Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
Virus Influenza D, revisión bibliográfica y su
presencia en rodeos bovinos de Argentina
Cansino José; Meyer Gilles; Pérez Sandra; De Yaniz Guadalupe.
Julio, 2018
Tandil
Virus Influenza D, revisión bibliográfica y su presencia en
rodeos bovinos de Argentina.
Tesina de la Orientación de Producción Animal presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Cansino José.
Tutor: Dr. Meyer, Gilles.
Directora: Dra. Pérez, Sandra.
Codirectora: Vet. De Yaniz, Guadalupe.
Dedicatoria
Agradecimientos
A mi mamá, por darme el mayor regalo de todos, la posibilidad de estudiar.
A mis hermanos y a mi familia, por acompañarme siempre.
Al Tomate, por aguantarme, y por todos estos años de amistad.
A todos los amigos que me dejan estos años viviendo en Tandil. A mis
compañeros del CECV, por todos los años de militancia.
A mis amigos de Bahía, que son como mis hermanos. A mi familia de ACA Luján,
que es un gran sostén en mi vida. A Mica, por todo lo que me acompaño este
tiempo.
A Luis Laplace, por abrirme las puertas de su veterinaria, por enseñarme todo lo
que sabe, y por convertirse en un gran amigo.
A Carlitos Saumell, por ser un gran docente, y además también, un gran amigo.
A mi directora Sandra, por responder siempre mis inquietudes y acompañarme
en la construcción de este trabajo con tanta paciencia y dedicación.
A la gente de la orientación Producción Bovina, Gladys, Fede, Roberto, Aldana,
por el mejor cuatrimestre de cursada de toda la carrera.
A Ale Cantarelli, por este tiempo compartido y por todo lo que me ha enseñado.
A toda la gente que conocí durante mi residencia en el ENVT, en especial al Dr.
Meyer, a Elias y Mariette, que me ayudaron con el trabajo para esta tesina. A
Victor, Agathe y Lisa por hacerme sentir como en casa.
A mis amigos Erasmus, Vicky, Heyken, Meri, Flavia, Lais, Mar, Besay, Elisa,
Nikky, Vero, Mai y Giovanna, que hicieron de esa una experiencia inolvidable.
A toda la gente de la FCV, que me ayudo durante mis años como consejero
académico.
Por último, pero no menos importante, a mi querida Facultad, por darme la
oportunidad de realizar parte de mi formación en el exterior. No olvidemos nunca
que somos hijos de la educación pública Argentina, defenderla y enarbolar sus
Resumen
El complejo respiratorio bovino (CRB) se caracteriza por ser una patología del aparato respiratorio de los bovinos, de origen multifactorial, que causa importantes pérdidas productivas, ya sea por la mortandad de animales, por los costos de tratamientos o por la forma en la que afecta el crecimiento y desarrollo de los animales. En general la acción de los virus respiratorios predispone a la infección bacteriana secundaria que culmina en bronconeumonía. Además de los virus más frecuentemente asociados con este complejo, diversos autores incluyen nuevos agentes virales, entre ellos, el más recientemente descubierto virus de la influenza D (IDV). Los primeros indicios del IDV datan de 2011, cuando fue aislado de cerdos con enfermedad similar a la influenza en USA. Posteriormente se confirmó que el IDV circula en poblaciones porcinas y que puede transmitirse a humanos, aunque tendría su reservorio natural en los bovinos. Al día de hoy, se confirmó su aislamiento de ganado bovino de USA, China, Francia, Italia y Japón. Además, existe evidencia serológica de que afecta a pequeños rumiantes. Mucho queda aún por descubrir sobre la patobiología del IDV, pero por el momento podemos inferir que forma parte del CRB, y, al igual que con los otros virus asociados al CRB, su sola acción no sería suficiente para causar enfermedad severa. En este trabajo, mediante el análisis de sueros bovinos se determinó la presencia de anticuerpos contra IDV y, por ende, se confirmó la exposición del ganado bovino de Argentina a este virus. Contrariamente, mediante RT-qPCR no se demostró la presencia de material genético viral en las muestras de tejidos respiratorios.
1
Índice
Introducción……… 1
Objetivos………. 2
Revisión bibliográfica……….3
1. Introducción al Complejo respiratorio Bovino………..3
2. Agentes virales involucrados………..4
2.1. Alfaherpesvirus bovino 1 (BoHV-1)………4
2.2. Virus de la diarrea viral bovina (BVDV)……….5
2.3. Respirovirus bovino 3 (ex BoPI3V)……….6
2.4. Orthopneumovirus bovino (ex BRSV)………7
2.5. Coronavirus bovino (BoCV)……….8
2.6. Adenovirus bovino……….9
3. Descripción de un nuevo agente viral involucrado en CRB, “virus influenza D (IDV)”………. 9
3.1. Orthomyxovirus……….9
3.1.1. Clasificación………..10
Figura 1………..11
3.1.2. Determinantes de patogenicidad………11
3.2. Identificación y aislamiento de un virus influenza C en cerdos…………12
Figura 2……….15
3.3. Posibles hospedadores naturales y reservorios……….15
3.4. IDV y enfermedad respiratoria en el bovino………18
4. Impacto productivo del CRB en la producción de bovinos de carne y leche..21
Estudios experimentales……….23
1. Hallazgos serológicos y virológicos del virus influenza D………...23
1.1. Muestras………...23
1.2. Lugar de trabajo………..24
1.3. Metodología……….24
1.4. Breve descripción bibliográfica de las técnicas y su fundamento……..25
2
Figura 3………..26
1.4.2. Ensayo de detección de genoma viral por RT-qPCR……….26
1.5. Materiales y métodos……….27
1.5.1. Ensayo de Inhibición de la hemaglutinación………27
1.5.2. Ensayo de detección de genoma viral por RT-qPCR……….28
1.6. Resultados………...28
1.6.1. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación………28
1.6.2. Ensayo de detección de genoma viral por RT-qPCR...29
1.7. Discusión y conclusiones………..29
Tabla 1……….31
Figura 4………31
1
Introducción
En el año 2011, un nuevo género de los virus de la familia Orthomyxoviridae, designado actualmente como género D, fue detectado por primera vez en el
ganado porcino y bovino de USA (Hause et al., 2014). El mismo se encuentra presente en el ganado bovino de Francia, y su genoma es 94 – 99% idéntico a
su par en los Estados Unidos, lo que sugiere transmisión intercontinental
(Ducatez et al., 2015).
Varios autores han sugerido la existencia de un ancestro común para los virus
de la influenza A, B y C, considerando la organización del genoma de los
diferentes virus que componen este taxón (Webster et al., 1992, Sheng et al., 2014). Existe entonces la necesidad de evaluar el momento de aparición y la
tasa evolutiva del virus de la influenza D, en la medida en la que se disponga de
más datos.
El estudio actual de nuestros pares franceses se centra, entre otras cosas, en
identificar el origen y la prevalencia geográfica del género influenza D.
Resulta interesante conocer el rango de hospedadores del virus, así como sus
reservorios naturales, para evaluar también la relevancia de este nuevo
patógeno en la salud pública. También, será importante establecer la relación de
causalidad entre los síntomas respiratorios y la infección por el virus de la
influenza D en el ganado vacuno, y en un futuro poder comparar las prevalencias
de diferentes áreas geográficas.
Por último, es necesario comprender la patobiología del virus de la influenza D
en el ganado, su posible rol o implicancia en relación al CRB, y, finalmente, de
2
Objetivos
Evaluar, mediante una breve revisión bibliográfica, las implicancias productivas de las patologías respiratorias causadas por virus en los
sistemas de producción bovina.
Recopilar información acerca del recientemente descripto virus de la influenza tipo D, a través de una revisión bibliográfica de la información
disponible.
Identificar la presencia del virus de la influenza D y su prevalencia en el
3
Revisión bibliográfica
1. Introducción general al Complejo Respiratorio Bovino
El Complejo Respiratorio Bovino (CRB) es una patología que afecta el aparato
respiratorio de los bovinos productores de carne y leche de diversas edades.
Tiene un origen multifactorial, y se trata de una enfermedad infecto-contagiosa,
de curso agudo a crónico, que, más allá del agente causal, presenta una
sintomatología similar, y evoluciona generalmente hacia la invasión bacteriana
secundaria. Entre los agentes causales identificados con mayor frecuencia se
encuentran el respirovirus bovino 3 (ex virus parainfluenza-3 o BoPI3V); el
alfaherpes-virus bovino 1 (BoHV-1); el orthopneumovirus bovino (ex virus sincitial respiratorio, BRSV); el virus de la diarrea viral bovina (BVDV); la Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica y mycoplasma (Andrews, 2004; Smith, 2010). Algunos otros agentes aislados más recientemente incluyen al
coronavirus bovino; el adenovirus bovino; el reovirus (Berra y Osacar, 2007) y el
virus de la influenza D (IDV) (Hause et al., 2013, Ducatez et al., 2015).
Las características anatómicas de los bovinos, pulmones chicos para su tamaño
corporal, y las lesiones irrecuperables en ellos, hacen que la enfermedad
respiratoria bovina (ERB) comprometa el futuro productivo de los animales,
además de las pérdidas que implican los animales muertos, el costo de los
tratamientos, el aumento de mano de obra, y las pérdidas en la producción
(Bagnis, 2000, Andrews, 2004, Casella, 2005). Es también una de las principales
causas de enfermedad y muerte en terneros durante las primeras semanas de
vida y en la primera etapa de la recría, originando importantísimas pérdidas
económicas, sobre todo en las vaquillonas que serán la futura reposición del
tambo (Berra y Osacar, 2007).
Durante la recría, la ERB es responsable del 21,3% de las muertes durante la
lactancia, las cuales ascienden a un 50,4% en el periodo posterior al destete
(González Martín, 2010). También ocasiona el 7% de las muertes de terneras y
es responsable del 50% de todos los tratamientos antibióticos (Kossaibati y
Esslemont, 1997). Otras manifestaciones de las pérdidas causadas por esta
entidad, son los costos indirectos por el efecto negativo de los índices
4
si se considerara por ejemplo que la ganancia media diaria (GMD) se reduciría
en 66 g/día en el primer mes (Virtala et al.,1996), lo que daría lugar a una disminución significativa de la ganancia de peso a los 14 meses de edad y por
ende, un retraso en la llegada al peso de entore. Otro índice afectado es la edad
al primer parto, la cual se retrasa desde unos días hasta 6 meses y agrava el
problema de la falta de recría (González Martín, 2010).
2. Agentes virales involucrados
2.1.
Alfaherpes-virus bovino 1 (BoHV-1)
El alfaherpes-virus bovino 1 es un virus de ADN doble, envuelto, que se clasifica
dentro de la subfamilia Alphaherpesvirinae, en la familia Herpesviridae. Se relaciona con múltiples síndromes del ganado bovino, entre los que se
encuentran la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR, por sus siglas en inglés), la
vulvovaginitis y balanopostitis pustular infecciosa y la conjuntivitis, entre otros
(Smith, 2010).
En lo que concierne a la enfermedad respiratoria, puntualmente IBR, la
morbilidad se acerca al 100% y la mortalidad puede ser sustancial si existen
complicaciones (MacLachlan y Dubovi, 2011). El ganado bovino es el principal
reservorio de la enfermedad, y la transmisión se produce principalmente vía
aerosoles o por contacto directo en la forma respiratoria (así como la
conjuntivitis). Una característica importante en el ciclo infeccioso de los
herpesvirus es su capacidad de producir infecciones latentes. Durante la
infección latente el genoma viral se mantiene en forma de episoma en las
neuronas de ganglios nerviosos, particularmente en los ganglios trigémino y
sacro. Ante situaciones de estrés, el virus latente puede reactivarse, lo que
conduce a la excreción viral y a la transmisión a otros hospedadores susceptibles
(Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011).
Las lesiones que produce son, principalmente, áreas focales de necrosis en la
5
reacción inflamatoria y la formación de acúmulos de fibrina y desechos celulares
(pseudomembrana).
La enfermedad respiratoria causada por el BoHV-1 se produce principalmente
como consecuencia de dos mecanismos: en primer lugar las lesiones
previamente mencionadas producto de la replicación viral en el epitelio y mucosa
del aparato respiratorio superior y los bronquios, sumada a la inflamación,
predispone a la infección por patógenos secundarios. En segundo lugar, la
inmunosupresión originada por la disfunción de los neutrófilos, linfocitos y
macrófagos, contribuye a lo antes expuesto (Smith 2010, Caswell y Kurt, 2016).
Todo esto concluye en la presentación clínica, que se caracteriza principalmente
por signos respiratorios como aumento de la frecuencia respiratoria, tos, disnea,
exudado nasal seroso-mucopurulento, y otros menos específicos como pirexia,
ptialismo, anorexia, agravados por la colonización bacteriana secundaria que
culmina generalmente en una bronconeumonía o enfermedad respiratoria severa
a grave (Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011).
La prevalencia serológica de BoHV-1 en Argentina varía según la región
analizada. Por ejemplo, en el noroeste argentino se determinó una
seroprevalencia del 17,5% en rodeos lecheros y del 28,3% en bovinos de cría
(Marin et al., 2011). Por otro lado, en la cuenca lechera de Santa Fe y Córdoba
la seroprevalencia alcanzó el 66,3% (Carbonero et al., 2011)
2.2.
Virus de la diarrea viral bovina (BVDV):
El BVDV es un virus de ARN monocatenario, positivo, envuelto, del género
Pestivirus, familia Flaviviridae. De manera similar al BoHV-1, se relaciona con
numerosas manifestaciones de enfermedad, tales como son la diarrea vírica
bovina, enfermedad de las mucosas, inmunodepresión, abortos, momificación
fetal, defectos congénitos e infecciones persistentes, entre otras (Smith, 2010,
6
Existen dos genotipos distintos del virus, 1 y 2, y a su vez dos biotipos distintos
dentro de cada uno. Se designa a los biotipos como virus citopático o no
citopático, dependiendo de su habilidad para producir, o no, efectos citopáticos
característicos en cultivos celulares (MacLachlan y Dubovi, 2011).
El rol del BVDV en el CRB o la ERB ha sido discutido, aunque estudios de
infecciones experimentales han demostrado que la enfermedad respiratoria
causada por agentes como Mannheimia haemolytica, BoHV-1 o BRSV es significativamente más grave cuando los animales se encuentran previamente
infectados con BVDV (Smith, 2010). Si bien se sabe que la infección con BVDV
por si sola es capaz de producir enfermedad respiratoria leve (Caswell y Kurt,
2016), el rol principal del mismo en este tipo de afección estaría dado por la
sinergia del virus con los otros agentes infecciosos, debido a su capacidad para
alterar la respuesta inmune del hospedador (Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi,
2011, Caswell y Kurt 2016).
Al igual que con BoHV-1, la seroprevalencia de BVDV es variable, con rangos
del 25 al 90% según la zona (Odeón et al., 2001). En rodeos de cría de la Cuenca
del Salado (Pcia. de Buenos Aires), se determinó una prevalencia individual del
66%, con un 86% de establecimientos positivos (Ministerio de Agroindustria,
2015). En rodeos lecheros se estimó una seroprevalencia similar (60%)
(Carbonero et al., 2011).
2.3.
Respirovirus bovino 3 (ex virus de la parainfluenza
bovina 3 o BoPI3V)
El BoPI3V es un virus de ARN monocatenario, negativo, envuelto, perteneciente
a la familia Paramyxoviridae (MacLachlan y Dubovi, 2011) que hemaglutina y hemadsorbe eritrocitos de ciertas especies (Smith, 2010).
Al igual que otros agentes virales que forman parte del CRB, el BoPI3V
aparentemente predispone al aparato respiratorio a infecciones subsiguientes
7
Este virus daña el aparato mucociliar y deprime varias funciones de los
macrófagos alveolares, y de esta forma, solo o acompañado de otros patógenos
virales, contribuye a la aparición posterior de neumonías bacterianas (Bagnis,
2000, MacLachlan y Dubovi, 2011, Caswell y Kurt, 2016).
La prevalencia generalizada de anticuerpos contra este patógeno indica que
circula con frecuencia en las poblaciones de rumiantes (Smith, 2010,
MacLachlan y Dubovi, 2011), y que estaría más implicado en la presentación de
la enfermedad respiratoria bovina de lo que se considera actualmente (Bagnis,
2000).
La seroprevalencia de BoPI3V sería aproximadamente un 45% (Carbonero et al., 2011).
2.4.
Orthopneumovirus
bovino
(ex
virus
sincitial
respiratorio bovino o BRSV)
El BRSV es un virus de ARN monocatenario, negativo, envuelto (MacLachlan y
Dubovi, 2011) que ha sido reclasificado en la familia Pneumovirinae, género Orthopneumovirus (ICTV, 2018). Su nombre deriva del efecto citopático
característico que produce tanto in vivo como in vitro, la formación de sincitios
(Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011), que son células multinucleadas
producto de la fusión de las membranas de varias células.
El BRSV carece de hemaglutinina y neuraminidasa; utiliza en su lugar una
proteína G como receptor (Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011).
El virus se disemina principalmente a través de aerosoles o excreciones del
aparato respiratorio de los animales enfermos (Smith, 2010), y la infección es
particularmente importante en terneros recién destetados y ganado joven
(MacLachlan y Dubovi, 2011). Los rumiantes parecen ser susceptibles a
reinfecciones durante toda la vida, inclusive en animales adultos (Smith, 2010).
Mediante la infección de las células del tracto respiratorio y la consecuente
8
destrucción del epitelio ciliado del aparato respiratorio (MacLachlan y Dubovi,
2011). A esto se suma una posible infección de los macrófagos alveolares, que
afectaría su capacidad de respuesta disminuyendo algunas de sus funciones
como la fagocitosis, expresión de receptores Fc, quimiotaxis de los neutrófilos
(Smith, 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011), y la actividad de mediadores de la
inflamación como los provenientes de las células mastoides degranuladas, que
en conjunto contribuyen a los cambios patológicos que se observan en los casos
severos (Smith, 2010).
Mediante estos mecanismos de patogenicidad es que el virus contribuye a la
aparición posterior de neumonías bacterianas y enfermedad respiratoria en el
bovino.
En un estudio reciente en feed-lots de nuestro país Ferella et al. (2017) determinaron que la prevalencia serológica de BRSV alcanza el 78,64%. En
rodeos lecheros la prevalencia estimada fue de un 46,6% (Carbonero et al., 2011)
2.5.
Coronavirus bovino (BoCV)
Los coronavirus bovinos son virus de ARN monocatenarios de sentido positivo,
envueltos, pertenecientes a la familia Coronaviridae (Smith, 2010). Son patógenos conocidos por causar enfermedades como la diarrea en terneros y
disentería en el ganado adulto, y por participar en los brotes de enfermedad
respiratoria en los bovinos (Smith, 2010; MacLachlan y Dubovi, 2011; Murray et
al., 2016). Como consecuencia de sus presentaciones tanto entéricas en animales jóvenes y adultos, como respiratorias, puede ser que el coronavirus se
encuentre recirculando entre poblaciones de variadas edades sin importar su
status inmunológico, con esporádica excreción viral por vía fecal o nasal
(MacLachlan y Dubovi, 2011).
En cuanto a la relevancia de este virus como patógeno respiratorio, existe cada
9
epidemias de enfermedad respiratoria de los bovinos (Smith, 2016; Murray et al.
2016).
2.6.
Adenovirus Bovinos
Son virus de ADN bicatenarios, desnudos, pertenecientes a la familia
Adenoviridae (Smith 2010, MacLachlan y Dubovi, 2011). Los adenovirus bovinos tienen tropismo tanto entérico como respiratorio (Murray et al., 2016).
En los rumiantes, estos virus han sido relacionados con diversas
manifestaciones de enfermedad como neumonía, enteritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis y “síndrome del ternero débil” (Smith, 2010, MacLachlan y
Dubovi, 2011).
3. Descripción de un nuevo agente viral involucrado en el CRB
“Virus de la influenza D (IDV)”
3.1.
Orthomyxovirus
La familia Orthomyxoviridae incluye virus con genomas compuestos por varios
segmentos (de 6 a 8, generalmente) de ARN de una hebra simple en sentido
negativo (MacLachlan y Dubovi, 2011). Los miembros más importantes dentro
de esta familia son los virus de la Influenza, que están incluidos a su vez en los
géneros designados como Influenza A, B y C. Se considera que los virus
Influenza que son patógenos para los animales pertenecen al género Influenza
A, mientras que los pertenecientes a los otros dos géneros (B y C) circulan
continuamente en las poblaciones humanas (MacLachlan y Dubovi, 2011). A su
vez, los virus pertenecientes al género Influenza A son reconocidos por causar
epidemias y pandemias en los humanos (MacLachlan y Dubovi, 2011), como ha
10
3.1.1.
Clasificación
Los virus Influenza poseen dos glicoproteínas de la envoltura que resultan claves
para su clasificación: la hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N). La primera se
acopla al receptor celular y media la fusión entre la envoltura y la membrana
endosómica, mientras que la segunda tiene como función el clivaje del ácido
siálico, receptor de la hemaglutinina (Acheson, 2011). Esto último es válido para
los géneros Influenza A y B, ya que la función de la neuraminidasa en los virus
Influenza C es llevada a cabo por una hemaglutinina esterasa (Hause et al., 2013).
Otras proteínas codificadas por su genoma comprenden la proteína integral de
membrana (M2) que forma canales de iones en la envoltura viral, permitiendo la
acidificación del interior de la partícula y la disociación de los complejos
ribonucleoproteicos, la proteína de la matriz (M1), la proteína de la nucleocápside
(NP), las ARN polimerasas (PA, PB1, PB2), dos proteínas no estructurales (NS1
y NS2), y la proteína no estructural adicional (PB1-F2) (Acheson, 2011). El
interés de algunas de estas proteínas radica en el grado de conservación de las
mismas y, en consecuencia, de su uso para la construcción de árboles
genealógicos de los virus de la influenza. (Acheson, 2011, MacLachlan y Dubovi,
11
Figura 1: Diagrama esquemático del virión del virus influenza con sus proteínas (Extraído de:
Acheson, N.H., Fundamentals of Molecular Virology, 2011).
3.1.2.
Determinantes de patogenicidad
Entre los principales factores moleculares de patogenicidad de los virus de la
Influenza, se encuentra la hemaglutinina, que cumple el rol de anti-receptor viral,
es decir, se une a los receptores celulares y media la fusión de la envoltura del
virión con la membrana endosómica (Acheson, 2011). La hemaglutinina debe ser
clivada post-traducción para que el virus sea infeccioso (Mahy y Regenmortel,
2008, MacLachlan y Dubovi, 2011), lo que establece una clara relación entre este
evento y la virulencia. Las cepas aviares designadas como altamente patógenas
(HPAI virus o high-pathogenicity avian influenza virus, por sus siglas en inglés)
poseen numerosos aminoácidos básicos en el sitio de clivaje de la
hemaglutinina, por lo que este mecanismo puede ser desencadenado por
cualquier endopeptidasa ubicua en el aparato de Golgi, lo que amplía el rango
de tipos celulares capaces de producir partículas virales infecciosas (Mahy y
Regenmortel, 2008, Acheson, 2011, MacLachlan y Dubovi, 2011). En contraste,
12
clivaje, por lo cual su capacidad de producir descendencia virulenta se ve
reducida a aquellas células que poseen proteasas capaces de clivar la arginina.
Otro factor molecular de patogenicidad es la proteína NS1, que actúa como un
antagonista o bloqueador de la producción de interferón por parte de las células
infectadas, interfiriendo tanto con la producción de Interferón beta, como con la
activación de genes inducidos por interferón requeridos para establecer el estado
antiviral (Mahy y Regenmortel, 2008). Las proteínas NS1 de diferentes virus de
la influenza parecieran tener diferentes capacidades de anular al sistema de
producción de interferón, lo que afecta a su vez la patogenicidad de las distintas
cepas virales. De esta manera, los virus de la influenza contrarrestan las
defensas antivirales innatas del hospedador, aunque se desconoce a ciencia
cierta cuál es el mecanismo por el cual dicha proteína produce este bloqueo
(Mahy y Regenmortel, 2008, MacLachlan y Dubovi, 2011).
La proteína PB1-F2 también interferiría con mecanismos de este último tipo,
induciendo un aumento de la apoptosis de las células de la inmunidad del
hospedador que responden a la infección por el virus de la influenza (Acheson,
2011).
3.2.
Identificación y aislamiento de un virus de la Influenza
C en cerdos
Los primeros indicios científicos de este nuevo género de virus de influenza
datan de abril del año 2011, cuando fueron remitidas a Newport Laboratories
(Worthington Minnesota, USA), muestras nasales de un cerdo de 15 semanas
con signos de enfermedad semejantes a los de la influenza, para aislamiento
viral (Hause et al., 2013). Las muestras originales y las obtenidas a partir de los
pasajes en diversos cultivos celulares resultaron negativas a la rt-RT-PCR para
virus Influenza A. Sin embargo, las mismas muestras inoculadas en cultivos de
células testiculares de cerdo mostraron efectos citopáticos característicos de
13
El secuenciamiento del genoma demostró una modesta homología (53%) con
los virus del género Influenza C (ICV), y por ende fue provisionalmente
designado como C/Swine/Oklahoma/1334/2011 (C/Ok) (Hause et al., 2013, 2014), y considerado como una nueva variante o subtipo de ICV (Hause et al.,
2013). Los fundamentos para esta clasificación provisoria fueron, entre otros, el
grado de relación de PB1, la proteína más conservada en los virus de la influenza
y que se usa para evaluar relaciones evolutivas entre los mismos (Acheson,
2011). Las características de esta proteína relacionan este aislamiento con los
virus de la gripe tipo C (Hause et al., 2013). También se consideraron la organización de su genoma (7 segmentos ARN) y las similitudes entre las
regiones codificantes y no codificantes (Hause et al., 2014).
En contrapartida a esto, existen otras características, propiedades o cualidades
del aislamiento de C/Ok que lo alejan de la clasificación dentro de los virus de la
influenza C y lo posicionan como un subtipo nuevo de los mismos. Las relaciones
evolutivas que se pudieron establecer al analizar las características de otras
proteínas de los virus de la influenza (como por ejemplo PB2, HE/HA, NS1, NP
y M, entre otras), marcaban una divergencia filogenética similar a la existente
entre los virus de la Influenza A y B (Hause et al., 2013, 2014).
También existen diferencias de tropismo celular, en las cuales C/Ok demuestra
tener un tropismo in vitro más amplio que otros ICV humanos, y carece de restricción de temperatura de replicación (Hause et al., 2013).
Mediante la prueba de “reordenamiento genético in vitro”, llevada a cabo para
dilucidar si este nuevo virus C/Ok utiliza el reordenamiento como potencial
mecanismo de evolución viral y la producción de nuevas variantes antigénicas
(interesante desde el punto de vista de la salud pública), permitió entender
también el estado taxonómico de C/Ok, ya que, por definición, todos los
miembros de un género de los virus de la Influenza pueden reordenarse entre sí
y generar una progenie viable (Mahy y Regenmortel, 2008, Acheson, 2011,
MacLachlan y Dubovi, 2011). En esta prueba, los representantes del género ICV humanos se reordenaron entre sí, y los ICV “animales” (C/Ok y los otros “C/Ok-like” aislados de bovinos con enfermedad respiratoria) también se reordenaron
14
reordenamientos entre los ICV humanos y los “ICV animales” serían incapaces
de generar progenie o descendencia viable. Los resultados de esta prueba
fueron la primera “evidencia funcional” de que este nuevo grupo de virus es
genéticamente distinto de los ICVs humanos típicos y que representa un nuevo
género de los virus de la Influenza dentro de la familia Orthomyxoviridae (Hause
et al., 2014).
En cuanto a las reacciones cruzadas de anticuerpos, mediante la prueba de
inmunodifusión en gel de agar, que normalmente se utiliza para diferenciar
serológicamente los géneros de los virus de la Influenza (Acheson, 2011), no se
detectaron reacciones cruzadas de anticuerpos policlonales entre C/Ok y
C/Taylor (ICV humano de referencia), (Hause et al., 2014), de manera similar a
lo que se observó en la comparación con IAV e IBV.
En definitiva, son estas incongruencias las que sugerirían que C/Ok es una cepa
representativa de un nuevo género de los virus de la Influenza en la familia
Orthomyxoviridae.
Aunque las similitudes que mantiene con los ICVs son escasas, el análisis de relación filogenética sugiere que este nuevo posible “IDV” diverge de los ICVs
luego de la divergencia de IAV e IBV (Hause et al., 2014), con una relación de
divergencia similar a la que existe entre estos últimos dos géneros (Hause et al.,
15
Figura 2: Arboles filogenéticos de los 7 segmentos de los virus C/Ok bovinos (Extraído de: Hause
et al., 2014)
3.3.
Posibles hospedadores naturales y reservorios
Como se mencionó previamente, el “C/Ok” fue aislado en primera instancia de
un cerdo con síntomas de enfermedad similar a la influenza (Hause et al., 2013).
A su vez, los primeros modelos de infección en hurones y conejillos de indias
demostraban la posibilidad de transmisión del C/Ok a los humanos, dado que
son estos pequeños mamíferos los utilizados convencionalmente como modelos
de infección de los virus de la Influenza en humanos (Hause et al., 2013). Los
mismos revelaron también que el IDV infecta y replica en el tracto respiratorio
superior e inferior, y es capaz de ser transmitido a contactos cercanos (White et
al., 2016). También, se hipotetiza que la estructura de la proteína de unión al receptor celular del IDV es similar a la del ICV que es patógeno para los humanos
16
Estudios de vigilancia serológica/epidemiológica llevados a cabo en poblaciones
humanas y porcinas (316 y 220 sueros, respectivamente) demostraron bajos
títulos de anticuerpos para C/Ok en los sueros humanos, y a su vez se obtuvo
evidencia de la circulación del virus C/Ok en poblaciones porcinas (Hause et al.,
2013). Sin embargo, los bajos títulos y las bajas prevalencias sugirieron además,
que el virus tendría otro hospedador principal en el medio ambiente (Hause et al., 2013, 2014; Collin et al., 2014).
Es entonces cuando el hallazgo de títulos de anticuerpos más representativos,
una mayor distribución y una aún mayor facilidad de aislamiento del virus C/Ok
se ponen en descubierto cuando se analizan sueros bovinos (Hause et al., 2014,
Collin et al., 2014, Luo et al., 2017).
En USA, un porcentaje relativamente alto de muestras del aparato respiratorio
de bovinos con enfermedad respiratoria manifiesta resultaron positivas a un virus
similar al C/Ok mediante rt-RT-PCR (Hause et al., 2014). Un estudio serológico de C/Ok mostró una alta prevalencia del virus, o “virus-like” en rodeos bovinos
de USA. En este estudio se enfrentaron sueros provenientes de 8 rebaños
(11-27 animales cada uno) de 5 estados diferentes, y diferentes condiciones
productivas, contra C/Ok y C/660 Ag (virus similar al C/Ok), y donde, con
excepción de un rodeo, todos tuvieron títulos elevados de anticuerpos (mayores
a 40) para ambos virus (Hause et al., 2014, Collin et al., 2014). Los porcentajes
de animales positivos y la magnitud de los títulos fueron similares a los valores
que se observan para el IAV en las aves acuáticas, reservorios naturales de la
enfermedad en el medio ambiente, lo que hace pensar en los bovinos como
reservorio natural para el IDV (Hause et al., 2014).
Estudios retrospectivos de archivos de sueros bovinos colectados en el estado
de Nebraska (USA), en rodeos de cría entre 2003/2004 y 2014 en busca de
anticuerpos contra IDV demostraron que las 40 granjas seleccionadas al azar
contenían adultos seropositivos y que aproximadamente 98% de los recién
nacidos tenían altos niveles de anticuerpos maternos contra IDV (Luo et al., 2017), lo que sugiere que el ganado de Nebraska está expuesto al IDV al menos
desde 2003. Resultados similares se obtuvieron en un estudio con sueros
17
prevalente en algunos rodeos de cría, con exposiciones desde, al menos 2004,
y altos niveles de anticuerpos maternos (94% positivos a IDV) en terneros 24-36
horas post-nacimiento (Ferguson et al., 2015).
En lo que respecta a otros animales de granja, existen evidencias obtenidas a
partir de estudios serológicos en pequeños rumiantes (cabras/ovejas) y aves de
granja (gallinas/pavos). En uno de los mismos, 648 muestras de suero de
cabras/ovejas y 250 de gallinas y pavos de 141 y 25 granjas de pequeños
rumiantes y producción avícola, respectivamente, de diferentes áreas
geográficas de USA, se analizaron mediante inhibición de la hemaglutinación
(IHA) y seroneutralización (Quast et al., 2015). Los resultados de este análisis
revelaron que los pequeños rumiantes son susceptibles a la infección con IDV, y
que existe evidencia serológica de la presencia del virus en cabras y ovejas de
USA por lo menos desde 2002 (Quast et al., 2015).
Llamativamente, en el estudio de Quast et al. en 2015, todos los sueros de granjas de producción avícola resultaron negativos a IDV.
Con respecto a los humanos, como se mencionó previamente, los títulos de
anticuerpos para IDV son bajos. Se estima que la seroprevalencia de IDV en la
población humana en general es del 1,3% (White et al., 2016).
Aunque no existe información concluyente y los resultados son preliminares, un
estudio serológico utilizando la prueba de IHA demostró que en un estado de
USA, en personas con contacto ocupacional con el ganado, es decir,
trabajadores de la hacienda, existe una prevalencia de 91% (White et al., 2016),
lo que confirma que los mismos tuvieron un riesgo de exposición mayor al IDV y
que este último podría ser un patógeno emergente en trabajadores rurales,
teniendo en cuenta otros aportes de la bibliografía.
El análisis filogenético también evidencia que existen dos linajes distintos de IDV
co-circulando en el ganado bovino de USA (Collin et al., 2014), y en pequeños
rumiantes como cabras y ovejas (Quast et al., 2015), y que sufren reordenamiento frecuentemente. Entonces, al igual que ICV, IDV consiste en un
solo subtipo con linajes co-circulantes. IDV es endémico en el ganado bovino,
así como ICV lo es en los humanos, aunque ambos sean capaces de infectar
18
Recientemente, tres cepas del IDV fueron aisladas en bovinos en China con un
grado de homología del 95 al 99 % con respecto a las encontradas en USA
(Collin et al., 2014). También en Francia se aislaron cepas homólogas a las de
USA (Ducatez et al., 2015), lo que sugiere o hace pensar en una distribución mundial del IDV, como así también pareciera que existe un origen común de
todas estas cepas o variantes encontradas en los distintos países (Collin et al.,
2014, Ducatez et al., 2015)
Entonces, desde que fue identificado en 2011, el IDV fue aislado de ganado
bovino y/o porcino en USA, China, Francia, Italia y Japón, y la evidencia
serológica sugiere que además puede afectar a pequeños rumiantes, tales como
cabras y ovejas (Hause et al., 2013, 2014, Collin et al., 2014, Ducatez et al., 2015, Ferguson et al., 2015, Quast et al., 2015, Luo et al., 2017).
3.4.
IDV y enfermedad respiratoria en el bovino.
A raíz de la información presentada que postula al ganado bovino como principal
hospedador natural de este nuevo género de virus de la influenza, IDV (Hause
et al., 2014, Collin et al., 2014, Ferguson et al., 2015), y de la importancia económica de la enfermedad respiratoria en los bovinos, surgen las siguientes
preguntas: ¿Es el IDV participe en la ERB o CRB? Y de ser así, ¿Qué rol ocupa
en el mismo?
Un análisis de secuenciamiento metagenómico demostró que el IDV es uno de
los agentes virales más comúnmente identificados en terneros lecheros del
estado de California diagnosticados con ERB (Ferguson et al., 2015), sugiriendo
una posible correlación entre IDV y ERB.
El IDV es comúnmente detectado en muestras de animales con ERB, y la
incidencia del mismo resulta ser similar a la de otros patógenos reconocidos que
19
La presencia de linajes co-circulando reafirma la idea de que IDV es endémico en el ganado bovino y que estos virus sufren “reordenamiento” frecuentemente.
Las diferencias antigénicas observadas entre las cepas pueden llegar a ser de
importancia si el rol del IDV como patógeno en la ERB se confirmara (Collin et
al., 2014).
Tanto el IDV como el coronavirus bovino (BoCV) usarían el mismo receptor para
unirse a las células del hospedador, y ya se ha demostrado en estudios
anteriores que la acetilesterasa del BoCV, la cual está involucrada en la remoción
de receptores para facilitar la liberación de la progenie viran, también remueve
receptores del ICV. Teniendo el IDV mayor tropismo celular que el ICV, podría
existir una sinergia entre IDV-BoCV (Collin et al., 2014) que influya en la presentación de la enfermedad respiratoria.
En cuanto a la patogenia del IDV, Ferguson et al. (2016) demostraron que el virus puede infectar al ganado y puede transmitirse eficientemente por contacto
directo. Si bien la enfermedad resultante no es grave, los animales infectados
muestran signos de enfermedad respiratoria e inflamación del tracto respiratorio.
En terneros seronegativos, la infección con IDV indujo una reducción leve,
multifocal, del epitelio traqueal e infiltración neutrofílica (Ferguson et al., 2016).
Esto resulta interesante, ya que los neutrófilos son importantes para guiar a las
células TCD8+ específicas de influenza en las vías respiratorias. En general el
IDV replica en cornetes nasales del ganado bovino y otros modelos animales,
como cerdos, hurones y conejillos de indias infectados, y puede ser detectado
en lavados nasales. Además, es posible su transmisión por contacto directo entre
miembros de la misma especie (Ferguson et al., 2016). Algunos estudios sugieren que es posible detectar el genoma de IDV en pulmón mediante el uso
de RT-PCR, pero en muchos de ellos no se detecta antígeno vía
inmuno-histo-química (IHQ) y no existe evidencia de patología pulmonar severa (Ferguson et
al., 2016), sugiriendo que el IDV se caracteriza por ser una infección del tracto respiratorio superior.
Si bien se encontraron diferencias con respecto a la carga viral y distribución
entre los distintos modelos animales (Ferguson et al., 2016), esto podría deberse
20
recordando que el modelamiento estructural del mismo sugiere que, de manera
similar al ICV, se uniría al ácido 9-0-acetil siálico (Hause et al., 2013).
Con respecto a la relación que se puede establecer entre los hallazgos de
vigilancia epidemiológica que asocian a IDV con la enfermedad respiratoria en el
campo, que indican que el IDV estaría ampliamente distribuido en los rodeos
bovinos de diferentes estados de USA (Ferguson et al., 2015, Luo et al., 2017) y
la patogenia viral, surge una controversia, ya que en los terneros infectados
experimentalmente la enfermedad se caracterizó por presentar síntomas leves,
y, consistentemente, el daño epitelial fue mínimo (Ferguson et al., 2016). Por lo
tanto, se hipotetiza que el daño leve inducido por IDV en estos terneros
infectados experimentalmente podría ocasionar inflamación y otras alteraciones
ya descriptas (Ferguson et al., 2016), que podrían facilitar las co-infecciones con
otros patógenos bovinos. El IDV formaría parte importante del CRB, pero su sola
acción no sería suficiente para causar enfermedad, teniendo en cuenta que,
como ya fue expresado previamente, se considera al BRD como una enfermedad
multifactorial, que se inicia por la acción de infecciones por patógenos virales
seguidos por colonización bacteriana secundaria del tracto respiratorio superior
e inferior. También es probable que otras condiciones como el clima, transporte
y confinamiento contribuyan a una presentación más severa en el campo
(Ferguson et al., 2016), cuando se las compara con las infecciones experimentales.
En resumen, lo que hasta ahora podemos aseverar, con respecto a la patogenia
y transmisión, es que el IDV puede causar lesiones del tracto respiratorio
superior y enfermedad respiratoria leve en el ganado, y que puede ser
transmitido efectivamente entre los bovinos por contacto directo y probablemente
indirectamente por aerosoles y fómites, aunque no se demostró la transmisión a
21
4. Impacto productivo del CRB en la producción de bovinos de
carne y leche
No existe demasiada información disponible en la bibliografía acerca de los
efectos del CRB sobre la productividad. A pesar de esto, ciertos autores aportan
datos y estudios que ayudan a entender las pérdidas productivas que sufren los
animales que padecen esta enfermedad.
Sin lugar a dudas, los principales datos sobre los efectos del CRB sobre la
producción hacen referencia a los sistemas productivos de bovinos de carne,
más precisamente en los sistemas de engorde a corral o feed-lot.
Las pérdidas en general se deben a la mortalidad, costos de tratamiento y
reducción de la productividad por animal, que en el año 2000, en Argentina, por
ejemplo, se calculaba alrededor de $ 30-32 por animal enfermo (Bagnis, 2000).
El CRB es responsable de aproximadamente 45-55% de las muertes en
feed-lots de USA (Johnson y Pendell, 2017).
Algunos de estos estudios que analizan el impacto económico del CRB combinan
el uso de datos sanitarios con puntajes asignados a las lesiones pulmonares
observadas en el matadero. Los resultados indican que la morbilidad por el CRB
y la extensión del tratamiento (es decir, animales que tienden a recibir mayor
cantidad de tratamientos porque no se curan o tienden a la cronicidad de la
enfermedad) tienen grandes consecuencias en los rasgos de performance y
carcasa medidos en matadero (Schneider et al., 2009).
Estos efectos adversos sobre los rasgos productivos están caracterizados por
ser mayormente pérdidas en la performance durante la etapa temprana de
alimentación luego del ingreso al feed-lot (Schneider et al., 2009), aunque posteriormente se observa algún grado de ganancia compensatoria en el ganado
tratado que supera la enfermedad.
Existe también un aumento de costos por animal que se desprende de un
incremento en la cantidad de días que deben permanecer en el feed-lot para
22
por CRB permanecen en promedio 2,6 días más que los no tratados (Buchanan
et al., 2016).
También, los retornos netos por cabeza decrecen a medida que aumentan los
tratamientos por CRB en las fases de adaptación, terminación, y en ambas
combinadas, sumado a otra disminución de retornos significativamente altos
producto de la muerte de animales en la fase de adaptación (Brooks et al., 2009).
Como se mencionó anteriormente, a medida que el número de tratamientos
aumenta y la enfermedad tiende a la cronicidad, la performance disminuye. En
comparación con el ganado tratado, el no tratado (es decir, que nunca enfermó),
tiene más estimaciones deseables para todos los rasgos de carcasa y puntaje de marbling o “marmolado” de la carne. Además, el ganado no tratado tiene más
peso a la faena y presenta tendencia a ser más musculado, y los animales
crónicamente enfermos o tratados al menos 3 veces caen por debajo del
estándar deseado con una frecuencia cinco veces mayor (Schneider et al., 2009).
En cuanto al costo por tratamientos, un estudio de 2011 en USA demostró que
un estimativo de 21,2% del ganado de feed-lots (aproximadamente 2,29 millones
de cabezas) fue afectado por la enfermedad respiratoria. El costo directo de
tratamiento por cabeza fue de aproximadamente USD$ 24, el costo total por
tratar 2,29 millones de animales equivale a USD$ 54 millones, sin incluir las
pérdidas por producción y mortalidad (Johnson y Pendell, 2017).
Con respecto a los datos de nuestro país, el análisis de información
epidemiológica de la enfermedad recabada por el Grupo de Sanidad Animal del
INTA Balcarce indica que el costo debido a un brote de CRB en un lote de
recría/invernada es de unos 2600 kg de carne por cada cien animales (Odeón,
2015).
Existe una cierta tendencia a subestimar el CRB en el ganado lechero, producto
tal vez de la importancia de otras patologías más estudiadas en el mismo o de
otros factores que la posicionan más fuertemente como una enfermedad que
afecta principalmente al feed-lot. Pese a esto, hay información que esclarece en
23
Si tenemos en cuenta la pérdida de terneras de recría y reposición, durante el
primer mes de vida la diarrea es la principal causa de muerte, seguida de la
neumonía o enfermedad respiratoria (González Martín, 2010), y algunos autores
estipulan que, más allá de otros factores incidentes, se espera como regla
general que de cada 4 o 5 terneros con cuadros clínicos, uno de ellos muera
(Berra y Osacar, 2007). A partir del primer mes de vida, la neumonía es el
principal origen de las muertes hasta la época de recría inclusive, originando
importantísimas pérdidas económicas sobre todo en las vaquillonas, que serán
la futura reposición del tambo (Berra y Osacar, 2007, González Martín 2010).
Además, como se mencioné anteriormente, es importante destacar los costos
indirectos como consecuencia de la alteración de índices productivos,
principalmente la disminución de la ganancia de peso, la cual puede alcanzar la
pérdida de 66 g/día en el primer mes (Virtala et al., 1996). Neumonías tempranas, entre los 0 y 6 meses de edad reducen la ganancia de peso en este período
hasta en 11 kg, y afectan la ganancia en períodos posteriores (hasta 14 meses)
reduciéndolas hasta en 30 kg (Van der Fels-Klerx et al., 2002).
Todo esto, consecuentemente, causa un retraso de la ganancia de peso,
crecimiento y desarrollo a los 14 meses, atrasa la edad al primer servicio 3 o más
meses (Van der Fels-Klerx et al., 2002) por lo cual la edad al primer parto se
atrasa desde unos días hasta 6 meses, lo que agrava el problema de la falta de
recría y reposición del tambo (González Martín, 2010).
Estudios experimentales.
1. Hallazgos serológicos y virológicos del virus de la influenza
D
1.1.
Muestras
Para esta parte del trabajo, se analizaron muestras de tejido respiratorio y de
24
Se analizaron 258 sueros de animales de los cuales se desconoce si presentaron
o no enfermedad respiratoria asociada. Todos los sueros provenían de animales
de establecimientos ubicados en la zona de influencia de la FCV UNCPBA, y se
distribuían en categorías de la siguiente manera: 81 animales adultos (tanto
vacas lecheras como de producción de carne), 58 terneros/as, 48 vaquillonas de
producción de carne y 71 vaquillonas de producción lechera.
Para el ensayo de detección de genoma viral, se analizaron 65 muestras de
pulmón y 21 muestras de otros tejidos del aparato respiratorio (linfonódulos
bronquiales y mediastínicos y mucosa nasal) de animales que presentaron o no
enfermedad respiratoria previa. Estas muestras también provenían de animales
de establecimientos de la zona de influencia de la FCV UNCPBA.
1.2.
Lugar de trabajo
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Virología del ENVT (École
Nationale Vétérinaire Toulouse, Francia), Unidad Mixta de Investigación 1225,
Interacción Huéspedes-Agentes Patógenos, INRA (Unié Mixte de Recherche
1225 Interaction Hôtes-agents pathogènes, Institute Nationale de la Recherche
Agronomique).
1.3.
Metodología
Para los sueros bovinos, se realizó el ensayo de inhibición de la hemaglutinación
para detección de anticuerpos contra el virus de la influenza D, mientras que en
las muestras de pulmón y otros tejidos respiratorios se realizó detección de
genoma viral por medio de RT-qPCR (Reacción en cadena de la polimerasa
25
1.4.
Breve descripción bibliográfica de las técnicas y su
fundamento
1.4.1.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación
Los virus de la influenza aglutinan los eritrocitos mediante la interacción entre la
glicoproteína de superficie viral, la hemaglutinina (HA), y los receptores en la
superficie de los glóbulos rojos. Si las partículas virales se encuentran presentes
en cantidad suficiente, la interacción de la proteína HA con los eritrocitos formará
una red o enrejado entre estas células previniendo o evitando su asentamiento
o precipitado como un pequeño botón en el fondo del tubo o placa. La
aglutinación de los eritrocitos es la base del ensayo de hemaglutinación. Por otro
lado, el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IHA por sus siglas en inglés)
permite detectar la presencia de anticuerpos específicos de subtipo viral
(Pedersen, 2014).
El ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IHA) es un procedimiento clásico
de laboratorio para la clasificación o sub-tipificación de los virus hemaglutinantes.
Para los virus de la influenza, la IHA se utiliza para identificar el subtipo de HA
de un aislamiento desconocido, o la especificidad de los anticuerpos contra un
subtipo determinado de HA. El test IHA es un procedimiento relativamente rápido
y poco costoso que utiliza equipamiento estándar de laboratorio (Acheson, 2011,
26
Figura 3: Representación esquemática de los pasos del test IHA. (1) Incubación de virus y suero;
(2) los anticuerpos presentes se unen al virus; (3) Adición de glóbulos rojos; (4) Los anticuerpos
bloquean al virus e impiden su unión a los glóbulos rojos. (Extraído de: Spackman, E., Animal
Influenza Virus, 2014).
1.4.2.
Detección de genoma viral mediante RT-qPCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción enzimática in
vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante
varios ciclos repetitivos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que
tiene la capacidad de sintetizar ADN naturalmente en las células. En la reacción,
si se usa como sustrato ADN genómico, hablamos típicamente de una PCR, pero
si en cambio se usa ADN complementario (ADNc) proveniente del ARN, se le
conoce como RT-PCR (Reverse transcription-PCR, por sus siglas en inglés).
Esta conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción
reversa, ejecutada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de sintetizar ADNc
a partir de una molécula de ARN. La transcriptasa reversa que se utiliza en esta
técnica proviene de los retrovirus, que utilizan esta enzima para sintetizar ADN
27
La reacción de PCR “real time” o “en tiempo real” hace referencia a la capacidad
de esta técnica para detectar y simultáneamente cuantificar las secuencias
específicas de ácidos nucleicos en cada ciclo de la reacción mediante el uso de
reporteros fluorescentes. La fluorescencia emitida en cada ciclo se grafica en la
curva de amplificación. Esto permite analizar y cuantificar el producto de
amplificación obtenido en cada ciclo (Tamay de Dios et al. 2013).
1.5.
Materiales y métodos
1.5.1.
Ensayo de inhibición de
la hemaglutinación
El virus de referencia utilizado para la prueba fue el IDV/Nebraska, y las muestras
se procesaron y analizaron bajo el siguiente protocolo:
Tratamiento con RDE (receptor destroying enzyme), para la eliminación de
inhibidores no específicos de la hemaglutinación.
Reconstitución del RDE.
Dilución ¼ del suero (50 ul suero + 150 ul RDE).
Incubación durante toda la noche a 37°C.
Inactivación a 56°C durante 30 min.
Dilución final de los sueros: adición de 300 ul de PBS a cada suero (dilución final
1/10).
Hemadsorción para inhibición de aglutininas específicas: a cada muestra se le
agregan 5 a 20 ul de glóbulos rojos y se incuban a 4°C durante al menos una
hora, en agitación. Luego se centrifuga y trasvasa el suero.
IHA: Previo a la realización de la prueba debe titularse el antisuero viral de
referencia a 8 UHA/50ul y preparar los glóbulos rojos al 1%. Para la prueba, se
28
Colocar 25ul de PBS en todos los pocillos de la placa, excepto la primera línea.
Colocar 50ul de suero en la primera línea de la placa.
Realizar la dilución ½ vertical de los sueros (de 1:10 a 1:640)
Adición de 25ul de antisuero viral a todos los pocillos.
Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
Adición de 50ul de glóbulos rojos en todos los pocillos.
Incubar a 4°C por 40 minutos.
Lectura de las placas.
Los títulos de anticuerpos se expresaron como media geométrica (GMT).
1.5.2.
Ensayo de detección de genoma viral por
RT-qPCR
El ARN viral a partir de las muestras de tejido se obtuvo mediante el uso de un
kit comercial (QIAmp Viral RNA, Quiagen, USA).
Se procedió a la qPCR utilizando un kit comercial (QuantiNova Probe
RT-PCR, Quiagen, USA), siguiendo las instrucciones del elaborador.
1.6.
Resultados
1.6.1.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación
Se consideró suero positivo a aquel con un título de anticuerpos igual o superior a 20 (límite inferior o “cutoff”).
El 50,3% (130 de 258) de los sueros presentó títulos de anticuerpos igual o
29
adultos y los terneros fueron las categorías con mayor porcentaje de títulos de
anticuerpos, siendo el 68% (55 de 81) y el 55% (32 de 58) de los animales
positivos para cada grupo, respectivamente. Ambos grupos superaron la media
general del título de anticuerpos (título medio IHA=30,25). En cuanto a las
categorías de vaquillonas, un 45% (32 de 71) de las muestras de hembras de
producción lechera superaron los títulos de 20, mientras que las vaquillonas
productoras de carne lo hicieron en un 23% (11 de 48), presentando el porcentaje
más bajo de las 4 categorías (Tabla 1 y Figura 4).
1.6.2.
Ensayo de detección de genoma viral por
RT-qPCR
No se detectó la presencia del genoma de IDV en ninguna de las muestras de
animales con o sin enfermedad respiratoria manifiesta analizados mediante
RT-qPCR.
1.7.
Discusión y conclusión
En lo que respecta a los análisis de los sueros bovinos, los títulos encontrados
confirman la presencia de animales seropositivos en rodeos de la Argentina, más
específicamente en la zona de influencia de la FCV UNCPBA. Si bien los
porcentajes de títulos no son tan altos como los encontrados en la bibliografía
(principalmente las publicaciones de rodeos provenientes de USA), este estudio
permite confirmar que los animales adultos y los terneros jóvenes son las
categorías en las que se encuentra la mayor proporción de animales con
anticuerpos anti-IDV, consistentemente con lo que indica la bibliografía de
referencia (Collin et al., 2014; Ferguson et al., 2015; Luo et al., 2017). También
es importante destacar que aunque las categorías de vaquillonas presentan
porcentajes de seropositividad inferiores, incluso a la media del estudio,
igualmente existen animales seropositivos en este grupo. Los hallazgos
serológicos evidencian que estos animales estuvieron en contacto con el IDV,
independientemente de si presentaron o no signos de enfermedad respiratoria
feed-30
lot, la producción intensiva en la cual el CRB se presenta con mayor frecuencia,
por lo cual los estudios posteriores que involucren a esta categoría de animales
podrían aportar información más concluyente.
Un estudio seroepidemiológico en bovinos del norte y oeste de África también
reveló que los títulos de anticuerpos eran bajos, con medias geométricas de los
títulos de IHA que variaban entre 13 y 42 (Salem et al., 2017). Un estudio similar
en bovinos de Japón demostró que un promedio del 30,5% de los bovinos
muestreados presentaba anticuerpos anti-IDV con títulos superiores a 40, con
variaciones en los porcentajes entre 13,5% y 50%, dependiendo de la región
geográfica. También observaron un aumento en el porcentaje de seropositividad
en animales adultos (Horimoto et al., 2016).
Un factor que debe considerarse es que la cepa de referencia utilizada en el
estudio de IHA puede ser en cierto gado divergente de las cepas circulantes en
nuestro país y por lo tanto estos resultados pueden subestimar la prevalencia
real de circulación del IDV en los rodeos argentinos.
El IDV es un patógeno que causa principalmente infecciones en el aparato
respiratorio superior, por lo cual el hecho de no haber detectado el genoma viral
en las muestras de pulmón no resulta alarmante y es consistente con lo
encontrado en la bibliografía. También, debe considerarse que no todas las
muestras de pulmón provienen de animales que presentaron enfermedad
respiratoria. Por otro lado, si bien se analizaron mediante la misma técnica
muestras de tejidos del aparato respiratorio superior (mucosa nasal), las mismas
son pocas, por lo cual pueden no ser representativas con respecto al total de
muestras analizadas. Flynn et al. (2018) analizaron 320 muestras de secreciones
nasales mediante RT-qPCR y detectaron el genoma del IDV en 18 (5,6%)
hisopados, 7 de los cuales correspondían a terneros, lo cual también demuestra
que a pesar del escaso número de muestras positivas, las muestras de tracto
respiratorio superior son de elección para la identificación de IDV. Del mismo
modo, Zhai et al. (2017) detectaron el genoma del IDV en 12,8% de hisopados
nasales de vacas Holstein provenientes de tres regiones distintas de China,
31
Tabla 1: Media geométrica (GMT) de los títulos de anticuerpos IDV en los sueros analizados.
(GMT: Media geométrica; %pos: Porcentaje de sueros positivos).
32
Bibliografía:
-Acheson, N.H. (2011). Influenza Viruses, pp 210-215. In: Acheson, N.H. (Ed),
Fundamentals of Molecular Virology, Second Edition, Wiley editions.
-Andrews, A.H. (2004). Respiratory diseases (Growing cattle), pp 286-292. In:
Andrews, A.H. (Ed), Bovine Medicine, diseases and husbandry of cattle, second
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