (Jackson A et al., 1987).. Como se discutirá posteriormente, en el. subcapítulo pertinente a los fenómenos de replicación y transcripción del genoma de los Rabdovirus, se generan ARN mensajeros (ARNm) separados para cada uno de los genes. Sorprendentemente, aún durante los procesos de transcripción y replicación del ARN genómico, este se encuentra estrechamente relacionado con el complejo RNP (Fields, 2001). Según su rango de hospederos, los Rabdovirus se dividen en cinco (5) géneros: Epherovirus, CytoRabdovirus, Lyssavirus y Vesiculovirus; siendo los dos últimos, los géneros presentes en ciertas patologías humanas, mientras que los dos primeros infectan gran rango de animales y plantas, respectivamente (Harty et al.. 2003). Esta familia viral es considerada como la más simple de todos los virus con genoma ARN no segmentado perteneciente al orden de los Mononegavirales. La organización genética de los Rabdovirus es similar al de las familias Paramyxoviridae y Filoviridae, familias pertenecientes al mismo orden.. Debido a que los genomas de estas familias son de. sentido negativo, y por ende no codificante, una característica fundamental es la presencia de la ARN polimerasa dependiente de ARN como plantilla molecular. Debido a esta característica, la replicación del genoma viral requiere la síntesis inicial de proteínas virales –polimerasa incluída- que resulta en la síntesis de copias completas de antigenomas, base de la transcripción, y posteriormente la síntesis de compias completas de genomas (ARN de sentido negativo) que son subsecuentemente empaquetados dentro del complejo proteínico que da origen a la progenie viral (Chaffotte et al., 1996). Los virus pertenecientes a esta familia están ampliamente distribuidos en la naturaleza y poseen un extenso rango de hospederos, infectando desde vertebrados e invertebrados hasta varias especies de plantas. Aunque el mayor problema de salud pública y por ende económico lo representa las infecciones por virus rabia, existen otros Rabdovirus que causan grandes pérdidas económicas en las industria pesquera. Estos virus parecen tener ciclos de infección restringidos a vertebrados. Sin embargo, otros virus miembros de esta familia son transmitidos hacia vertebrados y plantas por medio de artrópodos, organismos que se cree por estudios hechos a nivel de filogenia molecular de virus fueron el hospedero original desde el cual todos los Rabdovirus evolucionaron.. 4.

(14) En 1987, Shope y Tesh publicaron una excelente revisión sobre la ecología y la clasificación de esta familia de virus, enfatizando aquellos que infectan mamíferos, aproximadamente unas 70 especies clasificadas dentro de los géneros Vesiculovirus y Lyssavirus (Jackson et al., 1987). Sorprendentemente, de la revisión hecha por Shope y Tesh se puede resaltar la alta capacidad que tienen estos virus para infectar una gran cantidad de hospederos, característica que no comparten con casi ninguna otra entidad viral, ya que los virus suelen ser especie-específicos.. Figura 1. Modelo general de la morfología de la familia Rhabdoviridae. Se observa la forma tubular que oscila entre los 180nm largo x 75nm ancho; caracterizada además por la terminación planar generada por la gemación de la célula infectada. La parte más exterior está compuesta por una bicapa lipídica que forma la envoltura del virus y que obtienen de la membrana plasmática de su hospedero. Esta envoltura está cubierta parcialmente por trímeros de glicoproteína viral (de aproximadamente 67KDa) que le dan su apariencia puntiaguda, además de ser el mayor antígeno de superficie. Al mismo tiempo, dicha cobertura está unida a la nucleocápside viral por una proteína membranal de matriz de aproximadamente 26KDa. Interiormente se encuentran las proteínas N, P y L, encargadas de cubrir el ARN viral, servir como proteína de transcripción y como ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Figura tomada de Smith et al., 1988.. Sin embargo, ciertas especies de Rabdovirus poseen un hospedero específico y solo son infectivos a determinadas temperaturas ambientales. Algunos de los Rabdovirus del género Vesiculovirus son transmitidos por insectos hematófagos (Letchw orth et al., 1999), lo que en parte puede explicar la naturaleza cíclica y temporal de algunas enfermedades de importancia como la estomatitis vesicular, causada por el virus que lleva dicho nombre, VSV (Vesicular Stomatitis Virus por sus iniciales en inglés), Rabdovirus endémico en Centro América, el norte de Sur América, India y Medio Oriente. Aunque este virus infecta principalmente animales domésticos, se han presentado casos de infección en personas que han estado en contacto con el virus en condiciones naturales o de laboratorio,. 5.

(15) causando síntomas muy similares a los causados por el virus Influenza (Tesh et al., 1969). El nivel de clasificación por serotipos, como ocurre con el VSV New Jersey y el VSV Indiana se realiza con base en la similitud existente entre la secuencia de ARN genómico para la secuencia codificante para la glicoproteína, también conocida como proteína viral G. Por ejemplo para estos dos serotipos se estima una similitud tan solo del 50%, lo que permite subclasificarlos con certeza ya que las tasas de mutación en infecciones naturales en areas geográficas delimitadas es considerablemente menor que en cepas virales pasajeadas en laboratorio (Bilsel et al., 1990). Una de las características más sorprendentes de los virus pertecientes a esta familia es su sistema de genética reversa, particularidad que ha sido crucial para el conocimiento de sus fenómenos de replicación y ensamblaje, así como una herramienta vital en biología molecular, pues. genes. extraños. adicionales. pueden ser introducidos en virus. recombinantes logrando genes de expresión muy estable como lo reportan Mebatsion y Schnell en trabajos individuales en 1996 (Mebatsion et al., 1996 y Schnell et al., 1996). Un ejemplo muy interesante de la utilización de estos vectores recombinantes lo presenta el VSV como vector de la vacuna contra la influenza, expresando el gen de la hemaglutinina. La aplicación intranasal de una cantidad correspondiente a 100 unidades formadoras de placa (UFP) confirió resistencia inmunológica a los ratones sometidos a esta prueba experimental (Roberts et al., 1998). Recientemente se ha reportado algunos estudios hechos contra el VIH utilizando vectores Rabdovirales, específicamente el VSV, y los resultados obtenidos en macacos muestran la ausencia total de patogénesis por VIH y la generación de una respuesta inmune muy fuerte y específica contra este retrovirus (Fields, 2001). Schnell y su grupo de colaboradores presentaron en el año de 1997 en la revista Cell un estudio muy interesante, donde a partir de virus VSV recombinantes los cuales no poseían la secuencia genómica para producir la glicoproteína G y en lugar de esta ARN codificante para la molécula receptora y coreceptora del VIH, estos virus efectivamente se unieron específicamente a células infectadas In vitro, las infectaron y por ende las asesinaron (Schnell et al., 1997).. Finalmente, otros trabajos con Rabdovirus. recombinantes han permitido establecer los dominios de fusión de los receptores y coreceptores de las células hospederas con la glicoproteína de virus tan peligrosos como el Ebola sin la necesidad de trabajar bajo condiciones de bioseguridad tipo 4 (Ito et al., 1999).. 6.

(16) 1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR Con una sola molécula de ARN de aproximadamente -aproximadamente 12000 bases-, y con sentido negativo, lo que significa una dirección 3´ - 5´, el genoma de los virus pertenecientes. a esta familia se caracteriza por poseer una región líder de. aproximadamente 50 nucleótidos (nts) en su extremo 3´ que funciona como sitio único de entrada de la ARN polimerasa viral; y una región no transcribible de aproximadamente 60 nts en su extremo 5´. En cuanto al fenómeno de transcripción del ARNv a ARNm, dentro de estas dos regiones reguladoras se encierran los cinco genes monocistrónicos para las tres proteínas estructurales (G, M y N) y las proteínas funcionales (P y L) del virus. Entre cada gen existen regiones intergénicas o no codificantes y señales de poliadenilación para el extremo 3´ de cada uno de los cinco ARNm como se puede observar claramente en la Figura 2.. Figura 2. Genoma Rhabdoviridae. ARN sentido negativo o dirección 3´- 5´. El genoma de los miembros pertenecientes a esta familia del orden Mononegavirales (Mono por poseer un genoma con un solo segmento y nega por ser antisentido) se caracteriza por generar ARNm monocistrónicos para cinco proteínas virales, cada uno con secuencias que forman estructuras secundarias de ARN conocidas como cap en su extremo 5´ y poliadeniladas en el 3´ generadaspor la ARN polimerasa viral. Estos genes están separados por regiones intergénicas (RIG) altamente conservadas en el número y secuencias de nucleótidos entre cada gen. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.. La estrategia para descubrir las bases de la genética molecular de los Rabdovirus y los mecanismos. moleculares. involucrados. en la patogénesis. de enfermedades tan. importantes para la salud humana como la rabia ha tomado un rumbo diferente al de otros virus pues ha requerido el desarrollo de sistemas de ADN copia (ADNc) para la recuperación de viriones infecciosos, logro alcanzado para el RABV en 1994 por Matthias Schnell,. Teshome. Mebatsion. y. Karl-Klaus. Conzelmann del Centro Federal de. Investigación de Enfermedades Virales en Animales en Alemania, quienes con ADNc del RABV y bajo el promotor T7 lograron entidades infecciosas gracias a la síntesis de la. 7.

(17) polimerasa del bacteriófago T7 insertada como ADN por el sistema vaccinia antes de la transfección del ADNc del genoma del RABV (Mebatsion T et al., 1994). La necesidad de obtener ADNc se debe a que ni el ARNv ni el ARNvc pueden generar ARNm en la ausencia de la ARN polimerasa viral. Además, el ensamblaje In vitro de ARN diseñado dentro del complejo RNP es prácticamente imposible dado la complejidad de las interacciones ARN-proteína y proteína-proteína, así como del gran tamaño de los genomas virales. Sin embargo, la exitosa estrategia de utilizar ADNc no ha sido la única. Como es ampliamente referenciado por Roberts y Rose en 1998, otra estrategia utilizada antes de la utilización del ADNc fue el diseño de mini genomas de ARN, donde uno o más genes eran flanquados por secuencias naturales en los extremos 5´y 3´ de sistemas de expresión de plásmidos de ADN como el del virus vaccinia (Roberts A y Rose JK, 1998). Desafortunadamente, ninguna de estas estrategias permitía generar virus infectantes a partir de ARN de sentido negativo. 1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN El primer evento para la síntesis de nuevos virus después de la liberación del complejo RNP es. la transcripción del genoma viral para la generación de los ARNm. monocistrónicos para cada uno de las proteínas virales. Es conveniente aclarar que el complejo RNP no es una entidad aislada de la maquinaria celular y que se encuentra accesible a proteínas celulares. Debido al carácter negativo del ARNv y como característica principal del orden de los Mononegavirales, esta transcripción es llevada a cabo por la proteína L -una ARN polimerasa dependiente de ARN- en conjunto con tres unidades de la fosfoproteína P (antes conocida como NS) que actúa como cofactor de la polimerasa viral dependiendo de su estado de fosforilación. Como fuera publicado en PNAS por Barik y su grupo de colaboradores en 1992, la fosforilación de los residuos Serina y Treonina en el dominio l del extremo N-terminal de la proteína viral P por la caseína kinasa ll celular activaba transcripcionalmente a dicha proteína y por ende a la polimerasa viral en ensayos de transcripción In vitro (Barik S et al., 1992). Sin embargo, estudios posteriores hechos de igual manera en el VSV por Spadafora y su grupo cuatro años más tarde pusieron en tela de juicio esta teoría estableciendo que aunque la fosforilación de P era importante para la modulación del complejo transcripcional no era una proteína esencial para la transcripción (Spadafora D et al., 1996). Una vez más, el disponer de ADNc del genoma del VSV permitió establecer que definitivamente la fosforilación de P en el dominio establecido para 1994 es esencial para el fenómeno de. 8.

(18) transcripción y no está involucrada en la replicación (Pattnaik et al., 1997).. Esta. activación parece darse debido a que la fosforilación permite la trimerización de unidades de P y este trímero es funcionalmente activo para activar a la polimerasa viral. Con la proteína L activa, la transcripción se lleva a cabo en un complejo formado por el genoma viral y la proteína estructural de nucleocápside o proteína N.. Hipotéticamente, este. complejo se forma para evitar que las ribonucleasas celulares degraden este ARN de cadena sencilla (Fields, 2001). Sin embargo, la disposición del ARN dentro del complejo permitiría. postular. que. existen. también. características. estructurales. para. el. reconocimiento del genoma viral y su posterior transcripción una vez dentro del citoplasma de la célula hospedera. Aunque los ensayos In vitro con ARNv y las proteínas virales purificadas mostraban transcripción positiva, trabajos hechos por Gupta y su equipo de colaboradores permitió establecer que existen proteínas celulares, como los factores de elongación de la transcripción como EF-1a, EF-1b y EF-1g, esenciales para un proceso de transcripción similar al que ocurre In vivo (Gupta AK et al., 1998). Seguido a la entrada del virus a su célula blanco y la posterior liberación del ARN viral en el complejo RNP, se inicia la transcripción de la región líder, secuencia de nucleótidos que dispara la transcripción de los genes estructurales. Aunque esta región líder no posee la estructura cap en su extremo 5´ ni poliadenilación en el 3´, cuando existen concentraciones suficientes de las proteínas N y P en complejo es encapsidada, contribuyendo posiblemente en el mecanismo de autorregulación de los fenómenos de replicación-transcripción mediante su interacción con la proteína de nucleocápside N (Fields, 2001).. Se propone que el ARNv nunca se separa de la proteína N y que es. esencial como unidad de transcripción junto con las proteínas L y P, pues se probó que el ARNv desnudo transfectado en células In vitro no es infeccioso (Pattnaik et al., 1990). Se ha determinado, por lo menos para el VSV (Vesicular Stomatitis Virus), que el complejo RNP posee alrededor de 1200 copias de la proteína N, 500 de la fosfoproteína P y tan solo 50 de la ARN polimerasa o proteína L.. Sin embargo, estos niveles basales de. la ARN polimerasa dependiente de ARN y los otros dos factores involucrados en transcripción y replicación son suficientes para generar ARNv de novo y todas las demás proteínas contenidas en su genoma, incluyendo la glicoproteína G y la proteína de matriz M (Strauss, 2002). Tan pronto como la ARN polimerasa viral se une al único sitio de entrada en el extremo 3´ del ARNv se inicia la transcripción y se libera un ARN no codificante de la región líder. Este proceso continúa con la síntesis secuencial de los cinco ARNm con estructuras cap. 9.

(19) en su extremo 5´, generadas por la ARN polimerasa viral, y poliadenilados en su extremo 3´ que facilitan la traducción y generan protección contra ARNasas celulares, respectivamente. Como se observa en la Figura 2, el primer ARN mensajero que se genera es el que dará origen a la proteína de nucleocápside N. Inmediatamente inicia el proceso de transcripción adquiere la secuencia cap en el extremo 5´ como resultado de la acción de la ARN polimerasa viral o proteína L. Al final de este gen se encuentra la secuencia de reconocimiento AUACU7 donde la ARN polimerasa comienza a perder afinidad por el ARNv y produce una secuencia de adeninas, conocida como Poli(A) que queda ubicada en el extremo 3´ del ARN mensajero. De manera similar ocurre la síntesis secuencial de ARNm de los otros cuatro genes virales donde la ARN polimerasa viral no perderá afinidad al menos que encuentre la secuencia AUAC justo antes de una secuencia U7 con y no se unirá al menos que se tope con la secuencia UUGUC, que se encuentra después de los nucleótidos de la RIG, pues estas secuencias intergénicas son obviadas por la proteína L. Estudios de transcripción In vitro han demostrado que la polimerasa viral tiene un periodo de pausa que va desde 1 hasta 2 minutos en las RIG y luego, con una frecuencia del 70% al 80% reinicia la transcripción del siguiente gen. Estos mismos estudios postulan que este tiempo de pausa se debe al periodo que toma la proteína L en copiar la secuencia U7 que dará origen a la secuencia poli(A) en cada uno de los ARNm del VSV (Iverson LE et al., 1981). Las proteínas N, M, G y L son traducidas como un solo polipéptido, mientras que P se traduce como tres proteínas de masas moleculares diferentes debido a la presencia de codones de inicio alternativos. El codon AUG genera la proteína nominal P funcional, sin embargo existen otro dos codones de inicio AUG dentro del gen que generan polipéptidos de 55 y 65 aminoácidos, donde la proteína más corta es la versión truncada de la proteína de 65 aminoácidos (Strauss, 2002).. Se probó que estas versiones truncadas de la. proteína P poseen señales especiales de localización en membrana nuclear y de exporte núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente asociarlas con mecanismos de fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y relacionarlas también procesos de regulación del transporte de otras proteínas virales como L y N en posibles fenómenos de evasión de la respuesta antiviral mediante la interacción con proteínas nucleares (Blondel et al., 2002 y 2005). Aunque la síntesis de la proteína G se inicia, al igual que para todas la proteínas de los Rabdovirus, en ribosomas libres, la proteína activa y su glicosilación ocurre en el retículo. 10.

(20) endoplasmático y el aparato de Golgi (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). En cada una de las trascripciones del genoma viral ocurre un fenómeno de atenuación como resultado de un gradiente en la acumulación de ARNm, así como elementos tipo cis como la presencia de las estructuras secundarias de ARN en el extremo 5´ conocidas como cap, la metilación del ARN y la poliadenilación en el extremo 3´, donde las proteínas virales recién sintetizadas y proteínas celulares interfieren directamente con el ARNv. Estudios realizados por Stillman y sus colaboradores en 1997 con mini genomas recombinantes del VSV permitieron establecer que los primeros tres nucleótidos de la secuencia conservada 3´UUGUC….5´ de cada gen –secuencia complementaria al capAACAG al inicio de cada gen en el ARNm) eran esenciales para la expresión genética, pues el Uracilo en la posición 1 y la Guanina en la posición 3 permitían la acumulación de transcritos de los genes virales en células infectadas debido a que los nucleótidos correctos en estas posiciones hacían posible la generación de la estructura cap en el extremo 5´ mediante la adición, mediada por la polimerasa viral, de la secuencia 5´7mGpppG, responsables de dar forma a la estructura cap y de facilitar el inicio de la transcripción (Stillman EA et al., 1997 y 1999). A diferencia de los retrovirus o de los virus ARN de sentido positivo para los cuales el mecanismo de generación de la estructura cap y las proteínas virales como los factores celulares involucrados han sido descritas, para los Rabdovirus, el sistema por el cual los ARNm adquieren la secuencia de nucleótidos que dará origen a la estructura cap y las proteínas involucradas no han sido definidas completamente a la fecha, sin embargo, debido a que el ciclo de vida de esta familia de virus se lleva a cabo completamente en el citoplasma de la célula hospedera, se pueden descartar enzimas nucleares, al menos que exista tráfico desde el núcleo mediado por la localización de las formas truncadas de la fosfoproteína P, opción no considerada por Blondel y su grupo en su estudio del año 2005 (Blondel et al., 2005). Análisis de la estructura cap de los transcritos del VSV han revelado que los dos primeros fosfatos que constituyen la unión 5´-5´ de la Guanosina son contribuidos por la enzima guanosina difosfato (GDP) a diferencia de los eucariota donde esta reacción es llevada a cabo por la enzima guanosina monofosfato (GMP) (Abraham G et al., 1975). A partir de la evidencia recogida, se ha propuesto que la polimerasa viral o proteína L está involucrada en el proceso capping, pues aunque la proteína L tiene homología de secuencia con proteínas de unión a nucleótidos, no parece tener relación con la enzima GDP, una enzima nucleotidil transferasa (Shuman S, 1997). Sin embargo, virus deficientes para la. 11.

(21) acción metiltransferasa han resultado tener mutaciones mapeadas dentro del gen para la proteína L (Hercyk N et al., 1988), se sugiere entonces que existe relación entre la proteína L y factores celulares con propiedades de unión a GDP como EF-1 (Gupta AK et al., 1998). En los virus ARN de sentido negativo esta característica de secuencial y polar es una propiedad inherente de la polimerasa y garantiza que las proteínas esenciales y de las cuales se necesita una mayor cantidad para el correcto ensamblaje de viriones infectantes se produzcan en un mayor número de copias que aquellas que cuyo número es más reducido dentro de los mismos, como la proteína L. De esta manera se controla que las proteínas que se necesitan en mayor cantidad, y que se encuentran en las primeras posiciones dentro del genoma, como N, M y G sean producidas en mayor cantidad, y proteínas como L sean producidas en menor cantidad, corroborando las concentraciones de proteína viral encontradas para VSV y haciendo más eficiente el ciclo de vida del virus (Strauss, 2002). 1.2.2.2. REPLICACIÓN El otro evento crítico y fundamental para la correcta proliferación del virus es la replicación del genoma viral. Los miembros pertenecientes a la familia Rhabdoviridae se caracterizan por poseer una replicación dependiente de la producción de una hebra complementaria con sentido positivo- al genoma conocida como ARN viral complementario (ARNvc) o antigemoma que constituirá el templado para el ARNv del nuevo virion. En contraste con la transcripción, en el proceso de replicación del genoma la polimerasa viral debe ignorar los codones de inicio y parada, las señales para el capping y poliadenilación y todas aquellas señales que dan origen al ARN líder y ARNm monocistrónicos. A diferencia de la transcripción, la replicación de los Rabdovirus sucede simultáneamente con la traducción, particularmente de las proteínas que forman la nucleocápside viral: la proteína N y la proteína P.. Esta característica fue reportada por Davis y Wertz en 1982 donde en. ensayos In vitro inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida encontraron que la síntesis de nuevas moléculas de ARN de sentido negativo era también inhibida, a diferencia de ARNm que eran producidos de manera regular (Davis & Wertz, 1982). Al igual que el ARNv el ARN antigenómico nunca se encuentra libre en el citoplasma; es así que el proceso de replicación, al igual que el de transcripción, se lleva a cabo dentro del complejo RNP. A diferencia que en otros sistemas, en los Mononegavirales el proceso de replicación deber ir paralelo al de transcripción y traducción de proteínas pues el nuevo. 12.

(22) genoma debe ser encapsidado de inmediato. A diferencia del ARNm que se genera a partir del templado, el antigenoma posee secuencias señal para ser encapsidado. La ausencia de estas señales es lo que permite, tempranamente post-infección, al ARNm viajar hasta los ribosomas y traducirse, generar la suficiente cantidad de proteína requerida para que luego por la acumulación de estas mismas, exista un cambio o switch de transcripción a replicación. Este switch molecular se atribuye al cambio en la relación de concentraciones existentes entre el ARNv y las proteínas del complejo RNP, especialmente N, pues se ha postulado que a altas concentraciones de N, P y L, el ARNv es encapsidado y la ARN polimerasa viral copia indiscriminadamente ignorando codones de inicio y parada, generando ARN con sentido 5´ - 3´ o ARNvc que dará, gracias a la polimerasa viral, origen a copias exactas del ARN de hebra sencilla sentido negativo dentro del complejo, es decir, nuevos genomas del virus (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Este cambio genera ARNvc que servirá como templado para la generación de ARNv genómico (Strauss, 2002). Adicionalmente, la presencia de este antigenoma resuelve el dilema de como los ARNm no interfieran mediante hibridización con el ARN genómico antes de la formación del complejo RNP, pues si los genomas de ARN se sintetizaran fuera del complejo RNP, inmediatamente habría interferencia de los mensajeros de ARN presentes en el medio y la formación del complejo RNP y su posterior complementación a viriones infectivos no sería exitosa. De manera breve, la Figura 3 muestra el esquema de replicación de los Rabdovirus como el RABV. El mecanismo molecular que gobierna este switch transcripción-replicación hasta ahora está comenzando a ser descifrado, y el grupo de Raul Ladino de la Universidad de California en San Francisco descubrió en 1998 para el virus Polio, un virus ARN de sentido positivo, las bases moleculares y proteínas celulares y virales involucradas en el fenómeno (Ladino et al., 1998). Dentro de estas bases moleculares están las secuencias presentes en los extremos 3´ y 5´ del genoma viral que además de promover la unión de los ribosomas y generar sitios poli(A) cumplen funciones estructurales, ya que para los Bunyavirus, cuyo genoma lo constituye una sola hebra de ARN con sentido negativo, se comprobó por microscopía electrónica la existencia de estructuras secundarias de ARN que podrían estar fomentando, como promotores, la ciclización del ARNv para su replicación (Strauss, 2002).. El modelo propuesto para el switch de transcripción a. replicación propone que la molécula de ARN líder es encapsidada por la proteína N de novo causando un evento de antiterminación que señala a la polimerasa para ignorar las. 13.

(23) señales que dan origen a los ARNm. Una vez la polimerasa viral ha generado suficientes copias complementarias al genoma y existen la cantidad necesaria de proteínas N y P, este ARNvc es encapsidado y dentro de este complejo RNP (+) se inicia la síntesis de hebras sencillas de ARN genómico que dará origen a la progenie viral, que se encuentra de 20 a 50 veces más que el ARNvc (Fields, 2001). Recientemente se ha propuesto un nuevo modelo donde la proteína P es la polimerasa involucrada en replicación mientras que la proteína L es la polimerasa que actúa en transcripción. Esta teoría surgió de estudios realizados con virus recombinantes mutantes en el domino C-terminal de la proteína P. Estos virus permitieron la correcta replicación del genoma del VSV mientras que la transcripción se vio fuertemente afectada debido a que estas mutaciones abolían la correcta interacción de la fosfoproteína con la polimerasa viral por la ausencia de una correcta fosforilación de la proteína mutada (Das et al., 1997). Debido a que la encapsidación de los genomas y antigenomas de los Rabdovirus ocurre simultáneamente con su síntesis, se ha propuesto que la señal de antiterminación y de encapsidación reside en el extremo 5´ del genoma viral, región donde se encuentra la secuencia líder, específicamente cinco Adeninas que se repiten cada tercera posición (Blumberg et al., 1983). Recientemente, el grupo de Pattnaik descubrió mediante técnicas moleculares que involucraban ARN subgenómico derivado de ADNc que las señales necesarias para la encapsidación y la replicación se encuentran dentro de los 36 primeros nucleótidos en el extremo 5´ y los últimos 51 nucleótidos en el extremo 3´, respectivamente (Pattnaik et al., 1995). Para el RABV, la encapsidación y el switch molecular tienen una característica especial: el estatus de fosforilación de la proteína N. A diferencia de otros Rabdovirus como el VSV, la proteína N del RABV se fosforila en determinados residuos del aminoácido Serina y la forma no fosforilada de esta proteína tiene una mayor afinidad por la hebra de ARN líder, al menos en estudios In vitro (Dietzschold et al., 1999). Específicamente, una vez el ARNvc es encapsidado, las estructuras formadas por el extremo 3´ del ARNvc encapsidado (5´ del ARN genómico) promueven la unión de la polimerasa viral y se inicia la síntesis de la hebra complementaria, que dará origen al genoma de la progenie viral. Durante el proceso de replicación del genoma, la existencia de la proteína N es fundamental, es así que para el VSV existe una relación de 1200 copias de N por cada 500 copias de P y cada 50 copias de L.. La ausencia de la proteína estructural N. 14.

(24) promueve indirectamente la degradación del ARNvc que da origen al ARNv, mientras que por otro lado, junto con la proteína M, promueve su encapsidación.. Figura 3. Mecanismo de replicación de los Rabdovirus. Posterior a la entrada de viriones infectantes a una nueva célula hospedera el complejo RNP es liberado y una pequeña cantidad de proteína N de ARN polimerasa y su cofactor (proteína P) inician la transcripción de la cadena del ARNv de sentido negativo para la generación de proteínas virales. Por mecanismos de autorregulación de la transcripción mediados por la concentración de proteínas virales y ARNm viral se dispara un switch molecular que desencadena la síntesis de ARN antigenómico con sentido positivo. Este ARN es empaquetado dentro del complejo RNP inmediatamente y sirve como plantilla para la generación de nuevo ARNv genómico el cual es ensamblado dentro del RNP y transportado a membrana donde se fusiona con la proteína G que se encuentra anclada a la membrana celular. Los viriones son secretados y transportados a una nueva célula. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.. Finalmente, el proceso de replicación involucra la maduración de los viriones dentro de su hospedero. Un paso fundamental para la infectividad de los nuevos viriones es el correcto procesamiento de sus proteínas, especialmente de la glicoproteína G, conocida como la proteína de unión y fusión a la célula hospedera y el mayor antígeno de los virus pertenecientes a esta familia.. La proteína G recién trascrita a ARNm viral posee una. secuencia de 16 nucleótidos, a modo de secuencia señal, en el extremo que dará origen al dominio proteínico N-terminal que lidera su entrada en el retículo endoplasmático. Tan. 15.

(25) pronto esta señal en el ARNm para G es reconocida, es cortada -por acción de enzimas endógenas de retículo endoplasmático conocidas como signalasas- para dar origen al péptido. viral:. una. proteína. de. 495. residuos. aminoacídicos. con. un. dominio. transmembranal de 20 amino ácidos en su extremo C-terminal y uno citoplasmático de 29 amino ácidos en su extremo N-terminal. Esta proteína membranal tipo l es glicosilada en dos residuos del aminoácido Asparagina y transportada hacia la membrana celular, donde los viriones son ensamblados, adquiriendo su forma final e infectiva, forma que se observa en la Figura 4 (Strauss, 2002). Aunque inicialmente se creía que las 5 proteínas existentes en los Rabdovirus eran exclusivamente estructurales, exceptuando la ARN polimerasa dependiente de ARN (proteína L) y su cofactor (proteína P), se ha comprobado que tienen funciones en la regulación de la replicación del virus, así como papeles sorprendentes en el ingreso a la célula, transporte intercelular y evasión de la respuesta inmune. 1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES 1.2.3.1. PROTEÍNA N Proteína de Nucleocápside. La proteína de nucleocápside posee la función crítica de envolver estrechamente el ARN genómico viral dentro de un estructura resistente a ARNasas celulares. A su vez, esta estructura o core proteína-ARN sirve como plantilla para los procesos de transcripción y replicación. A partir de estudios hechos en el VSV, se ha estimado que cada unidad de la proteína cubre alrededor de 9 nucleótidos de ARN y que este complejo proteína-ARN interactúa durante la replicación y la transcripción con los otros dos componentes de la nucleocápside viral: la fosfoproteína P y la ARN polimerasa viral L, así como con la proteína de matriz M durante la condensación de la nucleocápside, la unión a membrana y la gemación. La proteína viral N reconoce secuencias específicas para empaquetamiento dentro del extremo 5´ del ARN viral genómico y antigenómico, regulando así los procesos de transcripción y replicación viral mediante el switch molecular discutido anteriormente. Debido a que la función fundamental de esta proteína es meramente estructural y otras funciones relacionadas con patogénesis viral, evasión de la respuesta celular o regulación genética propia o de su célula hospedera no han sido descritas, se sabe muy poco sobre su estructura (Fields, 2001). Sin embargo, la supresión o mutación de cinco residuos dentro de su extremo C-terminal elimina por completo su actividad de unión al ARN así. 16.

(26) como la interacción con la proteína P, complejo proteínico esencial que evita la agregación de monómeros de N (Das et al., 1993 y 1999).. 1.2.3.2. PROTEÍNA P Fosfoproteína. Como se discutió anteriormente en el capítulo de transcripción, el gen P codifica para la proteína P así como para formas truncadas, una de ellas, recientemente definida como la proteína C para el VSV (Fields, 2001). La proteína P o fosfoproteína en combinación con la polimerasa viral forma el complejo transcriptasa-replicasa donde P cumple la función de cofactor no catalítico de la polimerasa viral. La unidad proteínica se compone de 265 residuos de aminoácidos y se encuentra en diferentes formas de fosforilación dentro de las células y dentro de los viriones. Su estructura fundamental se compone de un dominio ácido N-terminal que se compone de 150 residuos de aminoácidos donde se encuentran los sitios de fosforilación. Desde el residuo 150 al 210 existe una región altamente variable entre las diferentes especies y diferentes cepas virales que se conoce como hinge o punto de giro. El segundo dominio, comprendido entre el aminoácido 210 y el 244, también posee sitios de fosforilación. Finalmente se encuentra el extremo C-terminal compuesto por 21 aminoácidos (Fields, 2001). Los diferentes fenómenos de fosforilación que sufre la proteína P y que son la base para la acción de la ARN polimerasa (proteína L), son llevados a cabo por proteínas citoplasmáticas como las Caseína Kinasa ll sobre los residuos de Serina y Treonina localizados en el dominio l ácido N-terminal (Barik et al., 1992). Estudios recientes han determinado que la fina regulación que se lleva a cabo durante la replicación está mediada por fenómenos de fosforilación dentro del dominio ll, proponiendo que los patrones diferenciales de fosforilación de la proteína P son la base de la regulación del switch molecular entre transcripción y regulación (Hw ang et al., 1999). La formación de trímeros es el requisito principal para la unión de esta fosfoproteína a la polimerasa viral y al complejo proteína N-ARNv, formando la unidad de transcripción funcionalmente activa L-P3-N-ARN (Gao et al., 1996). Como se estableció al principio de este capítulo, el gen que codifica para la proteína P en los Rabdovirus tiene un segundo marco de lectura que da origen a dos pequeñas proteínas de carácter básico de 55 y 65 aminoácidos. Estudiadas principalmente en el VSV, pero presumiblemente presentes en la gran mayoría de los Rabdovirus del orden de los Vesiculovirus y algunos Lyssavirus, estas proteínas tomaron los nombres de proteína C y proteína C´ (Fields, 2001).. Estudios. realizados eliminando los codones de inicio para estas formas truncada de la proteína P. 17.

(27) en el VSV mostraron que no existían diferencias en la cinética de crecimiento del virus, ni en la cantidad de ARNm producido, ni en la concentración de proteína virales presentes, ni en la disminución de las funciones celulares en comparación con el virus silvestre, al menos en modelos In vitro (Schnell et al., 1996).. Figura 4. Proteínas y estructura de los virus pertenecientes a la familia Rhabdoviridae. La proteína de mayor tamaño es la ARN polimerasa dependiente de ARN (proteína L), seguida por la proteína antigénica de membrana y principal receptor viral para la entrada a la célula (proteína G). Continúa en orden descendente: la proteína fundamental para la estructura y función del complejo RNP debido a sus dominios de unión al ARN (proteína N), la fosfoproteína o cofactor de la ARN polimerasa viral (proteína P) y finalmente la proteína de matriz, encargada de la unión entre el complejo RNP y la membrana viral (proteína M). Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.. Estudios de patogénesis y de transmisión In vivo han demostrado que tampoco existen diferencias entre las cepas silvestres y sus contrapartes mutantes para la producción de las proteínas C y C´ por lo que el papel de estas unidades parece no se esencial para los fenómenos replicativos, transcripcionales, de patogénesis y transmisión del virus, o por lo menos, no se ha descubierto todavía. Sin embargo, estudios realizados en RABV, donde adicionalmente a P se producen cuatro formas truncadas conocidas como P2, P3, P4 y. 18.

(28) P5, mostraron que estas versiones poseen señales especiales de localización en membrana nuclear y de exporte núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente asociarlas con mecanismos de fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y relacionarlas también en procesos de regulación del transporte de otras proteínas virales como L y N en posibles fenómenos de evasión de la respuesta antiviral mediante la interacción con proteínas nucleares (Blondel et al., 2002 y 2005).. 1.2.3.3. PROTEÍNA M Proteína de Matriz. Es la proteína de menor tamaño y con mayor abundancia dentro del virion de los Rabdovirus. Aunque su función principal es servir de puente de unión entre la membrana de virion y la nucleocápside (Mebatsion et al., 1999), como se observa en la Figura 4, se ha descrito que también está fuertemente involucrada en la condensación de la nucleocápside durante el ensamblaje del virus, en la disrupción del citoesqueleto de la célula hospedera, y en la inhibición de muchas de las funciones celulares (Fields, 2001). Esta proteína es altamente básica y no posee dominios hidrofóbicos, excepto en su extremo N-terminal, característica que le permite interactuar con la bicapa lipídica que la partícula viral adquiere de la membrana de su hospedero justo antes de gemar (Lenard et al., 1990).. Adicionalmente, la proteína M sufre fenómenos de fosforilación en los. aminoácidos Serina y Treonina presentes entre las posiciones 20 y 35. Sin embargo, la disrupción de estos sitios de fosforilación no afecta la funciones de ensamblaje de viriones, por lo que el papel de esta fosforilación debe ser determinado (Lyles et al., 1995). Una de las aproximaciones más interesantes a las funciones no estructurales de la proteína M fue hecha por el grupo de Justice en 1995, cuando mediante la expresión del gen M del VSV en un sistema de expresión In vitro lograron probar que regiones conservadas del un dominio rico en prolina de esta proteína viral tenían la capacidad intrínseca de inducir exocitosis mediante la vesiculación de la membrana de las células transfectadas con dicha secuencia genética mediante la unión específica a dominios WW determinados de proteínas celulares (Justice et al., 1995 y Harty et al., 1999). Mediante estudios de microscopía confocal se ha descrito que una fracción de la proteína M se encuentra asociada a la membrana celular, una fracción mayoritaria se localiza en el citoplasma y una tercera fracción se localiza dentro del núcleo (Lyles et al., 1988). Aunque no existen estudios reportados sobre características de la proteína de matriz para ser transportada a núcleo, puede existir relación entre las características encontradas por Blondel en el 2005 para las versiones truncadas de la fosfoproteína P, al menos para el. 19.

(29) RABV (descritas en el capítulo anterior). Recientemente se ha descrito que la proteína M está involucrada en la disrupción del tráfico nucleocitoplasmático mediante su interacción específica con la nucleoporina Nupp98 así como en la regulación del switch molecular (Finke et al, 2004). Regresando a la función estructural de la proteína M, reportes muy convincentes muestran que esta proteína es fundamental para la estabilización de los trímeros de la glicoproteína G y que solo las membranas de células que expresan formas silvestres de la proteína M tienen la capacidad de unirse a la nucleocápside viral (Lyles et al., 1992 y Rose et al., 1993) reafirmando la idea que la proteína M es el puente de unión entre la membrana y la nucleocápside del virus.. 1.2.3.4. PROTEÍNA G Glicoproteína.. Esta proteína transmembranal típica tipo l con la mayoría de sus. aminoácidos expuestos sobre la superficie del virion se distribuye a través de toda la superficie del mismo con aproximadamente 400 unidades triméricas, para un total de 1200 unidades, como se observa en la Figura 4. Debido a que es la proteína viral más antigénica ha merecido la mayor parte de los estudios para los Rabdovirus, especialmente para el VSV y su homólogo RABV. La proteína G está asociada tanto con la envoltura viral como con el complejo RNP y es considerada como la proteína fundamental de ensamblaje de los Rabdovirus (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).. El gen G codifica para una proteína de aproximadamente 500. aminoácidos en una sola cadena peptídica (Fields, 2001). En muchos Rabdovirus, esta proteína se sintetiza como un precursor con aproximadamente 16 residuos adicionales a modo de péptido señal en su extremo N-terminal que le permiten a la pre-proteína asociarse con la chaperona BiP (GRP 78) en el retículo endoplasmático celular para la adquisición de su conformación correcta (Bole et al., 1990).. Posteriormente, los. oligosacáridos glicosilados de esta proteína entran en contacto con una segunda chaperona molecular, la calnexina, en una acción secuencial de plegamiento a la realizada por la chaperona BiP, migrando al aparato de Golgi, para 30 minutos más tarde a su síntesis, aparezca anclada en forma trimérica a la membrana celular de la célula hospedera (Blobel et al., 1978 y Helenius et al., 1994).. Los sitios de glicosilación. mencionados anteriormente son dos ligados a sitios amino, uno de ellos en la posición 117 están fuertemente ligados tanto al correcto plegamiento así como una secuencia de 19 aminoácidos no cargados entre las posiciones 118 y 136 pare el VSV (y entre los residuos 103 a 179 en el RABV) parecen estar relacionados con las características de. 20.

(30) inserción a membrana y fusión de este glicoproteína de una manera pH dependiente (Ghosh et al., 1993 y Whitt et al., 1995). Adicionalmente posee un dominio altamente hidrofóbico de 20 aminoácidos que sin duda alguna es aquel que se encuentra atravesando la membrana y un dominio citoplasmático de 29 aminoácidos que se ubican en la parte interior del virion en posible contacto con la proteína M (Fields, 2001). Estudios mutacionales de los dominios extracelulares y transmembranales de la proteína G, como la disrupción de sus sitios de glicosilación, han mostrado que esta proteína se mantiene como monómeros altamente agregados, plegados incorrectamente y unidos a la chaperona BiP dentro del retículo endoplasmático. Si por el contrario las mutaciones se llevan a cabo en el dominio citoplasmático de esta glicoproteína, aunque no se afecta el correcto plegamiento molecular, la tasa de transporte de la proteína se ve afectada significativamente, indicando que el dominio citoplasmático de la proteína posee la señal de salida del retículo endoplasmático, posiblemente una señal diacídica conformada por los aminoácidos Asp-X-Gly (Balch et al., 1997) mientras que la fracción extra y transmembranal poseen las señales de plegamiento y procesamiento (Machamer et al., 1988). La organización de los trímeros a través de la membrana citoplasmática es un proceso pH dependiente donde solo a valores inferiores a pH 6.1 se induce el cambio conformacional que dará origen a los trímeros estables debido posiblemente a que este bajo pH expone un dominio hidrofóbico –no definido hasta el momento por falta de homología con otras proteína transmembranales virales, pero donde el extremo N-terminal es un fuerte candidato- que se inserta exitosamente dentro de la membrana celular (Helenius et al., 1993 y Rose et al., 1984).. 1.2.3.5. PROTEÍNA L Proteína Larga. Secuenciado por primera vez en 1984 por Schubert y su grupo de colaboradores (Schubert et al., 1984), esta proteína esta conformada por un poco más de 2100 aminoácidos organizados en una sola cadena polipeptídica. Siendo la proteína viral más grande, es razonable pensar en la multifuncionalidad de esta enzima de origen viral. Como se observó en los capítulos referentes a transcripción y replicación, la ARN polimerasa dependiente de ARN tiene funciones adicionales como el capping del ARNm, la metilación de la estructura 5´ cap y la poliadenilación del ARN viral (Fields, 2001). Aunque se han probado todas estas funciones para la polimerasa viral, no se han reportado estudios de mapeo de los dominios involucrados en cada una de estas. 21.

(31) funciones ni de los aminoácidos esenciales para las mismas, a excepción del dominio metiltransferasa, involucrado en la metilación de las estructuras 5´ cap (Moyer et al., 1988). Las mutaciones dentro de la proteína L causan poliadenilación aberrante en cada uno de los ARNm, confirmando la función de esta proteína en este proceso (Hunt et al., 1983).. Adicionalmente, el uso del compuesto S-adenosil homocisteína, reconocido por. ser un fuerte bloqueador de la metilación en las estructuras cap, ha demostrado promover la poliadenilación aberrante de ARNm del VSV (Rose et al., 1977).. 1.3. VIRUS RABIA (RABV) 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN Análisis detallados basados en reactividad cruzada con antígenos específicos antiproteína N o mediante análisis de secuencias de ARN permiten incluir al virus dentro del genero Lyssavirus el virus de rabia (RABV según la nueva nomenclatura establecida por el Comité Internacional de Taxonomía Viral ICTV).. Este virus es sin duda el virus. perteneciente a la familia Rabdoviridae de mayor interés clínico. El género Lyssavirus también contempla entidades como el Virus Mokola, el Virus del murciélago de Lagos, el Virus Duvenhage, el Virus del Murciélago australiano y los Virus del Murciélago europeo número 1 y número 2 (Baer, 1991). Conocida desde el sigo XXlll A.C, la rabia es una enfermedad fatal y ampliamente diseminada entre humanos y otro mamíferos, caracterizada por la transmisión horizontal, donde el virus se encuentra principalmente en la saliva del animal rábico que la transmite por su mordida (Strauss, 2002).. El ciclo de transmisión a humanos se observa en la. Figura 5. Las primeras evidencias de la presencia del RABV como agente etiológico de la encefalitis que lleva su nombre vinieron de reportes histopatológicos que mostraron la existencia de agregados citoplasmáticos en neuronas y que se llamaron cuerpos de Negri. La existencia de estos cuerpos se atribuye a la acción de las proteínas G y M, principalmente de la glicoproteína, pues son estas las proteínas relacionadas con la envoltura del virus y por ende las únicas capaces de inducir respuesta antiviral mediada por anticuerpos neutralizantes.. Aunque la transmisión ocurre exclusivamente por la. mordida de animales infectados y la penetración directa del virus a las células musculares, se han reportado casos de infección por contacto por mucosas, donde ocurre la contaminación de una herida abierta previamente, por rasguños, lamidas o inhalación de aerosoles del animal infectado, donde una mordida no está involucrada. A modo de ejemplo, datos estadísticos en Estados Unidos presentados a mitades de los años 90,. 22.

(32) revelaron que tan solo el 3% de la infecciones con RABV, equivalente a cinco casos de los 154 reportados entre 1950 y 1980, fueron. debidas a exposiciones sin mordidas.. Específicamente, cuatro de ellos fueron por contacto con aerosoles donde el RABV estaba altamente concentrado, dos de ellos en exploradores de cuevas y los otros dos en investigadores de laboratorio (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Sorprendentemente, y como caso clínico que abrió una nueva rama de investigación en el RABV, el quinto caso reportado ocurrió en un paciente quién recibió un transplante de córnea proveniente de un paciente moribundo de encefalitis quién nunca fue diagnosticado RABV positivo, como lo reporta el Centro para el Control de Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) en su informe de RABV en 1995 (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).. Figura 5. Ciclo de la infección por RABV. Caracterizada por ser una enfermedad viral de transmisión horizontal, el virus tiene un ciclo de mantenimiento endozootico donde sus vectores son mamíferos que sufren de síntomas igualmente pronunciados pero con tiemposde incubación y desarrollo de la enfermedad rábica muchos menores. Generalmente por mordida, contacto con mucosas y/o saliva o muy raramente por aerosoles el RABV alcanza su hospedero humano, donde, dependiendo del lugar de contacto, especie y condiciones del animal infectado, condición de salud e inmune del paciente y de la cepa viral inoculada, la enfermedad, caracterizada por parálisis focal y/o encefalitis aguda, puede desarrollarse entre los 5 días hasta más de 2 años. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.. 23.