Y x/s (g peso seco /mol glucosa)

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Sistemas de cultivo

1. Se estudió la producción de ácidos acético y butírico por Clostridium acetobutylicum utilizando glucosa como fuente de carbono y energía en cultivos de tipo continuo. Trabajando a diferentes velocidades de dilución (D), se obtuvieron los siguientes resultados para el rendimiento de biomasa en función del sustrato (Yx/s).

D ( h-1) Y x/s

(g peso seco /mol glucosa)

0.14 40 0.236 42.5 0.332 43.9 0.426 44.8 0.475 45 0.6 46 0.72 46.5

* Estimar el coeficiente de mantenimiento (m) y el rendimiento Y x/s verdadero

Respuesta: Yxs = 48; m = 5. 96 10-4 mol gluc/X h.

2. Se cuenta con una cepa de la levadura Hansenula polimorfa a la cual se le ha insertado el gen del interferon humano con el objeto de producirlo industrialmente.

Para evaluar cuales son las mejores condiciones de producción del mismo se realizó un sistema de cultivo continuo, donde se trabajo a distintas velocidades de dilución (D) obteniéndose los siguientes resultados:

D (h-1) biomasa (g/l) glucosa (g/l) Interferon (g/l)

0.05 24.4 0.05 15

0.08 24.8 0.12 6

0.10 25.1 0.15 5

0.15 25.3 0.20 13

0.22 25.4 0.20 5

Durante estos experimentoas la concentración de sustrato limitante (glu) en el reservorio fue de 50 g/l.

a) Calcule el rendimiento (Yx/s) verdadero

b) Se desea realizar un cultivo en batch-alimentado con alimentación exponencial. En base a los resultados de la tabla (calculando algún parámetro) elija la velocidad específica de crecimiento apropiada para producir el interferón y justifique su elección.

Considerando esa velocidad específica xce crecimiento, calcule el tiempo total de duración de cultivo si las condiciones iniciales y finales son:

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c) Si la concentración en el reservorio (recipiente que contiene el medio de cultivo con el que se alimenta al fermentador) de glucosa es de 300 g/l calcule el Flujo inicial (Fo).

Respuesta: Yxs G = 0.52; tiempo = 24 hs.; F = 0.049 l/h.

3. Se estudio el efecto de distintas concentraciones de fuente de nitrógeno (sulfato de amonio) sobre el crecimiento y la producción de etanol para un cultivo de la levaura S. cereviceae creciendo en aerobiosis. La concentración inicial de glucosa en el reservorio (SR) fue de 20 g/l. Se trabajo con tres concentraciones de sulfato de amonio: alta , intermedia y baja. En la siguiente tabla se muestran los resultados de la concentración de etanol en estado estacionario a distintas D:

Alta Intermedia Baja

D etanol (mM) D etanol (mM) D etanol (mM) 0.05 0.00 0.05 0.00 0.05 0.00 0.10 0.00 0.10 0.00 0.10 30 0.15 0.00 0.15 10 0.15 65 0.20 25 0.20 60 0.20 150 0.25 65 0.25 90 0.25 100 0.30 100 0.30 134 0.30 70 0.35 120 0.35 90 0.35 55

a) Si tuviera que elegir entre estos cultivos continuos para la producción de etanol, cual usaría? Justifique su respuesta.

b) Si la glucosa se consume produciendo biomasa, etanol y CO2, como sería el perfil de

YXS y de biomasa en un gráfico vs. D. (elija solo un de los tres como representativo)

4. En otro estudio utilizando un cultivo continuo de S. cereviceae se investigó el efecto de la velocidad de dilución sobre la producción de biomasa y etanol en aerobiosis. La concentración de sustrato limitante (glucosa) en el reservorio fue de 30 g/l. Para cada estado estacionario se observaron los siguientes resultados.

D Biomasa (g/l) s (g/l) etanol (g/l) 0.10 14.2 0.01 0.00 0.20 14.3 0.02 0.00 0.29 14.2 0.01 0.00 0.32 8.5 0.8 6.1 0.36 5.7 2.8 9.00 0.41 3.4 8.0 10.1

En base a este estudio se decidió realizar un sistema en batch-alimentado con el objetivo de obtener biomasa, partiendo de X0 = 5 g/l y V0 = 5 l y con flujo constante de glucosa (F = 300 ml/ h y SR = 250 g/l). Se desea llegar a un volumen final VF = 30 l.

Durante el proceso se observó producción de etanol en detrimento de la producción de biomasa. ¿ podrías indicar las razones (argumentando numéricamente) y como las corregirías?

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5. Se estudió la producción de la enzima glucosa oxidasa (GOD) por levaduras modificadas mediante técnicas de ADN recombinante. Se realizaron tres cultivos de batch alimentado con alimentación constante. Se usaron dos fuentes distintas de carbono en el reservorio de alimentación como substrato limitante: glucosa y galactosa. La concentración de estos azúcares en el reservorio fue de 275 g/l y el flujo inicial (Fo) de 13.5 ml/h. La biomasa inicial (Xo) al comienzo de la alimentación fue de 6.9 g/l y el volumen inicial (Vo) fue de 2.2 l. El tiempo de duración del batch alimentado desde el comienzo de la alimentación hasta el final del proceso fue 86 hs. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Substrato limitante Biomasa final obtenido PS (g/l) GOD U/ml Etanol g/l Glucosa 38 111 47 Galactosa 34 154 35

¿cuales fueron los rendimientos Yx/s (g PS/ g substrato) para cada proceso, a que velocidad de crecimiento () empezaron a crecer las levaduras?

¿que proceso elegirías para producir esta enzima?.

Respuesta: YxsGlu: 0.35 gX/gS YxsGal: 0.31 gX/gS µGlu: 0.086 h-1 µGal: 0.076 h-1

6. En el siguiente gráfico se muestra los resultados obtenidos de un cultivo en batch alimentado de un microorganismo X. Basándose en el perfil de µ, concentración de producto y sustrato en el biorreactor ¿podrías deducir que tipo de alimentación se realizó y basándose en eso el comportamiento de todos los parámetros medidos, sabiendo que la alimentación comenzó a tiempo 0? Graficar biomasa expresada en gr.

7. Streptomyces olindensis produce el metabolito secundario retamicina (C27H29NO11),

que es un potente antitumoral. Se realizó una serie de experimentos para estudiar el perfil de producción y crecimiento en un sistema de cultivo continuo. El medio usado contenía amonio como fuente de nitrógeno, sales y glucosa como fuente de carbono y energía. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. La concentración de sustrato limitante en el reservorio fue de 10 g/l: 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 s u s tr a to (g /l ), p ro d u c to (g /l ) tiempo, hsP S

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a) ¿Que podrías decir acerca del perfil de de producción y crecimiento en función de la velocidad de dilución?

b) Calcular la velocidad específica de formación de producto a una D= 0.1 h-1 y la velocidad de consumo de sustrato a una D= 0.3 h-1 .

c) Si tuvieses que producirlo industrialmente ¿que sistema de cultivo elegirías: batch, batch alimentado o continuo? Justificá tu respuesta.

d) Se desea realizar un cultivo en batch alimentado para producir retamicina ¿que tipo de alimentación elegirías y por que? Diseñá un proceso calculando la demanda de glucosa en g/h a tiempo cero para las siguientes condiciones iniciales Xo= 4.5 g/l y Vo= 85 l.

b) 0.6 mg P/g X h 0.94 g S/ g X h d) 30,8 g S/h

8. Clostridium butyricum es capaz de producir en anaerobiosis un interesante compuesto, el

1,3-propanodiol (1,3-PD, C3H8O2 PM: 76.1), utilizando glicerol como sustrato (uno de los principales subproductos del proceso de producción de biocombustibles). Se estudió en sistema continuo la formación de biomasa, la producción de 1,3-PD y otros subproductos de la fermentación. Como fuente de carbono y energía se utilizó glicerol (C3H8O3, PM: 92) 30 g/l. Trabajando a distintas velocidades de dilución se obtuvieron los siguientes resultados:

D h -1 X g/l S g/l PD g/l Ac g/l But g/l Y CO2/c-mol s 0,02 1,4 0,1 16,5 0,2 4,4 0,14 0,04 1,1 1,3 14,5 0,3 3,7 0,22 0,08 1,4 1,1 14,9 0,3 3,5 0,21 0,12 1,3 7,4 13,4 0,8 2,7 0,10 0,16 1,3 8,4 13,3 0,7 2,7 0,05 0,21 1,1 8,3 10,7 0,7 1,3 0,30 0 1 2 3 4 5 6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 D, h-1 B io m as a, g /l; G lu co sa g /l 0 20 40 60 80 100 120 140 R et am ic in a, u g/ l

Biomasa g/l Glucosa g/l Retamicina mg/l

D h-1 Biomasa g/l Glucosa g/l Retamicina mg/l 0,03 4,3 0,10 85 0,05 5,6 1,00 120 0,10 5,6 1,20 32 0,15 5,6 1,45 21 0,20 5,6 1,65 16 0,25 5,6 1,66 12 0,30 2,4 2,60 5

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0,29 1,3 9,0 10,0 1,7 1 0,26 a) Cuando se trabajó a una D = 0,16 h-1, cuantas horas se debió dejar pasar para llegar

al estado estacionario?.

b) Si se hubiera trabajado con una concentración de 75 g/l de glicerol que biomasa se debería alcanzar en el estado estacionario a una D = 0,21 h-1?

c) Se desea producir 1,3-PD por sistema de batch alimentado con alimentación exponencial a que velocidad de crecimiento programarías tu sistema? Justificar. d) En base a su respuesta anterior indicá con que flujo inicial deberías trabajar si la concentración de glicerol en el Reservorio fuera de 60 g/l. Si el proceso se extendiera hasta las 25 hs. ¿Que biomasa (gr X) alcanzaría y cual sería la concentración de 1,3-PD. Datos: Xo= 3.5 g/l y Vo= 5,5 l. (Calcular VF utilizando una planilla de cálculo e intervalos de 1 h para cada cambio de flujo).

a) Tee 18.75 h b) 3,4 g/L d) 27106 g X

Ejercicios Resueltos de Sistemas de Cultivo

1. . Se estudió la producción de ácidos acético y butírico por Clostridium acetobutylicum utilizando glucosa como fuente de carbono y energía en cultivos de tipo continuo. Trabajando a diferentes velocidades de dilución (D), se obtuvieron los siguientes resultados para el rendimiento de biomasa en función del sustrato (Yx/s).

D ( h-1) Y x/s

(g peso seco /mol glucosa)

0.14 40.0 0.236 42.5 0.332 43.9 0.426 44.8 0.475 45.0 0.60 46.0 0.72 46.5

a) Estimar el coeficiente de mantenimiento (m) y el rendimiento Y x/s verdadero De acuerdo a la ecuación



=

+

m

S

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Si se gráfica la inversa de D vs. la inversa del Yx/s observado se obtiene el siguiente gráfico.

Por lo tanto la intersección en el eje y es = 1/ YG o sea YG = 47.85 y la pendiente es el

mantenimiento mS = 0.006

2. Se cuenta con una cepa de la levadura Hansenula polimorfa a la cual se le ha insertado el gen del interferon humano con el objeto de producirlo industrialmente.

Para evaluar cuales son las mejores condiciones de producción del mismo se realizó un sistema de cultivo continuo, donde se trabajo a distintas velocidades de dilución (D) obteniéndose los siguientes resultados:

D (h-1) biomasa (g/l) glucosa (g/l) Interferon (g/l)

0.05 24.4 0.05 15

0.08 24.8 0.12 6

0.10 25.1 0.15 5

0.15 25.3 0.20 13

0.22 25.4 0.20 5

Durante estos experimentoas la concentración de sustrato limitante (glu) en el reservorio fue de 50 g/l.

a) Calcule el rendimiento (Yx/s) verdadero

b) Se desea realizar un cultivo en batch-alimentado con alimentación exponencial. En base a los resultados de la tabla (calculando algún parámetro) elija la velocidad específica de crecimiento apropiada para producir el interferón y justifique su elección.

Considerando esa velocidad específica xce crecimiento, calcule el tiempo total de duración de cultivo si las condiciones iniciales y finales son:

Xo= 5 g/l; Xf= 35 g/l; Vo= 10 l; Vf= 55 l.

c) Si la concentración en el reservorio (recipiente que contiene el medio de cultivo con el que se alimenta al fermentador) de glucosa es de 300 g/l calcule el Flujo inicial (Fo).

a) Para diseñar una alimentación exponencial en un sistema en batch alimentado es necesario saber a que velocidad de crecimiento queremos que crezca el organismo en el proceso. De acuerdo a la tabla que muestra los resultados de un sistema continuo se elige la D o  en la cual la productividad es máxima. En este caso se eligió la velocidad de dilución 0.15 y = 0,0006x + 0,0209 R² = 0,9872 0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

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Productividad = [P] * D  Prod. = 13 g/l * 0.15 = 1.95 g/l h interferon. De esta manera podemos diseñar la alimentación de acuerdo a la ecuación:

F S

R

= Xo Vo e

t



+ m

S

Y

XS

Donde se fijan las condiciones iniciales del inóculo, vol inicial, etc

b) El tiempo total de cultivo para esas condiciones si la alimentación es exponencial será:

t = ln X V - ln Xo Vo

Por lo tanto

t = ln (35 g/l *55l) - ln ( 5g/l * 10 l) 

El tiempo total del proceso será 24.34 hs.

c) Si diseñamos el proceso de tal manera que m = 0.15, Xo= 5 g/l, Vo= 10 l y el Yx/s=0.51. además consideramos que el mantenimiento es despreciable queda que:

F

0

S

R

=

Xo Vo e

t

Y

XS Despejando

F

0

F

0

=

Xo Vo e

t

Y

XS

S

R

F

0

=

5 g/l 10 l e t h 0.51 300 g/l Por lo tanto

F

0

= 49 ml /h

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