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Identificación y caracterización de levaduras no-saccharomyces de distintas regiones vitivinícolas españolas

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(1)

Identificación y caracterización

de levaduras no-

Saccharomyces

de distintas regiones vitivinícolas

españolas

Subprograma Nacional de Conservación de

Recursos Genéticos de Interés

Agroalimentario-Recursos Microbianos

(2)

ENTIDAD: IMIDRA

PROYECTO Nº RM2006-00012-00-00

TITULO DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN Y

CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS NO-

SACCHAROMYCES

DE

DISTINTAS REGIONES ESPAÑOLAS

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

EQUIPO

PARTICIPANTE ADMINIST. (*)SITUACIÓN

DEDICACIÓN APROBADA (UNICA O COMPARTIDA) CENTRO INVESTIGADOR PRINCIPAL: TERESA

ARROYO CASADO CONTRATADA COMPARTIDA teresa.arroyo@madrid.orgIMIDRA

PERSONAL INVESTIGADOR: EVA Mª VALERO BLANCO GUSTAVO CORDERO BUESO CONTRATADA BECARIO COMPARTIDA COMPARTIDA UNIV. PABLO DE OLAVIDE, SEVILLA IMIDRA

(3)

OBJETIVO: Identificación, caracterización y ampliación de

la colección de levaduras vínicas no-

Saccharomyces

del

IMIDRA

Estudio de la viabilidad de la colección de cepas de levaduras autóctonas

y de colección no-

Saccharomyces

presentes en el IMIDRA.

Aislamiento de nuevas cepas de levaduras no-

Saccharomyces

procedentes de viñedo y de bodega de elaboración.

Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de

especie de estas cepas de levaduras no-

Saccharomyces

.

Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de cepa

de levaduras no-

Saccharomyces.

Recopilación, análisis de datos y creación de una base de datos en el

IMIDRA de cepas de levaduras no-S

accharomyces

.

(4)

Material de partida

• Colección de levaduras del IMIDRA (CLI) ~ 1200

cepas

(

Saccharomyces

RM2007-00008

y

no-Saccharomyces

) conservadas en YM a 4ºC.

• Recopilación de 118 cepas de levaduras

no-Saccharomyces,

conservadas en la colección de

levaduras del IMIDRA

• 38 cepas proceden de aislados asociados a levaduras

de flor de diferentes regiones españolas, recogidas a

mediados de los años 50

• 80 cepas autóctonas de Arganda, Nalvalcarnero y San

Martín de Valdeiglesias, año 1991. Primeros estudios

de la microbiota de mostos y vinos en la D.O. “Vinos

de Madrid”.

(5)

Tareas realizadas

• Test de viabilidad y pureza

• Ajuste de condiciones óptimas de liofilización,

primera vez que se aplica este sistema de

conservación al mantenimiento de la colección

• Conservación de las cepas en leche descremada

(200 g/l)

Nueva catalogación (CLIXX) y

mantenimiento bajo dos sistemas de

conservación, LIOFILIZACIÓN y

CONGELACIÓN -80ºC

Nueva catalogación (CLIXX) y

mantenimiento bajo dos sistemas de

conservación, LIOFILIZACIÓN y

CONGELACIÓN -80ºC

Nueva catalogación (CLIXX) y

mantenimiento bajo dos sistemas de

conservación, LIOFILIZACIÓN y

CONGELACIÓN -80ºC

Nueva catalogación (CLIXX) y

mantenimiento bajo dos sistemas de

conservación, LIOFILIZACIÓN y

CONGELACIÓN -80ºC

Nueva catalogación (CLIXX) y

mantenimiento bajo dos sistemas de

conservación, LIOFILIZACIÓN y

CONGELACIÓN -80ºC

(6)

CLI liofilizada y conservada a 4ºC y a

temperatura ambiente

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

Rhodotorula mucilaginosa

(7)

Ampliación de la colección

• 834 aislados de cepas no-

Saccharomyces

procedentes del

viñedo

• Estudios de biodiversidad de levaduras sobre diferentes

variedades de vid cultivadas en la D.O. “Vinos de Madrid”

• Viñedos bajo diferentes sistemas de mantenimiento del

(8)

Las colonias fueron seleccionadas en

función de su capacidad para crecer

en medio con lisina como única fuente

de carbono

YNB Lys - YNB Lys +

Saccharomyces

Non Saccharomyces

(9)

Identificación genética

• RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic

DNA-Polymerase Chain Reaction) desarrollada

por Williams et al. (1990).

• Se utilizó el primer OPB-15 MWG Biotech AG

(Ebersberg, Alemania) secuencia:

• 5’-GGAGGGTGTT-3’

• Se tomó como referencia las cepas tipo de la

CECT.

(10)

• Identificación genética de las cepas de

levaduras no-Saccharomyces método

basado en PCR-RFLP de la región ITS

del ADN ribosómico desarrollado por

Granchi y col. (1999)

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

Identificación molecular por

PCR/RFLP de la región ITS

ribosómica

(11)

Referencias para la identificación

• Comparación de los productos amplificados y el

tamaño de los fragmentos de restricción descritos

previamente por Guillamón

et al

. (1998),

Esteve-Zarzoso

et al

. (1999) y Fernández-Espinar

et

al

.(2000). http://motor.edinfo.es/iata

• Base de datos yeast-id.com

• En cada reacción de amplificación y restricción, se

utilizaron como referencia cepas tipo procedentes

de la Colección Española de Cultivos Tipos (CECT)

(12)

Cepas utilizadas como referencia

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

Cepa Referencia

Candida glabrata CECT 1448

Candida stellata CECT 11918

Candida vini CECT 11905

Dekkera bruxellensis CECT 1010

Debaryomyces hansenii var. hansenii CECT 10353

Hanseniaspora uvarum CECT11105

Kluyveromyces thermotolerans CECT 1962

Metschnikowia pulcherrima CECT 10071

Pichia carsonii CECT10227

Pichia membranaefaciens CECT 10037

Rhodotorula mucilaginosa CECT 10359

Schyzosaccharomyces pombe CECT 10685

Torulaspora delbruekii CECT 1015

(13)

Resultado de clasificación de cepas de diferentes regiones

CLI Género y especie Zona Compatibilidad

ITS-RFLP(%) yeast-id.com 906 Candida micoderma Galicia Candida vini (39)

944 Torulaspora colliculosa Valladolid Torulaspora delbrueckii (35) 966 Candida stellatoidea Madrid -

968 Hansenula subpelliculosa Toledo -

985 Candida guillermondii Murcia Candida guillermondii (40) 991 Kloeckera africana Extremadura Kloechera sp (400X) 995 Candida parasilopsis Extremadura - 996 Candida tropicalis Extremadura - 1003 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1004 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1005 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1007 Torulopsis famata Extremadura - 1008 Torulopsis famata Extremadrua - 1025 Candida tropicalis Extremadura - 1027 Candida tropicalis Extremadura - 1028 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1037 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1041 Candida stellatoidea Extremadura - 1050 Torulopsis colliculosa Jérez - 1056 Candida clausenii Montilla -

1057 Torulopsis holmi Cádiz ¿Saccharomyces exiguus ? 1058 Candida tropicalis Jérez -

1060 Candida clausenii Montilla -

1061 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (35) 1062 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (40) 1063 Candida melibiosis Montilla -

1078 Schyzosaccharomyces pombe Burdeos RAPD (400X) 1079 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1080 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1081 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1093 Saccharomycodes ludwigii - -

Cultivos de levaduras muy antiguos

(1956).

Mantenidos en mosto peptonado

rejuvenecimiento cada 2 meses

durante 25 años; y en medio sólido

(YM) cada 6 meses.

Resultados ¿ ? no coinciden con

base de datos CECT

se hace necesario recurrir a:

Base de datos CBS

(

http://www.cbs.knaw.nl

)

Secuenciación de regiones

ribosomales

Dominios D1/D2 del extremo

5’del gen 26S (Cadez et

(14)

Resultado de identificación de las 80 cepas

autóctonas de la colección (ITS-RFLP)

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

Género y especie

Número de cepas, amplificado y

fragmentos

Candida sp.(cantarelli, dattila,

lambica, intermedia, stellata,

vini.)

23

ITS: 490-590

Hanseniaspora uvarum

1

CfoI: 490 HaeIII: 600 HinfI: 300

Kloeckera apiculata

11

ITS:750 CfoI: 650+100 HaeIII: 700 HinfI: 300+200+190

Metschnicowia pulcherrima

11

ITS:400 CfoI: 200+75 HaeIII: 250+100 HinfI: 190

Pichia membranaefaciens

3

ITS:650 CfoI: 550 HaeIII: 600 HinfI: 300+300

Rhodotorula mucilaginosa (rubra)

3

ITS:600 CfoI: 275+225+75 HaeIII: 400+200 HinfI: 350+200

Torulaspora delbrueckii

25

ITS:800, CfoI: 325 HaeIII: 800, HinfI: 350+200+175

(15)

Fragmentos de restricción y número de aislados

cepas (834 aislados para ampliación de colección)

Especie

ITS

RFLP_HaeIII

RFLP_CfoI

RFLP_HinfI

Total aislados

Metschnicowia pulcherrima

400

280 + 95

210 + 80

190

153

Candida apicola

490

385+88

210+184

228+133

2

Candida stellata

500

490

210+115+70

230 +230

60

Candida sorbosa

600

600

560

315

4

Pichia guilliermondii

625

298+261

368+115+90

309+285

30

Pichia anomala

630

620

550

310+310

152

Hanseniaspora guilliermondii

775

775

340+320+105

360+200+160

115

Kluyveromyces thermotolerans

700

300+210+85

305+280

355

303

Pichia toletana

700

600

625

375

4

Torulaspora delbrueckii

800

750 320+210+140+100

410+375

11

Saccharomyces cerevisiae

850

325+250+185+150

375+325+150

375+365+110

156

(16)

Cepas de levaduras aisladas en el viñedo

• Las cepas se han agrupado bajo 6 géneros y

11 especies diferentes: Candida apícola,

Candida sorbosa, Candida stellata,

Hanseniaspora guilliermondii,

Kluyveromyces thermotolerans,

Metschnicowia pulcherrima, Pichia

anomala, Pichia guilliermondii, Pichia

toletana y Torulaspora delbrueckii

(17)

Perfiles electroforéticos de las especies de levaduras

(18)

Gestión de la colección

Madrid/19-01-10

Jornada de presentación de resultados

Proyecto RM2006-00012

• Software Bionumerics

http://www.biosystematica.com

Análisis de geles

Tratamiento de datos y agrupamientos

Base de datos

(19)

Propiedades enzimáticas

• Sobre 156 cepas no-

Saccharomyces

(83 del viñedo y 73 de la

colección CLI)

• Actividades: proteasa (40%), pectinasa (35%), glucanasa (50%), y

sulfito reductasa (100%)

• Actividad β-glucosidasa (29%)

Hansenula > Metschnicowia > Hanseniaspora > Kloeckera

Candida y Pichia

(-)

• Levaduras aisladas en viñedo

presentan mayor actividad β-glucosidasa

+++ +++ + -++ ++ ++ + + + + + + ++ + +/-+++ +++ + +++ +++ + -++ ++ ++ + + + + + + ++ + +/-+++ +++ +

(20)

Información científica generada

Congresos:

• SEM. Sociedad española de microbiología. Sevilla 17-20 de Septiembre de 2007. Biodiversidad de la

microbiota de levaduras asociada a la uva en viñedos con diferentes sistemas de defensa biológica. A. Serrano, T. Arroyo, R. González, E. Valero.

• XIII CONGRESO ANUAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, CYTALIA 2008. Madrid, 9,

10 y 11 de Abril de 2008. Biodiversidad de la microbiota de levaduras de la uva en viñedos con distintos sistemas de manejo del suelo. Serrano, A., Arroyo, T., Cordero, G., González, R., Pedrosa, R., Lissarrague R., Valero, E.

• XXXI Congreso Mundial de la Viña y el Vino, OIV. Verona, 15-20 de Junio de 2008. Influencia de los

parámetros agronómicos del viñedo en la Biodiversidad de levaduras fermentativas asociadas a la uva. A. Serrano, T. Arroyo, G. Cordero,González, R. Pedrosa, R. Lissarrague, E. Valero.

• XII WEURMAN FLAVOUR RESEARCH SYMPOSIUM. Interlaken (Switzerland) 1-4 de Julio de 2008.

Glycosidase production by non-Saccharomyces yeast isolated from vineyard. T. Arroyo, G. Cordero, A. Serrano, E. Valero.

• XVI CONGRESO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. Córdoba (Spain) 14-17 de

septiembre de 2008. Evolución de las levaduras comerciales en el ambiente. Primer año de estudio. A. Serrano, T. Arroyo, G. Cordero, E. Valero. ISBN: 978-84-691-5094-8. Pg: 327

• XXIV Reunión anual del grupo de trabajo de Experimentación en Viticultura y Enología. Madrid, 5-6 de Mayo

de 2009 en el IMIDRA. Resultados preliminares agronómicos sobre la microbiota del viñedo en la CM. G. Cordero, E. Valero, A. Serrano y T. Arroyo.

• 27th ISSY Pasteur’s Legacy “ Yeasts for Health and Biotechnologies” Paris 25-29 de Agosto de 2009. Effect

of agronomic parameters on the microbiote of the vineyeard. First year of study. T. Arroyo, G. Cordero-Bueso, A. Serrano y E. Valero.

Diploma de Estudios Avanzados (DEA). Gustavo Cordero Bueso, Universidad Autónoma de Madrid. Departamento

de Química Física Aplicada. Área de Tecnología de los Alimentos. Septiembre 2009. Efecto de los factores agronómicos sobre la microbiota del viñedo. Estudios preliminares.

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