bioremediacion de metales por EPS bacterianos

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(1)Instituto Politécnico Nacional. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA – Querétaro. POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA. Remoción de metales por microorganismos productores de polisacáridos. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA. Presenta:. IQI. Diana Guadalupe Cruz Vega Directoras de tesis:. Dra. Norma G. Rojas Avelizapa Dra. Luz I. Rojas Avelizapa. Santiago de Querétaro, Qro. Junio de 2008.

(2) b.

(3) Agradecimientos,. A la Dra. Norma G. Rojas Avelizapa y la Dra. Luz I. Rojas Avelizapa por su asesoría y apoyo para este trabajo de tesis. A el Dr. Jaime García-Mena y la M en C. Elsa Cervantes Gonzáles agradezco su valiosa asesoría en la identificación por métodos moleculares realizada en el Laboratorio de Genómica Ambiental del CINVESTAV Zacantenco. A la Lic. Claudia Reyes por su intermediación para realizar la cuantificación de metales en el Laboratorio de Metalurgia de la Facultad de Química de la UNAM . A la Dra. Eva González Jasso, Dr. Pedro A. Vázquez Landaverde y al Dr. Reynaldo Pless Elling por la revisión detallada y sugerencias para mejorar el contenido de esta tesis. A mis compañeras y compañeros (Griselda, Giovanna, Lupita, Wendy, Sagrario, Vicente, Sara, etc.) así como al personal del CICATA Querétaro por todo su apoyo brindado. Y ante todo al CICATA-Querétaro y al Instituto Politécnico Nacional por brindarme la oportunidad de continuar con mi preparación académica.. Esta tesis de maestría contó con el financiamiento de la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) del IPN, con clave: 20070222, así mismo agradezco al CONCAYT por la beca otorgada.. c.

(4) Dedicatoria,. Este trabajo está dedicado a mis hijos: Bruno, Paulina, Sebastián, y a mi esposo: José Luis, pues fueron mi principal motivación e inspiración para lograr esta meta. Gracias también a toda mi familia (aunque no los mencione a cada uno) pues sin ustedes no habría sido posible llegar hasta donde ahora estoy.. d.

(5) ÍNDICE ÍNDICE.... ......................................................................................................................................................................... i Índice de figuras........................................................................................................................................................... iv Índice de tablas ...............................................................................................................................................................v Resumen.. ........................................................................................................................................................................ vi Summary........................................................................................................................................................................ vii 1.. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 1. 1.1 1.1.1 1.2. Problemática de la contaminación por metales .......................................................................... 1 Metales de importancia por sus características tóxicas .......................................................... 4 Tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales ............................... 6. 1.2.1. Tratamientos físico-químicos ............................................................................................................. 8. 1.2.2. Tratamientos biológicos........................................................................................................................ 9. 1.2.2.1 Fitorremediación ...................................................................................................................................... 9 1.2.2.2 Biorremediación....................................................................................................................................... 9 1.3. Polisacáridos microbianos ................................................................................................................. 10. 1.3.1. Composición ............................................................................................................................................ 11. 1.3.2. Importancia biológica .......................................................................................................................... 13. 1.3.3. Importancia comercial ........................................................................................................................ 14. 1.4. Antecedentes indirectos ...................................................................................................................... 16. 1.4.1. Capacidad de remoción de metales por microorganismos .................................................. 16. 1.4.2. Mecanismos de remoción de metales por microorganismos ............................................... 19. 1.4.2.1 Bioabsorción ............................................................................................................................................ 20 1.4.2.2 Bioacumulación ...................................................................................................................................... 20 1.4.2.3 Biomineralización.................................................................................................................................. 20 1.4.2.4 Quimisorción mediada por microorganismos ........................................................................... 20 1.4.3 Estudios de remoción de metales por microorganismos productores de biopolímeros.. ........................................................................................................................................................... 20 1.4.3.1 Microorganismos involucrados en la remoción de metales ................................................. 22 1.5. Antecedentes directos .......................................................................................................................... 24. 2.. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................. 25. 3.. OBJETIVOS............................................................................................................................................ 26. 3.1. Objetivo general ..................................................................................................................................... 26. 3.2. Objetivos específicos ............................................................................................................................ 26. i.

(6) 4.. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 27. 4.1. Fuente de microorganismos y caracterización.......................................................................... 27. 4.1.1. Morfología colonial y tinción de Gram ........................................................................................ 27. 4.1.2. Tinción de esporas................................................................................................................................. 27. 4.1.3. Tinción de cápsula................................................................................................................................. 28. 4.1.4. Tinción de polisacáridos extracelulares ....................................................................................... 28. 4.1.5. Tinción de cristales paraesporales ................................................................................................. 29. 4.2. Identificación de microorganismos por amplificación parcial de 16S rDNA .............. 29. 4.2.1. Extracción de ácidos nucleicos totales .......................................................................................... 29. 4.2.2. Caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos totales .............................................. 30. 4.2.3. Amplificación de la región 16S rDNA .......................................................................................... 30. 4.2.4. Secuenciación de los productos de PCR ...................................................................................... 31. 4.2.5. Análisis de las secuencias ................................................................................................................... 32. 4.3. Conservación de los microorganismos ......................................................................................... 32. 4.4. Selección de microorganismos por su capacidad para acumular metales .................... 33. 4.4.1. Crecimiento en cultivo sólido ........................................................................................................... 35. 4.4.1.1 Evaluación de crecimiento en presencia de discos de inhibición ...................................... 35 4.4.1.2 Evaluación de crecimiento en agar nutritivo-metal................................................................ 35 4.4.2. Remoción de metales en cultivo líquido ....................................................................................... 36. 4.4.2.1 Cinética de crecimiento en cultivo líquido .................................................................................. 36 4.4.2.2 Evaluación de la remoción de metales en cultivo líquido ..................................................... 37 4.4.2.2.1 Determinación de metales por espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente......................................................................................................................................... 38 4.5. Crecimiento y producción de EPS de Bacillus (PL7) y Serratia (PL18)......................... 39. 4.6. Remoción de plomo por Bacillus (PL7) ....................................................................................... 39. 4.7. Remoción de plomo por el EPS producido por Bacillus (PL7) .......................................... 40. 4.8. Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7)........................................ 41. 4.8.1. Azúcares totales...................................................................................................................................... 41. 4.8.2. Azúcares reductores ............................................................................................................................. 41. 4.8.3. Proteína total ........................................................................................................................................... 42. 5.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...................................................................................................... 43. 5.1. Caracterización morfológica de los microorganismos........................................................... 43. 5.2. Identificación de microorganismos por métodos moleculares ........................................... 46. 5.3. Conservación de microorganismos ................................................................................................ 50. 5.4. Selección de microorganismos por su capacidad de remoción de metales.................... 51. ii.

(7) 5.4.1. Evaluación de tolerancia a metales utilizando discos de inhibición................................. 52. 5.4.2. Medio agar metal ................................................................................................................................... 54. 5.4.2.1 Remoción de metales en cultivo sólido ......................................................................................... 62 5.4.3. Evaluación de la remoción de metales por biomasa ............................................................... 65. 5.4.3.1 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio ................................................. 65 5.4.3.2 Remoción de metales por microorganismos en estudio ........................................................ 71 5.5. Cinética de crecimiento y producción de EPS por Bacillus (PL7) y Serratia (PL18) 75. 5.6. Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) ................................................. 76. 5.7. Caracterización parcial del EPS aislado a partir de Bacillus (PL7)................................ 78. 6.. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................ 79. Bibliografía.................................................................................................................................................................... 80. iii.

(8) Índice de figuras Figura 1 Principales destinos y fuentes de emisión de metales en el ambiente .................... 3 Figura 2 Procesos de transformación de metales en suelo ............................................................... 3 Figura 3 Estructura celular de bacterias Gram (+) y Gram (-). ................................................. 11. Figura 4 Formación del enlace O-glicosídico ......................................................................................... 12 Figura 5 Localización celular de procesos microbianos de captación y detoxificación de metales ......................................................................................................................................................... 17 Figura 6 Mecanismos biológicos involucrados en la remoción de metales .......................... 19 Figura 7 Región 16S rDNA secuenciada ................................................................................................... 31 Figura 8 Tinción de Gram de los microorganismos en estudio crecidos en agar. ............ 45 Figura 9 Tinción negativa de cápsula del microorganismo PL14 .............................................. 45 Figura 10 Dendograma de los aislados del Pitch Lake en estudio ............................................. 49 Figura 11 Diámetro (mm) de la inhibición de crecimiento de los microorganismos en estudio en presencia de las sales de Cd y Zna .............................................................................. 52 Figura 12 Evaluación del crecimiento de los microorganismos en medio agar-metal a 30°C y 72 h ...................................................................................................................................................... 54 Figura 13 Crecimiento de los microorganismos en medio agar-plomo a 30°C y 48 h .. 56 Figura 14 Crecimiento de microorganismos en medio agar-selenio a 30°C y 48 h. ........ 58. Figura 15 Crecimiento de microorganismos en medio agar-vanadio a 30°C y 48 h Figura 16 Crecimiento de microorganismos en medio agar-zinc a 30°C y 72 h. ..... 59. .............. 60. Figura 17 Relación entre el diámetro de halo y el diámetro de colonia desarrollados en presencia de distintas concentraciones de metales ................................................................... 63 Figura 18 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio en caldo nutritivo a 30oC durante 36 h ..................................................................................................................................... 66 Figura 19 Crecimiento y producción de polisacáridos extracelulares a) Bacillus (PL7), b) Serratia (PL18) ........................................................................................................................................ 75 Figura 20 Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) en solución de pH 7 ............................................................................................................................................................................... 77. iv.

(9) Índice de tablas Tabla 1 Descripción de ventajas y desventajas de las tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales. 7. Tabla 2 Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios contaminados con metales. 8. Tabla 3 Polisacáridos extracelulares producidos por microorganismos y sus aplicaciones. 15. Tabla 4 Estudios y concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) reportadas para distintos microorganismos 18 Tabla 5 Microorganismos productores de EPS con capacidad de remoción de metales. 23. Tabla 6. Codificación de los microorganismos en estudio. 24. Tabla 7. Intervalos de concentración para cada metal. 34. Tabla 8 Morfología colonial de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake. 44. Tabla 9 Morfología microscópica de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake 44 Tabla 10. Secuencias depuradas de los microorganismos evaluados. 47. Tabla 11. Conservación de los microorganismos en estudio. 51. Tabla 12. Características de los halos formados después de la exposición a H2S. 62. Tabla 13. Valores de crecimiento calculados a partir de la fase exponencial. 70. Tabla 14 Capacidad de remoción de metales por la biomasa microbiana de los microorganismos en estudio. 72. Tabla 15. 78. Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7). v.

(10) Resumen Este proyecto de investigación presenta el estudio de siete microorganismos, los cuales fueron aislados de muestras originarias de un lago de brea conocido como Pitch Lake, localizado en Trinidad y Tobago. El estudio consistió en evaluar la capacidad que estos microorganismos presentan para remover metales y producir polisacáridos. Lo anterior debido a la creciente problemática de la contaminación por metales en el ambiente, los efectos negativos de estos contaminantes sobre la salud de los organismos vivos, incluido el ser humano, así como el creciente interés en la remoción microbiana de metales y la aplicación de biopolímeros extracelulares producidos por diversos microorganismos. Inicialmente, se realizó la caracterización morfológica y microscópica de los microorganismos en estudio, lo cual, junto con herramientas de biología molecular permitieron su identificación. Parte importante y medular del trabajo fue evaluar la capacidad de estos microorganismos para remover metales como cadmio, cromo, níquel, plomo, selenio, vanadio y zinc en cultivo líquido y sólido. Lo anterior permitió seleccionar aquellos microorganismos que presentan una mayor capacidad de remoción del metal blanco. Así también, se determinó la producción de polisacáridos extracelulares (EPS) por los microorganismos seleccionados, para posteriormente evaluar el papel de estos y del EPS en la remoción del metal de interés. Los resultados más relevantes indican que seis de los siete microorganismos fueron identificados como Bacillus sp., con un 100% de homología, pertenecientes al grupo cereusthuringiensis, mientras que el séptimo de ellos presentó un alto porcentaje, 98%, de homología con Serratia marcescens. Los estudios de tolerancia y remoción de metales indicaron que con excepción de cromo y zinc, en forma de cloruro, el resto de los metales evaluados fueron tolerados por los microorganismos en estudio, encontrando una afinidad de estos microorganismos hacia los metales de Ni>Pb>Znb>V en medio sólido. Sin embargo, considerando la capacidad de remoción de metales en cultivo líquido, la afinidad de los microorganismos resultó ser Pb>Znb>V>Se>Ni, aunque ésta depende fuertemente del microorganismo, del metal y de la concentración evaluada. La remoción de plomo por el EPS de Bacillus (PL7) fue mayor comparada con la remoción presentada por la biomasa en pH 7, además la caracterización parcial del EPS realizada indicó que presenta un bajo contenido de proteína (1.14%) y un 17% de azucares reductores. Los resultados obtenidos revelaron que la remoción de diversos metales por los microorganismos estudiados fueron comparables, y en algunos casos mayores, a la reportada en la literatura por lo cual se hace necesario un estudio más profundo de los mismos así como de los mecanismos y condiciones que favorecen la remoción.. vi.

(11) Summary The research project presents the study of seven microorganisms, which were isolated from samples that came from Pitch Lake, located in Trinidad and Tobago. The study consisted into evaluate the capacity of these microorganisms to remove metals and produce extracellular polysaccharides. The previous due to the recent and increasing problematic of environmental pollution by metals, the negative effect of these pollutants on living organisms health, including the human, moreover the increasing interest in the microbial removal of metals and the use of extracellular biopolymers produced by several microorganisms. Initially,. the. morphological. and. microscopical. characterization. of. the. studied. microorganisms was done, which join to molecular biology tools allowed the identification of microorganisms. An important and central part of the present work was to evaluate microorganisms for their capacity to remove metals such as cadmium, chromium, nickel, lead, selenium, vanadium and zinc in liquid and solid media. Previous information allowed the selection of those microorganisms that showed a higher target metal removal. Also, there was evaluated the production of extracellular polysaccharides (EPS) by selected microorganisms, afterwards, the role of both biomass and EPS were evaluated for their capacity to remove the target metal. The most relevant results indicated that six of the seven microorganisms corresponded to Bacillus sp, with an homology of 100%, belonging to the cereus-thuringiensis group, the seventh one showed a high percentage of homology, 98%, with Serratia marcescens. The studies of tolerance and metal removal indicated that, with exception of chromium and zinc, in the chloride salt, the rest of the evaluated metals were tolerated by studied microorganisms, with a microbial affinity to metals of Ni>Pb>Znb>V in solid media. However, considering the capacity of metal removal in liquid culture, the microbial affinity to metals was Pb>Znb>V>Se>Ni, although it depended strongly of evaluated microorganism, metal salts and their concentration. Removal of lead by the EPS of Bacillus (PL7) was higher compared to removal by biomass at pH 7, moreover the partial characterization of the EPS showed a low content of protein (1.14%) and a 17% of reducing sugars. Results obtained indicated that removal of several metals by microorganisms tested were well compared, and in some cases superior, to reports in literature, because of this it will be necessary to do a deeper study about these microorganisms and also the mechanisms and conditions that favor the removal.. vii.

(12) Introducción. 1. INTRODUCCIÓN La contaminación por metales de suelos, aguas superficiales y subterráneas así como sedimentos, se ha incrementado en forma paralela a la actividad industrial debido a la falta de normatividad en la materia y a la inadecuada disposición y manejo de desechos industriales y municipales.. Los metales se encuentran en el subsuelo en forma de minerales, por lo que durante su extracción, beneficio y purificación se producen desechos potencialmente tóxicos que son liberados al ambiente contaminando el aire, suelo y cuerpos de agua, lo que ha ocasionado un daño serio al ecosistema. Además, durante los procesos de fundición y refinación de metales se generan partículas que son depositadas en distintos lugares por la acción del viento, así también por la descarga de aguas residuales con altos contenidos de metales.. 1.1. Problemática de la contaminación por metales La emisión de elementos metálicos hacia la atmósfera procede tanto de fuentes. naturales como antropogénicas (derivadas de las actividades humanas). Entre las principales fuentes de emisión de metales en México se tienen las siguientes (INESEMARNAT, 2007): ♣ actividades mineras de extracción de oro, plata y cobre principalmente ♣ fundición primaria y secundaria de diversos metales ♣ producción de carbón y coque (carbón mineral) ♣ combustión de combustóleo y carbón en la generación de electricidad ♣ industria de cloro-sosa ♣ incineración de residuos peligrosos y biológico infecciosos Además de lo anterior, dentro del territorio mexicano, se han identificado sitios abandonados con alto contenido de residuos peligrosos, en los cuales y de acuerdo con información proporcionada por el INE-SEMARNAT (Volke et al., 2005), el 36%. 1.

(13) Introducción corresponde a metales (Cr, Hg, Pb, Zn), As, cianuro, baterías y el 13.5% corresponde a escorias de fundición (As, Cd, Pb), por lo que se puede considerar que casi en la mitad de estos sitios se encuentran residuos de metales.. La contaminación del suelo con metales produce diversos efectos en los ecosistemas (Carrizales et al., 2006; INE-SEMARNAT, 2005; Razo et al., 2004; Ongley et al., 2003; Castro-Larragoitia et al., 1997) siendo los principales: ♣ transporte de contaminantes hacia aguas superficiales y subterráneas ♣ absorción y acumulación de contaminantes por plantas y animales ♣ intoxicación de seres vivos por contacto directo en los sitios contaminados Asimismo, el tratamiento inadecuado de efluentes residuales tiene como consecuencia el transporte de los contaminantes hacia el agua de ríos, lagos y presas principalmente, y dependiendo de la naturaleza del contaminante, éste puede precipitar y aumentar los contenidos presentes en los sedimentos que sirven de alimento para los organismos base en la cadena alimenticia (Acuagranjas, 2005; INE-SEMARNAT, 2002). Conjuntamente, cuando se realiza el tratamiento de aguas residuales se generan lodos de desecho, los cuales en algunas ocasiones son utilizados como aditivos para suelos de cultivo (Ibáñez-Burgos et al., 2006).. Separadamente de la generación de desechos líquidos y sólidos, durante las actividades industriales, mineras, incineración de desechos municipales y residuos peligrosos también se generan descargas aéreas en forma de partículas de diversos tamaños, las cuales pueden permanecer suspendidas por lapsos de tiempo variables. Estas partículas pueden afectar directamente a los organismos al entrar en el sistema respiratorio o bien, depositarse en suelos y cuerpos de agua. La Figura 1 muestra el destino de los metales en el ambiente, así como algunas de las principales fuentes generadoras.. 2.

(14) Introducción Descarga AIRE. Combustibles fósiles. Agricultura. Actividades industriales. Desechos sólidos. Descarga líquida SUELO Tratamiento Lixiviado Lodo. Organismos AGUA SEDIMENTO. Figura 1 Principales destinos y fuentes de emisión de metales en el ambiente. Una gran cantidad de metales tienen como destino final el suelo, y dependiendo de las condiciones físicas, químicas y ambientales que se presenten en el mismo pueden presentarse diversos procesos que hacen que el metal sea inmovilizado, lixiviado, volatilizado o absorbido (Figura 2).. Figura 2 Procesos de transformación de metales en suelo (http://www.unex.es/edafo/GCSP/GCSL4CEMetalesPesados.htm). 3.

(15) Introducción 1.1.1 Metales de importancia por sus características tóxicas La toxicidad de los metales depende principalmente de tres factores: (1) la concentración en que se encuentran, muchos metales en cantidades traza se consideran necesarios para el funcionamiento adecuado de los organismos pero al aumentar la concentración pueden llegar a ser tóxicos a los mismos; (2) el tipo de especie que forman en un medio específico, sólo ciertas especies de metales con determinadas cargas son tóxicas, es decir, presentan características físicas o químicas que los hace estar biodisponibles; (3) la persistencia del contaminante, ya que los metales no pueden ser degradados o descompuestos únicamente se distribuyen en el entorno de distintas maneras (Kiely, 1999).. Los metales evaluados en el presente trabajo, cadmio, cromo, níquel, plomo, vanadio y zinc así como el metaloide selenio, presentan características que les permiten acumularse y originar efectos adversos en la salud del hombre. En los siguientes párrafos se resumen las características más importantes de cada uno de ellos.. El cadmio (Cd) se utiliza comercialmente en depósitos electrolíticos, aleaciones, soldaduras, estabilizadores de plásticos, baterías, etc., las descargas al ambiente provienen de la combustión de combustibles fósiles, incineración de basura, fundición y de la extracción de zinc. En suelos se absorbe por la materia orgánica y en medio ácido se absorbe por plantas. También puede bioacumularse en organismos de agua dulce (ASTDR, 1999). Los principales efectos del cadmio sobre los seres humanos son la acumulación del metal libre en hígado y riñón, así como daño al sistema nervioso central y al sistema inmune además de infertilidad. Una concentración de Cd de 100 nmol/l en sangre se considera un nivel crítico si la exposición es crónica (ESST, 2007).. El uso del cromo (Cr) depende de su estado de oxidación, Cr(0) se emplea en acero y aleaciones, mientras que Cr(III) y Cr(VI) se utilizan en curtido y como catalizador, por lo que las descargas al ambiente se originan por actividades antropogénicas (industria textil, de pinturas, cementera y curtidurías) (ATSDR, 1994). El Cr, dependiendo su estado de oxidación, puede unirse fuertemente al suelo dependiendo del tipo y condiciones del mismo. 4.

(16) Introducción o bien ser disuelto y migrar a capas más profundas (aguas subterráneas). El Cr(III) es esencial en sistemas biológicos, mientras el Cr(VI) es la forma más tóxica al ser humano afectando el tracto respiratorio, sin que exista un nivel seguro de exposición claramente establecido, sin embargo, la exposición aguda a niveles superiores de CrVI de 50 mg/m3 en aire aumenta la incidencia de cáncer en los órganos respiratorios (ESST, 2007).. El uso del níquel (Ni) incluye aleaciones de acero inoxidable, joyería, monedas, válvulas, baterías y como catalizador. Las descargas de níquel al ambiente son originadas por la incineración de basura y las plantas de fundición, así como por las aguas residuales. El Ni se deposita en suelo y se moviliza en medio ácido hasta alcanzar el agua subterránea, se adhiere en sedimentos que contienen Fe y Mn. Se considera un elemento traza esencial, aunque los polvos de refinación de Ni y el bisulfuro de Ni se consideran carcinógenos; en forma de carbonilo de níquel es altamente tóxico, pues la exposición aguda accidental por inhalación puede producir desde nauseas, dolor de pecho y malestar gastrointestinal hasta la muerte (ATSDR, 2005).. En cuanto al plomo (Pb), se puede decir que aproximadamente 40% se utiliza en forma metálica, 35% en compuestos químicos y un 25% en aleaciones (ESST, 2007). La descarga al ambiente proviene de fundiciones, proceso y producción secundaria de metales, manufactura. de pigmentos, pinturas y químicos. Es retenido por el suelo mediante. procesos de adsorción, intercambio iónico, precipitación y acomplejamiento con la materia orgánica (Volke et al., 2005). Se absorbe y acumula vía percutánea, respiratoria y digestiva; se distribuye en sangre, tejidos blandos (riñón, médula ósea, hígado y cerebro) y tejido mineralizado (huesos y dientes). De acuerdo con la Administración para la Salud y la Seguridad en el Trabajo de los Estados Unidos (OSHA), una concentración de plomo correspondiente a 40 µg/dl en sangre es el límite de exposición máxima admisible (ESST, 2007). El selenio (Se) es utilizado en la industria del caucho y vidrio, eléctrica, electrónica y como pigmento y pesticida. Es liberado al ambiente tanto por procesos naturales como por actividades humanas. El Se se considera un metal traza esencial pues forma parte de los. 5.

(17) Introducción aminoácidos selenocisteína y selenometionina (ATSDR, 2003). El Se(0) es estable en suelo y co-precipita en sedimentos. Es bioacumulado y biomagnificado por organismos acuáticos. Algunos compuestos como óxido de selenio, seleniuro de hidrógeno (en concentraciones mayores a 5 mg/m3 es intolerable) y oxicloruro de selenio son peligrosos con efectos en los pulmones, tracto intestinal y lesiones de la piel (ESST, 2007).. El vanadio (V) es ampliamente utilizado en aleaciones, partes de automóviles y como catalizador. Se emite al ambiente principalmente por la combustión de petróleo crudo. Tiende a acumularse en suelos y sedimentos (ATSDR, 1992). Se considera un elemento traza esencial, aunque tiene efectos adversos sobre el sistema respiratorio; el límite de exposición en el aire de trabajo, marcado por la OSHA, es de 0.05 mg/m3 para polvos de V2O5 y de 0.1 mg/m3 para vapores del mismo compuesto durante la jornada de trabajo (ESST, 2007).. El zinc (Zn) se utiliza en aleaciones de latón y bronce, así como en cubiertas anticorrosivas. Este metal ingresa al ambiente por la producción del acero, la minería, y la combustión de petróleo (ATSDR, 2005b). Permanece en suelo, formando compuestos insolubles, y se moviliza a pH neutro o ácido (Volke et al., 2005). Es un elemento traza esencial pero la exposición crónica produce anemia y daño al páncreas. El fosfuro de zinc (plaguicida) al igual que el cloruro de zinc (cuyo límite de exposición ocupacional es de 2 mg/m3), son las sales más peligrosas provocando incluso la muerte por intoxicación (ESST, 2007).. 1.2. Tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales La remoción de un contaminante de un sitio puede realizarse utilizando diversos. tipos de tecnologías, las cuales se clasifican dependiendo de los principios utilizados, así la elección dependerá de las características del sitio y del contaminante. El primer paso consiste en evaluar si el proceso se realizará in situ (en el sitio) o ex situ (fuera del sitio) lo cual se logra mediante un análisis de factibilidad, considerando las ventajas y desventajas que pueden presentarse en ambos casos (Tabla 1).. 6.

(18) Introducción Tabla 1. Descripción de ventajas y desventajas de las tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales. Tipo de proceso In situ. Ex situ. Ventajas. Desventajas. No requiere transporte. Mayor tiempo de tratamiento. del material. Algunas veces no se asegura la uniformidad. Menor costo. Dificultad para verificar la eficiencia del proceso. Menor tiempo de. Requiere excavación. tratamiento. Mayor costo e ingeniería. Mayor seguridad en. Manipulación del material y consecuente. cuanto a uniformidad. exposición del contaminante. Tomado de Volke et al., 2005 De acuerdo con información reportada por la Agencia de Protección al Ambiente de los E.U.A. (EPA, 2004), las tecnologías in situ representan el 42% de los tratamientos de remediación aplicados en suelos y aguas contaminadas, y aproximadamente el 75% de los proyectos de este tipo se refiere a contaminantes orgánicos mientras que poco más del 25% considera contaminantes metales o metaloides, algunos otros proyectos consideran tanto contaminantes orgánicos como metales. Entre las tecnologías de tratamiento más utilizadas para sitios contaminados por metales, se encuentran la solidificación/estabilización, seguida por el tratamiento químico y separación física (EPA, 2004). En México, se ha evaluado la factibilidad de aplicación de diversas tecnologías en la remediación de suelos contaminados con metales, entre éstas se encuentran: separación física, lavado de suelos, remediación electrocinética, solidificación/estabilización y biorremediación utilizando bacterias sulfato reductoras (Velasco et al., 2004).. Con base en el tipo de agente que se aplica para la remoción de los contaminantes, las tecnologías se dividen en tres: físico-químicas, térmicas y biológicas (Volke y Velasco, 2002) aunque cabe señalar que para la remoción de metales, los tratamientos térmicos no se consideran un tratamiento ya que se producen residuos en los cuales se encuentran contenidos los metales. Algunos ejemplos de tecnologías aplicadas en sitios que presentan contaminación por metales se enlistan en la Tabla 2.. 7.

(19) Introducción Tabla 2. Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios contaminados con metales. Tipo de. Suelo. tratamiento. Oxidación/reducción: agente patentado base fosfato, químico Químico. reductor. Aguas profundas. Barrera reactiva permeable Oxidación/reducción con diversos materiales como: ditionito de sodio, Fe2+ +piedra caliza+ KMnO4, H2O2, FeSO4 +HCl, NaOH +HCl Precipitación de metales. Inundación (tensoactivo) Físico. Lavado de suelos Separación electrocinética Solidificación/estabilización. Biológico. Térmico. Inundación (tensoactivo) Separación electrocinética Separación física. Biorremediación. Biorremediación. Fitorremediación. Fitorremediación. Incineración Vitrificación. FUENTE: EPA 2004. N/A N/A: no aplica. 1.2.1 Tratamientos físico-químicos En este tipo de tratamiento se aprovechan las propiedades físicas y/o químicas de los contaminantes o del medio contaminado para separar o contener la contaminación. Entre sus ventajas se encuentran el que son económicamente factibles, requieren de periodos cortos de tratamiento y el equipo necesario es accesible y no requiere mucha energía. Las principales desventajas que presenta consisten en que se generan residuos que deben tratarse nuevamente o disponerse, lo cual genera un aumento en los costos, además de que la movilidad de los contaminantes puede aumentar (Volke y Velasco, 2002).. 8.

(20) Introducción 1.2.2 Tratamientos biológicos Este tipo de tratamientos tiene dos grandes divisiones, la fitoremediación y la biorremediación, y consiste en el empleo de organismos vivos o productos derivados de ellos, para contener o remover compuestos tóxicos como los metales. Los procesos a través de los cuales se realiza el tratamiento dependen de las características de los microorganismos y especies vegetales utilizadas y en el caso de la remoción de metales pueden consistir en la precipitación, absorción o formación de complejos.. Las ventajas del uso de estos tratamientos es que pueden ser selectivos en cuanto al contaminante a tratar, efectivos en cuanto a costos y se consideran tecnologías más benéficas para el ambiente (Volke y Velasco, 2002). Las desventajas, se refieren principalmente a los largos periodos de tratamiento y la necesidad de equipos específicos (reactores, etc.) así como la generación de cantidades importantes de biomasa microbiana.. 1.2.2.1. Fitorremediación Consiste en el uso de plantas, las cuales remueven, acumulan o estabilizan el. contaminante en suelos, sedimentos o aguas. Los mecanismos que pueden estar involucrados en la remoción de metales son, (1) fitoextracción o fitoacumulación en la cual el contaminante pasa a la planta a través de la raíz y se acumula en las hojas y tallos, (2) fitoestabilización por compuestos químicos producidos y liberados por las plantas para inmovilizar algunos contaminantes en el entorno entre la raíz y el suelo (EPA, 2004).. 1.2.2.2. Biorremediación Esta estrategia depende de la actividad metabólica de los microorganismos capaces. de utilizar los contaminantes como fuente de alimento y energía o bien producir compuestos para acomplejar y secuestrar algunos metales (Volke y Velasco, 2002). Algunas de las técnicas incluidas en esta categoría son el bioventeo, biopilas, biorreactores, tratamiento co-metabólico, composteo, fertilización, bioaumentación, por mencionar algunas (EPA, 2004).. 9.

(21) Introducción Una característica determinante en la elección de la tecnología a emplear es que los metales no son susceptibles de ser degradados, por lo que, únicamente se disminuye su toxicidad o su movilidad haciendo uso de distintos procesos. Sin embargo, se tienen reportes que señalan que la remoción de metales utilizando sistemas de remediación con microorganismos puede ser eficiente y rentable en el tratamiento de sedimentos contaminados mediante el uso de reactores de lecho fluidizado utilizando bacterias sulfato reductoras (Seidel et al., 2004) así como biopolímeros modificados (Kostal et al., 2005). En el tratamiento de suelos contaminados con metales se ha evaluado la precipitación de plomo haciendo uso de consorcios de bacterias sulfato reductoras en reactor anaerobio de flujo ascendente con una eficiencia de remoción del 99.8% (Volke et al., 2005).. En cuanto al tratamiento de aguas contaminadas, se ha utilizado biomasa viva en forma de biopelícula e inmovilizada en diversos tipos de soporte y en distintos biorreactores (pellets de reactor anaerobio de flujo ascendente, discos biológicos rotatorios, cama fija, filtros de percolación, cama fluidizada y tipo air-lift); estos sistemas tienen el inconveniente de que generan grandes cantidades de biomasa que debe ser dispuesta (Gadd y White, 1993). También es posible utilizar biomasa muerta tratada con álcali para mejorar la capacidad de absorción de metales y a partir de la cual se forman gránulos o pellets, el metal absorbido es liberado por un tratamiento posterior y los gránulos de biomasa se regeneran para su reutilización (Cañizares-Villanueva, 2000).. En la siguiente sección y debido a que el objetivo del presente trabajo es estudiar la capacidad que presentan microorganismos productores de polisacáridos, provenientes de un lago de brea, en la remoción de metales se presenta información sobre el papel que pueden jugar estos bio-productos.. 1.3. Polisacáridos microbianos Existen gran variedad de microorganismos con características de producción de. polisacáridos extracelulares (EPS) con distintas composiciones y propiedades y el estudio de ellos tiene diversas aplicaciones desde la retención y remoción de contaminantes hasta la. 10.

(22) Introducción explotación comercial de las propiedades específicas como espesantes, gelificantes, etc. (ver Tabla 3).. Los polímeros extracelulares, junto con algunas glicoproteínas, se conocen con el nombre general de glicocalix pero pueden constituir distintos tipos de estructuras: (1) cápsula celular, la cual está unida covalentemente a la superficie celular, (2) capa viscosa, “slime layer” o exopolisacárido (EPS), la cual puede estar unida débilmente a la pared celular o ser excretada al medio (Ruas-Madiedo y de los Reyes-Gavilán, 2005), este tipo de cápsula o capa se encuentra altamente hidratada, con un contenido de agua de hasta un 98% (Wilkinson, 1958). Entre los microorganismos productores de polisacáridos extracelulares, existen tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas.. Algunas diferencias. estructurales entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas así como la ubicación del glicocalix en las mismas se muestran en la Figura 3.. Gram positiva. Gram negativa Membrana exterior (lipopolisacárido, LPS) Pared celular (peptidoglicano). Membrana citoplasmática Membrana citoplasmática Citoplasma Citoplasma. Pared celular (peptidoglicano y ácido lipoteicoico) Glicocalix (cápsula y EPS). Periplasma. Glicocalix (cápsula y EPS). Figura 3 Estructura celular de bacterias Gram (+) y Gram (-) (Ruas-Madiedo y de los Reyes-Gavilán, 2005). 1.3.1 Composición Los polisacáridos están formados por unidades simples (monosacáridos) de glúcidos, los cuales se encuentran unidos mediante enlaces O-glicosídicos, este tipo de. 11.

(23) Introducción enlace tiene lugar entre el radical –OH del carbono hemiacetálico y el grupo alcohol del otro monosacárido (Figura 4). Los polisacáridos forman una estructura que puede ser lineal o ramificada y se clasifican de acuerdo a su composición en homogéneos (formados por un solo tipo de monómero) o heterogéneos (formados por dos y hasta cinco azúcares diferentes).. Figura 4 Formación del enlace O-glicosídico. Los homopolisacáridos conteniendo glucosa pueden clasificarse en función del tipo de enlace en α-D-glucano y β-D-glucanos. Los α-D-glucanos presentan ramificaciones en sus estructuras y tres o más tipos de uniones (ejemplos: almidón y glucógeno), mientras que los β-D-glucanos (ejemplo: celulosa y quitina) son polímeros lineales de moléculas neutras unidas por un solo tipo de enlace y polímeros ramificados con dos tipos de enlace. Los heteropolisacáridos están formados por unidades que varían en cuanto a tamaño y naturaleza, en cada unidad las hexosas pueden presentar un tipo de enlace α, β o ambos en alternancia, además pueden estar presentes en forma piranósica o furanósica, el punto de enlace también puede variar entre las posiciones 2,3,4,6; un heteropolisacárido típico es una estructura ramificada compleja cuya proporción de componentes no puede ser reducida a una pequeña unidad repetitiva (Wilkinson, 1958).. Algunos de los polímeros extracelulares de bacterias con propiedades de remoción de metales han sido bien caracterizados: Janecka et al. (2002) reportaron que el EPS de Sinorhizobium 9702-M4, está formado por 51.8% de glucosa, 21.15% de galactosa, 13.8% de ácido glucurónico, 10.5% de manosa, 1.7% de arabinosa y 0.3% de N-acetilglucosamina; Ozdemir et al. (2005) determinaron que la composición del EPS producido por Chryseomonas luteola TEM05 es 33% de azúcares totales y 26% de proteína; Kazy et al. (2002) evaluaron la composición de EPS en cepas de Pseudomonas aeriginosa resistente y sensible a cobre, encontrando que el mayor contenido en ambos EPS era de. 12.

(24) Introducción alginato seguido por galactosa, piruvato, acetato, galactosamina y glucosa principalmente, además de que la cantidad de EPS producido por la cepa resistente fue poco menor del doble de la cantidad producida por la cepa sensible; McLean et al. (1990) describen las características del polímero capsular formado por poly-γ-ácido glutámico producido por Bacillus licheniformis, Arias et al. (2003) analizaron el EPS producido por Halomonas maura y reportaron que estaba compuesto por 65.34% de carbohidratos, 2.57% de proteínas, 8.14% de ácidos urónicos y 0.185% de acetiles. La mayoría de los EPS microbianos tienen naturaleza aniónica debido al contenido de ácidos urónicos y el componente más común es el ácido D-glucurónico.. El papel que desempeñan los EPS y su composición en la remoción de metales se tratará con detalle en la sección 1.4.. 1.3.2. Importancia biológica La composición de los polisacáridos extracelulares varía dependiendo del. organismo que lo produce y puede ser grueso, fino, rígido o flexible. Las capas rígidas forman una matriz impermeable (cápsula) que repele algunos colorantes como la tinta china. Se ha sugerido que la producción de EPS así como su función, es dependiente de la naturaleza del ambiente en que se encuentra el microorganismo (Whitfield, 1988), y que algún factor en el ambiente favorece la selección de variantes mucoides (Wilkinson, 1958).. Los polisacáridos extracelulares (EPS) desempeñan diversas funciones en un microorganismo, la mayoría de las cuales son de protección y se encuentran relacionadas con dos propiedades que tienen en común la mayoría de los EPS: son muy hidrofílicos y le confieren algún tipo de carga eléctrica a la superficie celular. Algunas de las funciones que se les atribuyen incluyen las siguientes: (1) son importantes en la adherencia o fijación a sustratos, formando biopelículas, causantes de corrosión y obstrucción de tuberías, formación de placa dental y caries, formación de biopelículas en catéteres y prótesis quirúrgicas, etc., así como la adhesión a la flora autóctona en intestinos de mamíferos,. 13.

(25) Introducción (2) resistencia a la acción de células fagocitarias, en sistemas patológicos la cápsula es un factor de virulencia ya que muchas de ellas no son reconocidas como material extraño por el sistema inmune, (3) contribuyen a la resistencia, a la desecación (retención de cantidades de agua importantes) y también proporcionan un sistema amortiguador protegiendo la célula de una pérdida o ganancia rápida de agua además de protección contra la depredación por protozoarios, (4) funcionan como una resina de intercambio mejorando la difusión de nutrientes hacia la célula, (5) protección contra agentes bacterianos (anticuerpos, antibióticos, metales pesados, detergentes, etc.), (6) en bacterias fijadoras de N2 atmosférico actúan como barrera a la difusión de O2 evitando la inactivación de la nitrogenasa, o como fase de reconocimiento entre la bacteria y la planta específica, por mencionar algunos (Madigan et al., 2004; Whitfield, 1988; Wilkinson, 1958).. 1.3.3. Importancia comercial Los polisacáridos microbianos ofrecen ventajas frente a los de origen vegetal o de. algas, entre ellas se encuentra la gran cantidad de especies microbianas que son capaces de sintetizarlos así como la variedad que presentan en cuanto a composición y propiedades funcionales, además de que su producción puede realizarse bajo condiciones controladas en reactores y por lo tanto es renovable. A pesar de esto, sólo unos cuantos EPS son explotados comercialmente (Tabla 3).. 14.

(26) Introducción. Tabla 3 Nombre Alginato. Polisacáridos extracelulares producidos por microorganismos y sus aplicaciones. Microorganismo productor Azotobacter, Pseudomonas. Biofill®, Celulosa. Curdlan. Gluconacetobacter xylinum. Beijerinckia sp. Xantana. Agente de suspensión, gelificante, emulsificante, espesante en alimentos.. Agrobacterium sp. Preparación de geles en cromatografía, absorbentes y. Alcaligenes faecalis. como aditivo de alimentos.. Leuconostoc mesenteroides,. Aditivo, emulsificador, estabilizador, transportador. Se. Referencia Sabra et al., 2001 Chávez-Pacheco et al., 2004. Moreira et al., 2003. Lee et al., 1997. Naessens et al., 2005. utiliza para dar volumen en plasma-sangre.. Qader et al., 2005. Sphingomonas paucimobilis. Espesante, formación de geles en fitogel así como en. Sutherland, 2001. Sphingomonas spp.. cultivos bacterianos y en materiales absorbentes.. Sutherland, 1997. Gluconobacter oxydans Gelan. artificial”, inmovilización de proteínas y células, aditivo de alimentos, etc.. Acetobacter sp. Dextran. Gelificante, estimulación del sistema inmune. Estabilización de emulsiones, fabricación de “piel. Gengiflex® Clairana ®. Usos. Xanthomonas campestris. Estabilizante de suspensiones en la industria alimentaria. Xanthomonas gummisudans. y en la recuperación terciaria del petróleo. Agente. Xanthomonas phaseoli. encapsulante, floculante, adhesivo, agente gelificante.. Sutherland, 2001. 15.

(27) Introducción. 1.4. Antecedentes indirectos La interacción entre metales y microorganismos es determinada por diversos. factores tales como el tipo de microorganismo, la especie química del metal y el nivel en que se lleva a cabo dicha interacción. En este capítulo se presenta una revisión del estado del arte de la aplicación de microorganismos y sustancias producidas por ellos (EPS) en la remoción de metales tóxicos, los mecanismos a través de los cuales se realiza la interacción, así como los distintos microorganismos que han sido estudiados.. 1.4.1 Capacidad de remoción de metales por microorganismos La interacción entre la biomasa, ya sea viva o muerta, con metales puede llevarse a cabo tanto en el interior, en el exterior o en la superficie de la célula (Suárez y Reyes, 2002). De acuerdo con el trabajo de Gadd y White (1993) la localización de algunos procesos de captación de metales puede darse en el espacio intracelular, periplásmico, pared celular, materiales asociados a células y reacciones extracelulares, tal como se muestra en la Figura 5.. Diversos mecanismos tienen lugar en el interior, exterior y alrededores del microorganismo, dependiendo del tipo de interacción que se presenta entre el metal y el microorganismo. A nivel extracelular pueden presentarse mecanismos de movilización e inmovilización, también pueden secretarse compuestos orgánicos de bajo peso molecular con alta afinidad por el hierro (sideróforos). La interacción con la superficie celular depende de la composición estructural característica del microorganismo (ver Figura 3), por lo que las bacterias Gram positivas presentan mayor capacidad de unión con especies metálicas con respecto a las Gram negativas (Suárez y Reyes, 2002). A nivel intracelular, el metal acumulado desencadena transformaciones enzimáticas o síntesis de proteínas específicas (metalotioninas).. 16.

(28) Introducción. Membrana celular/espacio periplásmico Adsorción/intercambio iónico Reacciones redox Precipitación Difusión y transporte Pared celular Adsorción Intercambio iónico Unión covalente Reacciones redox Precipitación. Intracelular Enlazamiento no específico/quelación Compartamentalización en organelos Reacciones redox Metalotioninas. Reacciones extracelulares Precipitación por productos excretados (sulfuro, oxalatos) Formación de complejos y quelación Sideróforos. Materiales asociados a la célula (polisacáridos, cápsulas) Intercambio iónico Atrapamiento de partículas Enlazamiento no específico Precipitación. Figura 5 Localización celular de procesos microbianos de captación y detoxificación de metales (Gadd y White, 1993). De acuerdo con diversos estudios reportados (Hernández et al., 1998; Roane, 1999; Taniguchi et al., 2000; Richards et al., 2002; Yilmaz, 2003; Hetzer et al., 2006) la capacidad de acumulación o remoción de metales varía dependiendo del metal o metales en cuestión, el microorganismo involucrado y las condiciones de cultivo en que se realice el experimento.. En la Tabla 4 se presentan algunos estudios realizados sobre la capacidad de remoción de metales que presentan algunos microorganismos, así como las concentraciones mínimas inhibitorias que presentan hacia algunos de los metales evaluados en el presente trabajo. Cabe indicar que esta información se tomó como referencia para establecer los intervalos de concentración evaluados en el presente trabajo.. 17.

(29) Introducción. Tabla 4. Estudios y concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) reportadas para distintos microorganismos. Microorganismo. Origen. Metal. CMI (mM). Referencia. Agua, sedimentos, suelo de mina. Zn. 1, 10, 20. Castro-Silva et al.. de carbón. Ni. 1, 5. 2003. Cu, Co. 2.5, 2.0. Cd, Ni. 2.0, 10.0. Mn, Zn. 24.0, 22.0. Suelo contaminado. Pb. 0.6. Roane, 1999. Suelo de mina de zinc. Zn. 15. Taniguchi et al., 2000. Enterobacter cloacae. Suelo de refinería. Ni, V. 21, 6. Hernández et al., 1998. Escherichia hernannii. Suelo de refinería. Ni, V. 10-21, 4-6. Hernández et al., 1998. Cd, Cr. <0.1– 0.4, 0.1-1.75. Ni, Pb. 0.2-0.5, 5.0-8.0. Se. 0.3-3.5. Bacterias G+ neutrófilas Bacilos G- acidófilos. Bacillus circulans EB1. Bacillus megaterium Brevibacterium sp. HZM-1. Cepas de Frankia. Suelo contaminado con metales pesados. Suelo. Yilmaz, 2003. Richards et al., 2002. Geobacillus stearothermophilus. Aguas termales. Cd. 0.6. Hetzer et al., 2006. Geobacillus. thermocatenulatus. Aguas termales. Cd. 0.6. Hetzer et al., 2006. Cd. 8, 10. Co. 6, 10. Zn. >15. Pb. 2.5. Cd, Co. 9, 10. Zn. 12. Se. 6. Cepas de Gluconobacter. Pseudomonas marginalis Ralstonia eutropha ATCC 43123 Ralstonia metallidurans CH34. Colección microbiana. Suelo Colección microbiana Suelo contaminado. Leigh-Emma, 2000. Roane, 1999 Leigh-Emma, 2000 Roux et al,. 2001. 18.

(30) Introducción. 1.4.2. Mecanismos de remoción de metales por microorganismos Como se mencionó previamente, el tipo de interacción que existe entre. los. microorganismos y los metales está en función de las características del metal tales como estado de oxidación y especiación, así como del tipo del microorganismo en estudio.. De esta forma, la principal división que se tiene se relaciona con el efecto que se produce en la movilidad del metal, es decir, si es movilizado, un proceso conocido como lixiviación microbiana, o inmovilizado lo cual puede ocurrir por diversos mecanismos (Vullo, 2003). La Figura 6 ilustra como se clasifican los mecanismos involucrados en la remoción de metales.. SISTEMA BIOLÓGICO. Movilización. Biolixiviación. Inmovilización. Biosorción. Bioacumulación. Biomineralización Biotransformación. Quimisorción mediada por microorganismos. Figura 6 Mecanismos biológicos involucrados en la remoción de metales (Vullo, 2003). A continuación se da la descripción de cada uno de los mecanismos de inmovilización de metales por microorganismos (Vullo, 2003; Valls y de Lorenzo, 2000). Es importante señalar que la mayoría de las veces es difícil establecer con certeza el mecanismo que tiene lugar.. 19.

(31) Introducción 1.4.2.1. Bioabsorción Se caracteriza por una interacción fisicoquímica del metal con ligandos de la. superficie celular, este tipo de interacción es el que se lleva a cabo cuando se produce un polímero extracelular y ofrece la ventaja de remover en forma específica los metales aún en concentraciones bajas.. 1.4.2.2. Bioacumulación El metal se transporta al interior de la célula mediante un gasto de energía y puede. ser almacenado en organelos. Cuando un metal sufre una biotransformación ocurre un cambio de tipo químico tal como cambio en el estado de oxidación, metilación, etc.. 1.4.2.3. Biomineralización Se refiere a la precipitación del metal como carbonato, hidróxido, sulfuro o fosfato.. 1.4.2.4. Quimisorción mediada por microorganismos Primero se lleva a cabo una biomineralización formándose un depósito primario el. cual funciona como núcleo de cristalización para capturar el metal de interés.. 1.4.3. Estudios de remoción de metales por microorganismos productores de biopolímeros La producción de biopolímeros extracelulares, incluidos entre estos los. polisacáridos, se encuentra ampliamente distribuida tanto entre especies procedentes de suelo como de ambientes marinos. Estos biopolímeros extracelulares pueden estar formados por polisacáridos y proteínas o una mezcla de ambos. La interacción con diversos metales depende de las propiedades de los grupos funcionales presentes en estos biopolímeros.. Recientemente se ha reportado el uso de un biopolímero semejante a la elastina (ELP) formado de residuos de histidina (manipulado para aumentar la cantidad de estos últimos) en la remoción de cadmio del suelo con una eficiencia del 55%. Una característica. 20.

(32) Introducción importante de este biopolímero es que puede ser recuperado por precipitación por cambio de temperatura, lo cual permite que sea reutilizado, la desventaja es que la eficiencia de recuperación del mismo por precipitación disminuyó debido a la presencia de zinc en la muestra de suelo (Prabhukumar et al., 2004). El ELP también se ha modificado para que contenga una proteína metaloregulatoria de elevada afinidad y especificidad por el mercurio, las propiedades de dicho biopolímero consisten en una combinación de ambos componentes, es decir, puede enlazar mercurio de forma selectiva aún en presencia de otros metales y además puede ser separado por precipitación y regenerado para uso continuo, la concentración de mercurio pudo ser disminuida hasta niveles de partes por billón (Kostal et al., 2005). De igual forma existen diversos reportes acerca de la remoción de metales por polímeros extracelulares extraídos de lodos activados provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales. La composición de estos biopolímeros varía considerablemente dependiendo de su origen, pero en general tienen un alto contenido de proteínas, ácidos húmicos, ácidos urónicos, polisacáridos y pequeñas cantidades de ácidos nucleicos y lípidos; se ha demostrado además que existe una correlación positiva importante entre el número de sitios de enlazamiento y el contenido de proteína, polisacáridos y sustancias húmicas (Guibaud et al., 2005).. En cuanto al uso de polisacáridos extracelulares (EPS) en la remoción de metales de suelos, se ha reportado que la eficiencia de esta remoción disminuye si se trabaja con suelos contaminados por prolongados periodos de tiempo (décadas) (Jensen-Spaulding et al., 2004). Otros estudios evaluaron el tiempo de permanencia o mineralización de EPS en el suelo y el efecto de la adición de EPS sobre la movilidad de cobre, se concluyó que la degradación del biopolímero es más rápida y mayor en condiciones aerobias pues en condiciones anaerobias la mayor descomposición tiene lugar los primeros diez días y representa el 40% del total del EPS adicionado; el mismo estudio demostró que la adición de polisacáridos bacterianos favorece la movilización del cobre ya que la cantidad de cobre soluble presente en el suelo tratado fue 6.2 veces mayor que en el control (Zhou et al., 2004).. 21.

(33) Introducción. 1.4.3.1. Microorganismos involucrados en la remoción de metales Los microorganismos con capacidad de producción de polisacáridos extracelulares y. retención de metales son muy diversos y pertenecen a especies distintas con características específicas en cuanto a la composición del EPS producido. La Tabla 5 resume la composición de EPS producidos por algunos microorganismos reportados así como el/los metales evaluados. De acuerdo con lo anterior, la capacidad de retención o remoción de metales depende en gran medida de la composición del EPS producido.. 22.

(34) Introducción. Tabla 5 Microorganismo Bacillus licheniformis. Bacillus firmus MS-102 Chryseomonas luteola TEM05. Halomonas maura. Pseudomonas aeruginosa. Paenibacillus jamilae Paenibacillus polymyxa P13. Sinorhizobium 9702-M4. Zoogloea ramigera. Microorganismos productores de EPS con capacidad de remoción de metales Metal. composición de EPS. Referencia. Mg, Ca, Mn, Ni, Cu, Al, Cr, Fe. Poli-γ ac. glutámico 0.015% proteína, 0.008% ac. urónicos. McLean et al., 1990. Pb, Cu, Zn. 87% azúcar total, 38% ácido urónico 6.3 % ácido pirúvico. Salehizadeh y Shojaosadati, 2003. Cd, Co. 33% azúcares totales, 26% proteína total. Ozdemir et al., 2005. Pb. 65.3% carbohidratos, 2.5% proteínas 8.1% ácidos urónicos, 0.18% acetiles. Arias et al., 2003. Cu. 33% alginato, 10% galactosa, 8.5% piruvato, 6.5% acetato, 4.2% galactosamina, 2.6% glucosa 2.1% manosamina, 1.8% quinosamina 1.6% glucosamina, 0.7% manosa. Kazy et al., 2002. Pb, Cu, Zn, Co, Ni, Cd Cu Cd, Cu, Pb, Zn. Cd. Fucosa, Glucosa, Arabinosa, Xilosa Ramnosa, Manosa, Galactosa Manosa 51.8% glucosa, 21.1% galactosa 13.8% ac. Glucurónico, 10.5% manosa 1.7% arabinosa, 0.3% N-acetil glucosamina 11 D-glucosa, 3 D- galactosa, 1.5 Ac. piruvico. Aguilera et al., 2001 (ver Morillo et al. 2006) Prado et al., 2005. Jensen-Spaulding et al., 2004. Ikeda et al., 1982 (ver Park et al., 1999). 23.

(35) Introducción. 1.5. Antecedentes directos Los microorganismos utilizados en este trabajo se aislaron de 8 muestras acuosas y. sólidas provenientes del lago de brea conocido como Pitch Lake, el cual se encuentra localizado en Trinidad y Tobago. Estudios previos, realizados en la ENCB-IPN y el Instituto Mexicano del Petróleo, llevaron a cabo el aislamiento de 22 microorganismos, de los cuales en el presente trabajo sólo se estudian 7. Lo anterior obedece a que estos microorganismos presentaron cierta capacidad de retener metales como son níquel, manganeso, selenio y vanadio, además su apariencia parecía indicar la producción de polisacáridos extracelulares (datos no publicados).. La Tabla 6 enumera a los aislados en estudio y la codificación que se les dio para el desarrollo del presente trabajo.. Tabla 6. Codificación de los microorganismos en estudio Aislado. Codificación. 1. PL3. 2. PL4. 3. PL7. 4. PL13. 5. PL14. 6. PL18. 7. WTFI. 24.

(36) Justificación. 2. JUSTIFICACIÓN La contaminación de aguas, sedimentos y suelos por metales pesados, surge como consecuencia de actividades humanas tanto industriales como relacionadas con la agricultura y el inadecuado procesamiento y disposición de residuos que contienen estos materiales. Este problema es cada vez más grave ya que produce efectos directos sobre los ecosistemas y en la salud de las poblaciones. En México se tienen reportes de contaminación con metales tales como arsénico, plomo, cobre, zinc en diferentes localidades tanto en aguas como en suelos y sedimentos.. Los metales no son susceptibles de ser degradados como puede suceder con los compuestos orgánicos (bifenilos, dioxinas), por lo que no se puede hablar de su eliminación en el sentido elemental debido a lo cual únicamente varía la concentración así como la forma química en que se encuentren. Existen diferentes técnicas empleadas en la remoción de metales tanto de suelo como de agua, las cuales son empleadas cuando se tienen concentraciones elevadas, pero cuando se tienen concentraciones muy bajas estas técnicas no son costeables y es en estas situaciones en las que se ha propuesto la aplicación de los sistemas biológicos como una alternativa.. La ventaja principal del uso de sistemas biológicos para la remediación de suelos y aguas contaminados con metales es que permiten una remoción eficiente, además de que ésta puede ser selectiva en cuanto a los metales contaminantes, con un mínimo impacto sobre las características del suelo o efluente.. En la naturaleza pueden encontrarse gran cantidad de microorganismos tolerantes o acumuladores de metales y el estudio de ellos permitirá el desarrollo de tecnologías de remediación biológica más efectivas.. 25.

(37) Objetivos. 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo general. Evaluar la capacidad de remoción de metales que presentan los microorganismos productores de polisacáridos extracelulares provenientes de un lago de brea.. 3.2 Objetivos específicos 1.- Conocer las características de morfología y de producción de polisacáridos en los microorganismos en estudio. 2.- Identificación de microorganismos por técnicas de biología molecular. 3.- Evaluar y seleccionar métodos de conservación a corto plazo de los microorganismos en estudio. 4.- Selección de los microorganismos por su capacidad de remover diferentes metales en cultivo sólido. 5.- Estudiar la cinética de crecimiento y producción de EPS por los microorganismos previamente seleccionados. 6.- Evaluar la remoción de metal por biomasa con respecto a la remoción presentada por el EPS de Bacillus (PL7). 7.- Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7).. 26.

(38) Materiales y métodos. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Fuente de microorganismos y caracterización Los microorganismos utilizados en el presente trabajo fueron proporcionados por el. laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB-IPN. Su origen y codificación se presentan en la Tabla 6 del presente trabajo (sección 1.5). Los microorganismos en estudio fueron caracterizados en cuanto a morfología colonial y microscópica, además se realizaron diversas tinciones para evaluar su Gram, formación de esporas y cristales paraesporales así como para evidenciar la presencia de cápsula y la producción de EPS.. 4.1.1. Morfología colonial y tinción de Gram Cada microorganismo se sembró en placas de agar nutritivo por la técnica de estría. y estas se incubaron durante 18 h a 30oC, en seguida se determinaron las características de morfología colonial.. La tinción diferencial de Gram se realizó utilizando el equipo de tinción de Gram (Golden Bell) siguiendo el protocolo tradicional (Madigan et al., 2004) que consistió en fijar el frotis al calor seguido por adición de solución de cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el portaobjeto, luego se adicionó una solución fijadora de lugol y en seguida se realizó la extracción del colorante con mezcla de alcohol-acetona, finalmente se adicionó safranina como colorante de contraste, entre cada adición de reactivo se hizo un enjuague con agua. Las preparaciones fueron observadas en un microscopio óptico con objetivo de inmersión (resolución 100X), evaluándose tanto la forma como el color.. 4.1.2. Tinción de esporas La verificación de formación de esporas por los aislados se realizó por tinción. diferencial de Wirtz-Conklin en la cual se utilizaron cultivos en fase estacionaria (cultivos de 24 h de incubación). La técnica consistió en preparar un frotis del aislado a evaluar y adicionar suficiente colorante verde de malaquita para cubrir el portaobjetos, se colocó. 27.

(39) Materiales y métodos encima del mechero y se calentó sin hervir durante 10 min, evitando que el sistema se secara; se enjuagó con abundante agua y se tiñó con safranina durante 1 min, finalmente se enjuagó y se dejó secar. La preparación se observó al microscopio con objetivo de inmersión (100X).. Las esporas retuvieron el primer colorante (verde) mientras que las células vegetativas sólo retuvieron el segundo colorante (rosa), lo cual permitió diferenciarlas y observar las esporas teñidas.. 4.1.3. Tinción de cápsula Para evaluar la presencia de cápsula en los aislados se realizó tinción en fresco. utilizando tinta china, lo anterior consistió en mezclar una asada de microorganismo en una pequeña cantidad de tinta china y mezclar. Las preparaciones se observaron al microscopio utilizando objetivo de inmersión (100X) así como en microscopio de contraste de fases.. 4.1.4. Tinción de polisacáridos extracelulares La evaluación de producción de EPS por los microorganismos se realizó siguiendo. el método reportado por Ruijssenaars y Hartmans (2001) para la evaluación de la producción de polisacarasas. Este método emplea un colorante (rojo Congo, Golden Bell) el cual interactúa de forma no covalente con los EPS haciéndolos visibles en la placa.. El método fue realizado inoculando por picadura cada uno de los aislados en placas de agar nutritivo e incubando por 18 h a 30oC. Luego de la incubación se cubrió la superficie de la placa conteniendo las colonias a evaluar, con una solución acuosa de rojo Congo (1 g/l) y se dejó reposar durante 20 min. Posteriormente, se enjuagó con agua desmineralizada y se cubrió con una solución 1 M de NaCl por 20 min. Finalmente, se enjuagó con agua desmineralizada y se observó si había retención de colorante por las colonias de cada microorganismo; una coloración roja fue considerada como prueba positiva.. 28.