Tesis Doctoral
Papel fundamental de cFLIP en el control de la
apoptosis en células epiteliales de mama
Rosario Yerbes Cadenas
Enero, 2010
Centro Anadaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER).
Dr. Abelardo López Rivas, Profesor de Investigación del
Consejo Superior de Investigaciones Científicas y miembro del Centro
Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER),
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Papel fundamental de cFLIP en el
control de la apoptosis en células epiteliales de mama” presentado
por Doña Rosario Yerbes Cadenas, para optar al Grado de Doctor por
la Universidad de Granada, ha sido realizado bajo su supervisión en
el Centro Andaluz de Biología Molecular Y Medicina Regenerativa y
reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea
defendido ante el tribunal correspondiente.
Y, para que conste a los efectos oportunos, expido y firmo el
presente certificado en Sevilla a de 200
Fdo: Dr. Abelardo López Rivas
I. Abreviaturas………. 1
II. Resumen……….. 4
III. Introducción………... 7
1. Mecanismos de muerte celular
………... 8
2. Apoptosis
……… 12
3. Mediadores de la apoptosis. Caspasas
………. 15
3.1 Características y organización estructural
…………. 15
3.2 Clasificación ………. 16
3.3 Activación……… 19
3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras……… 19
3.3.2 Activación de caspasas ejecutoras………. 20
3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs……… 21
3.5 Otros mecanismos de regulación……….. 24
4. Rutas de apoptosis……… 26
4.1 Ruta Intrínseca o mitocondrial……… 26
4.4.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis……….. 26
4.1.2 Familia de proteínas de Bcl-2………. 28
4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte…………. 33
4.2.1 Señalización mediada por TNFR1/TNF………… 36
4.2.2 Señalización mediada por Fas/FasL………. 39
5. Señalización mediada por el ligando de muerte TRAIL
…. 42
5.3 Señalización no apoptótica mediada por TRAIL………. 47
5.4 TRAIL y cáncer………. 47
6. FLIP
……….. 51
6.1. Estructura molecular de FLIP………. 51
6.2. Regulación de la expresión de cFLIP………. 53
6.2.1 Regulación de la síntesis de cFLIP………. 53
6.2.2 Regulación de la degradación de cFLIP………….. 55
6.3 Funciones de cFLIP……….. 57
6.3.1 Inhibición de la apoptosis ……… 57
6.3.2. Proliferación celulas. Activación de las células T…. 59
6.3.3. Adhesión y migración celular……….. 61
6.3.4. Fenotipo del ratón deficiente para cFLIP………… 61
6.3.5 Regulación de la autofagia ………. 62
6.3.6. cFLIP y cáncer……….. 62
7. Desarrollo morfogenético del epitelio glandurar de mama... 64
IV. Objetivos……….. 70
V. Materiales y Métodos……… 72
VI. Resultados……….. 96
1.Sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Papel de cFLIP……… 96
1.1 Doxorrubicina y SAHA sensibilizan a células de cáncer
de mama a la apoptosis inducida por TRAIL……… 96 1.2 cFLIP juega un papel fundamental en la resistencia depor la sensibilización de células de cáncer de mama a TRAIL….. 112
2. Papel de cFLIP en la supervivencia celular……….. 115
2.1 La disminución de cFLIP por RNA de interferencia induce apoptosis en células de cáncer de mama………. 115
2.2 La bajada de expresión de cFLIP por siRNA induce apoptosis en células epiteliales no transformadas de mama MCF-10A . … 118
2.3 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA requiere del receptor de TRAIL, TRAILR2…… 120
2.4 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP es independiente de ligando……….. 122
2.5 Los componentes del DISC de TRAIL, FADD y Caspasa-8 participan en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP……… 124
2.6 La muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP siFLIP requiere la ruta mitocondrial de apoptosis…………. 126
2.7 cFLIP regula la morfogénesis de células epiteliales de mama .. 130
3. Regulación de la expresión de cFLIP……… 140
3.1 Regulación de la degradación de cFLIP
……… 140
3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP……….. 144
VII. Discusión……….. 150
VIII. Conclusiones……….. 165
ABREVIATURAS.
3D : Tridimensional
ADN: Ácido desoxirribonucléico
AIF: Factor inductor de apoptosis (Apoptotic Inducing Factor)
APAF-1: Factor 1 activado por proteasas apoptóticas (Apoptotic Protease-Activating Factor-1)
APS: Persulfato de amonio (Amonium Persulfate) ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ATP: Adenosina 5´-trifosfato
BH: Dominio de homología de las proteínas de la familia de Bcl-2 (Bcl-2 Homology)
BIR: Repetición IAP del baculovirus (Baculoviral IAP repeat) BSA Seroalbúmina bovina
CARD: Dominio reclutador de caspasas (caspase reruitment domain) CHX: Cicloheximida
CRD: dominio rico en cisterna, de la región extracelular de receptores de la familia de TNF (cystein rich domain)
DAPI: Diaminofenilindol (4´,6-diamidino-2-phenylindole) DcR: Receptor señuelo (decoy deceptor)
DD: Dominio de muerte (death domain)
DED: Dominio efector de muerte (death efector domain)
DISC: Complejo inductor de señales de muerte (death inducing signalling complex)
DMEM: Dubelco’s modified Eagle’s medium DMSO: Dimetilsulfóxido
DEPC: Dietilpirocarbonato DTT: Ditiotreitol
ECL: Reactivo quimioluminiscente (Enhanced chemiluminiscence) EDTA Etinildiaminotetraacetato
EGF: Factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor) FBS: Suero fetal bovino (foetal bovine serum)
HRP: Peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase)
IAP: Proteínas inhibidoras de apoptosis (inhibitor of apoptosis proteins) IFN: Interferón
KDa: Quilodaltons mg: miligramo ml: mililitro mM: milimolar
NF-κB : Factor nuclear kappa B (Nuclear factor Κappa B) ng: nanogramo
nm: nanometros nM:nanomolar
OPG: Osteoprotegerina
PARP: Poli-ADP-ribosa polimerasa
PBS: Tampón fosfato (Phosphate-buffered saline) PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PMSF: Fenilmetil sulfonil fluoruro (Phenylmethyl sulphonyl fluoride) PS: Fosfatidilserina
rpm: revoluciones por minuto
RT-PCR: Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa
shRNA: ARN de bucle corto (Short hairpin RNA)
siRNA : Pequeño ARN de interferencia (Small interfering RNA) TA: Temperatura ambiente
TE: Tris- DTA
TNF: Factor de necrosis tumoral (Tumor necrosis factor)
TRAIL: Ligando inductor de apoptosis de la familia de ligandos TNF (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)
μg: microgramo μl: microlitro μM: micromolar
RESUMEN.
TRAIL es un ligando de muerte de la familia de TNF con un gran potencial terapéutico contra el cáncer, debido fundamentalmente a que es capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin provocar toxicidad en células normales. Sin embargo, existen algunos tipos de células tumorales, como las de mama, que presentan resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL por causas no bien conocidas.
En esta tesis se ha estudiado el papel que cFLIP, proteína inhibidora de la apoptosis inducida por ligandos de muerte, juega en la resistencia de células tumorales de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Así, hemos determinado que cFLIP es un componente clave en la resistencia de estas células a TRAIL, puesto que la inhibición de su expresión mediante tratamientos como Doxorrubicina (antraciclina muy utlizada en quimioterapia del cáncer) o SAHA (inhibidor de deacetilasas de histonas), así como el silenciamiento de su expresión mediante oligonucleótidos de ARN de interferencia (siRNA) de cFLIP, sensibilizan a todas las células tumorales de mama testadas a la apoptosis inducida por TRAIL.
Además, hemos demostrado que cFLIP es también una proteína clave en la viabilidad de las células epiteliales de mama, tumorales o no, puesto que la inhibición de su expresión induce apoptosis. Esta apoptosis requiere de los componentes de la señalización apoptótica de TRAIL, como son el receptor TRAIL-R2, la molécula adaptadora FADD y la caspasa-8, pero es independiente del propio TRAIL.
Por otra parte, y en vista de la importancia de cFLIP en el control de la apoptosis, se ha estudiado la participación de cFLIP durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A, proceso en el que la apoptosis tiene un papel fundamental. Así una expresión elevada de cFLIPL
células cuando son cultivadas en presencia de matriz extracelular (cultivos 3D). Por otra parte, la inhibición de la expresión de cFLIP impide el desarrollo de acinos, debido probablemente a que las células que no expresan suficientes niveles de cFLIP no son viables.
Por ello, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP ha sido de gran interés en este trabajo. Así hemos determinado, que la ruta de señalización PI3K/AKT no es la principal responsable del mantenimiento de la expresión de cFLIP en células tumorales de mama, y apuntamos a que, posiblemente, la ruta de NF-kB sea una de las implicadas en ello. Además, hemos demostrado que el sistema ubiquitina-proteasoma, juega un papel fundamental en la degradación celular de cFLIP y, actualmente, trabajamos en la descripción de la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de la degradación de cFLIP por dicho sistema.
INTRODUCCIÓN.
1. MECANISMOS DE MUERTE CELULAR.
La muerte celular puede ser clasificada de acuerdo a sus características morfológicas (apoptosis, necrosis, muerte celular autofágica o muerte celular asociada con mitosis), de acuerdo a criterios enzimológicos (con o sin participación de nucleasas o de diferentes tipos de proteasas como caspasas, calpainas, catepsinas y transglutaminasas), de acuerdo a aspectos funcionales (muerte celular programada o accidental, fisiológica o patológica) o de acuerdo a características inmunológicas ( inmunogénica o no inmunogénica). Es por ello que el Comité de Nomenclatura de Muerte Celular (Nomenclature Commitee on Cell Death, NCCD) ha propuesto una clasificación y definición actualizada de las diferentes modalidades de muerte celular que se han descrito hasta el momento y que, brevemente, se describen a continuación [2] [1]:
Apoptosis: muerte celular programada con características morfológicas, como son el redondeamiento de las células, la retracción de pseudópodos, reducción del volumen celular y nuclear (pyknosis), fragmentación nuclear (karyorrhexis), división de la membrana plasmática en vesículas, aunque sin pérdida de su integridad física (blebbing) y la fagocitosis de la célula, in vivo. Algunas de sus características bioquímicas son la activación de caspasas, de proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2, pérdida de potencial mitocondrial, fragmentación del ADN y exposición del lípido fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plásmatica, entre otras. La apoptosis no debe considerarse sinónimo de muerte celular programada, porque existen otros tipos de muerte celular programada que no tienen las características morfológicas de la apoptosis. Tampoco debe considerarse sinónimo de activación de caspasas, ya que la activación de estas también
puede estar asociada a procesos biológicos no letales, aunque para la adquisición de las características apoptóticas se requiera de las caspasas. Muerte celular que cursa con autofagia: morfológicamente se define como un tipo de muerte celular que ocurre en ausencia de condensación de la cromatina pero acompañada por una masiva vacuolización autofágica. Al contrario que las células apoptóticas, las células que mueren con morfología autofágica, no tienen asociación o muy poca con los fagocitos. Como el propio nombre indica esta muerte cursa con autofagia y no debe asumirse que la autofagia es la ejecutora de esta muerte, ya que en principio, la autofagia es un mecanismo de supervivencia celular, como lo indica el hecho de que la inhibición de la autofagia acelera el proceso de muerte celular. Necrosis: muerte celular caracterizada por un aumento de volumen de los orgánulos y del citoplasma celular, moderada condensación de la cromatina y rotura de la membrana plasmática con la consecuente pérdida del contenido intracelular. Muchos orgánulos y procesos celulares se han descrito como mediadores de la muerte celular necrótica, pero aún no está muy claro cúal es la relación existente entre unos y otros. Estos fenómenos incluyen alteraciones mitocondriales (producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), permeabilización de la membrana mitocondrial), cambios lisosomales (producción de ROS por reacciones Fenton, permeabilización de la membrana lisosomal), cambios nucleares (hiperactivación de PARP-1), degradación de lípidos, incremento en la concentración citosólica de calcio (que provoca la activación de proteasas como las calpaínas y las catepsinas). La necrosis siempre se ha considerado como una muerte celular accidental no programada, pero actualmente se están acumulando evidencias de que la muerte celular necrótica puede estar finamente regulada. Así receptores de muerte (TNF-R1, Fas, TRAIL-R) y receptores Toll-like, son capaces de inducir necrosis en presencia de inhibidores de caspasas, principalmente.
Esta muerte celular inducida por estos receptores parece depender de la proteína quinasa RIP1, y se puede inhibir con necrostatinas. Por tanto, se ha propuesto el término de necroptosis para distinguir este tipo de necrosis regulada de la que no lo está.
Cornificación: es una muerte celular programada, específica de la epidermis, morfológica y bioquímicamente diferente de la apoptosis. Este proceso permite la formación de corneocitos, que son queranocitos muertos con una mezcla de proteínas y lípidos necesarios para la resistencia mecánica, elasticidad y estabilidad estructural de la epidermis.
Otras modalidades de muerte celular:
Catástrofe mitótica: muerte celular que ocurre durante o justamente después de una mitosis fallida. Se acompaña de características morfológicas que incluyen la micronucleación (fragmentos de cromosomas que no han sido bien repartidos entre las células hijas) o multinucleación, debido a una incorrecta separación de núcleos. El hecho de que este fenómeno pueda
Figura 1. Morfología de la muerte celular. A) Célula epitelial humana en necrosis. Se observa rotura de la membrana plasmática y pérdida de la integridad mitocondrial. B) Células epitelial humana en apoptosis. Se observa condensación de la cormatina e intergridad de la mitocondria. C) Célula epitelial humana en autofagia. Se observa una morfología normal del núcleo y la formación de vesiculas autofágicas con contenido citoplasmático.
D) Amplificación de C) donde se ve la doble membrana característica de las vacuolas de autofagia. Adaptado de Kroemer y El-Deiry, 2005 [1])
expresión “muerte que ocurre durante la metafase” por ser más preciso e informativo.
Anoikis: apoptosis inducida por la pérdida de adhesión al sustrato o a otras células. Sin embargo hay que tener en cuenta que otros procesos de muerte celular pueden darse tras la pérdida de adhesión al sustrato que no tienen características apoptóticas.
Entosis: define una modalidad de muerte celular en la que una célula es internalizada por otra célula vecina y, posteriormente, desparece mediante degradación lisosomal. La entosisis no es inhibida por Bcl-2 ni por Z-VAD-fmk. Se ha descrito que células de cáncer de mama MCF-7 sufren entosis cuando se les priva de adhesión al sustrato.
Paraptosis: este término se introdujo para describir un tipo de muerte celular programada con características morfológicas y bioquímicas diferentes de la apoptosis. En muchos tipos celulares la paraptosis se pude disparar por el IGFR-1 (insulin-like growth factor receptor 1) y cursa con una extensiva vacuolización citoplasmática y aumento del volumen mitocondrial. No puede inhibirse por Bcl-2 ni por inhibidores de caspasas y en su señalización están implicados miembros de la familia de MAPK. En la actualidad no está muy claro si la paraptosis representa un tipo de muerte celular realmente diferente a las demás.
Piroptosis: esta forma de muerte celular ha sido descrita principalmente en macrófagos e implica la activación de la caspasa-1 y la liberación de IL-1β y de IL-8, citoquinas implicadas en el proceso inflamatorio. Los macrógafos que sufren piroptosis presentan características morfológicas de la apoptosis y de la necrosis
.
2. Apoptosis.
La apoptosis tiene un papel fundamental en el desarrollo y en la homeostasis de todos los organismos multicelulares [3]. Estos dependen de la apoptosis para eliminar células que deben ser remplazadas, que no se necesitan más o que están irreparablemente dañados [4]. El término “apoptosis” fué acuñado porKerr, Wyllie y Currie en1972 para describir un modo de muerte celular con
ciertas características morfológicas [5], [6]. No fue
hasta los estudios desarrollados en el nemato C.
elegans cuando se descubrió
que la apoptosis, además, era un proceso de muerte controlado genéticamente [7] [8]. Los principales componentes de la maquinaria apoptótica en C.
elegans son tres proteínas
CED (Cell death abnormal) llamadas CED-3, CED-4 y CED-9 [9] [10]. El inicio de la apoptosis se da con el aumento
de expresión génica de egl-1. La unión de EGL-1 a la proteína antiapotótica CED-9 la libera de la unión a la proteína adaptadora CED-4, quien se une y activa a CED-3, proteína con actividad proteasa, la cual degrada múltiples componentes celulares dando lugar a la muerte celular [11] [12]. En humanos, las proteínas homólogas a las proteínas CED, están presentes en
Figura 2. Expansión evolutiva de la maquinaria apoptótica. Adaptado de Alexei Degterv, Nat. Rev. 2008.
las proteínas de la familia de Bcl-2, proteínas APAF-1/NLR y la familia de las caspasas. El mecanismo apoptótico es similar al de C.elegans aunque mucho más complejo (Figura 1). Por ejemplo, aunque el aumento transcripcional de miembros pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2 puede iniciar la apoptosis [13], muchos otros miembros pueden ser activados por diferentes mecanismos como rotura, fosforilación, ubiquitinación y miristoilación [14] [15] [16] [17]. Además, en humanos, la apoptosis también puede iniciarse por una familia de proteínas denominada receptores de muerte, que no están presentes en C.elegans [18].
Con todos los datos obtenidos hasta la actualidad se puede hacer una caracterización secuencial tanto morfológica como bioquímica de los eventos que se dan durante la apoptosis (Figura 3), que de forma resumida sería: tras la inducción de apoptosis, se produce la condensación del citoplasma y la compactación de la cromatina dando lugar a la formación de densos agregados que se deslocalizan para situarse junto a la membrana nuclear. Posteriormente, sobre la cromatina actúan las endonucleasas que cortan el ADN en fragmentos olionucleosomales de 180pb (o múltiplos de estos). Se produce la dilatación del retículo endoplásmico que origina la formación de vesículas que tienden a unirse a la membrana plasmática adquiriendo una forma característica en burbujas (blebbing). Finalmente, la célula se divide en los llamados cuerpos apoptóticos. Estos, son rápidamente reconocidos y fagocitados por los macrófagos y otras células vecinas impidiendo una exposición del material intracelular al sistema inmune, que podría provocar una respuesta inflamatoria.
Los fagocitos pueden reconocer a las células apoptóticas por diversas características. El fosfolípido fosfatidilserina (PS), que normalmente se encuentra en la cara interna de la membrana citoplasmática, se transloca a la cara externa en la fase temprana de la apoptosis, [19] siendo la exposición de
la fosfatidilserina esencial para el reconocimiento de la célula apoptótica por los macrófagos [20] [21] [22]. La anexina I es otra molécula que se expone en la superficie de la célula apoptótica. También se pueden producir modificaciones en proteínas de membrana como ICAM-3 y CD31, así como cambios en la composición de azúcares y en la carga eléctrica de la superfice celular [23] [24] .
La crítica importancia de la apoptosis para la homeostasis de los tejidos tiene implicaciones patológicas. Una excesiva apoptosis contribuye en diferentes enfermedades como el SIDA, Alzheimer, enfermedad de Huntington, isquemia cardiaca y daños renales. De forma contraria, una deficiencia en apoptosis es el componente clave en el desarrollo de enfermedades autoinmunes y cáncer [4]. Por ello, las estrategias terapeúticas
áreas más prolíficas a este respecto han sido el desarrollo de agentes antitumorales. Una de las características de la activación de la apoptosis como herramienta antitumoral es su potencial de inducir regresión del tumor más que inhibir su crecimiento.
3. Mediadores de la Apoptosis. Caspasas.
3.1. Características y organización estructural.Las caspasas constituyen una familia de enzimas muy conservadas en la evolución y son los componentes centrales de la respuesta apoptótica. Las caspasas son una familia de cistein-proteasas en cuyo sitio catalítico es esencial un residuo de cisteína y que cortan sus sustratos después de un residuo de aspártico, de ahí su nombre (cysteine-dependent aspartate specific protease). En 1993, se demostró que el gen ced-3, esencial en la apoptosis de C.elegans, codicaba una proteína cistein-proteasa homóloga a la enzima convertidora de Interleuquina-1β de humanos [25] (Cerretti et al 1992) [26] [27]. La sobrexpresión de esta enzima, renombrada Caspasa-1, era suficiente para inducir apoptosis en mamíferos [28]. A partir de entonces se han descrito más miembros homólogos pertencientes a esta conservada familia de proteínas en organismos como, el díptero Drosophila melanogaster [29], el lepidóptero Spodoptera frugiperda [30], e incluso la levadura
Saccharomyces cerevisiae [31]. En humanos existen 11 genes que codifican para
11 caspasas, de la caspasa-1 a la 10 y la caspasa 14 (esta sólo se expresa en queranocitos) [32]. Las caspasas se sintetizan en las células como zimógenos inactivos que contienen un prodominio N-terminal, una subunidad grande (p20) y una subunidad pequeña (p10). El centro catalítico se sitúa en la subunidad p20 y contiene un residuo de cisteína (285), que forma parte de una secuencia de cinco aminioácidos muy conservados “QACXG” [33]. El sitio de unión al sustrato lo forman tanto la subunidad p20 como la p10,
pero el residuo determinante para la especificidad del sustrato lo contiene la subunidad p10. La activación del zimógeno por proteolisis, separa el prodominio y la subunidad grande de la pequeña y, posteriormente, el prodominio es eliminado. La forma activa de las caspasas consiste en un homodímero formado por dos monómeros que contienen una subunidad grande y una pequeña y que poseen, por tanto, dos sitios catalíticos. Las caspasas reconocen en sus sustratos una secuencia de al menos cuatro aminoácidos P4-P3-P2-P1 y cortan después del aminoácido carboxi-terminal, el P1, que es un residuo de Aspártico. [6]. El residuo P3 suele ser una glutamina, y los residuos P2 y P4 son variables, por lo que la secuencia de especificidad de corte de una caspasa puede ser X-Glu-X-Asp. Los aminoácidos de la enzima que se unen al sustrato y que, por tanto, reconocen la secuencia P4-P3-P2-P1 se denomina S4-S3-S2-S1. S1 y S3 son residuos muy conservados en las diferentes caspasas, al contrario que S2 y S4, que varían significativamente entre las caspasas y originan las diferentes especificidades por el sustrato en las posiciones P2 y P4
.
3.2 Clasificación.
Tradicionalmente las caspasas humanas se han dividido en dos grupos bien diferenciados en base a su función: caspasas pro-inflamatorias (caspasa-1, -4, -5, -1(caspasa-1, -12), que regulan la maduración de las citoquinas durante el proceso inflamatorio y caspasas proapoptóticas (caspasa2, 3, 6, 7, 8, 9, -10), que son la maquinaria ejecutora de la apoptosis. Sin embargo actualmente esta clasificación no es del todo exacta ya que la activación de las caspasas pro-inflamatorias puede derivar en piroptosis, una modalidad de muerte celular asociada con una masiva activación de células inflamatorias y, además, recientemente se están describiendo funciones de las caspasas apoptóticas no relacionadas con la apoptosis sino con
proliferación, diferenciación y migración celular [34] [6] o incluso como supresoras de tumores, como es el caso de la caspasa-2 [35].
De igual forma, las caspasas apoptóticas se han divido en dos grupos: caspasas iniciadoras (-2, -8, -9, -10) y caspasas efectoras (-3, -7,-9) (Figura 4). Las capasas inicadoras poseen un prodominio largo, de unos 100 aminoácidos, que contiene uno de los dos motivos característicos de interacción proteína-proteína, como son el dominio efector de muerte (DED) y el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Se activan por dimerización y están implicadas en la activación de las caspasas efectoras. Las caspasas efectoras poseen un prodominio corto, de menos de 30 aminoácidos, se activan por el corte del sitio catalítico por caspasas iniciadoras, y están implicadas en la proteolisis de un amplio abanico de componentes celulares que, en última instancia, derivan en la muerte celular. Dentro de los sustratos de caspasas se encuentran componentes estructurales (actina y laminina), proteínas reguladoras (proteinas quinasas dependientes de ADN), inhibidores de deoxirribonucleasas (como DFF45 o ICAD) que permiten la liberación de DFF40 o CAD que degradan el DNA durante la apoptosis [3] y otras proteínas pro-apoptóticas y caspasas. Una información más detallada sobre los sustratos de caspasas se puede encontrar en la base de datos “CASBAH” ( http://www.casbah.ie ) [36].
Caspasa-3 Caspasa-7 Caspasa-6 Caspasa-8 Caspasa-9 Caspasa-10 Caspasa-4 Caspasa-2 Caspasa-13 Caspasa-5 Caspasa-12 Caspasa-11 Caspasa-1 Caspasa-14 Efectoras Iniciadoras Inflamatorias y otras
Figura 4. Clasificación de las caspasas en mamíferos. Excepto las caspasas-11 y -12 (ratón)
y la -13 (bovina), todas las demás son humanas.La flecha indica el primer sitio de corte en la activación.Las flechas medianas y más finas represenatan sitios adicionales de corte. El residuo de cisteína responsable de la actividad catalítica se representa con una línea roja. Los segmentos de colores representan las las regiones que corresponden a los bucles que constituyen la actividad catalítica. Adaptada de Shi, Mol. Cell, 2002)
3.3 Activación de las caspasas.
3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras.
En estado basal, las caspasas iniciadoras son monómeros inactivos. Tras un estímulo apoptótico, se induce el ensamblaje de las denominadas plataformas de activación, que están formadas por las propias caspasas y por proteínas adaptadoras, y que resulta en la activación de las caspasas iniciadoras. Las proteínas adaptadoras que forman parte de las plataformas se unen específicamente a los dominios DED o CARD de las caspasas. Cada caspasa iniciadora tiene su plataforma de activación: el DISC (Death Inducing Signalling Complex) recluta y activa a la caspas-8 y -10 [37] [38]. El apoptosoma activa a la caspasa-9 [39] [40, 41], y el PIDDosoma está implicado en la activación de la caspasa-2 [42, 43] [44] (Figura 5). Dentro de las caspasas pro-inflamatorias, se ha descrito el inflamosoma como plataforma de activación de la caspasa-1.
El mecanismo de activación de las caspasas iniciadoras en las
Figura 5. Plataformas de activación de las caspasas iniciadoras apoptóticas. Se muestran los
componentes de las plataformas donde se activan las caspasas apoptóticas iniciadoras: el DISC para la activación de las caspasas-8 y-10, el PIDDosoma para la activación de la caspasa-2 y el apoptosoma para la activación de la caspasa-9 (Adaptado de Po-Ki Ho et al, The FEBS Journal 2005).
plataformas no está bien definido y se proponen dos modelos principalmente: 1) Modelo de activación por dimerización inducida por proximidad: este modelo propone que las caspasas iniciadoras deben dimerizarse para activarse y que la dimerización es facilitada en las plataformas de activación. La proteolisis interna no activa a estas caspasas, sino que es un evento secundario que ayuda a la estabilización del dímero activo [34]. 2) El modelo de conformación inducida, propone que, en el apoptosoma, se pueden activar directamente monómeros de caspasa-9 a través de modificaciones en la conformación de su sitio activo [6].
En algunos casos, las moléculas adaptadoras incorporadas en las plataformas pueden señalizar hacia diferentes vías, por ejemplo, la caspasa-2 y la -8 pueden señalizar para muertecelular o para supervivencia a través de NF-kB, aunque poco se conoce aún del mecanismo que subyace dicha señalización. [45], [46], [34].
3.3.2 Activación de las caspasas efectoras. Activación por proteolisis.
Las caspasas efectoras existen ya como homodímeros y requieren de proteolisis en el dominio catalítico para activarse (Figura 6). La proteolisis provoca un correcto posicionamiento del sitio activo y, a su vez, una correcta alineación de los residuos que interaccionan con los sustratos [47] [48] [6] [34]
3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs.
Debido a que el proceso de proteolisis es irreversible, la activación de las caspasas en las células está finamente regulado. Así, en las células xisten varias estrategias para prevenir la activación de las caspasas: inhibición del sitio activo, degradación proteasomal y proteínas “decoy”. Un modo básico de inhibición de las proteasas en general se basa en ocupar el sitio activo con un segmento proteico que mimetiza a los residuos de unión de los verdaderos sustratos impidiendo la unión de estos con las proteasas. Así con
Figura 6. Mecanismos de activación de las caspasas. A) Organización estructural de las
caspasas. Un pro-dominio precede al dominio catalítico compuesto por dos subunidades unidas covalentemente. Los sitios para la (auto)-proteolisis en los residuos de Aspártico están indicados. B) Mecanismos de activación de las caspasas. Las caspasas iniciadoras son monómeros que se activan dimerización mediada por los predominios. Las caspasas ejecutoras son dímeros que se activan por la rotura entre sus subunidades. Tras la activación, pueden ocurrir adicionales eventos proteolíticos que provocan una mayor estabilidad en la estructura y que pueden estar sujetos a regulación.Adaptado de Cristina POP, et al. JBC, 2009.
respecto a la inhibición de las caspasas, encontramos este mecanismo en algunos virus. Dos de los mejores inhibidores virales de caspasas caracterizados, como son las proteínas CmrA y p35/49, procedentes de baculovirus, se unen directamente al sitio activo de la mayoría de las caspasas impidiendo su acción. Un mecanismo de inhibición similar pero mucho más específico lo encontramos en las proteínas humanas pertenecientes a la familia de los IAPs. Los IAPs son las únicas proteínas endógenas que regulan tanto la actividad de las caspasas iniciadoras (caspasa-9), como efectoras (caspasa-3 y -7). Hasta la fecha se han identificado ocho miembros: NAIP, XIAP, c-IAP1, c-IAP2, survivina, ML-IAP, ILP2 y Apollon [49]. Esta familia se caracteriza por poseer uno o más dominios de 70-80 aminoácidos agrupados alrededor de un átomo de Zinc, a denominados dominios BIR (Bacuoloviral IAP Reapeat). Dentro de los IAPs que poseen más de un dominio BIR (XIAP, c-IAP1 y cIAP2), parece que cada dominio tiene una función diferente. Así en XIAP, el dominio BIR3 inhibe específicamente a la caspasa-3, mientras que la región existente entre el dominio BIR1 y BIR2 inhibe específicamente a las caspasas-3 y-7. De los IAPs que solo contienen un dominio BIR, ML-IAP, por ejemplo, inhibe caspasa-3 y-9 [49]. Se han descrito proteínas homólogas a los IAPs en Drosophila pero no en nematodos (Figura 7).
Las proteínas “decoy”, son proteínas estructuralmente similares a las caspasas y que compiten con ellas por la unión a las proteínas adaptadoras en las plataformas de activación. Por tanto, desde un punto de vista semántico no inhiben a las caspasas sino que previenen su activación. Un ejemplo de este tipo de proteína es cFLIP, que compite con la caspasa-8 para unirse a la proteína adaptadora FADD en el DISC y, cuya estructura y función, se comentan más detalladamente en el apartado 6 de la Introducción. El tercer mecanismo de regulación de las caspasas implica su degradación via proteasoma. Las caspasas activas tienen una vida media muy corta, y se ha propuesto que las proteínas responsables para su degradación por el proteasoma son los IAPs, de hecho, muchos IAPs, Figura 7. Esquema de la familia de las proteínas IAPs y su estructura. Se muestran las
proteínas pertenecientes a la familia de los IAPS en mamíferos y en
además del dominio BIR, contien un dominio RING y UbA implicados en la ligación de ubiquitina, requisito necesario para la degradación proteasomal de las proteínas [34].
3.5 Otros mecanismos de regulación de las caspasas:
Regulación génica: aunque en la mayoría de los casos la apoptosis no requiere la síntesis de novo de caspasas, la regulación de la transcripción de las caspasas tiene importancia en algunas cirscuntancias. Por ejemplo, los niveles de expresión de caspasa-11 en ratones sanos o células en reposo es muy bajo, pero el tratamiento con LPS u otro estímulo patológico, como una isquemia in vivo, induce un fuerte aumento de la transcripción de esta caspasa. La bajada de expresión de E2F por el adenovirus E1A, la pérdida de Rb o una aumentada expresión de E2F1 resulta en la acumulación de zimógenos de caspasas por una directa regulación génica. Esto puede explicar por qué las células que expresan oncogenes son más sensibles a cualquier estímulo apoptótico, que las células que no los expresan, lo que se está potenciando como terapia antitumoral.
Fosforilación: se ha descrito que, en respuesta a factores de crecimiento, AKT y ERK/MAPK son capaces de fosforilar a la caspasa-9 e inhibir su activación y la apoptosis [50] [6]. También se ha descrito que durante la mitosis, la caspasa-9 puede ser inhibida por fosforilación en el residuo Treonina125 por CDK1/ciclina B1 para impedir la apoptosis [51]. La caspasa-2 puede ser fosforilada para inhibir su acción por la calcio-calmodulina proteína quinasa-2, en respuesta al metabolismo de la glucosa en oocitos de Xenopus [52]. Recientemente se ha descrito que la caspasa-2 puede ser fosforilada en la Serina122 por la DNA-PK tras un daño al ADN no letal. Esta fosforilación activaría a la caspasa-2 y mediaría la parada en el ciclo celular más que apoptosis. Además la activación de la caspasa-2 se
produciría en un complejo intranuclear, en asociación de la caspasa con PIDD y la subunidad catalítica de DNA-PK pero sin RAIDD [35]. Esta es la primera evidencia de una función no apoptótica de caspasa-2. Aún más reciente es el trabajo de Bouchier-Hayes et al (2009) [43] donde demuestran mediante una nueva técnica de fluorescencia (BiFC) que la activación de la caspasa-2 se da en el PIDDosmoa y en el citoplasma incluso tras estímulos que provocan daño en el ADN como es el inhibidor de la topoisomerasa etopósido. Tras estos resultados, no queda claro si la fosforilación de la caspasa-2 media su activación o si por el contrario la fosforilación inhibiría las funciones apoptóticas de la caspasa-2 e induciría la ejecución de otras funciones no apoptóticas.
La familia de tirosin quinasas Scr pueden fosforilar a la caspasa-8 en la Tirosina380 [53]. La fosforilación de la Tirosina380 inhibe la activación de la caspasa-8 inducida por Fas y media la señalización antiapoptótica en células estimuladas con EGF y en células de cáncer de colon. Recientes estudios han sugerido que la fosforilación de la caspasa-8 en la Tirosina380 la dirige a zonas de la membrana donde actúa como proteína puente en una manera que no requiere su actividad enzimática [54] [55] [53].
La caspasa-3 puede ser fosforilada por p38 en la Serina150 y esta fosforilación puede ser inhibida por la asociación de la proteína fosfatasa 2A(PP2a) con la caspasa-3. Por lo que la regulación de la PP2A puede ser un punto clave en la regulación de la caspasa-3 [56] [53]. PKC también puede fosforilar a la caspasa-3 aumentando su actividad proteolítica, aunque el sitio de fosforilación no ha sido determinado.
Ubiquitinación. Hasta el momento, existe una única referencia de regulación de la actividad caspasa por ubiquitinación [57]. En el trabajo se demuestra como la caspasa-8 necesita ser ubiquitinada por la E3 ubiquitin
ligasa Cul-3 para su completa activación tras la inducción apoptosis por el ligando de muerte TRAIL.
4. Rutas de apoptosis
Las principales causas por las que en las células se induce la respuesta apoptótica son la activación de los receptores de muerte y la inducción de un estrés celular causado por la privación de factores de crecimiento en el medio, pérdida de adhesión al sustrato, daño al ADN, estrés en el retículo endoplámico, activación de oncogenes, infección viral, radiaciones ionizantes, radiaciones ultravioleta, etc. En células de mamíferos la respuesta apoptótica está mediada por dos rutas principales, intrínseca y extrínseca, dependiendo del origen del estímulo apoptótico (Figura 8).
4.1 Ruta intrínseca o mitocondrial.
4.1.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis. La ruta intrínseca de apoptosis se activa en respuesta a estímulos de muerte inducidos por estrés o daño celular, como se ha comentado anteriormente. La ruta intrínseca de apoptosis está mediada por la mitocondria y el evento fundamental es la permeabilización de su membrana externa (MOMP). En respuesta a estímulos apoptóticos, se liberan al citosol proteínas mitocondriales como citocromo C, Smac/Diablo, AIF, Omi/HtrA2 y endonucleasa G [58] [59] [60] [49]. La principal proteína implicada en la ruta mitocondrial de apoptosis es el citocromo C. Tras su liberación al citosol, se induce la formación de la plataforma de activación de caspasas iniciadoras denominado apoptosoma.
El apoptosoma está compuesto por APAF-1, citocromo C, y ATP/dADP y es donde se recluta y activa la caspasa-9, iniciando así la ruta de activación de caspasas [61] [62] [41]. Otra proteína liberada desde la mitocondria durante la apoptosis es Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) [63] o DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI) [64] que actúa uniéndose a los miembros de la familia de los IAPs y neutralizando su actividad antiapoptótica, favoreciendo con ello la activación de las caspasas. Omi/HtrA2, al igual que Smac/Diablo, está implicada en la activación de caspasas por inhibir a los IAPs, aunque también puede estar implicada en la muerte independiente de caspasas por su actividad serín proteasa [65]. La proteína AIF (Factor Inductor de Apoptosis), es una flavoproteína con actividad NADH oxidasa, capaz de inducir muerte independiente de caspasas [66] [67] [68] [69]. Tras su liberación al citosol desde la mitocondria,
se transloca al núcleo y se une al ADN mediante interacciones electrostáticas y mediante la interacción con endonucleasas, como la endonucleasa G, e induce la degradación del ADN en fragmentos grandes no oligonucleosomales de aproximadamente 50 kpb [70] [71]. Tras la inducción de un estrés a la mitocondria, además de la activación de la ruta intrínseca de apoptosis, mediada por el Citocromo C y el apoptosoma, y de la muerte celular independiente de caspasas mediada por AIF, se puede producir la inducción de necrosis, mediada por la liberación desde la mitocondria de especies reactivas de oxigeno (ROS) y de Ca2+ [72]. La ruta mitocondrial de apoptosis está mediada por proteínas de la familia de Bcl-2, que comentamos más en detalle a continuación.
4.1.2 Proteínas de la familia de Bcl-2. Estas proteínas juegan un papel central en la regulación de la muerte celular y participan en mecanismos como apoptosis, necrosis y autofagia [73]. Alteraciones en su expresión y función contribuyen a la patogénesis y progresión del cáncer, por lo que constituyen una fuente de dianas terapeúticas que, actualmente, están siendo exploradas en ensayos clínicos. Bcl-2 fue descrito como un oncogen que se activaba como resultado de la translocación cromosómica que se da en linfomas foliculares de células B humanas y que yuxtapone en el cromosoma 14 el gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, con el gen bcl-2 proveniente del cromosoma 18 [74] [75]. Un punto clave en su descubrimiento fue que la sobreexpresión de Bcl-2 no inducía proliferación celular, como la mayoría de los oncogenes descritos anteriormente, sino que la sobreexpresión inhibía la muerte celular [76] [77]. En humanos se han descrito al menos 20 miembros de esta familia. Todos poseen entre uno y cuatro dominios de homología con la proteína Bcl-2 (BH1-BH4, Bcl-2
homology), que corresponden a segmentos α-hélices. Clásicamente se han divido en tres grupos de acuerdo a su estructura y función (Figura 9):
Clase 1: miembros antiapoptóticos: poseen de tres a cuatro de los llamados
dominios BH y principalmente se encuentran integradas en la membrana mitocondrial externa, aunque pueden tener una localización citosólica y de membrana nuclear y del retículo endoplásmico. A este grupo pertenecen las proteínas Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B/Boo/DIVA y A1/Bfl-1/Bcl-2A1. La función de estas proteínas en la apoptosis es unir e inhibir directamente a los miembros pro-apoptóticos de la familia. Los dominios BH1-BH3 forman un surco hidrofóbico, mientras que el BH4 estabiliza dicha estructura [78]. Este surco hidrofóbico puede unir la α-hélice del dominio BH3 de una proteína pro-apoptótica de la familia de Bcl-2 [79]. En condiciones basales, no todas las proteínas con un dominio BH3 pueden interaccionar con el surco hidrofóbico de los Bcl-2 antiapoptóticos. Es necesario que los
Figura 9. Clasificación de proteínas de la familia de Bcl-2. La familia se compone
de proteínas que contienen uno o varios domnio conservados BH. Se dividen en miembros anti-apoptóticos y proapop´tocios. Estos últimos a su vez se dividen en miembros multidominio y miembros con solo el dominio BH3. El dominio transmembrana (TM) puede estar ausente de algunos de los miembros “sólo BH3” (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009)
miembros “sólo BH3” y “tipo Bax” expongan su dominio BH3 tras una modificación pos-traduccional y/o cambio conformacional [80].
Clase 2: miembros pro-apoptóticos multidominios: en este grupo se incluyen las
proteínas Bax, Bak y Bok que contienen los dominios BH1-BH3. Bax y Bak, son los responsables de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa porque forman un poro proteolipídico en ella que permite la liberación de las proteínas residentes en el espacio intermembranoso y la consecuente inciación de la cascada apoptótica. Células que han perdido la expresión de Bax y Bak son resistentes a multitud de estimulos apoptóticos. Para que Bax y Bak induzcan la permeabilización de la membrana mitocondrial externa deben estar en ella o muy próximos a ella [81] y, además, la formación del poro implica una oligomerización de proteínas Bax o Bak [82] [83]. Bax es una proteína citoplamástica que, por lo tanto, debe translocarse a la membrana mitocondrial tras el estímulo apoptótico. El mecanismo de translocación no es bien conocido pero se sabe que implica un cambio conformacional de la proteína [84. Recientes estudios sobre Bak, determinan que moléculas inactivas de Bak residentes en la membrana mitocondrial, sufren un cambio conformacional tras el estímulo apoptótico que les permite asociarse con otras moléculas de Bak para formar el poro {Dewson, 2008 #87].
Clase 3: miembros pro-apoptóticos “sólo BH3”: estos miembros de la familia
Bcl-2 solamente comparten entre ellos mismos, y con los otros miembros de la familia, el dominio BH3. Unos diez miembros han sido identificados en mamíferos, entre ellos las proteínas Bad, Bid, Bim/Bod, Bik/NBK, Bmf, Hrk/DP5, Noxa y Puma/BBC3 [85] [86]. Las proteínas “sólo BH3” actúan por encima de los miembros proapoptóticos tipo Bax, ya que no son capaces de inducir apoptosis en ausencia de estos [87] y han sido descrito como sensores y mediadores de la apoptosis ya que podrían transmitir señales de
muerte diferentes y específicas a los miembros de la familia Bcl-2 que poseen varios domios BH. Por ejemplo, Bim es importante para la muerte de linfocitos tras la retirada de citoquinas del medio [88], Bmf y Bim son necesarios en anoikis [89] [90] y Noxa y Puma participan en la apoptosis mediada por p53 como consecuencia de un daño al ADN [91] [92]. En células de mamíferos sanas, las proteínas “sólo BH3” se encuentran inactivas [93] y, en respuesta a un estímulo apoptótico, aumenta su transcripción y/o se modifican pos-traduccionalmente, o se relocalizan para su activación.
Cómo interaccionan los miembros de la familia para permitir la permeabilización de la membrana mitocondrial es un tema que provoca una gran controversia y actualmente existen dos modelos principales para explicar cómo se activan Bax y Bak:
Modelo de activación indirecta: de acuerdo a este modelo, las proteínas
Bax y Bak están siempre unidas a los miembros antiapoptóticos que inhiben su activación. Tras un estímulo apoptótico, las proteínas “sólo BH3” se unen a los miembros antiapoptóticos de la familia liberando a Bax y Bak [94]. Una predicción que surge de este modelo es que Bax y Bak deben estar siempre unidos a proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2 o Mcl-1, sin embargo experimentos de co-inmunoprecipitación de Bax y Bak demuestran que sólo una minoría de estas proteínas están unidas a las antiapoptóticas en estado basal. Nuevas aportaciones de este modelo indican que la fracción de proteínas Bax y Bak que se encuentran unidas a las proteínas antiapoptóticas, son las que están ya activadas, tal vez de forma espontánea o tal vez por otros estímulos desconocidos [95] [96].
Modelo de activación directa: según este modelo proteínas “sólo BH3”,
como Bid y Bim directamente interaccionan e inducen cambios conformacionales en Bax y Bak. Estudios donde se utilizan proteínas
recombinantes, lípidos de membrana y la técnica de transferencia de fluorescencia FRET, indican que, efectivamente, estas interacciones se dan y que provocan la permeabilización de la membrana (Novell et al Cell 2008). Los miembros de la familia antiapoptóticos, inhibien la muerte celular porque se unen y secuestran a los miembros “sólo BH3” activadores y también uniendose a las proteínas Bax y Bak que pueden estar activadas. En este modelo los miembros “sólo BH3” son divididos en dos categorías, activadores (Bid y Bim) y sensibilizadores [97]. Los sensiblizadores no pueden unirse y activar a Bax y Bak, pero si pueden unirse a las proteínas antiapoptóticas liberando así a los activadores para que ejerzan su función sobre Bax y Bak. Una predicción que se puede sacar de este modelo es que la deleccion de los “sólo BH3” activadores debería resultar en la inhibición de la apoptosis, como ocurre cuando se elimina la expresión de Bax y Bak al mismo tiempo. Sin embargo, esto no ocurre así, y la inhibición de la expresión de Bid y Bim afecta mínimamente a la inducción de la apoptosis [94]. Esto pone de manifiesto que deben existir otras proteínas que actúen como activadores, de hecho hay datos que asignan esta función a proteínas como Puma y p53 [98] [99]. Resultados muy recientes apoyan este modelo de activación directa, ya que se ha conseguido determinar la interacción entre Bim y Bax, aunque sorprendentemente, la interacción se da en la superficie de Bax opuesta al bolsillo hidrofóbico formado por los dominios BH1, BH2 y BH3 [100].
4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte.
Ruta extrínseca o de receptores de muerte se activa por la unión de diferentes ligandos a sus receptores en la membrana plasmática. A los receptores responsables de transmitir la señal de apoptosis al interior de la célula se les denomina receptores de muerte y pertenecen a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). En humanos se han descrito seis receptores de muerte que son CD95 (Fas, APO-1), TNFR1 (p55, CD120Aa), TRAMP (APO-3, DR3, WSL-1,LARD), R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5, APO-2, KILLER, TRICK2) y DR6 (TR-7) [101]. Los receptores de muerte son proteínas transmembrana de tipo I, que intracelularmente, contienen un dominio de interacción con otras proteínas, denominado
Figura 10. Modelos de activación de Bax/Bak. En el modelo de activación directa,
proteínas “sólo BH3” activadores como Bim, se mantienen unidas a proteínas anti-apoptóticas, hasta que esta unión es desplazada por proteínas “sólo BH3” sensibilizadores como Bad. Una vez libres, los activadores pueden unirse y activar a las proteínas efectoras como Bax. En el modelo indirecto, las proteínas efectoras activas son inhibidas por las proteínas antiapotóticas, hasta que las proteínas “sólo BH3” neutralizan a las antiapoptóticas (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009)
dominio de muerte (DD) de unos 80 aminoácidos. Este dominio es fundamental para la transmisión del impulso apoptótico y sirve de anclaje a una serie de proteínas señalizadoras que también poseen un dominio de muerte (DD). Extracelularmente poseen entre dos y cuatro dominios conservados ricos en cisteínas (CRDs) por los que se unen a su ligando específico. Los ligandos de estos receptores, llamados ligandos de muerte, son proteínas transmembrana tipo II (extremo c-terminal en el espacio extracelular) y también pertenecen a la superfamilia ligandos de TNF. Se unen a sus receptores a través de una región de 150 aminoácidos en el extremo c-terminal denominada dominio de homología a TNF (THD) [102]. La mayoría de los ligandos pueden existir también en forma soluble y ser funcionales (Figura 11).
Figura 11. Ligandos y receptores de la familia de TNF. En color morado se
representan los dominios ricos en cisteína (CRDs) extracelulares y en verde los dominio de muerte (DD) intracelulares.
El inicio de la señalización a través de los receptores de muerte, requiere de la oligomerización de estos y la yuxtaposición de los dominios de muerte (DD) intracelulares. Inicialmente se pensaba que la unión del ligando en forma de trímero al dominio extracelular del receptor, provocaba la trimerización de este [103]. Sin embargo, este concepto ha cambiado ya que, mediante experimentos de cristalografía de proteínas, se ha establecido que el ligando trimerizado se une a un pre-emsamblado complejo oligomérico del receptor. La formación de estos complejos de receptores independientes de ligando ocurre a través de los dominios ricos en cisteína de la región extracelular de los receptores, denominada PLAD (preligand assembly domain) [104]. Aunque esta región no es la implicada en la unión del ligando, la delección de la misma afecta severamente a la unión de TNF-α al TNFR-1, sugiriendo que el pre-ensamblaje de los receptores es un evento crucial en la unión del ligando al receptor. La formación de complejos de receptores independiente de ligando también se han descrito para los receptores de FAS y TRAIL [105] [106]. La unión del ligando provoca un cambio conformacional en el receptor que permite la unión de proteínas adaptadoras mediante los dominios DD [107]. Las proteínas adaptadoras, como por ejemplo, FADD y TRADD, no tienen actividad enzimática por sí mismas sino que sirven como puente para la unión de caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -10), a través de los dominios DED presentes tanto en las proteínas adaptadoras como en las caspasas. Todo el conjunto de estas proteínas forman el complejo señalizador de muerte (DISC, Death-Inducing Signalling Complex) descrito por primera vez para el receptor de Fas [108], que sirve como plataforma de activación de las caspasas iniciadoras -8 y -10, lo que a su vez induce la activación de caspasas efectoras (-3, -6y 7) y el consecuente inicio de la apoptosis. Al DISC también pueden unirse proteínas inhibidoras de la activación de las caspasas, como
por ejemplo cFLIP, que inhibe la activación de la caspasa-8 y al que nos referiremos más en detalle en el apartado 6 de la Introducción.
La ruta extrínseca de apoptosis (principalmente la mediada por los receptores de muerte Fas y TRAIL-R) está conectada con la intrínseca a través de la proteína de la familia de Bcl-2, Bid. Tras la activación de la caspasa-8 en el DISC, ésta puede procesar a Bid dando lugar su forma truncada, tBid, que es capaz de translocarse a la membrana mitocondrial externa y junto con Bax y Bak inducir la liberación de citocromo C al citosol y la consecuente activación de caspasa-9 en el apoptosoma, lo que provocaría más activación de caspasas efectoras (-3,-6 y -7) (Figura 9).
Que tras la activación de la ruta extrínseca de apoptosis se active la ruta intrínseca depende del tipo celular y se ha determinado que las células se clasifiquen en células Tipo I, en las que la activación de caspasa-8 en el DISC es suficiente para activar directamente a las caspasas efectoras, o células Tipo II, en las que o la activación inicial de la caspasa-8 en el DISC no es suficiente para activar a las caspasas efectoras y requiere de la vía mitocondrial para ello, o bien los niveles de IAPs en estas células son tan altos que no permiten la activación de las caspasas efectoras tras la activación de la caspasa-8 en el DISC y requieren de los factores mitocondriales necesarios para inhibir la función de los IAPs (Smac/Diablo).
4.2.1 Señalización a través de TNFR-1/TNF-α.
El sistema TNF/receptor de TNF consta de dos receptores, TNFR-1 y TNFR-2 y tres ligandos, TNF-α unido a membrana, TNF-α soluble y TNF-β (soluble). Sólo el TNFR-1 es considerado como receptor de muerte puesto que el TNFR-2 carece del dominio de muerte intracelular y, además, estudios en ratones deficientes para TNFR-1 indican que este receptor es esencial para la apoptosis inducida por TNF en células infectadas [109] [110].
El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) juega un papel fundamental en inflamación e inmunidad, tanto como en proliferación y diferenciación de diferentes tipos celulares [111]. Tanto el soluble, como el unido a membrana, son biológicamente activos y son producidos principalmente por macrófagos, monocitos y células T en respuesta a infección y condiciones inflamatorias.
La unión de TNF-α a TNFR-1 permite la formación de dos complejos, uno inicial (complejo I) que regula la expresión de proteínas antiapoptóticas y que, por tanto, previene la muerte celular y un segundo complejo (Complejo II) que dispara la muerte celular [112]. El Complejo I está formado por el ligando, el receptor, TRADD, RIP, TRAF-2 y c-IAP1/2, aunque la presencia de la proteína adaptadora TRADD en este complejo es
Figura 12. Señalización mediada por TNFR-1.Modelo
de señalización y formación de complejos de señalización mediados por TNF-R1. Para detalles ver el texto (Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al , The Faseb Journal, 2009)
objeto de controversia [112] [113]. La formación del complejo I requiere de la translocación del TNFR-1 a regiones de la membrana plasmática ricas en colesterol y esfingolípidos (lipid-rafts). Aquí, varias de las proteínas del complejo pueden sufrir modificaciones pos-traduccionales, por ejemplo, RIP es poliubiquitinado por cIAP1/2, requisito necesario para la activación de NF-kB [114] [115]. De la formación del complejo I pueden derivar dos vías de señalización diferentes. Una de ellas promueve supervivencia celular y está mediada por la unión de la proteína quinasa TAK1 a RIP ubiquitinado que resulta en la activación de la quinasa y la consecuente fosforilación y degradación del inhibidor de NF-kB, IkBα a través del complejo de IKK. Tras la degradación proteasomal de su inhibidor, NF-kB puede translocarse al núcleo dando lugar a la transcripción de proteínas implicadas en la supervivencia celular como TRAF1, TRAF2, cIAP-1, cIAP-2 y cFLIP entre otros. La otra vía de señalización promovida por el complejo I permite la activación de la proteína quinasa JNK que puede dar lugar a apoptosis, por ejemplo, a través de la fosforilación y activación de la proteína E3 ubiquitin ligasa Itch, la cual promueve la degradación proteasomal de cFLIP, aumentando la activación de caspasa-8 [116]. El complejo I es rápidamente internalizado por endocitosis y se ha sugerido, que durante este proceso el receptor se disocia del resto de proteínas y así el DD de RIP puede interaccionar con el DD de FADD, lo que conlleva el reclutamiento y activación de la caspasa-8. Este complejo II (receptosoma) estaría formado, por tanto, por TRADD, TRAF2, RIP, FADD y caspasas-8/-10 [112]. Sin embargo, la composición del complejo II ha sido cuestionada tras la descripción de vesículas endocíticas que contienen el receptor TNFR-1 [113]. Independientemente de su composición, lo que se puede asegurar es que el complejo II es espacial y temporalmente diferente al complejo I.
Además de por la inhibición de la actividad transcripcional de NF-kB, (inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida, por ejemplo), la señalización apoptótica de TNF puede ser facilitada por el uso de moléculas miméticas de Smac, que inhiben XIAP, cIAP-1 y cIAP-2. Aunque tanto la cicloheximida como los miméticos de Smac inducen la activación de caspasa-8, los mecanismos implicados parecen ser diferentes. Así, la cicloheximida inhibie la síntesis de cFLIP inducida por NF-kB, permitiendo la activación de caspasa-8 en el complejo II, sin embargo los miméticos de Smac se unen a cIAP-1 y cIAP-2 promoviendo su actividad E3 ubiquitin ligasa, lo que les hace autoubiquitinarse y degradarse por el proteasoma. Esto permite la deubiquitinación de RIP y su liberación del complejo I, lo que permite su asociación con FADD y el reclutamiento y activación de la caspasa-8 [46]. Así el estado de ubiquitinación de RIP determinaría la señalización hacia supervivencia o muerte [117] (O´Donnell MA, Curr. Biol 2007) [118].
4
.2.2 Señalización a través de Fas/FasL.El receptor Fas se expresa en la mayoría de los tejidos humanos (esto es real?, en tesis de Menchu se dice otra cosa), pero es particularmente abundante en hígado, corazón, riñón, páncreas, cerebro, timo, tejido linfoide además de en linfocitos T maduros activados. Se puede encontrar unido a la membrana plasmática o en forma soluble por la pérdida del dominio transmembrana por splicing alternativo del ARN mensajero [119].
El ligando de Fas (FasL) se expresa principalmente como estructuras homotriméricas en la membrana de las células T activadas (mFasL), aunque de esta puede derivarse una forma soluble (sFasL) cuya actividad biológica genera controversia [120]. La unión de FasL a complejos preasociados del receptor, induce la formación de agregados (resistentes a SDS y
mercaptoetanol) donde se produce la palmitoilación del receptor [121] [122]. Esta es la señal para la localización de los agregados en lipid- rafts. Posteriormente, los agregados se organizan en otros de mayor peso molecular, que son microscópicamente detectables a los que se les denomina SPOTS (signalling protein oligomerization structures) y donde se recluta a FADD. La interacción entre FADD y el receptor es requisito imprescindible para la formación de los SPOTS [123 {Siegel, 2004 #130]. La función de los SPOTS es reclutar suficientes niveles de caspasa-8 para obtener una completa activación enzimática. Tras la unión de la caspasa-8 se forman unos mayores agregados en grandes plataformas de lipid-rafts, que inducen la internalización del receptor por endocitosis dependiente de clatrina. En los compartimentos endosomales es donde se da una mayor formación del DISC y activación de caspasa-8 [124]. Recientemente se ha descrito la formación de un segundo complejo (complejo II) citosólico que estaría compuesto por FADD, caspasa-8 y cFLIP cuya función sería aumentar la activación de la caspasa-8 y cuya formación no dependería de la internalización del receptor [125]. Tras la activación de la caspasa-8 en el DISC se induciría la activación de caspasas efectoras y, dependiendo del tipo celular, la activación de la ruta mitocondrial de apoptosis a través del corte de Bid por la caspasa-8, activándose así toda la maquinaria apoptótica.
En muchos tipos celulares Fas no solo no es citotóxico, sino que induce proliferación, migración y producción de citoquinas [126] [127]. Ejemplos de estas funciones no apoptóticas pueden ser: la señalización de ERK inducida por Fas es esencial en regeneración de las neuronas [128]; Fas puede inducir la regeneración del hígado tras un daño o tras una hepactetomía parcial [129, 130]; Fas aumenta la proliferación de células T y timocitos a través de una vía dependiente de FADD y caspasa-8 [131
{Newton, 1998 #140]; Fas facilita la invasión de células de glioblstoma resistentes a la apoptosis in vivo por activar la via PI3K-AKT [132].
La compartimentalización del DISC de Fas es critica para determinar la señalización que se inducirá tras la estimulación ya que si la internalización del receptor es alterada o la formación del DISC se reduce, los agregados del receptor señalizan hacia rutas de supervivencia como NF-kB y ERK [124].
Recientemente se ha descrito en el receptor de Fas un conservado motivo extracelular de unión a glicoesfingolípidos (GMB, glicosphingolipids-binding motif) que determina la ruta de internalización. Mutaciones de pérdida de función en este motivo provocan una formación del DISC Figura13. Señalización mediada por Fas/FasL.
Modelo de la vías apoptótica y no apoptótica
de Fas/FasL. Para detalles ver el texto. Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al. The Faseb Journal, 2009)
defectuosa y causa una endocitosis independiente de clatrina, lo que potencia las funciones no apoptóticas de FAS [133]
5. Señalización mediada por TRAIL. 5.1 TRAIL y sus receptores.
TRAIL es una proteína transmembrana tipo II que pertenece a la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF). Se identificó por homología con el dominio c-terminal de FasL (CD95L) [134]. Aunque se sintetiza como proteína transmembrana puede ser cortado de la superficie celular mediante proteolisis y liberarse al medio extracelular en una forma soluble que mantiene su actividad. Las proteínas encargadas de esta proteolisis pertenecen a la familia de las cistein-proteasas [135]. TRAIL es activo biológicamente como un homotrímero con el residuo de cisteína 230 unido a un átomo de zinc esencial para su actividad [136] [137]. El ARN mensajero de TRAIL está presente en la mayoría de los tejidos pero se expresa principalmente en células del sistema inmune [135], donde juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de las células T y en la muerte mediada por células Natural Killer (NK) y células T Natural Killer (TNK) de células tumorales o transformadas por infección viral [138, 139] [140]. Existen grandes esperanzas en el uso de TRAIL como agente contra el cáncer, ya que se ha visto que es capaz de inducir apoptosis selectivamente en células tumorales y no en células normales, aunque las razones en esta diferencia de sensibilidad aún no están bien esclarecidas [134] [141]. Además, a diferencia de TNF-α y FasL, la administración sistémica de TRAIL es capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin ninguna toxicidad en órganos o tejidos normales [142] [143]. Aunque se ha descrito cierta toxicidad en hepatocitos in vitro, ésta depende de la preparación de TRAIL recombinante utilizada [144].
TRAIL puede unirse específicamente a cuatro receptores transmembrana (TRAIL-R1 a –R4) y, con menor afinidad, a un receptor soluble denominado osteoprotegerina (OPG), aunque en condiciones fisiológicas esta unión no parece darse [145] [146] (Figura 14).
Los receptores transmembrana de TRAIL son proteínas tipo I que pertenecen a la familia de receptores de TNF y, al igual que TRAIL, se expresan constitutivamente en la mayoría de tejidos y tipos celulares humanos. Dos de estos receptores, TRAIL-R1 (DR4) [147] y TRAIL-R2 (DR5) [148] [149] poseen en su región intracelular el dominio de muerte (DD) necesario para la señalización apoptótica y es por eso que se les denomina receptores pro-apoptóticos de TRAIL. Por otro lado, TRAIL-R3 (DcR1) [150] [151] y TRAIL-R4 (DcR2) [152] son incapaces de señalizar para apoptosis porque o bien carecen del dominio citoplasmático y transmembrana como ocurre con R3, o poseen un DD truncado, como es el caso de TRAIL-R4, por lo que no es capaz de ensamblar la maquinaria de activación de la
Figura 14. Receptores de ApoL2/TRAIL. Los receptores DR4 y DR5 corresponden a
TRAIL-R1 y TRAIL-R2 respectivamente. Los receptores señuelo o Decoy, DcR1 y DcR2 corresponden a TRAIL-R· y TRAIL-R4 respectivamente. La osteoprotegerina (OPG) es un receptore soluble capzar de unir Apo2/TRAIL, aunque el significado biológico de la unión no es conocido. Adpatado de Almasan and Ashkenazi, Citokine and Growth Factor Review, 2003.
apoptosis. Por eso a estos receptores se les denomina receptores antiapoptóticos o señuelo, ya que además de no trasmitir las señales apoptóticas, compiten con los receptores pro-apoptóticos por la unión a TRAIL.
5.2 Señalización apoptótica mediada por TRAIL.
La unión de TRAIL a sus receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y TRAIL-R2 inicia una señalización apoptótica muy similar a la inducida tras la activación de Fas. Sin embargo, parece que TRAIL-R2 juega un papel más importante que TRAIL-R1 en la activación de la apoptosis cuando ambos receptores están expresados en la misma célula [153]. A diferencia de lo que ocurre con Fas, los receptores de TRAIL no tienen que ser internalizados tras la unión del ligando para que se forme el DISC y que se transmita la señalización apoptótica. Tras la unión de ligando y receptor, se reclutan las proteínas FADD y caspasa-8/-10, dando lugar a la formación del DISC de TRAIL y su localización en lipid-rafts, donde se activará la caspasa-8. La caspasa-8 activa puede activar, a su vez, directamente a las caspasas efectoras (-3,-7) o cortar a Bid para activar la ruta mitocondrial de apoptosis. Bid cortado (tBid) se transloca a la mitocondria y junto con Bax y/o Bak induce la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Esto permite la liberación desde la mitocndria de citocromo C y Smac/Diablo, entre otras proteínas. En el citosol, el citocromo C formará el apoptosoma junto con Apaf-1 y caspasa-9 que inducirá la activación de ésta. La caspasa-9 activa puede activar, a su vez, a las caspasas efectoras. Smac/Diablo actúa como ya se describió anteriormente uniendose a los IAPs y provocando su autoubiquitinación y degradación por el proteasoma, permitiendo así la activación de las caspasas.
Al igual que ocurre con la señalización mediada por Fas, parece que tras la formación del DISC de TRAIL, se produce el ensamblaje de un segundo complejo intracelular del que se disocian el ligando y el recptor, manteniendose FADD y caspasa-8 y al que se le unen moléculas como RIP, TRAF-2, IKKγ y TRADD y que conduce a la activación de NF-kB y a vías de las MAPK como JNK y p38 [154].
Aunque TRAIL induce apoptosis en células tumorales y no en células normales, existen muchos tumores que son resistentes a TRAIL. La resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL puede darse a diferentes niveles dentro de su vía de señalización:
Figura 15. Señalización apoptótica y de supervivencia mediada por TRAIL.. Adaptado
