Identificación y caracterización
de levaduras no-
Saccharomyces
de distintas regiones vitivinícolas
españolas
Subprograma Nacional de Conservación de
Recursos Genéticos de Interés
Agroalimentario-Recursos Microbianos
ENTIDAD: IMIDRA
PROYECTO Nº RM2006-00012-00-00
TITULO DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS NO-
SACCHAROMYCES
DE
DISTINTAS REGIONES ESPAÑOLAS
Madrid/19-01-10
Jornada de presentación de resultados
Proyecto RM2006-00012
EQUIPO
PARTICIPANTE ADMINIST. (*)SITUACIÓN
DEDICACIÓN APROBADA (UNICA O COMPARTIDA) CENTRO INVESTIGADOR PRINCIPAL: TERESA
ARROYO CASADO CONTRATADA COMPARTIDA teresa.arroyo@madrid.orgIMIDRA
PERSONAL INVESTIGADOR: EVA Mª VALERO BLANCO GUSTAVO CORDERO BUESO CONTRATADA BECARIO COMPARTIDA COMPARTIDA UNIV. PABLO DE OLAVIDE, SEVILLA IMIDRA
OBJETIVO: Identificación, caracterización y ampliación de
la colección de levaduras vínicas no-
Saccharomyces
del
IMIDRA
•
Estudio de la viabilidad de la colección de cepas de levaduras autóctonas
y de colección no-
Saccharomyces
presentes en el IMIDRA.
•
Aislamiento de nuevas cepas de levaduras no-
Saccharomyces
procedentes de viñedo y de bodega de elaboración.
•
Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de
especie de estas cepas de levaduras no-
Saccharomyces
.
•
Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de cepa
de levaduras no-
Saccharomyces.
•
Recopilación, análisis de datos y creación de una base de datos en el
IMIDRA de cepas de levaduras no-S
accharomyces
.
Material de partida
• Colección de levaduras del IMIDRA (CLI) ~ 1200
cepas
(
Saccharomyces
RM2007-00008
y
no-Saccharomyces
) conservadas en YM a 4ºC.
• Recopilación de 118 cepas de levaduras
no-Saccharomyces,
conservadas en la colección de
levaduras del IMIDRA
• 38 cepas proceden de aislados asociados a levaduras
de flor de diferentes regiones españolas, recogidas a
mediados de los años 50
• 80 cepas autóctonas de Arganda, Nalvalcarnero y San
Martín de Valdeiglesias, año 1991. Primeros estudios
de la microbiota de mostos y vinos en la D.O. “Vinos
de Madrid”.
Tareas realizadas
• Test de viabilidad y pureza
• Ajuste de condiciones óptimas de liofilización,
primera vez que se aplica este sistema de
conservación al mantenimiento de la colección
• Conservación de las cepas en leche descremada
(200 g/l)
Nueva catalogación (CLIXX) y
mantenimiento bajo dos sistemas de
conservación, LIOFILIZACIÓN y
CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y
mantenimiento bajo dos sistemas de
conservación, LIOFILIZACIÓN y
CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y
mantenimiento bajo dos sistemas de
conservación, LIOFILIZACIÓN y
CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y
mantenimiento bajo dos sistemas de
conservación, LIOFILIZACIÓN y
CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y
mantenimiento bajo dos sistemas de
conservación, LIOFILIZACIÓN y
CONGELACIÓN -80ºC
CLI liofilizada y conservada a 4ºC y a
temperatura ambiente
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Rhodotorula mucilaginosa
Ampliación de la colección
• 834 aislados de cepas no-
Saccharomyces
procedentes del
viñedo
• Estudios de biodiversidad de levaduras sobre diferentes
variedades de vid cultivadas en la D.O. “Vinos de Madrid”
• Viñedos bajo diferentes sistemas de mantenimiento del
Las colonias fueron seleccionadas en
función de su capacidad para crecer
en medio con lisina como única fuente
de carbono
YNB Lys - YNB Lys +
Saccharomyces
Non Saccharomyces
Identificación genética
• RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic
DNA-Polymerase Chain Reaction) desarrollada
por Williams et al. (1990).
• Se utilizó el primer OPB-15 MWG Biotech AG
(Ebersberg, Alemania) secuencia:
• 5’-GGAGGGTGTT-3’
• Se tomó como referencia las cepas tipo de la
CECT.
• Identificación genética de las cepas de
levaduras no-Saccharomyces método
basado en PCR-RFLP de la región ITS
del ADN ribosómico desarrollado por
Granchi y col. (1999)
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Identificación molecular por
PCR/RFLP de la región ITS
ribosómica
Referencias para la identificación
• Comparación de los productos amplificados y el
tamaño de los fragmentos de restricción descritos
previamente por Guillamón
et al
. (1998),
Esteve-Zarzoso
et al
. (1999) y Fernández-Espinar
et
al
.(2000). http://motor.edinfo.es/iata
• Base de datos yeast-id.com
• En cada reacción de amplificación y restricción, se
utilizaron como referencia cepas tipo procedentes
de la Colección Española de Cultivos Tipos (CECT)
Cepas utilizadas como referencia
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Cepa Referencia
Candida glabrata CECT 1448
Candida stellata CECT 11918
Candida vini CECT 11905
Dekkera bruxellensis CECT 1010
Debaryomyces hansenii var. hansenii CECT 10353
Hanseniaspora uvarum CECT11105
Kluyveromyces thermotolerans CECT 1962
Metschnikowia pulcherrima CECT 10071
Pichia carsonii CECT10227
Pichia membranaefaciens CECT 10037
Rhodotorula mucilaginosa CECT 10359
Schyzosaccharomyces pombe CECT 10685
Torulaspora delbruekii CECT 1015
Resultado de clasificación de cepas de diferentes regiones
CLI Género y especie Zona Compatibilidad
ITS-RFLP(%) yeast-id.com 906 Candida micoderma Galicia Candida vini (39)
944 Torulaspora colliculosa Valladolid Torulaspora delbrueckii (35) 966 Candida stellatoidea Madrid -
968 Hansenula subpelliculosa Toledo -
985 Candida guillermondii Murcia Candida guillermondii (40) 991 Kloeckera africana Extremadura Kloechera sp (400X) 995 Candida parasilopsis Extremadura - 996 Candida tropicalis Extremadura - 1003 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1004 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1005 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1007 Torulopsis famata Extremadura - 1008 Torulopsis famata Extremadrua - 1025 Candida tropicalis Extremadura - 1027 Candida tropicalis Extremadura - 1028 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1037 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100) 1041 Candida stellatoidea Extremadura - 1050 Torulopsis colliculosa Jérez - 1056 Candida clausenii Montilla -
1057 Torulopsis holmi Cádiz ¿Saccharomyces exiguus ? 1058 Candida tropicalis Jérez -
1060 Candida clausenii Montilla -
1061 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (35) 1062 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (40) 1063 Candida melibiosis Montilla -
1078 Schyzosaccharomyces pombe Burdeos RAPD (400X) 1079 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1080 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1081 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X) 1093 Saccharomycodes ludwigii - -
Cultivos de levaduras muy antiguos
(1956).
Mantenidos en mosto peptonado
rejuvenecimiento cada 2 meses
durante 25 años; y en medio sólido
(YM) cada 6 meses.
Resultados ¿ ? no coinciden con
base de datos CECT
se hace necesario recurrir a:
Base de datos CBS
(
http://www.cbs.knaw.nl
)
Secuenciación de regiones
ribosomales
Dominios D1/D2 del extremo
5’del gen 26S (Cadez et
Resultado de identificación de las 80 cepas
autóctonas de la colección (ITS-RFLP)
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Género y especie
Número de cepas, amplificado y
fragmentos
Candida sp.(cantarelli, dattila,
lambica, intermedia, stellata,
vini.)
23
ITS: 490-590Hanseniaspora uvarum
1
CfoI: 490 HaeIII: 600 HinfI: 300Kloeckera apiculata
11
ITS:750 CfoI: 650+100 HaeIII: 700 HinfI: 300+200+190Metschnicowia pulcherrima
11
ITS:400 CfoI: 200+75 HaeIII: 250+100 HinfI: 190Pichia membranaefaciens
3
ITS:650 CfoI: 550 HaeIII: 600 HinfI: 300+300Rhodotorula mucilaginosa (rubra)
3
ITS:600 CfoI: 275+225+75 HaeIII: 400+200 HinfI: 350+200Torulaspora delbrueckii
25
ITS:800, CfoI: 325 HaeIII: 800, HinfI: 350+200+175Fragmentos de restricción y número de aislados
cepas (834 aislados para ampliación de colección)
Especie
ITS
RFLP_HaeIII
RFLP_CfoI
RFLP_HinfI
Total aislados
Metschnicowia pulcherrima
400
280 + 95
210 + 80
190
153
Candida apicola
490
385+88
210+184
228+133
2
Candida stellata
500
490
210+115+70
230 +230
60
Candida sorbosa
600
600
560
315
4
Pichia guilliermondii
625
298+261
368+115+90
309+285
30
Pichia anomala
630
620
550
310+310
152
Hanseniaspora guilliermondii
775
775
340+320+105
360+200+160
115
Kluyveromyces thermotolerans
700
300+210+85
305+280
355
303
Pichia toletana
700
600
625
375
4
Torulaspora delbrueckii
800
750 320+210+140+100
410+375
11
Saccharomyces cerevisiae
850
325+250+185+150
375+325+150
375+365+110
156
Cepas de levaduras aisladas en el viñedo
• Las cepas se han agrupado bajo 6 géneros y
11 especies diferentes: Candida apícola,
Candida sorbosa, Candida stellata,
Hanseniaspora guilliermondii,
Kluyveromyces thermotolerans,
Metschnicowia pulcherrima, Pichia
anomala, Pichia guilliermondii, Pichia
toletana y Torulaspora delbrueckii
Perfiles electroforéticos de las especies de levaduras
Gestión de la colección
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Jornada de presentación de resultados
Proyecto RM2006-00012
• Software Bionumerics
http://www.biosystematica.com
Análisis de geles
Tratamiento de datos y agrupamientos
Base de datos
Propiedades enzimáticas
• Sobre 156 cepas no-
Saccharomyces
(83 del viñedo y 73 de la
colección CLI)
• Actividades: proteasa (40%), pectinasa (35%), glucanasa (50%), y
sulfito reductasa (100%)
• Actividad β-glucosidasa (29%)
•
Hansenula > Metschnicowia > Hanseniaspora > Kloeckera
•
Candida y Pichia
(-)
• Levaduras aisladas en viñedo
presentan mayor actividad β-glucosidasa
+++ +++ + -++ ++ ++ + + + + + + ++ + +/-+++ +++ + +++ +++ + -++ ++ ++ + + + + + + ++ + +/-+++ +++ +
Información científica generada
Congresos:
• SEM. Sociedad española de microbiología. Sevilla 17-20 de Septiembre de 2007. Biodiversidad de la
microbiota de levaduras asociada a la uva en viñedos con diferentes sistemas de defensa biológica. A. Serrano, T. Arroyo, R. González, E. Valero.
• XIII CONGRESO ANUAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, CYTALIA 2008. Madrid, 9,
10 y 11 de Abril de 2008. Biodiversidad de la microbiota de levaduras de la uva en viñedos con distintos sistemas de manejo del suelo. Serrano, A., Arroyo, T., Cordero, G., González, R., Pedrosa, R., Lissarrague R., Valero, E.
• XXXI Congreso Mundial de la Viña y el Vino, OIV. Verona, 15-20 de Junio de 2008. Influencia de los
parámetros agronómicos del viñedo en la Biodiversidad de levaduras fermentativas asociadas a la uva. A. Serrano, T. Arroyo, G. Cordero,González, R. Pedrosa, R. Lissarrague, E. Valero.
• XII WEURMAN FLAVOUR RESEARCH SYMPOSIUM. Interlaken (Switzerland) 1-4 de Julio de 2008.
Glycosidase production by non-Saccharomyces yeast isolated from vineyard. T. Arroyo, G. Cordero, A. Serrano, E. Valero.
• XVI CONGRESO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. Córdoba (Spain) 14-17 de
septiembre de 2008. Evolución de las levaduras comerciales en el ambiente. Primer año de estudio. A. Serrano, T. Arroyo, G. Cordero, E. Valero. ISBN: 978-84-691-5094-8. Pg: 327
• XXIV Reunión anual del grupo de trabajo de Experimentación en Viticultura y Enología. Madrid, 5-6 de Mayo
de 2009 en el IMIDRA. Resultados preliminares agronómicos sobre la microbiota del viñedo en la CM. G. Cordero, E. Valero, A. Serrano y T. Arroyo.
• 27th ISSY Pasteur’s Legacy “ Yeasts for Health and Biotechnologies” Paris 25-29 de Agosto de 2009. Effect
of agronomic parameters on the microbiote of the vineyeard. First year of study. T. Arroyo, G. Cordero-Bueso, A. Serrano y E. Valero.
Diploma de Estudios Avanzados (DEA). Gustavo Cordero Bueso, Universidad Autónoma de Madrid. Departamento
de Química Física Aplicada. Área de Tecnología de los Alimentos. Septiembre 2009. Efecto de los factores agronómicos sobre la microbiota del viñedo. Estudios preliminares.