EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani

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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO

FITOPATOGENO Rhizoctonia solani

JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA

Bogotà D.C 2008

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TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de

Microbiòlogo Agrìcola y Veterinario

Bogotà D.C Enero 2008

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artìculo 23 de la Resoluciòn No _{13 de Julio de 1946}

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velarà por que no se publique nada contrario al dogma, y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”

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_____________________________ JOSE SALVADOR MONTAÑA MSc.

DIRECTOR.

Bogotà D.C Enero 2008

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______________________________ ________________________ Gerardo Moreno Durán MSc. Luis David Gomez MSc.

JURADO JURADO

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotà D.C

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“A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con

su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi

corazòn, por su amor de madre y comprensión infinita, a mi padre

Julio Cèsar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables

consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a

Angèlica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por

el hermoso regalo de existir en mi vida “.

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AGRADECIMIENTOS

A Jose salvador Montaña por su calidad humana y enseñanzas, por su apoyo y orientación constante e incondicional, por su comprensión y por la confianza brindada para culminar exitosamente este proyecto de mi vida.

Al Doctor Gerardo Moreno por su orientación y consejos en la realización de los ensayos de la investigación en la Estaciòn experimental de la Pontificia Universidad Javeriana.

Al Laboratorio de Microbiologìa ambiental y de suelos por el suministro del aislamiento T3 y por la colaboración durante la realización de esta investigación.

Al CIIA por el suministro del hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani para el desarrollo de la investigación.

Al LESYHT por el suministro del hongo nativo de Trichoderma T235 para el desarrollo de la investigación.

A flor América por el suministro de los esquejes de clavel enraizados y el aislamiento Trichoderma Tsp5, Tv1, Tc1 y Ti1.

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RESUMEN

Trichoderma es un hongo de gran importancia a nivel agrícola gracias a las diversas ventajas que ofrece como agente de control biológico, para la protección de plantas frente al ataque de fitopatògenos causantes de enfermedades de importancia económica, como es el caso de los cultivos hortícolas.

En el presente estudio se evaluò la capacidad antagonista de 6 aislamientos de

Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un fitopatògeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para ello la técnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes de inhibición micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento la menor tasas de crecimiento.

Con el fin de confirmar la capacidad antagonista “in vivo” de los 6 aislamientos de Trichoderma, se realizaron ensayos en esquejes enraizados de clavel de la variedad everest susceptibles a R. solani bajo condiciones de invernadero, Confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de antagonismo “in vitro”, se observo que el tratamiento silvestre T235 resultò tener la mejor capacidad antagonista, reflejado en mayores valores de crecimiento de la parte aérea, raiz y peso de los esquejes de clavel, además de una mejor apariencia de los mismos y ausencia de signos o síntomas de la enfermedad.

Contrario a lo observado en el ensayo in vitro, donde el aislamiento Tc1 mostro tasas de crecimiento libre y porcentajes de inhibición micelial bajos, en los ensayos de invernadero este aislamiento presento una buena capacidad antagonista y promocion del crecimiento vegetal indicando que no necesariamente la capacidad antagonista de un aislamiento observada in Vitro sea un indicativo de cómo se va a comportar en condiciones de invernadero o campo

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INDICE GENERAL

1. INTRODUCCIÓN………...…….. 1

2. MARCO TEÒRICO Y ESTADO DEL ARTE ……… 3

2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma ……….. 5

2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma……….. 6

2.2.1. Biocontrol por competencia………. 7

2.2.2 Competencia por nutrientes……… 8

2.2.3 Antibiosis………..8

2.2.4 Micoparasitismo……….. 9

2.2.5 Sinergismo………..……….…...10

2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas……….. 10

2.2.7 Modificación de la rizosfera . ……… 10

2.3 Trichoderma en el biocontrol……….….13

2.4 Trichoderma como biofertilizante……….………. 15

2.5 Rhizoctonia solana……….…..16

2.5.1 BIOLOGÌA de Rhizoctonia solani……….. 17

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN………...………20

4. OBJETIVOS………..22 4.1. Objetivo General………. 22 4.2 Objetivos específicos……….. 22 5. MATERIALES Y METODOS………. 23 5.1 Diseño de la investigación……….. 23 5.1.1 Ubicación……….23 5.1.2 Microorganismos………23 5.1.3. Material vegetal ………... 24

5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24

5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma …..……….. 25

5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani………..……….. 25

5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro ………..……….. 26

5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo…….……… .26

5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”……….……….. 27

5.3 Diseño experimental ……….……….. 28

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÒN……….30 6.1 Evaluaciòn Macro y Microscòpica de aislamientos de Trichoderma ….. 31 6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma………... 33 6.3 Evaluaciòn de crecimiento del patógeno R. solani ……… 34 6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio ……….. 35 6.5 Evaluaciòn del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma …38 7. CONCLUSIONES ………...…59 8. BIBLIOGRAFIA ……….…. 61

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Crecimiento en placa de los Aislamientos de Trichoderma T3, TSP5, Tv1, Tc1, Ti1, y T235 en agar PDA durante 48 horas a 30°C………....31

Figura 2. Porcentajes de crecimiento libre evaluado a las 24,36,48 y 60 horas para 6 aislamiento de Trichoderma……….34

Figura 3. Curva de Crecimiento de Rhizoctonia solani………..… 34 Figura 4. Técnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia solani. Fotografía tomada 72 horas después del inicio de la prueba…………36 Figura 5. Porcentaje de inhibición micelial de los 6 aislamientos de

Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas……….…..37 Figura 6. Aspecto del material vegetal previo a la inoculación con el Hongo Rhizoctonia solani……….…… 39 Figura 7. Aspecto del material vegetal luego de la inoculación en campo con el patógeno ………... 40

Figura 8. Aspecto del material vegetal 7 días después de la inoculación con el patógeno ……… ……… 40

Figura 9. Aspecto del material vegetal 11 días después de la inoculación con el patógeno ………... 41

Figura 10. Aspecto del material vegetal 15 días después de la inoculación con el patógeno ………..42

Figura 11 Evaluaciòn de la longitud de la parte aérea de esquejes de clavel En respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani……….…. 42

Figura 12. Síntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani...43 Figura 13. Aspecto del material vegetal 19 días después de la inoculación con el patógeno ……….. 44

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Figura 14. Evaluación de la longitud foliar de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani………44

Figura 15 Evaluación del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…….46

Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 días después de la inoculación con el patógeno ………...48

Figura 17. Evaluación del peso seco aéreo de esquejes de clavel en

respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani ……… 49

Figura 18 Evaluación del peso seco raíz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani……50

Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad en el material vegetal………. 51 Figura 20. Evaluación del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…... 52

Figura 21. Incidencia de Muerte de esqujes de clavel en los tratamientos por acción patogénica de R. solani ……….52

Figura 22. Evaluaciòn de las raíces en los diferentes tratamientos

durante el desarrollo del ensayo ………. 54

Figura 23. Evaluación de la longitud de raiz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani ………... 55 Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 días después de la inoculación con el patógeno……….. 56

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tratamientos para la evaluación de antagonismos “in vivo” ……… 28 Tabla 2. Evaluación macroscópica de los 6 Aislamientos de Trichoderma … 31 Tabla 3. Resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre de

Trichoderma a las 24, 36, 48 y 60 horas……….. 32 Tabla 4. Resultados obtenidos al evaluar el porcentaje de inhibición

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INTRODUCCIÓN

El aumento de la población mundial, el deterioro del medio ambiente y calidad de vida del hombre, son sólo algunos de los tantos factores que han motivado al ser humano a buscar nuevos procesos de producción agrícola que permitan cubrir la demanda, cada vez más creciente, de alimento y materias primas a través de procesos donde se aprovechen los recursos naturales de manera sostenible e integrando así los conceptos de conservación y desarrollo para la plena satisfacción de las necesidades humanas. No obstante las actividades agrícolas extensivas y la ampliación de sus fronteras han traído consigo problemas fitosanitarios en los sistemas naturales, especialmente en el suelo, que es considerado el soporte principal de la agricultura.

Uno de los aspectos importantes en la producción agrícola es el control de plagas y enfermedades; medidas fitosanitarias que minimicen las perdidas económicas ocasionadas por diferentes efectos como son los agentes químicos o biológicos.

La utilización extensiva de compuestos químicos para el control de enfermedades, la emergencia de patógenos resistentes a fungicidas, y el deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la búsqueda de alternativa viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la producción agrícola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.

Desde 1980 Rhizhobacterias y hongos biocontroladores han sido investigados como posible alternativa de producción limpia. El empleo de agentes de control biológico (BCAs) ha permitido una reducción en la aplicación de fungicidas químicos y por lo tanto un control más eficiente de patógenos causantes de enfermedades, al ser incorporados a los programas de manejo integrado.

El hongo Trichoderma sp es un eficiente controlador biológico que está siendo ampliamente usado en agricultura como agente de biocontrol debido a su

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habilidad para colonizar sustratos rápidamente, inducir resistencia sistémica adquirida en plantas, promover el crecimiento vegetal y poseer actividad antagonista contra un amplio rango de hongos patógenos. El efecto inhibitorio de sus antibióticos y la degradación de componentes de la pared celular de patógenos de plantas, es citado como aspecto importante de su actividad antagonista.

Las especies de Trichoderma tienen una gran actividad antagonista sobre patógenos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de rábano, clavel, crisantemo, fríjol, cafeto, haba, tomate y cítricos entre otros. Durante los últimos años, varios investigadores y algunas empresas han

mostrado gran interés en estudiar el potencial de Trichoderma como

controlador biológico de patógenos de suelo.

En este contexto, el presente trabajo evaluó bajo condiciones de invernadero, la capacidad antagonista de aislamientos nativos y comerciales de Trichoderma spp frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani. Los resultados de esta investigación ayudaron en la obtención de información tanto en laboratorio como en campo sobre la acción potencial biocontroladora de este género.

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2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

El control biológico de enfermedades en plantas o insectos con agentes microbianos es una posibilidad atractiva, si se tiene en cuenta que los costos respecto al uso de otras prácticas de control tradicionales pueden resultar menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar en forma más lenta y en menor escala, su acción puede ser más estable y duradera que el control químico (Papavizas y Lewis, et al.1984).

El conocimiento concerniente al comportamiento de algunos hongos como antagonistas es esencial para su efectivo uso, debido a que pueden actuar contra organismos blanco de varias formas constituyéndose en una alternativa biológica al empleo de compuestos químicos convencionales, considerados nocivos para el medio ambiente (Jeffries y Young, 1994).

Mediante el uso de hongos y bacterias antagonistas se han podido conocer estrategias con mayor potencial para el control de enfermedades ocasionadas por patógenos del suelo (Cook y Baker, 1983). Muchas especies saprofitas como Trichoderma harzianum., Gliocladium spp., y Verticillium lecanii son antagonistas de varios organismos plaga, incluyendo patógenos de plantas, malezas e insectos (González et al., 1998). De otra parte sobreviven durante periodos relativamente largos como formas de resistencia, haciendo innecesaria la reinfección continua con el agente biocontrolador (Wainwright et al., 1995)

Las especies de Trichoderma han sido investigadas como agentes de control

biológico (BCAs) de enfermedades fúngicas por cerca de 70 años (Hjeljord y Tronsmo, 1998), pero es solo recientemente que las cepas han comenzado ha ser comercialmente aprovechables. El éxito de las cepas de Trichoderma como (BCAs) es debido a su alta capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir bajo condiciones ambientales desfavorables, eficiencia en la utilización de nutrientes, capacidad para modificar la rizósfera, fuerte agresividad contra

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hongos fitopatógenos y eficiencia en promoción de crecimiento en plantas e inducción de mecanismos de defensa (Benítez y Rincón 2004). Estas

propiedades han hecho que Trichoderma se presente en cualquier hábitat en

una alta proporción.

Las diferentes especies de Trichoderma se caracterizan por tener un

crecimiento micelial rápido y una abundante producción de esporas que ayuda a la colonización de diversos sustratos y del suelo. Así mismo pueden producir enzimas extracelulares, antibióticos antifùngicos, ser competidores contra hongos patógenos, promover el crecimiento en plantas, e inducir resistencia

(Zimand et al., 1996) Además compiten muy bien por nutrientes, son

micoparasitos muy activos y son competidoras muy eficientes de la rizosfera (Papavizas et al., 1985; Ahmad y Baker, 1987).

Liu y Baker en 1980 y Chet y colaboradores en 1987, demostraron que

especies de Trichoderma harzianum y T. hamatum fueron especialmente

eficientes en el control de patógenos como Rhizoctonia solani.

Varios aislamientos de Trichoderma harzianum se han utilizado exitosamente en el control de algunas enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani como: damping off en tomate (Rodríguez, 2002), pudriciones radiculares en plantas de fríjol (Gutiérrez et al., 2006), podredumbre negra de la raíz en fresa (Baldarrago,1999), pudrición del tallo en clavel ( García et al.,1998), pudrimiento de las raíces en habichuela ( Cardoso, et al., 1987 ) y mal del talluelo o damping off en el cafeto (Castro et al., 2005 ).

Además, se ha encontrado que algunas especies de Trichoderma,

especialmente Trichoderma harzianum tienen el potencial de aumentar el

crecimiento y desarrollo de las plantas; esto parece deberse a la inhibición de patógenos menores y a la producción de factores que estimulan el crecimiento de la planta y favorecen la toma de nutrientes (Widham et al., 1986; Chang et al., 1986; Chet, 1987; Baker, 1990).

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Los procedimientos por los cuáles se promueve la actividad de biocontrol contra fitopatógenos fúngicos se fundamenta sobre la activación de múltiples mecanismos entre los que se encuentran: la inactivación de las enzimas del patógeno, la competencia por el espacio y nutrientes, la secreción de metabolitos secundarios con efecto antibiótico y el ataque directo a otro hongo o micoparasitismo. Además indirectamente Trichoderma, es capaz de proteger a la planta del patógeno, mediante la inducción de sus sistemas de defensa ( Benitez, 2004 ).

2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma spp

Trichoderma sp, es un habitante natural del suelo, caracterizado por un comportamiento saprófito o parásito, propiedades que benefician su actividad antagónica. (Camargo, 2005). Es considerado un colonizador secundario dado su frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición, también es aislado comúnmente a partir de la superficie de raíces de varias plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos, debido a la competencia por nutrientes y micoparasitismo (Camargo et al., 2005).

Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rápido, que va formando una colonia delgada de sobre la superficie del agar, debido a la conidiación que presenta a través de su desarrollo. Las colonias al comienzo son lisas o casi transparentes y algunas veces blancas, posteriormente se presentan penachos blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa, responsable del pigmento característico. (Barnett, y Hunter, 1982).

Las especies del género Trichoderma presentan conidióforos complejos y

altamente ramificados en forma piramidal o cónica dando origen a esterigmas, con extremos ahusados. Al microscopio las fiàlides se observan más estrechas en la base que en la parte superior, permitiendo una buena correlación entre el sistema de ramificación del conidióforo y la disposición de estas. (Barnett, y Hunter, 1982).

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Microscópicamente muchas especies del género crecen rápidamente en cultivos artificiales y produce un largo número de pequeñas conidias verdes o blancas de células conidiogenas situadas al final de conidioforos extensamente ramificados. Esta característica permite una relativa fácil identificación de Trichoderma como género, pero el concepto de especies son difíciles de interpretar, y allí hay una considerable confusión sobre la aplicación de nombres específicos. Rifai dividió el género Trichoderma en nueve especies sobre la base de características morfológicas. Bisset, revisó el género y además incluyó algunas Hypocrea anamorfas en el género, resultando en el establecimiento de cinco nuevas secciones (Hermosa et al., 2000).

La abundancia de Trichoderma spp en varios suelos, junto con su habilidad para degradar varios sustratos orgánicos, su versatilidad metabólica y su resistencia a inhibidores microbianos, sugiere que este hongo puede poseer la habilidad para sobrevivir en varios nichos ecológicos, dependiendo de las condiciones que prevalezcan y sobre las especies involucradas. (Riegel y Nielsen, 1996).

Trichoderma spp se encuentra clasificado según Alexopulus et al., 1996 como: División: Eumycota Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Hypomicetes Orden: Hyphales Familia: Monilaceae Género: Trichoderma

Especie: Harzianum, hamatum, viride, longibranchiatum, entre otras.

2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma

El entendimiento de la diversidad genética de cada cepa dentro de las especies de Trichoderma y sus mecanismos de biocontrol ha permitido mejorar la

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aplicación de las diferentes cepas. Estos mecanismos son diversos, complejos y pueden actuar sinergicamente para lograr el control de enfermedades

(Howell et al., 2003).

Las diferentes especies de Trichoderma ejercen el biocontrol de una manera indirecta bien sea por competencia por nutrientes o espacio, antibiosis (producción de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o mediante la producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal y de una forma directa por micoparasitismo (Benítez, 2004).

Algunas especies del género Trichoderma son muy comunes en diversos

suelos, principalmente en suelos ácidos y ricos en materia orgánica. Estas especies son fáciles de aislar, de cultivar y de propagar en diversos sustratos y la mayoría presentan un buen micoparasitismo (Benítez, 2004).

A pesar de la cantidad creciente de investigaciones dedicadas a estudiar la actividad antimicrobial de Trichoderma spp ” in vitro“, el conocimiento de los mecanismos exactos responsables de la reducción en la incidencia de las

enfermedades, después de la aplicación de Trichoderma spp. es aún

insuficiente. (Yedidia et al., 1999).

2.2.1. Biocontrol por competencia

Fungistasis. Un buen antagonista es capaz de superar el efecto fungistático que resulta de la presencia de diferentes metabolitos producidos por otras especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo condiciones adversas o competitivas (Benítez, 2004).

Las cepas de Trichoderma crecen rápidamente cuando se inoculan en suelo ya que son naturalmente resistentes a muchos compuestos tóxicos incluyendo herbicidas, fungicidas y pesticidas tales como DDT, y compuestos fenólicos (Chet,1997) además recuperan muy rápidamente después de la adición de dosis subletales de algunos de estos compuestos.

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La resistencia a compuestos tóxicos puede estar asociada con la presencia en

cepas de Trichoderma de sistemas de transporte ABC (Harman et al., 2004).

Por esta razón son muy eficientes en el control de muchos patógenos como R. solani, Pythium ultimum o Sclerotium rolfsii, cuando se aplica en combinación con fungicidas químicos como el bromuro de metilo, benomyl, captan u otros químicos (Vyas et al., 1995).

2.2.2 Competencia por nutrientes

La inanición es la causa mas común de muerte para microorganismos, la competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control biológico de hongos fitopatògenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997).

Un ejemplo claro de este mecanismo de acción se encuentra representado en hongos filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de los mismos. Bajo condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreta agentes quelantes específicos de bajo peso molecular llamados sideroforos, que le permiten tomar el hierro en forma reducida (Eisendle et al., 2004), citado por (Chávez, 2004).

2.2.3 Antibiosis

La antibiosis ocurre durante la interacción de los compuestos difusibles de bajo

peso molecular o antibióticos producidos por cepas de Trichoderma que

inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Además las cepas de Trichoderma producen metabolitos tóxicos volátiles y no volátiles que impiden colonización por microorgansimos antagonizados; entre estos metabolitos, la producción de ácido harzianico, alameticinas, tricholinas, peptaiboiles, antibióticos, 6-penthyl pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas, ácido heptéldico y otros están siendo descritos (Howell et al., 1998).

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2.2.4 Micoparasitismo

El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetración subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma spp puede ejercer control directo por el rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y creciendo sobre el. (Benítez et al., 2004).

El proceso de micoparasitismo ejercido por Trichoderma se produce en varias etapas sucesivas. Comienza por el crecimiento quimiotrófico de Trichoderma hacia el hospedador, estimulado por moléculas procedentes del mismo, de naturaleza desconocida. Las únicas que se han detectado hasta ahora son aminoácidos y azúcares, por lo que no cabe esperar que la inducción sea específica del hospedador (Chet et al., 1981).

Los hongos del género Trichoderma se adhieren con carbohidratos unidos a lectinas en la pared celular del patógeno. Una vez Trichoderma es adherido se enrosca alrededor del patógeno y forma el apresorio (Howell, 2003). El paso siguiente consiste de la producción de CWDE´s, peptaiboles y enzimas hidrolíticas CWDE´s (Howell, 2003), lo cual facilita la entrada de la hifa de Trichoderma dentro del lumen del hongo parasitado y la asimilación del contenido de la pared celular. (Benítez et al., 2004).

Degradación de la pared celular: La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolíticas producidas por los microorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Se ha observado que Trichoderma spp, produce celulasas, glucanasas y quitinasas que degradan “in vitro “la celulosa de las paredes celulares de microorganismos oomycetes y la quitina y B-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos Deuteromycetes como Gliocladium spp (Elad et al., 1982).

El sistema quitinolìtico de Trichoderma comprende muchas enzimas y la lista de estos componentes inicia con la actualización de nuevas enzimas y genes

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-acetylglucosaminidasas (glucanasas ), endoquitinasas y exoquitinasas. De igual forma las (glucanasas) -1,3-glucanasas, así como las quitinasas actúan sinérgicamente, e inhiben la germinación de la espora y el crecimiento de algunos patógenos (Benítez, 1998; El-Katatny, 2001).

Se ha mostrado que 1,3 – glucanasas inhiben la germinación de esporas o el crecimiento de patógenos en cooperación sinérgica con quitinasas (Benítez, et al., 1998) y antibióticos (Harman et al., 2004).

2.2.5 Sinergismo

El sinergismo entre la actividad de enzimas líticas y antibióticos, es la mejor estrategia para ser un buen controlador, además de abrir el campo para posibles cepas transformantes que puedan producir las diferentes enzimas logrando un sinergismo que sea relevante (Benítez, 2004).

2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas 2.2.7 Modificación de la rizosfera

La habilidad para desarrollarse sobre o amplios rangos de condiciones externas de pH es un importante componente del complejo conjunto de características que Trichoderma, mejor adaptado a suelos ácidos, encuentra durante esta interacción con otros organismos. (Benítez et al., 2004).

Algunas cepas de Trichoderma harzianum controlan estrictamente su pH

externo, asegurando valores óptimos para su propias enzimas secretadas (Benítez et al., 2004). Así mismo Diferentes proteínas extracelulares son sintetizadas a diferentes valores de pH.

Las cepas de Trichoderma están siempre asociadas con raíces de plantas y ecosistemas de raíces. Algunos autores han definido las cepas de Trichoderma

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como plantas simbiontes oportunistas, organismos avirulentos, capaces de colonizar raíces de plantas por mecanismos similares a los de los hongos micorrizales y producir compuestos que estimulan el crecimiento como citoquininas, zeatinas y giberilinas (GA3) ó relacionadas con GA3; así como promover mecanismos de defensa en plantas. (Harman et al., 2004).

La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer raíces, penetrar y resistir metabolitos tóxicos producidos en respuesta a la invasión de organismos extraños, sean o no patógenos. (Benítez, et al., 2004). Así mismo Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíces y su desarrollo, productividad del cultivo, resistencia a estrés abiótico y la toma y uso de nutrientes (Arora y Elander, 1992) citado por Benítez 2004). La productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300%

después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii

(Benítez, 2004).

Se ha observado que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia sistémica en las plantas, ya que aplicadas en la rizosfera, producen protección contra patógenos del suelo o foliares. Esta resistencia viene acompañada en muchos casos de un aumento de actividades peroxidasa y quitinasas en zonas distantes de la raíz (Yedidia et al., 1999).

Las cepas de Trichoderma son generalmente más resistentes a compuestos como fitoalexinas, flavonoides y terpenoides, derivados fenólicos, agliconas que muchos hongos: sin embargo su habilidad a colonizar fuertemente raíces de plantas depende de la capacidad de cada cepa a tolerar estos. Esta resistencia es considerada un requerimiento esencial para la colonización de plantas, siendo asociada con la presencia de sistemas de transporte ABC en cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004).

Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, pepino, berenjena, arveja, rábano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodón, fríjol y pastos ornamentales (www.soil-fertility.com ).

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Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es así como (Yossen et al.2003), citado por (Castro y Rivillas 2006), demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el crecimiento de las plantas. Igualmente, (Inbar, et al 1994), citado por ( Castro y Rivillas 2006), observaron

que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se

incrementó significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, desde la etapa de germinador para obtener plantas vigorosas y sanas.

De la misma forma Se han realizado algunos estudios preliminares con Trichoderma para la estimulación del crecimiento sobre plantas de fríjol, donde los aislamientos seleccionados estimularon la germinación y presentaron un aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso de un 60% aproximadamente, lo que supone un incremento en los rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto Estrella demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un 30%.(www.soil-fertility.com ).

Se han evaluado parámetros de crecimiento y desarrollo del control de la enfermedad de R. solani por parte de Trichoderma spp. Estudios desarrollados (Rincón et al., 1991) demostraron el efecto antagónico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (Trichoderma 1644).

2.3 Trichoderma en el biocontrol

El biocontrol por parte de trichoderma en el manejo integrado de enfermedades en campo, causadas por hongos fitopatógenos, ha sido demostrada en su capacidad antagónica frente a agentes causales de pudriciones radiculares y

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marchitamientos como Rhizoctonia solani, Sarocladium sp y Sclerotinia sp en Arroz, Flores, Papa, Hortalizas, Frutales y Fríjol, Fusarium oxysporum en Clavel, Botrytis cinerea en Flores, Colletotrichum gloesporioides, causante de Antracnosis en Tomate de Árbol, Fresa, Fríjol y Flores; así como la reducción en la incidencia de la enfermedad llamada “pata prieta “, ocasionada por Phytopthora nicotianae var. nicotianae.

En 1990, Lewis, reportó que bajo condiciones de invernadero y de campo T. viride ejercía un control biológico promisorio sobre Rhizoctonia solani en cultivos de tomate.

Por su parte, Salmando en 1996, reportó que la técnica de pregerminación controlada de semillas de Tomate Variedad chonto, en presencia de T. koningii, es una alternativa promisoria para contrarestar el efecto de R. solani en condiciones de semillero, mostrando porcentajes de protección del 70 %, mientras que el tratamiento que consistía en semillas no pregerminadas y tratadas con T. koningii presentó sólo un 15 % de protección.

Así mismo Ochoa en 1996 determinó en condiciones de invernadero que la

utilización individual y combinada de T. hamatum, P.fluorescens y

Sterptomyces coelicolor, ofrecía un alto nivel de protección a claveles variedad Nora. Barlo contra Fusarium oxysporum.

Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, más versátil y polifacético que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo sea patógeno de ninguna planta. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hábitat, donde los hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos significativos de pesticidas y otros químicos. Además su gran variabilidad se constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico bajo diferentes

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Cuando se aplica Trichoderma en campo se deben tener en cuanta varios aspectos importantes que permitan su adecuada expresión, que se relacionan con la interacción planta hospedante – fitopatógeno susceptible – ambiente favorable (Temperatura del suelo, humedad, presencia de oxigeno, pH), Condiciones del suelo (estructura, contenido de materia orgánica y nutrientes) y tiempo ( Villegas, 2005).

Asi mismo existen algunos principios básicos de vital importancia para el éxito del control biológico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la importancia de un propágalo efectivo ( jóven, hifa de activo crecimiento ) en tenencia a una base de alimento, edad de la preparación, habilidad de los hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el patógeno; la consideración de la cantidad de preparación y el tiempo de aplicación, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y después de la aplicación. ( Lewis and Papavizas ). Varios Autores han realizado estudios

tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a R. solani. Rodriguez, en 2002 evaluó la eficiente acción inhibitoria de la

utilización de cepas de Trichoderma y Pseudomonas Como antagonistas

contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero.

La adición de hongos tales como Trichoderma y gliocladium antes de realizar la siembra, en suelos infestados por R. solani, disminuye de manera considerable la incidencia y severidad de las enfermedades que ocasiona este patógeno en la mayoría de los cultivos como la zanahoria, el frijol, el tomate, el clavel y la papa, en los cuales se ha intentado controlar el hongo. Al parecer el método da buenos resultados en el aumento de las poblaciones de Trichoderma y otros microorganismos que son antagonistas de Rhizoctonia solani y, quizá la liberación de algunos compuestos químicos fungitóxicos ( Agrios G, et al.,1998). De la misma manera Cook y Baker distinguen varias especies de Trichoderma: T hamatum, T viride, T harzianum, T. koningue y T. polyspermun, en el control de hongos fitopatógenos ( Chet I, et al.,1980).

(28)

2.4 Trichoderma como biofertilizante

En Colombia se han realizado algunos estudios enfocados a la optimización de parámetros para la producción de Trichoderma. Chávez, (2006) evaluó la producción de este hongo mediante fermentación sólida, líquida o bifásica empleando diferentes sustratos como arroz, avena, soya, trigo, cebada, entre otros y diferentes condiciones de temperatura y fotoperíodo. Los resultados indicaron que el proceso de fermentación sólida empleando como sustrato arroz–agua destilada a 25ºC y la exposición constante a la luz permitió mayor

recuperación (45x1018_{conidios/mL), con 88 y 96% de germinación a las 18 y}

24 horas respectivamente y una pureza estimada de 92.1%.

Este proceso representa una alternativa viable para producción tanto industrial como artesanal de un inoculante biológico de buena calidad a base del Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero, recién transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el crecimiento y desarrollo de las mismas.

Algunas industrias agrícolas y biológicas en Colombia como: agrobiológicos del campo Ltda, biológicos y ecológicos de Colombia y Orius biotecnología entre otros, han desarrollado productos biológicos para el agro, como biofertilizantes y biocontroladores de organismos fitopatógenos. Cepas específicas a base de

hongos como Trichoderma harzianum (exporaxx wp) desarrollada por Orius

Biotecnología, así como (Fitoripen wp) a base del hongo Trichoderma spp como agente microbial, desarrollado por saber agrobiológicos y Trichode wp de Orius biotecnología, han permitido la activación de mecanismos antagonistas frente a hongos fitopatógenos que afectan los cultivos de importancia agrícola.

Ahora bien, el conocimiento de estos nuevos biofertilizantes a base de

concentración de esporas a partir del hongo Trichoderma spp ha permitido el

desarrollo de estudios “in vivo” para la inducción de respuesta en plantas e incremento en la producción de cultivos.

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Brunner y Zeilinger, en 2005), en estudios “in vivo”, demostraron los progresos

del hongo de biocontrol Trichoderma atroviridae para la inducción de

respuestas de defensa en plantas de fríjol, frente al patógeno foliar B. cinerea, conteniendo 1x108 esporas/ml tipo salvaje.

Reynoso y colaboradores (2006), demostraron en estudios de biocontrol bajo condiciones de cultivo, que la aplicación de diferentes concentraciones de inóculo de T. harzianum (102 _{y 10}6_{), produjo un notable incremento en la}

cosecha de maní. Se encontró un incremento en el porcentaje de 45 a 76% en zonas naturalmente infestadas y de 57 a 95% en suelos artificialmente infestados, cuando las semillas fueron tratadas con T. harzianum 106_.

2.5 Rhizoctonia solani

Es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de plantas. Por lo general causa enfermedades en una amplia gama de hospederos, afectando tanto partes aéreas como subterráneas. Usualmente se le conoce como hongo estéril, debido a que durante muchos años se pensó que era incapaz de producir algún tipo de espora, ya fuera sexual o asexual. Actualmente se sabe que Rhizoctonia solani produce basidiosporas que hacen que esta especie sea un basidiomiceto al que se le denominó Thanatephorus cucumeris (Agrios, 2004). Un considerable número de aislamientos de Rhizoctonia son saprótrofos, aunque otros son micorrizales sobre orquídeas u otras plantas.

2.5.1 Biología de Rhizoctonia solani

Rhizoctonia solani según Agrios (2004) ha sido clasificado como: Hongo superior

Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Agonomycetes

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Orden: Agonomycetales (Myceliales) Género: Rhizoctonia

La especie R solani, fue definida por Candolle (1815), Sobre la base de la producción de esclerocios de textura uniforme con hilos hifales emanantes de estos, y la asociación del micelio con raíces de plantas vivas. (Sneh, et al, 1991). Es la especie más conocida dentro del género Rhizoctonia sp. Fue originalmente descrito en 1858 por Julis Kuhn (Barnett y Hunter 1982).

Dentro de las características que permiten clasificar taxonomicamente aislamientos de R.solani son: tendencia de pigmentación hifal café, ramificación próxima al septo distal de células en hifas vegetativas jóvenes, estrechamiento de hifa y formación de septos a una distancia corta del punto de origen a la ramificación hifal, Septo dolípora y células multinucleadas en hifa vegetativa joven (Parmeter y Whitney, 1970).

El anamorfo es denominado Rhizoctonia solani y su teleomorfo Thanatephorus cucumeris, es un basidiomiceto no productor de esporas asexuales (conidios) y productor ocasional de basidiosporas (esporas sexuales). En la naturaleza se reproduce asexualmente y se encuentra en forma de micelio vegetativo y/o esclerocios (Agrios, 2004). Macroscópicamente las colonias jóvenes de Rhizoctonia solani se caracterizan por ser incoloras, algodonosas y planas aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse la maduración, la colonia toma una coloración marrón (Ceresini et al., 1999).

Microscópicamente el micelio está constituido de hifas fraccionadas en células individuales polinucleadas y comunicadas entre si a través de un poro septal que permite el movimiento del citoplasma, las mitocondrias y los núcleos de una célula a otra (Ceresini et al., 1999). Características tales como células moniliales, esclerocio, hifas más grandes a 5 um en diámetro, rápida tasa de crecimiento y patogenicidad están usualmente presentes. Aunque puedan estar ausentes en algunos aislamientos.

(31)

Este hongo, parasiticamente no especializado forma escleorcios en el suelo sobrevive por largos periodos de tiempo en ausencia de hospederos, mediante tales estructuras o por medio de hifas de pared gruesa sobre residuos de plantas; al conservar estas características de patógeno no especializado, es un buen competidor saprofítico, puede colonizar muchos sustratos y puede tolerar cambios amplios de ambiente; esta condición le favorece tanto para su supervivencia como para su acción patogénica sobre tejidos juveniles o en stress fisiológico inadecuado (González et al., 1989 ; Contreras et al., 1996).

La especie fitopatógena Rhizoctonia solani ocasiona perdidas importantes, en la mayoría de plantas perennes y anuales, incluyendo casi todos los cultivos hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. Entre las enfermedades más comunes causadas por este fitopatógeno está el llamado damping-off o caída de las plántulas, como consecuencia del estrangulamiento y necrosis del tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Produce una reducción Significativa del vigor de las plantas y de la producción de tubérculos en cultivos de papa (Cedeño, 2001).

En clavel el marchitamiento lento fungoso causado por una raza de R. solani

produce una enfermedad que se caracteriza por la reducción en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente y la planta se marchita y muere. Al hacer un corte del tallo, se observa a nivel vascular una coloración marrón.

Para entender la relación que se establece entre patògenos y antagonistas, es necesario realizar estudios “in vivo e “in Vitro “, que permitan por una lado conocer a fondo los aspectos biológicos, bioquímicos y ecológicos de la interacción y por otro lado monitorear la actividad de los microorganismos biocontroladores en campo para enfocar de manera más precisa el control y manejo de la enfermedad.

(32)

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del problema

El incremento de enfermedades en plantas, causadas por un gran número de hongos fitopatógenos ha obligado a los agricultores a la aplicación de grandes cantidades de fungicidas e insecticidas químicos durante décadas. Este uso plantea una grave amenaza para la salud de los humanos y el medio ambiente, provocando la aparición de organismos resistentes a estos productos. La acción nociva de fungicidas químicos sobre los cultivos agrícolas ha originado entre otros problemas resistencias de plagas y patógenos, contaminación de los suelos y aguas de riego, de los animales y de los mismos seres humanos.

3.2 Justificación

La utilización de fungicidas químicos durante décadas para el control de enfermedades en cultivos agrícolas ha hecho inminente la búsqueda de alternativas amigables, que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre el medio ambiente. Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado al hombre a buscar metodologías de control, que contribuyan en la prevención o reducción de los efectos a corto o a mediano plazo de estos compuestos frente al daño ambiental.

El desarrollo basado en la conservación, debe proteger la estructura, función y la diversidad biológica de los sistemas naturales agrícolas, buscando mantener un equilibrio y un control de nuestro medio ambiente y los recursos naturales. Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de la agricultura. El manejo biológico y controlado de los cultivos, se presenta como una alternativa ecológica y eficaz frente a los numerosos y crecientes

(33)

problemas causados por microorganismos patógenos presentes en nuestro agro ecosistema.

Los hongos biocontroladores como Trichoderma spp ofrecen buenas

posibilidades como antagonista de hongos patógenos de plantas, actuando como hiperparasitos competitivos, de la misma manera debido a su ubicuidad, facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rápido en gran número de sustratos esta presente en todos los suelos agrícolas; sumado a la resistencia y persistencia de estos hongos en cultivos y cosechas, promueve una continua y progresiva investigación y análisis en estudios de control biológico de enfermedades en plantas.

En este contexto el presente trabajo evaluó la capacidad biocontroladora de algunos aislamientos nativos y comerciales de Trichodema spp. Frente al hongo fitopatógeno R. solani bajo condiciones de invernadero. Los resultados del presente estudio permitirán apoyar los programas de manejo integrado de plagas empleando tecnologías limpias y amigables con el medio ambiente.

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Evaluar la capacidad antagonista “in vivo” de 6 aislamientos Trichoderma frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani

4.2 Objetivos específicos

Confirmar la patogenicidad de un aislamiento de R solani sobre plantas de clavel.

Obtener inóculos de 6 aislamientos de Trichoderma y confirmar su viabilidad y pureza

Verificar la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el fitopatógeno R solani bajo condiciones “in vitro”

Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el hongo patógeno Rhizoctonia solani.

Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo “in vivo” con resultados obtenidos en condiciones “in vitro”

(35)

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Diseño de la investigación: 5.1.1 Ubicación

Este proyecto se desarrolló en la estación experimental San Francisco Javier ubicada en la vereda el Mortiño, municipio de Cogua Cundinamarca 61 Km al norte de la ciudad de Bogotá y las instalaciones del laboratorio de Microbiología ambiental y de suelos del Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.1.2 Microorganismos

Se utilizó un aislamiento nativo de Trichoderma ( T3 )aislado en trabajo previo el cual fue suministrado por el cepario de micologìa del Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana, 4 aislamientos provenientes de suelo de cultivos de flores de la sabana de Bogotá ( Tsp5 Tc1,Tv1,Ti1, y un aislamiento nativo procedente de bosque alto andino, suministrado por la Doctora Amanda Varela del Laboratorio de Ecología Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT).del departamento de biología

Para las pruebas de antagonismo se evaluaron aislamientos del patógeno Rhizoctonia solani suministrados por el laboratorio de fitopatología del Centro de Investigaciones Agroindustriales (CIAA) de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Se seleccionò un aislamiento por la capacidad de infectar esquejes de clavel de la variedad Everest.

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5.1.3. Material vegetal

Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo “in vivo” se utilizaron esquejes enraizados de clavel Dianthus caryophyllus suministrados por la compañía América flor.

5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma spp

Con el fin de determinar la estabilidad de las cepas durante el estudio y el mantenimiento de las condiciones iniciales, se realizó un banco de trabajo a

partir de 6 aislamientos de Trichoderma evaluados por Cháves 2004 y que se

encuentran conservados a -70o_{C. A partir de los aislamientos, se realizaron}

repiques sobre agar papa dextrosa (PDA).

De cada uno de los aislamientos se preparó una suspensión con una concentración igual a 108 esporas/ml, en un volumen final de 10ml en PBS. Esta suspensión se utilizó posteriormente como inóculo 10% para la

fermentación discontinua de 24-48 horas, 100rpm, y una temperatura de 25OC

en caldo papa dextrosa, en un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.

La evaluación del crecimiento, viabilidad y evaluación de cada una de las cepas, se realizó mediante cultivo en placa, tinción con azul de lactofenol, y microcultivo de acuerdo al método propuesto por Sergey et al., 2000.

Guevara y Urcia en 2002 demostraron que se puede realizar la fermentación discontinua, en un Erlenmeyer de 250ml conteniendo caldo papa dextrosa con

10 ml de una suspensión conidial en una concentración de 108_{conidias/ml. El}

cultivo se incubó a una temperatura de 28°C por 48 horas con agitación a 100 rpm logrando así un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.

(37)

5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma.

Para evaluar el crecimiento libre de cada uno de los 6 aislamientos del antagonista, a partir de los aislamientos crecidos en tubos de vidrio de (16X150), se realizó un repique en cajas de PDA hasta obtener un crecimiento radial de 90mm aproximadamente. Posteriormente se tomaron discos de 0.5cm de diámetro de zonas de crecimiento similares y serán sembradas sobre PDA (Cundom, 2003)

Para cada cepa de Trichoderma en estudio se tomaron por triplicado datos sobre el crecimiento radial en mm a las 24, 48, 60 y 72h.

5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani

Para la preparación del inóculo de Rhizoctonia solani se tuvieron en cuenta su crecimiento en agar papa dextrosa durante 7 días. El micelio del hongo se resuspendió en agua destilada esterilizada, hasta obtener 103 _{UFC/ml en PDA.}

5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro

Previo al enfrentamiento del patógeno y el antagonista Trichoderma spp, se evaluó el crecimiento libre en el centro de la caja de petri con agar PDA del

patógeno Rhizoctonia solani y los seis aislamientos del antagonista

Trichoderma spp ( T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1, T235 ). Se inoculó por triplicado en cada caso en el centro de la caja de petri.

5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo

Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de Trichoderma, sobre el patógeno Rhizoctonia solani, se aplicó un diseño completamente al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental correspondió a una caja de Petri con agar PDA.

(38)

Para las pruebas de enfrentamiento se tomarán discos de 0,5cm de diámetro obtenidos a partir de propágulos del patógeno (crecimiento libre), y se sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centímetro del borde de la caja (Cundom, et al., 2003).

Este procedimiento se realizó por triplicado. Después de 24 horas de incubación a una temperatura de 28°C el patógeno Rhizoctonia solani fue sembrado a 1cm del borde de la caja pero en posición opuesta un disco de 0,5cm de diámetro del antagonista (Cundom, et al., 2003; Holmes, et al., 2004).

5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”

Esta prueba se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero en un sustrato de Cascarilla/Turba 3.1. Se utilizaron los aislamientos Trichoderma T3.

TrichodermaTsp5, TrichodermaTc1, TrichodermaTV1, Trichoderma Ti1 y TrichodermaT235.

Para evaluar la capacidad antagónica de los 6 aislamientos de Trichoderma se utilizaron esquejes enraizados de clavel. Está prueba se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero en materos con Cascarilla/Turba humedecida.

Los esquejes fueron inicialmente inoculados por inmersión de las raíces lesionadas levemente en una suspensión de Rhizoctonia solani por 5 minutos. Posteriormente cada uno de los esquejes de clavel infectados con el patógeno, fueron colocados individualmente en materos con la mezcla de cascarilla: turba.

Una vez inoculado el patógeno, después de 48 h, se realizó la aplicación al

suelo con una suspensión de 108 _{conidias/ml de cada uno de los aislamientos}

de Trichoderma spp. (Tabla 1). La concentración de conidias se ajustó utilizando la cámara de Neubauer.

Luego de ser inoculado el material vegetal con el patógeno y el sustrato con el antagonista, cada cuatro días se realizaron registros de: altura de la planta,

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incidencia de la enfermedad (% de plantas vivas), longitud de la raíz, peso seco de la parte aèrea y de raìz, número de hojas, color y apariencia de las plantas.

El peso seco total, de la parte aérea y de raíz del material previamente medidio,

se determinó mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55Oc durante 48

horas.

La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo, durante todo el ensayo.

5.3 Diseño experimental

El ensayo de antagonismo “in Vitro” se realizó por triplicado para cada uno de los tratamientos.

El ensayo de antagonismo in vivo se desarrolló empleando esquejes de clavel (Dianthus caryophyllus) La metodología del ensayo se desarrollará con un diseño completamente al azar con 3 repeticiones para cada tratamiento.

Cada tratamiento constará de 24 plantas de clavel para cada uno de los 9 tratamientos.

Tratamiento nomenclatura Controlador Patógeno 1 T3 Aislamiento nativo (PUJ) R. solani 2 Tsp5 Cultivo de Flores R. solani 3 Tv1 Cultivo de Flores R. solani 4 Tc1 Cultivo de Flores R. solani 5 Ti1 Cultivo de Flores R. solani 6 T-235 Aislamiento nativo ( LESYHT) R. solani 7 Control infecciòn --- R. solani 8 Control Trichoderma Trichoderma Tsp --- 9 control Ccto --- ---

(40)

5.4 VARIABLES DE ESTUDIO

Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 dìas registros de:

Altura de la planta Longitud parte aérea Longitud raíz

Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas

)

Síntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos. Peso fresco total

Peso seco parte aérea Peso seco de raíz Peso seco total

Los tratamientos control corresponden a:

Control de infección: Plantas con el patógeno Rhizoctonia solani Control de crecimiento: Plantas sin patógeno ni antagonista Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235

Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los análisis “ in Vitro como para los “ in vivo “.

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La expresión de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de metabolitos difusibles y altamente tóxicos de carácter enzimático (Celulasas, Quitinasas y Proteasas) acompañados por otros compuestos encargados de la inhibición del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles, antibióticos, 6-pentil- -pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas, acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limón, et al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son motivos para la utilización de este microorganismo como antagonista, para el control de fitopatógenos.

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) ( * "+ +,!'"

AISLAMIENTO 24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS

T3 15,33 56,33 62,33 TSP5 14,00 36,33 48,67 TV1 12,00 27,67 42,00 TC1 11,00 30,33 40,00 Ti1 14,33 33,67 41,00 T235 24,00 61,67 63,67 ) ( * "+ +,!'"

(43)

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Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer este hongo fitopatógeno cuando encuentra acción directa sobre ó sin la eficiente acción biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13). Barrera et al.,1997, afirman que la aparición de los primero síntomas, se ve influenciado por la agresividad del aislamiento del patógeno.

Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un crecimiento a nivel radicular y de la parte aérea progresivo en el tiempo y mayor al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue menor, en comparación con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14).

(44)

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Por otra parte, la acción positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve

reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y

calidad en los esquejes, así como un mayor crecimiento total, al ser comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de infeccion presentó los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G), amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes.

Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las raíces de las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los demás tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion (Figuras 13ª y 13H). Esto confirma además los resultados obtenidos al evaluar

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el crecimiento libre in vitro donde se observó que los aislamientos T3 y T235 tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patógeno R.solani (Tabla 3, Figura 3).

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(46)

En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepción de Tsp5, muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento aéreo y radicular, así como ausencia de signos o síntomas de la enfermedad por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani. Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte aérea y radicular en el control con Trichoderma, el cual muestrà un crecimiento de 16,1 cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control con el patógeno el cual mostrò para estas mismas variables, resultados de 15,3 cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados coinciden con los descritos por López et al., 1999, el cual establece que

Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas, que actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemáticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no han sido tratadas con dicho microorganismo.

De la misma forma que lo observado al día 15, en el día 19, la patogenicidad del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia débil de los esquejes y una menor tasa de crecimiento, además se presentó amarillamiento, marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19). Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este tiempo, respecto a la longitud de la parte aérea, ( Figura 10), donde se manifiesta que la acción patógenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ). Los síntomas observados en las plantas de clavel en el día 19, han sido reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978,

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quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reducción en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera.

En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicación de los diferentes

aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel,

así como de la acción antagonista ejercida por los diferentes tratamientos frente al hongo fitopatógeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05) con relación al control de infección.

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Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los mayores valores de longitud de la parte aérea, longitud total y peso fresco total (Figuras 10 y 13 y 15) así como altos valores en cuanto a la longitud radicular (Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con mejor apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1,