FACULTAD DE VETERINARIA
"ESTUDIO DE LA HETEROCROMATINA EN CROMOSOMAS FIJADOS DE
BÓVIDOS DOMÉSTICOS (Bos taurus, Ovis aries y Capra hircus)"
Memoria presentada por el Licenciado D. JOSÉ LUIS FERNÁNDEZ GARCÍA
para optar al grado de Doctor Cáceres, 1.995.
José Ángel Padilla Peñas, Profesor Titular del Área de Producción
Animal (Genética y Mejora Animal) del Departamento de Zootecnia de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura.
INFORMA:
Que la tesis doctoral Titulada "ESTUDIO DE LA HETEROCROMATINA EN CROMOSOMAS FIJADOS DE BÓVIDOS DOMÉSTICOS (Bos taurus, avis
aries y Capra hircus)" presentada por D. José Luis Fernández García, Ldo. en
Veterinaria, ha sido realizada bajo mi dirección, en la Cátedra de Genética y Mejora Animal de la Facultad de Veterinaria de la UEx, y reúne las condiciones y calidad científica necesarias para su lectura y defensa con vistas a optar al Título de Doctor.
Para que conste y surta los efectos oportunos donde sea necesario, firmo el presente en Cáceres a 13 de Junio de 1995.
Al Dr. D. José Ángel Padilla Peñas Director de esta Tesis, por la dedicación y ayuda que he recibido en todo momento durante la realización y culminación de la misma.
A los Drs. D. Jaime Gosálvez y D. José Luis Bella y a su equipo de investigación (Departamento de Biología, Unidad de Genética, U.A.M.), por las valiosas aportaciones a las técnicas y la inmejorable acogida que me han ofrecido.
A todos los ganaderos e instituciones que me permitieron la recogida de las muestras, por el tiempo dedicado desinteresadamente les doy las gracias.
A los miembros de la Cátedra de Genética y de la Cátedra de Agricultura y Economía Agraria que me proporcionaron ayuda de gran valor cuando más la he necesitado.
A aquellas personas que de un modo u otro hayan contribuido al desarrollo y la finalización de este trabajo.
Y muy especialmente quiero expresar a Coro mi agradecimiento por haber estado a mi lado en todo momento, ofreciéndome compresión, paciencia y apoyo.
III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ... 11
III.1.- Estudio óptico de la organización del cromosoma metafásico eucariótico en los mamíferos. ... 13
III.1.1.- Estudios en cromosomas fijados sin tratamiento de pretinción. ... 15
III.1.1.1.- La tinción convencional con Giemsa es uniforme. ... 15
III.1.1.2.- Los bandeos fluorescentes tienen distintos objetivos... 15
III.1.2.- Estudios cromosómicos con tratamiento de pretinción... 19
III.1.2.1.- La Hibridación In Situ origen de la técnica de bandeo-C... 19
III.1.2.2.- Las bandas-C ponen de manifiesto heterocromatina constitutiva... 20
III.1.2.3.- Las bandas-G muestran heterocromatina intercalar. ... 22
III.1.2.4.- Patrón de bandas revertido o Bandeo-R. ... 23
III.1.2.5.- El bandeo-NOR detecta estructuras cromosómicas especializadas... 24
III.2.- Clasificación de los métodos de bandeo... 25
III.3.- La heterocromatina constitutiva. ... 27
III.3.1.- Definición de heterocromatina... 27
III.3.2.- La regularidad estructural de la heterocromatina está sometida a evolución ... 28
III.3.5.- Heterocromatina y ADN satélite - Papel funcional de la
heterocromatina ... 33
III.4.- Estudios cromosómicos en los bóvidos. ... 38
III.4.1.- Los cariotipos de la familia de los Bóvidos presentan una gran similitud... 38
III.4.2.- Las homologías cromosómicas dan luz a las teorías sobre la evolución y la conservación cromosómica en los bóvidos ... 53
III.4.3.- La fusión céntrica no constituye la única vía de evolución cromosómica en los bóvidos ... 55
III.5.- Análisis de la cromatina con endonucleasas de restricción. ... 58
III.5.1.- Endonucleasas de Restricción. Tipos. Otras nucleasas... 58
III.5.2.- Estudios citogenéticos con Endonucleasas de Restricción. ... 60
III.5.3.- Diferentes aplicaciones de las Endonucleasas de Restricción sobre cromatina de eucariotas. ... 65
III.5.4.- Factores determinantes de la acción de las endonucleasas. ... 67
III.5.4.1.- Influencia de las condiciones experimentales sobre el bandeo con Endonucleasas de Restricción... 67
III.5.4.2.- Frecuencia y tamaño de la diana de la endonucleasa. ... 69
III.5.4.4.- Método de preparación. Fijación... 75
III.5.4.5.- Detección de ADN satélite con Endonucleasas de Restricción. ... 77
III.5.4.6.- Heterogeneidad de la heterocromatina tratada con Endonucleasas de Restricción... 82
III.5.4.7.- Tamaño molecular de las Endonuclaeasas de Restricción... 86
IV. MATERIAL Y MÉTODOS... 89
IV. 1.- Material ... 91
IV.1.1.- Material biológico... 91
IV.1.2.- Material instrumental... 92
IV.1.2.1- Cultivos celulares... 92
IV.1.2.2.- Tratamientos cromosómicos. ... 93
IV.1.2.3.- Soluciones, tampones y mezclas de reacción... 94
IV. 2.- Métodos... 99
IV.2.1.- Toma de muestras de sangre... 99
IV.2.2.- Método de cultivo de sangre... 101
IV.2.3.- Procedimiento de cosecha del cultivo. ... 102
IV.2.4.- Almacenaje de preparaciones. ... 103
IV.2.5.- Métodos de bandeos. ... 103
IV.2.5.1.- Método de bandeo-CBG: ... 103
restricción... 107
IV.2.6.- Preparación de cariotipos... 111
V. RESULTADOS ... 113
V.1.- Detección de heterocromatina en bovinos, ovinos y caprinos mediante la aplicación de técnicas de bandeos clásicos. ... 115
V.1.1.- Detección de la heterocromatina constitutiva. ... 115
V.1.1.1.- Vacuno ... 116
V.1.1.2.- Ovino ... 117
V.1.1.3.- Caprino... 118
V.1.2.- La identificación cromosómica por bandeo-GTG. Estudio comparativo de bandas-GTG. ... 118
V.2.- Composición de la cromatina en bovinos, ovinos y caprinos mediante la aplicación de técnicas de bandeos fluorescentes adn específicos. ... 120
V.2.1.- Aspectos de la composición de la cromatina que reveló la técnica CDD. ... 121
V.2.2.- La tinción CDD como modelo de analogías cromosómicas entre bovinos, ovinos y caprinos... 122
V.2.2.1.- Vacuno ... 123
V.2.2.1.a.- Tinción CDD en vacunos con la translocación 1/29... 124
V.2.2.2.a.- Ovino ... 126
V.2.2.2.b.- Caprino ... 127
V.2.2.3.- Comparaciones del bandeo con CMA3 de las tres especies. ... 128
V.2.2.3.a.- Diferencias del patrón de bandas en autosomas con CDD... 132
V.2.2.3.b.- Las diferencias de bandeo CDD en los cromosomas sexuales. ... 135
V.2.2.3.c.- Otras diferencias del patrón de bandeo CDD entre ambas subfamilias. ... 137
V.2.3.- Composición de la heterocromatina. La regularidad y las variaciones de la heterocromatina en vacuno, ovino y caprino ... 138
V.2.3.1.- Estructura de la región heterocromática con CDD... 139
V.2.3.2.- Regularidades y diferencias del patrón de bandas-C... 140
V.2.3.3. Polimorfismos de bandas-C con bandeo CDD... 143
V.2.3.3.a.- Localización típica. ... 144
V.2.3.3.b.- Localización ectópica. ... 144
V.3.- Localización de las regiones organizadoras nucleolares por tinción con sales de plata. ... 146
V.4.- Efectos diferenciales y bandeos inducidos por las Endonucleasas de Restricción sobre cromosomas fijados de vacuno, ovino y caprino. ... 147
V.4.1.- Modelos de bandeo inducidos por digestión de cromosomas fijados con Endonucleasas de Restricción. ... 148
V.4.1.6.- Modelo de bandeo inducido por TaqI ... 165
VI. FIGURAS ... 169 VII. DISCUSIÓN ... 249
VII.1.- La distribución cromosómica de los diferentes patrones de bandeos
clásicos en bóvidos domésticos está conservada. ... 251
VII.1.1.- La localización de las bandas-C fue centromérica... 251 VII.1.2.- Efecto del bandeo-GTG sobre la heterocromatina... 255 VII.1.3.- La técnica CDD permite la identificación: de los cromosomas
de los bóvidos, de las regiones heterocromáticas y el análisis de
homologías cromosómicas entre especies... 257 VII.1.3.1.- La técnica CDD permite la identificación de los
cromosomas de los bóvidos... 258 VII.1.3.1.a.- la técnica CDD proporciona información para la
identificación... 260 VII.1.3.1.b.- Análisis comparativo de las diferencias de los
cariotipos de tipo bovino y tipo caprino... 264 VII.1.3.1.c.- Homologías estructurales de los cromosomas
sexuales del cariotipo tipo bovino y caprino... 269 VII.1.3.2.- La estructura de la región heterocromática esta
VII.3.- Detección de heterocromatina constitutiva por técnicas de bandeo con Endonucleasas de Restricción y su relación con el adn satélite de
los bóvidos. ... 284
VII.3.1.- La organización estructural de la heterocromatina. ... 287
VII.3.2.- Heterogeneidad de las dianas de restricción en la heterocromatina y la localización de ADNs satélites... 291
VII.3.2.1.- El ADN satélite I posee fracciones más resistentes a las endonucleasas de restricción empleadas... 294
VII.3.2.2.- El ADN satélite II es altamente repetitivo dada su susceptibilidad a los enzimas... 297
VII.3.2.3.- El ADN satélite III y IV exclusivos de ganado vacuno. ... 299
VII.3.2.4.- El ADN satélite en los cromosomas sexuales. ... 301
VII.3.2.5.- El ADN satélite en los cromosomas con translocación 1/29. ... 302
VII.3.2.6.- Evolución de las dianas de restricción en las regiones cromosómicas heterocromáticas comunes a las tres especies. ... 303
VII.3.2.6.a.- Ganancia o delección de las secuencias diana... 304
VII.3.2.6.b.- Inactivación o activación de secuencias diana. ... 304
VII.3.2.6.c.- Formación de "novo" de las dianas de restricción. ... 304
VII.4.- Implicaciones citogenéticas del ADN repetitivo... 306
VII.4.1.- La amplificación afecta a diferentes estructuras cromosómicas. ... 306
IX. RESUMEN ... 315
AT: pares de bases Adenina-Timina.
Bandas-CBAo: Bandas-C teñidas con naranja de acridina.
Bandas-CBG: Bandas-C teñidas con Giemsa.
Bandas-C-RE: Bandas similares a las bandas-C obtenidas con Endonucleasas de
Restricción.
Bandas-GBG: Bandas-G obtenidas por sustitución de timidina con
5-bromo-deoxiuridina y teñidas con Giemsa.
Bandas-G-HaeIII: Bandas similares a las bandas-G obtenidas por digestión con HaeIII
y teñidas con Giemsa.
Bandas-G-RsaI: Bandas similares a las bandas-G obtenidas por digestión con RsaI y
teñidas con Giemsa.
Bandas-GTG: Bandas-G obtenidas por digestión con tripsina y teñidas con Giemsa. Bandas-QFH: Bandas fluorescente obtenidas con Hoescht 33258.
Bandas-RBG: Bandas-R obtenidas con 5-bromo-deoxiuridina teñidas con Giemsa. Bandas-RBA: Bandas-R obtenidas con bromo-deoxiuridina teñidas con naranja de
Acridina.
CDD: Nomenclatura dada a la tinción cromosómica secuenciada por la aplicación de
Cromomicina A3, Distamicina A y 4,6'-Diaminidino-2-Phenyl-Indol HCl.
GG↓CC: Diana de restricción de HaeIII, indicándose con la flecha el lugar de corte. La
flecha tiene idéntico significado sobre las dianas de otras endonucleasas.
HIS: Hibridación in situ. Kpb: 1000 pares de bases.
NBA: Número de brazos autosómicos.
NOR: Regiones de los Organizadores Nucleolares. sat: satélite.
pb: pares de bases.
4-pb: dianas de restricción con cuatro pares de bases. 5-pb: dianas de restricción con cinco pares de bases.
La aplicación de técnicas citogenéticas al estudio de los cromosomas de los seres eucariotas han revelado la heterogeneidad de su estructura y composición (COMINGS y OKADA, 1975). La observación de una sensibilidad diferencial de los cromosomas fijados a la acción de agentes químicos y físicos (bandeo-C, -G y -R), o fluorocromos ADN específicos (bandeo-CDD)(BURKHOLDER, 1988), han demostrado la existencia de dos clases principales de cromatina en las células de eucariotas, eucromatina y
heterocromatina (SUMNER, 1982).
Una clase estructuralmente diferente de heterocromatina es la heterocromatina
constitutiva, que ha sido definida como bloques permanentemente condensados de
cromatina localizada en regiones discretas de los cromosomas homólogos en un complemento dado (BROWN, 1966). Otros análisis han corroborado su diferenciación estructural y funcional cuando fue comparada con la eucromatina. Así, las regiones heterocromáticas están frecuentemente, aunque no exclusivamente, compuestas de ADN altamente repetitivo o satélite (HSIEH y BRUTLAG, 1979) que, aparentemente, no tiene actividad transcripcional (CATALÁ et al., 1981, JOHN; 1988).
El bandeo-C ha sido el método rutinario empleado para localizar la heterocromatina constitutiva en un amplio número de organismos (SUMNER, 1972). Sin embargo, las técnicas de bandeo-C no han permitido distinguir si la heterocromatina contiene una o varias familias de ADN satélite o repetitivo (BIANCHI et al., 1990, MILLER et al., 1983).
La realización de estudios estructurales han mostrado la existencia de una gran similitud en la morfología de los cromosomas y el alto grado de homología en el patrón de bandeo-C en los bóvidos. Son particularmente importantes la utilización de fluorocromos específicos del ADN tales como 4'-6-diamidino-2-phenilindol (DAPI) o la cromomicina A3 (CMA3) para la detección de regiones cromosómicas que contienen
altas cantidades de pares de bases Adenina-Timina (AT) o Guanina-Citosina (GC), respectivamente (SCHWEIZER, 1976; JORGENSON et al., 1978; SCHWEIZER,
específicos ricos en pares de bases GC en la heterocromatina mediante la producción de una respuesta fluorescente homogénea (MAYR et al., 1985). Algunos estudios moleculares demostraron que el ADN satélite de vacuno, ovino y caprino contiene varias familias de ADN repetitivo enriquecido en pares de bases GC (KURNIT et al., 1973 y KURNIT et al., 1978).
Por otro lado, varias clases de cromatina, que diferían en términos de composición de bases del ADN, también han podido ser detectadas mediante la utilización de ciertas herramientas bioquímicas, como las Endonucleasas de Restricción de tipo II, que digerían diferencialmente el ADN localizado en diferentes regiones de los cromosomas fijados, y han dado lugar a modelos específicos de bandeo (MEZZANOTTE et al., 1983b; BIANCHI et al., 1985a; DE STEFANO et al., 1986; MEZZANOTTE, 1986). Se ha observado que la acción de las Endonucleasas de Restricción depende de la cantidad de dianas de restricción de cada área cromosómica considerada. Como se presume que la heterocromatina contiene ADN altamente repetitivo, las regiones específicas de Bandas-C serán ampliamente digeridas o, por el contrario, no afectadas, según que el ADN repetitivo contenga o no, respectivamente, la diana de la enzima de restricción utilizada. También es posible que las secuencias de bases repetitivas estén localizadas en áreas no consideradas como heterocromatina constitutiva. Así, cuando el número de dianas es alto, fragmentos cortos de ADN son extraídos (<1Kb de longitud) durante el tratamiento, mientras que frecuencias bajas de las dianas de reconocimiento producen grandes fragmentos (>1Kb de longitud) que quedan retenidos en la proteína cromosómica. La observación a lo largo de los cromosomas de regiones con diferencias en la intensidad de tinción indica la existencia de áreas cromosómicas con diferente sensibilidad a la enzima, incluso áreas completamente extraídas (BIANCHI et al., 1990).
Los primeros estudios basados en el empleo de Endonucleasas de Restricción en el genoma eucariota, se realizaron sobre ADN aislado que ha sido de gran utilidad para
el estudio y reconocimiento de secuencias repetitivas, ADN ribosómico y regiones metiladas del ADN (SOUTHERN y ROIZES, 1974; HÖRZ et al., 1974). También, el empleo determinadas Endonucleasas de Restricción sobre los cromosomas fijados demostraron la existencia de diferencias entre la eucromatina y la heterocromatina (SAHASRABUDDHE et al., 1978). Posteriormente, LIMA DE FARIA et al. (1980), utilizando las enzimas HaeIII y EcoRI sobre preparaciones citológicas de Muntiacus
muntjak, obtuvieron una serie de bandas sobre cromosomas fijados, indicando que las
Endonucleasas de Restricción podían escindir la molécula de ADN y producir diferenciación lineal del cromosoma fijado. Esta diferenciación lineal se relacionó con la distribución a lo largo de la molécula de ADN de secuencias específicas de nucleótidos que son reconocidas, cortadas y extraídas por el enzima.
Por todo ello, la extracción de ADN de los cromosomas metafásicos puede ser observada en las preparaciones citológicas con fluorocromos o Giemsa, lo que suministra información de secuencias de bases específicas y de la accesibilidad del ADN localizado en ciertas regiones del cromosoma. Las Endonucleasas de Restricción pueden así ayudar a comprender algunos aspectos de la estructura de la cromatina y analizar la naturaleza y distribución de las regiones de heterocromatina, en estudios comparativos y de diagnóstico (BABU, 1988).
Desde que EVANS et al. (1973) mostraran la amplia conservación cromosómica en los bóvidos, al encontrar analogías estructurales en todas las especies de bóvidos estudiadas, ha existido un creciente interés por el estudio comparativo de los cromosomas de estas especies filogenéticamente emparentadas. Según HEDIGER (1991), la existencia de analogías cromosómicas podría ser de utilidad en la extrapolación de los resultados de localizaciones génicas a las diferentes filogenias.
Sin embargo, frente estas amplias analogías cromosómicas, la heterocromatina constitutiva de los mamíferos ha mostrado mayor diversidad del ADN, como sucede en las especies animales más modernas, sin que se haya dado una explicación completa de su presencia en el genoma de los mamíferos, constituyendo uno de los principales y más intrigantes misterios de la citogenética (GRAPHODATSKY, 1989).
Esta diversidad ha planteado a los citogenetistas un gran número de preguntas. Así, en estudios comparativos realizados en bóvidos domésticos y no domésticos, MAYRet al.(1985) mostraron gran interés por determinar la estructura y organización en subregiones de la heterocromatina de las bandas C, detectadas sólo sobre cromosomas elongados. Otros investigadores como BIANCHI et al. (1990) profundizan en cuestiones como la composición de estas subregiones y en conocer la existencia de diferencias en la organización entre cromosomas de un mismo complemento.
En esta línea, el Objetivo General de nuestro trabajo fue indagar en la naturaleza y características de la estructura y la composición de la heterocromatina constitutiva de las tres especies de bóvidos domésticos más importantes en nuestra región (Bos taurus, Capra hircus y Ovis aries), utilizando para ello herramientas de análisis de la heterocromatina como las técnicas de bandeo clásicas, técnicas fluorescentes y técnicas de digestión de cromosomas fijados con Endonucleasas de Restricción.
1º. Determinar las equivalencias cromosómicas mediante el estudio comparativo de la analogías estructurales en Bos taurus L., Ovis aries L. y Capra hircus L..
1.a. Obtención de los cariotipos de bandeo en las especies citadas mediante técnicas de tinción diferencial: Bandeo-C, Bandeo-G y NOR.
1.b. Reconocimiento y localización de regiones cromosómicas heterocromáticas ricas en pares de bases AT y GC, mediante el uso de técnicas de fluorescencia con colorantes específicos del ADN, en las especies en estudio.
2º. Análisis comparativo de las analogías y divergencias en la composición de la heterocromatina constitutiva en cromosomas fijados de Bos taurus L., Ovis aries L. y Capra hircus L. mediante la aplicación de Endonucleasas de Restricción útiles en citogenética.
III.1.- ESTUDIO ÓPTICO DE LA ORGANIZACIÓN DEL CROMOSOMA METAFÁSICO EUCARIÓTICO EN LOS MAMÍFEROS.
La cromatina de los mamíferos está compuesta de ADN de doble hélice continuo, ARN y proteínas, plegados en diferentes puntos durante el ciclo celular1, utilizándose este término cuando aludimos a la organización molecular del material hereditario2.
Durante la metafase mitótica, esta cromatina se condensa de forma reproducible, en elementos con una morfología característica que denominamos cromosomas y cuyo número es generalmente constante para cada especie3. En estos cromosomas y por medio de diferentes técnicas citológicas es posible la obtención de una segmentación longitudinal en entidades denominados bandas. Estas técnicas citológicas, denominadas
bandeos cromosómicos, han permitido tanto identificar los cromosomas en diferentes
especies como explorar en detalle su morfología y estructura4, definiéndose como la variación longitudinal de las propiedades de tinción a lo largo de un cromosoma. Este concepto tiene un doble significado ya que ha venido aplicándose tanto al proceso de producción de las bandas como al patrón de bandeo obtenido con el mismo5. Además, cada cromosoma posee un patrón único que sugiere la existencia de una organización molecular sistemática que sería fundamental tanto en la estructura como en la función cromosómica.
1
Comings, D.E.; Elgin, S. y Weintraub, H. citados por S. A. Latt (1976).
2 Lacadena, J.R. (1988). 3 Latt, S.A. (1976). 4 Schulz-Schaeffer, J. (1980). 5 Sumner, A.T. (1990).
permitido distinguir tres tipos clásicos de cromatina: (1) la heterocromatina constitutiva centromérica que se corresponde con la cromatina de la bandas-C y que normalmente está enriquecida en ADN satélite totalmente inactivo; (2) heterocromatina intercalar, que corresponde a bandas-Q y -G, de los brazos cromosómicos enriquecidos en ADN de replicación tardía y relativamente inactiva; (3) eucromatina de las interbandas y que contiene ADN de replicación temprana y relativamente activo1.
En los inicios, los trabajos de CASPERSSON et al. (1968-1970), pusieron de manifiesto que los cromosomas metafásicos de numerosos organismos presentaban bandas fluorescentes cuando se tiñen con el fluorocromo mostaza de quinacrina (derivado de acridina)2. Posteriormente, los cromosomas procedentes de cultivos celulares pudieron diferenciarse, o bien directamente (p.e. con colorantes ADN específicos) o tras la exposición de las preparaciones a tratamientos químicos (p.e. exposición a álcalis), con un cuádruple objetivo: (i) revelar el nivel de organización, (ii) conocer las características morfológicas, (iii) obtener regiones definidas, (iiii) proponer una clasificación e identificación cromosómicas. Así, detrás de todos estos trabajos sobre bandeos ha surgido no sólo un conocimiento general de la estructura y organización cromosómica, sino también una comprensión de muchas de las diferencias y/o semejanzas citogenéticas entre especies3. Para entender dicha organización estructural vamos a repasar los métodos más utilizados en la investigación al microscopio óptico de cromosomas.
1
Comings, D.E. y A.T. Okada (1975).
2
Caspersson, T., Faber, S., Foley, G.E., Kudynowsky, J., Modest, E.J., Simonsson,E., Wagh, U. y L. Zech (1968).
Caspersson, T., Zech, L., Modest, E.J., Foley, G.E., Wagh, U. y E. Simonsson (1969). Caspersson, T., Zech, L.,
Johannson C. y E.J. Modest (1970a). Caspersson, T., Zech, L. y C. Johannson (1970b). Caspersson, T., Zech, L. y C. Johannson (1970c).
3
III.1.1.- Estudios en cromosomas fijados sin tratamiento de pretinción.
III.1.1.1.- La tinción convencional con Giemsa es uniforme.
Una vez que los cromosomas se encuentran sobre portaobjetos, pueden examinarse por diferentes técnicas. Así, si excluimos el contraste de fases de cromosomas no teñidos, los conteos cromosómicos, la observación de puntos frágiles sobre los cromosomas e incluso el análisis de la heterocromatina se efectúa, con frecuencia, por medio de la tinción con colorante Giemsa1. Este colorante, en circunstancias normales, tiñe uniformemente a los cromosomas sin especifidad sobre el ADN cromosómico2.
III.1.1.2.- Los bandeos fluorescentes tienen distintos objetivos.
La asociación de colorantes fluorescentes a cromosomas han tenido distintos objetivos3:
a.- Cuantificar el ADN total.
b.- Estimar el contenido de proteínas. c.- Detectar la integridad del ADN
d.- Estudiar la composición en pares de bases del ADN y su distribución a lo largo de los cromosomas.
En el primero de ellos, el procedimiento comúnmente utilizado es el procedimiento de Feulgen4. 1 Halnan, C.R.E. (1989). 2 MacGregor, H.C. y J. Varley (1983). 3 Latt, S.A. (1976). 4
sido utilizado la Sulfaflavina brillante, mientras que el contenido de residuos lisina en las proteínas cromosómicas ha sido determinado por medio del Cloruro de Dansilo. Especial interés poseen los análisis con anticuerpos fluorescentes conjugados, los cuales han demostrado que no todas las histonas son eliminadas de los cromosomas durante el proceso de fijación, aunque no proporcionen información cuantitativa de las proteínas que permanecen1.
En último lugar, las interacciones entre colorantes fluorescentes y el ADN o la cromatina permiten el estudio estructural de la misma. La integridad del ADN se ha estudiado con el fluorocromo Naranja de Acridina. Así, los cromosomas teñidos con Naranja de Acridina no sujetos a pretratamiento muestran o una fluorescencia verde con una pequeña diferenciación longitudinal (coloración que ha sido asociada a la presencia de ADN nativo) o, bien, una fluoresecencia roja cuando el ADN es de cadena sencilla2.
La técnica de bandeo fluorescente con quinacrina (bandeo-Q) u otras sustancias afines inducen un modelo de bandas constantes y reproducibles, características de cada pareja de cromosomas3.
La observación de una fluorescencia brillante con quinacrina tanto de una región del genoma de Drosophila, que contiene casi exclusivamente pares de bases A-T, como la mayor intensidad de fluorescencia encontrada en mezclas de poli(dA-dT) que en las mezclas de poli(dG-dC) teñidas con quinacrina, apoyaban la teoría de que estos colorantes incrementan la fluorescencia cuando se incrementa el contenido en pares de bases A-T del ADN, al cual se encuentran unidos4.
1
Pothier, L. Gallagher, J.F., Wright, C.E. y P.R. Libby (1975).
2
Lubs, H.A., McKenzie, W.H., y S. Merrick (1973). Comings, D.E., Avelino, E., Okado, T.A. y H.E. Wiandt (1973).
3
Märki, U y D.R. Osterhoff (1985).
4 Ellison, J.R. y H.J. Barr (1972) citados por S.A. Latt (1976). Comings, D.E., Kovacs, B.W., Avelino, E. y D.C. Harris
Los factores principales implicados en la producción de bandas en los cromosomas teñidos con quinacrina son: la distribución de pares de bases A-T y pares de bases G-C en el ADN1; las proteínas cromosómicas, predominantemente no histónicas2, que reducen la afinidad y la cantidades límite de colorante que pueden unirse a una cantidad fija de ADN; las fluctuaciones en la concentración de ADN a lo largo del cromosoma, p.e. para el brazo largo del cromosoma Y humano es el mayor determinante del modelo de tinción3.
Sin embargo, las bandas-Q aunque son equivalentes a otros tipos de bandas (p.e. bandas-G) no están recomendadas para los cromosomas de vacuno por tener una baja resolución4.
Por otro lado, un estudio más detallado de las estructuras cromosómicas se viene realizando mediante colorantes fluorescentes específicos para regiones ricas en pares de bases A-T o G-C5.
HILWING y GROOP (1972) utilizaron un derivado del bisbenzimidazole (Hoechst 33258) para realzar la intensidad de fluorescencia del ADN rico en pares de bases A-T. Así, aquellas regiones que contienen ADN repetitivo rico en pares de bases A-T aparecerán brillantes6, tal es el caso de los centrómeros de los cromosomas de ratón o las regiones centroméricas de algunos cromosomas humanos. Además, esta afinidad específica se ha utilizado para justificar su capacidad para descondensar las regiones centroméricas de los cromosomas de ratón, ricas en pares de bases A-T7.
1
Pachmann, U. and R. Rigler (1972).
2
Märki, U. and D.R. Osterhoff (1985).
3 Caspersson, T., Lomakka, G. and L. Zech (1971). 4
Gustavsson, J., Hagelthorn, M. and L. Zech (1976).
5
Schweizer, D., Ambros, P., Andrle, M., Rett, A. y W. Fiedler (1979). Schnedl, W., Abraham, R., Förster, M. y D.
Schweizer (1981). Mayr, B., Schweizer, D., Mendelak, M., Krutzler, Schleger, W., Kalat, M. y H. Auer (1985). Mayr, B., Lambrou, M., Kalat, M., Scheleger, W. y A. Bigelbach (1990).
6 Jalal, S.M., Clark, R., Hsu, T.C. y S. Pathak (1974). 7
fluorescencia al unirse a regiones cromosómicas ricas en pares de bases A-T es el 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)1, ambos producen un patrón semejante a las bandas-G.
Una modificación del contraste de las bandas observadas en los cromosomas, cuando se tiñen con fluorocromos específicos de pares de bases A-T, puede obtenerse si contrateñimos el porta con AmD (Actinomicina D), constituyendo el método AmD/DAPI, o con el oligopéptido antibiótico DA (Distamicina A), constituyendo el método DA/DAPI, que aunque no son fluorescentes presentan afinidad de unión a pares de bases complementarios a las del colorante principal2. La competencia por los puntos de unión a la cromatina o la transferencia de energía han sido citados como los mecanismos que justifican la estimulación del contraste3.
Al contrario que estos colorantes, la Cromomicina (CMA3) es un antibiótico
fluorescente con una afinidad específica por aquellas regiones compuestas por ADN satélite rico en pares de bases G-C, una prueba de ello es la intensa fluoresecencia observada en las regiones centroméricas de los bóvidos4.
Además, el método DA/DAPI fue modificado y mejorado por SCHWEIZER (1981), quién al añadir CMA3 a las bandas DA/DAPI obtiene dos modelos de bandeo:
bandas-R y bandas-QFH sobre la misma metafase5. Esta nueva técnica de tinción combinada. denominada CDD (CMA3/DA/DAPI), ha conducido a un marcado
1 Mayr, B., Lambrou, M., Kalat, M., Scheleger, W. and A. Bigelbach (1990). Jorgenson, K.F., Van de Sande, J.H. and
C.C. Lin (1978). Schweizer, D. (1976).
2
Schweizer, D. (1981). Sahar, E. and S.A. Latt (1978). Jorgenson, K.F., van de Sande, J.H. and C.C. Lin (1978).
Schweizer, D. (1976).
3
Schweizer, D. (1981). Sahar, E. and S.A. Latt (1978).
4 Mayr, B., Schweizer, D., Mendelak, M., Krutzler, Schleger, W., Kalat, M. and H. Auer (1985). 5
doblemente selectivo para regiones heterocromáticas de células metafásicas de diferentes especies animales1.
III.1.2.- Estudios cromosómicos con tratamiento de pretinción.
Existen un gran número de técnicas que cuentan con el pretratamiento de los cromosomas antes de realizar la tinción2. Estos tratamientos fueron elegidos por sus efectos sobre el ADN o la cromatina en solución. Posteriormente, se asumió que los mismos efectos se producían en los cromosomas fijados, aunque fue difícil examinar esta extrapolación de una forma directa3.
III.1.2.1.- La Hibridación In Situ origen de la técnica de bandeo-C
Este método, desarrollado por PARDUE y GALL4, utiliza la capacidad de ciertas secuencias de ADN o ARN exógeno para unirse específicamente con secuencias de nucleótidos complementarios de los cromosomas metafásicos en las preparaciones citológicas.
Desde el punto de vista técnico existen dos modalidades para la hibridación "in situ" (HIS):
a.- El ADN exógeno (sonda) contiene un isótopo radiactivo (3H o 125I) cuya localización puede detectarse por la deposición de granos de plata en una autoradiografía.
1
Schweizer, D., Ambros, P., Andrle, M., Rett, A. and W. Fiedler (1979). Schnedl, W., Abraham, R., Förster, M. and D.
Schweizer (1981). Mayr, B., Lambrou, M., Kalat, M., Schleger, W. and A. Bigelbach (1990). Mayr, B., Schweizer, D., Mendelak, M., Krutzler, Schleger, W., Kalat, M. and H. Auer (1985). Mayr, B., Schweizer, D. and W. Schleger (1983).
2
Latt, S.A. (1976).
3 Latt, S.A. (1976). 4
detectado por fluorescencia directa1 o indirecta utilizando digoxigenina o biotina y los anticuerpos específicos conjugados a sustancias fluorescentes2.
Las secuencias hasta ahora localizadas incluyen una gran variedad de ADN satélites3 así como ADNr (5S, 18S y 27S) y genes de copia sencilla4
Además, el bandeo-C fue descrito como un resultado del pretratamiento de preparaciones para hibridación in situ5, durante la realización de experimentos para localizar en los centrómeros de los cromosomas de ratón una secuencia de ADN satélite6. Posteriormente, fue modificado por ARRIGHI y HSU (1974)7 quienes al teñir con giemsa produjeron una intensa tinción de los centrómeros cromosómicos del ratón y otras especies animales8.
III.1.2.2.- Las bandas-C ponen de manifiesto heterocromatina constitutiva.
Estas bandas se ajustan a la definición clásica de heterocromatina constitutiva9, detectándose en los cromosomas de todos los organismos donde han intentado demostrarse, aunque su número varía enormemente entre las poblaciones y especies estudiadas.
1
Bauman, J.G.J., Wiegant, J., Borst, P. and P. Van Duijn (1980). Bauman, J.G.J., Van der Ploeg, M. and P. Van Duijn
(1984).
2
Renz, M. and C. Kurz (1984).
3 Pardue, M.L. and J. Gall, (1970). 4 Fechheimer, N.S. (1989) 5
MacGregor, H.C. and J. Varley (1983).
6
Pardue, M.L. and J. Gall, (1970).
7
Arrighi, F.E. and T.C. Hsu (1974).
8 MacGregor, H.C. and J. Varley (1983). 9
Así, fue denominada constitutiva, ya que la técnica citológica no diferenciaba la heterocromatina facultativa del cromosoma X humano de su homólogo de replicación temprana y genéticamente más activo1.
Este bandeo se interpretó por la existencia de una extensa desnaturalización del ADN, seguida de renaturalización selectiva de las secuencias repetitivas existentes en las regiones teñidas2.
Este modelo se pudo demostrar por diferentes caminos: (i) los resultados de hibridación in situ3, (ii) mediante la reacción de los cromosomas a anticuerpos específicos del ADN desnaturalizado4, (iii) análisis de microscopía electrónica que han indicado que la cromatina se pierde en las áreas de bandas-C negativas5.
Sin embargo, no parece existir una relación firme entre el grado de condensación de los bloques de ADN y su capacidad de producir bandas-C, ni tampoco entre el tipo de secuencia y las bandas-C, y aunque tiñe preferentemente ADN satélite no lo hace con exclusividad6. En algunas especies, las bandas-C pueden contener más de una secuencia satélite que, posiblemente, también estén dispersas en el ADN eucromático, como ha sido demostrado en el hombre y los primates7.
1
Latt, S.A. (1976).
2 Arrighi, F.E. and T.C. Hsu (1971). Hsu, T.C. and F.E. Arrighi (1971). 3
Pardue, M.L. and J. Gall, (1970).
4
Dev, V.G., Warburton, D., Miller, O.J., Miller, D.A., Erlanger, B.F. and S.M. Beiser (1972).
5
Latt, S.A. (1976).
6
MacGregor, H.C. and J. Varley (1983).
7 Gosden, J.R, Mitchell, A.R., Buckland, R.A., Claiton, R.P. and H.J. Evans (1975). Gosden, J.R, Mitchell, A.R.,
Poco después de la aparición de las técnicas de bandas-C, fue descubierta una técnica que proporcionaba una distribución más detallada de bandas1 y que denominaron bandas-G.
El estudio de los mecanismos de producción de estas bandas han originado diferentes hipótesis, que hemos resumido como sigue:
(i) Al contrario que el procedimiento de obtención de bandas-C, los tratamientos que inducen bandas-G no originan pérdidas de una cantidad significativa de la cromatina del portaobjetos2, aunque SUMNER y EVANS (1973) demostraron la inexistencia de relación entre la cantidad de ADN que permanece sobre los cromosomas y el patrón de bandas3.
(ii) Las bandas-G pueden ser producidas con pre-incubación de los portas a una temperatura suficientemente alta como para renaturalizar las secuencias ricas en A-T pero no las G-C4. Además, existen evidencias de que las secuencias repetitivas están localizadas predominantemente en las bandas-G positivas5, mientras que las secuencias que codifican para ARNm citoplasmático están predominantemente localizados en las bandas-G negativas. Tales diferencias podían explicar las diferencias en composición de proteínas entre bandas claras y oscuras, pero esta correlación aún no ha sido totalmente aclarada6.
1
Schnedl, W. (1971). Drets, M.E. and M.W. Saw (1971). Sumner, A.T., Evans H.J. and R.a. Buckland (1971).
2
Comings, D.E., Avelino, E., Okada, T.A. and H.E. Wyandt (1973).
3
Sumner, A.T. and H.J. Evans (1973).
4
Latt, S.A.(1976).
5 Pierpont, M.E. and J.J. Yunis (1977). Yunis, J.J., Kuo, M.T. and G.F. Saunders (1977). 6
(iii) Se ha postulado que las proteínas implicadas en las bandas-G son no histonas1, ya que los cromosomas fijados han perdido las histonas2 y, además, tras su completa eliminación con HCl 0.2 N aún pueden obtenerse bandas-G3. Por ello, las histonas parecen jugar un papel clave en las estructura de las subunidades cromosómicas en solución, mientras que las no histonas han sido consideradas los mayores determinantes en la estructura bandeada de los cromosomas fijados4.
(iv) Las bandas-G positivas corresponden a las regiones de replicación tardía de los cromosomas, como ha sido determinado por autoradiografía5 y por la técnica de incorporación de un análogo de la timina, la 5-bromodeoxiuridina (BrdU)6. Es posible, que las bandas-G representen áreas de organización de replicones, aunque está poco clara la forma de ordenación en dos tipos: aquellos replicones representados por bandas oscuras o positivas y aquellos representados por interbandas claras o negativas7.
III.1.2.4.- Patrón de bandas revertido o Bandeo-R.
Una pista tendente a dilucidar la naturaleza del bandeo con Giemsa consiste en la observación de que una variedad de tratamientos puede resultar en un revertimiento del patrón usual de Giemsa8. Este patrón revertido o bandeo-R, publicado por DUTRILLAUX y LEJEUNE (1971)9, sugirieron que las divisiones de los cromosomas
1
Comings, D.E., Avelino, E., Okado, T.A. and H.E. Wyandt (1973).
2
Comings, D.E., Avelino, E., Okado, T.A. and H.E. Wyandt (1973). Sumner, A.T., Evans, H.J. and R.A. Buckland
(1973).
3
Comings, D.E., Avelino, E., Okado, T.A. and H.E. Wyandt (1973).
4 Latt, S.A. (1976). 5
Ganner, E. y H.J. Evans (1971). Calderón, D. y W. Schnedl (1973).
6
Crossen, P.E., Pathak, D. y F.E. Arrighi (1975). Dutrillaux, B. (1975). Kim, M.A., Johanssman, R y K.H. Grzeschik
(1975). 7 MacGregor, H.C. y J. Varley (1983). 8 Latt, S.A. (1976). 9 Dutrillaux, B. y J. Lejeune (1975).
diferencialmente afectadas por los tratamientos particulares.
III.1.2.5.- El bandeo-NOR detecta estructuras cromosómicas especializadas.
GOODPASTURE y BLOOM (1975) describieron el método de tinción con plata para las Regiones de Organización Nucleolar (NOR) (genes de ARNr 18S y 28S), empleado para investigar y delimitar la posición y actividad de los mismos sobre los cromosomas de un gran número de especies1. La aparición de tinción sobre un cromosoma es el resultado de la unión de la plata al componente con proteínas ácidas del NOR activo en la interfase precedente, más que al ADN de esa porción del cromosoma2. La especificidad de esta tinción se mostró extremadamente elevada en mamíferos. Sin embargo, una sobrexposición a la plata originó no sólo la tinción de los NOR sino también la de los centrómeros, llegando incluso a afectar al cromosoma completo3. Modificaciones relativamente pequeñas de la técnica produjeron la tinción de las regiones ricas en pares de bases A-T y regiones satélites de los cromosomas humanos4 o los centriolos5.
En un estudio reciente, en sementales de la especie bovina, pudo demostrarse que el patrón de bandas NOR era característico de cada animal6 y que la frecuencia de distribución de los mismos entre los distintos pares de cromosomas homólogos, así como el número en cada par, estaba claramente controlada por el genotipo7.
1
Arruga, M.V. (1989). Miller, O.J., Miller D.A., Dev, V.G., Tantravahi, R. y R.M. Croce (1976). Goodpasture, C. y S.E. Bloom (1975). Howell, W.M., Denton, T.E. y J.R. Diamond (1975).
2
Busch, H., Lischwe, M., Michalik, J., Chan, P.-K. y R.K. Busch (1982). Howell, W.M. (1977).
3
Howell, W.M., Hsu, T.C. y B.M. Block (1977). Goodpasture, C. y S.E. Bloom (1975).
4
Howell, W.M. y T.E. Denton (1976).
5
Howell, W.M., Hsu, T.C. y B.M. Block (1977).
6 Mayr, B., Schleger, W. y H. Auer (1987a). 7
III.2.- CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE BANDEO.
La necesidad de una nomenclatura estandarizada para el bandeo cromosómico quedaron cubiertas en la conferencia de París de 1971, en la cual se definió la banda como "una parte del cromosoma claramente distinguible de los segmentos adyacentes por aparecer más clara u oscura después del tratamiento con diferentes métodos de bandeo"1.
La nomenclatura para las bandas está principalmente basada en los métodos utilizados para producirlas. Así, las bandas-C incluirían a aquellos métodos que son capaces de demostrar heterocromatina constitutiva; el bandeo-Q agruparía a aquellos métodos que utilizan la quinacrina o sus derivados para diferenciar bandas a lo largo de los cromosomas; las bandas-G reunirían los métodos que demuestran bandas a lo largo de los cromosomas utilizando mezcla de Giemsa y, el bandeo-R, (bandas revertidas) a aquellos métodos que produzcan un patrón de bandas opuesto en intensidad de tinción al obtenido con bandas-G2.
En la siguiente tabla se muestran las iniciales y denominaciones que describen cada tipo de bandas:
1 ISCN (1985). 2
TABLA I: Nomenclatura para denominar cada tipo de bandas.
Tipo de Banda Descripción
A Bandas inconsistentes producidas en preparados envejecidos. C Tinción heterocromática.
Cd Puntos centroméricos (cinetocoros).
D Bandas fluorescentes con Daunomicina o Adriamicina (equivalentes a bandas Q). D Regiones cromosómicas hipersensitivas a DNasaI.
E Bandas G producidas por digestión enzimática.
EM Bandas estructurales observadas en microscopía electrónica. F Cualquier tipo de bandas fluorescentes.
G Tinción Giemsa para bandas eucromáticas.
G11 Tinción diferencial producidas con Giemsa a pH 11. H Bandas fluorescentes con Hoescht 33258.
Hy Bandas heterocromáticas para tratamiento ácido. N Tinción con Giemsa para NOR. Q Bandas fluorescentes con quinacrina. R Bandeo G invertido.
T Bandas terminales producidas por choque térmico. W Bandas G y C con tinción Wright.
III.3.- LA HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA.
III.3.1.- Definición de heterocromatina
En 1928, HEITZ introdujo el término "heterocromatina" para describir aquel material cromosómico que presentaba características heteropicnóticas en determinadas etapas del ciclo de división celular1.
Mucho más tarde, BROWN (1966) estableció la diferencia entre dos conceptos2:
a.- Heterocromatina constitutiva, que es heteropicnótica en los núcleos interfásicos en todos los tipos celulares, cuya presencia y acción son constantes.
b.- Heterocromatina facultativa, que es heteropicnótica o bien en determinados tipos celulares o bien en fases concretas del ciclo de división celular y, por tanto, dependiente del estado fisiológico celular.
Las bandas que aparecen cuando las preparaciones citológicas de cromosomas metafásicos se tratan mediante bandeo-C u otras técnicas afines, han posibilitado la diferenciación de las regiones de heterocromatina constitutiva dentro de los cromosomas y la detección de sistemas de variación heterocromática en poblaciones naturales. Con ello, ha ido adquiriendo cada vez más fuerza la idea de que la categoría de variación cromosómica más común, implica la aparición de diferencias cuantitativas tanto en el número como en el tamaño de los segmentos heterocromáticos en cromosomas homólogos3. 1 Heitz, E. (1928). 2 Brown, S.W. (1966). 3 John, B. (1981).
evolución
El análisis de los primeros datos sobre bandas-C mostraron que el ADN del componente heterocromático del genoma presenta diferencias, tanto cuantitativas como cualitativas1. Esta categoría de variación cromosómica, además de ser muy común, implica la aparición de diferencias que afectarán tanto al número como al tamaño de los segmentos heterocromáticos en los cromosomas. Por ello, los cambios en la localización y el tamaño de los bloques de heterocromatina son una vía importante de la evolución de los mamíferos2.
Utilizando como marcadores cromosómicos los segmentos heterocromáticos de un genoma, es posible, no sólo caracterizar el cariotipo de una población determinada, sino también establecer la incidencia en las poblaciones naturales de una serie de polimorfismos y politipismos relacionados estrechamente con fenómenos citológicos importantes, como el apareamiento entre cromosomas homólogos o la distribución de quiasmas en los patrones de recombinación. Desde este punto de vista, las leyes y regularidades que gobiernan la posición en el cariotipo de las bandas C, proporcionarán la clave de los mecanismos citológicos y moleculares que subyacen en la evolución de los patrones de bandeo3.
Los estudios sobre distribución de las bandas, llevados a cabo fundamentalmente en insectos4, han permitido establecer una serie de regularidades y restricciones que parecen gobernar de una forma general la distribución de los patrones de bandeo5 y que pasamos a describir a continuación:
1
Hsu, T.C. y F.E. Arrighi (1971).
2
Graphodatsky, A.S. (1989).
3
Schweizer, D. y J. Loidl (1987).
4 John, B., King, M., Schweizer, D. y M. Mendelak (1985). 5
• Dotación heterocromática básica: cuando se demuestra la presencia
de bandas-C en un cariotipo, se localizaran de forma preferencial en los telómeros, centrómeros y los NOR.
• Modo de bandeo: todos los cromosomas de un complemento muestran
características de bandeo semejantes (distribución, cantidad y composición de bases) que se ven alteradas únicamente en los cromosomas con funciones especializadas (cromosomas sexuales, cromosomas portadores de NOR).
• Modelo de bandeo y tamaño cromosómico: Así, las bandas
teloméricas son frecuentes en los cromosomas pequeños de los complementos o en los brazos cromosómicos cortos. En cambio, los brazos largos tienden a desarrollar bandas intersticiales.
• Distribución equilocal de la heterocromatina: la heterocromatina
constitutiva tiende a localizarse, en los miembros no homólogos del mismo complemento diploide, en posiciones similares con respecto a la distancia del centrómero.
• Regularidades y restricciones que gobiernan la posición de las bandas intersticiales: para cada banda intersticial existe un brazo
cromosómico dentro del complemento cuyo telómero guarda la misma distancia respecto al centrómero que el borde proximal de la banda, lo cual sugiere un papel importante de los telómeros en la iniciación de la banda1.
1
establecer un modelo de mecanismo que explica la evolución de los patrones de bandeo-C y que, operando en brazos cromosómicos individuales, parece ser una característica común de muchos organismos1. Este modelo proporciona una explicación racional de los fenómenos de distribución equilocal de las bandas-C y de la coevolución tanto de los patrones de bandeo en brazos cromosómicos similares como de secuencias heterocromáticas en similares posiciones cromosómicas, y se basa en tres tipos de procesos moleculares: los mecanismos de amplificación de secuencias, de transferencia de secuencias y de homogeneización de secuencias. Este modelo asume que los telómeros, incluyendo las regiones céntricas de los cromosomas acro-telocéntricos, son lugares de iniciación de las bandas-C. En estas regiones tienden a originarse la amplificación heterocromática a partir de la cual las secuencias heterocromáticas se dispersarán2.
III.3.3.- La evolución heterocromática afecta al tamaño genómico de los mamíferos
Los tres mecanismos citados anteriormente contribuyen a la aparición de grandes diferencias en la cantidad de ADN tanto en el genoma completo como en cromosomas individuales de los mamíferos, debidas a cambios en el contenido de heterocromatina3.
Una prueba de ello podemos encontrarla en los roedores del género
Peromyscus. Estos fueron los primeros en evolucionar debido a la variación en brazos
heterocromáticos adicionales4. La determinación de la cantidad de ADN, en especies de este género con muchos brazos adicionales y sin ellos, demostró la existencia de
1
Schweizer, D. y J. Loidl (1987).
2
Schweizer, D. y J. Loidl (1987).
3 Patton, J.L. y S.W. Sherwood (1982). Sherwood, S.W. y J.L. Patton 1982). 4
diferencias de un 36% en sus tamaños genómicos1. Por ello, las diferencias en el tamaño de los genomas de estos roedores fueron indicativas de diferencias en el contenido de heterocromatina. Además, en estas especies está demostrado que el contenido de eucromatina es común, 5-6 pg2.
Por otro lado, SUMNER (1977) demostró que los cambios de tamaño de los bloques de heterocromatina en la especie humana influyen sobre la cantidad de ADN de cada cromosoma individual. Así, las diferencias de tamaño del genoma humano (las cantidades estimadas van desde 6 pg hasta 8 pg), también son debidas a las variaciones en el contenido del ADN heterocromático y que será característico de cada individuo3.
En los animales domésticos, también se han estudiado las diferencias de tamaño genómico, aunque en un menor número de ocasiones. En 1965, ATKIN et al. estimaron el tamaño genómico en cerdos (5.8 pg), conejos (5.9 pg) y caballos (7.2 pg), este último aparentemente subestimado dado el gran contenido en heterocromatina en el genoma de esta especie4. Más tarde, en un estudio comparativo en los bóvidos SUMNER y BUCKLAND (1976) detectaron que el buey (Bos taurus, L.) posee un 14% más de ADN genómico que ovinos y caprinos5. Y por ello, se ha sugerido que dado que el cariotipo de estas tres especies es idéntico en cuanto a patrón de bandas, las diferencias cuantitativas observadas pueden deberse, bien a microdelecciones o a un menor contenido de heterocromatina en los genomas de ovino y caprino respecto del contenido del genoma del vacuno6. Así, el tamaño genómico estimado para el yack y el vacuno doméstico, parece ser el mismo (11.1 pg) mientras que el de ovinos y caprinos es menor (9.9 pg)7.
1
Deaven, L.L., Vidal-Rioja, I., Jett, J.H. y T.C. Hsu (1977).
2
Gamperl, R., Ehmann, C. y K. Bachmann (1982).
3
Sumner, A.T. (1977).
4
Atkin, N.B., Mattison, G., Becak, W y S. Ohno (1965).
5 Sumner, A.T. y R.A. Buckland (1976). 6
Graphodatsky, A.S. (1989). Toll, G.L. y C.R.E. Halnan (1976).
7
III.3.4.- La heterocromatina de los bóvidos contiene ADN satélite rico en pb GC
La distribución de la heterocromatina en los bóvidos se conoce desde que HSU y ARRIGHI (1971) mencionaran que la cabra (Capra hircus) poseía heterocromatina centromérica1. Frecuentemente, se presentaba en bloque sencillo en cada pareja autosómica, no faltando ocasiones en las que algunos de los bloques se observan dividido en dos zonas. Este hecho puede reflejar diferencias estructurales de los bloques de heterocromatina constitutiva de los cromosomas de los bóvidos2. Pero, dada la uniforme disposición de bandas, esta técnica no permite identificar de una forma correcta los cromosomas, ni siquiera aquellos implicados en posibles polimorfismos de la heterocromatina constitutiva como los observados por POPESCU (1974), MORAES
et al. (1979) y GUSTAVSSON (1980)3.
Además, BRITTEN y SMITH (1970 y 1971) pusieron de manifiesto que tanto ovinos como bovinos presentaban secuencias de ADN altamente repetitivo rico en pb GC4 , que YASMINEH y YUNIS (1971) describen, en genoma de ternera, como dos satélites ricos en pb GC localizados en la heterocromatina de los núcleos interfásicos5.
Sin embargo, KURNIT et al. (1973) pusieron de manifiesto la existencia de 5 clases de ADN satélite en bovino (satélite I, II, III, IV y V) y dos clases en ovinos y caprinos (I y II); y que ovinos, caprinos y bovinos difieren en el contenido porcentual, en clases y en la localización del ADN satélite, sugiriendo que el exceso del 14% del satélite vacuno sea debido a la presencia de satélite III, IV y V. En estudios llevados a cabo por estos autores utilizando HIS y centrifugación de ADN genómico en gradiente
1
Hsu, T.C. y F.E. Arrighi (1971).
2
Evans, H. J., Buckland , R.A. y A.T Sumner (1973).
3
citados por Popescu, P.C. (1989).
4 Britten, R.J. y J.F. Smith (1970). Britten, R.J. y J.F. Smith (1971). 5
de ClCs revelaron cuatro similitudes superficiales entre las clases de satélite I y II de las tres especies, que resumimos1:
② ambos satélites son ricos en pares de bases GC. ② similares densidades de flotación en ClCs.
② las cantidades por genoma son relativamente iguales.
② pronunciada separación de cadenas del satélite I en gradiente de
densidad del satélite I.
III.3.5.- Heterocromatina y ADN satélite - Papel funcional de la heterocromatina
El genoma eucariótico está compuesto de secuencias de ADN con diferentes grados de repetición. Aunque no hay una definida distinción entre clases de frecuencia de repetición, este ADN está dividido, por conveniencia, en cinco clases diferentes de secuencias2:
a.- secuencias palindrómicas, que presentan reasociación más rápida que las secuencias de ADN altamente repetitivas y, por ello, reciben el nombre de secuencias de reasociación cero o muy rápida.
b.- secuencias de ADN altamente repetitivo, con más de 106 copias por genoma. Las unidades de repetición van desde secuencias de menos de 10 pares de bases hasta el ADN satélite localizado en la heterocromatina centromérica.
c.- secuencias de ADN moderadamente repetitivo con 105-103 copias por genoma haploide.
1 Kurnit, D.M., Shafit, B.R. y J.J. Maio (1973). 2
d.- secuencias de ADN de baja frecuencia de repetición, caracterizadas por una frecuencia de repetición de unas 40 copias por genoma.
e.- ADN único (single-copy) con menos de 102 copias por genoma.
El grupo de ADN repetitivo afecta a secuencias que van desde genes ARNr e histonas hasta secuencias cortas de pares de nucleótidos que, obviamente, no tienen función codificadora y se encuentran dispersas por el genoma (microsatélites). Aquellas moléculas con tamaño y estructura semejante estarán formando familias. Estas familias son conocidas como1:
I. Secuencias estructuralmente sencillas ricas en pares de bases AT o GC en el ADN satélite.
II. Familias de secuencias repetitivas caracterizadas por diferencias en la localización cromosómica y grado de conservación evolutiva.
Por otro lado, la heterocromatina y las secuencias de ADN repetitivas no deben ser consideradas lo mismo, dado que no todas las secuencias repetitivas se localizaban en la heterocromatina sino que una buena parte de ellas estaban dispersas a lo largo del cromosoma. Sin embargo, la detección de regiones de bandas-C parece depender del ADN repetitivo implicado en la formación de los bloques, como sucedió en las regiones heterocromáticas de los cromosomas sexuales del hamster que son deficientes en fracciones de ADN altamente repetitivas2.
1 Graphodatsky, A.S. (1989). 2
Los estudios que intentan relacionar las regiones heterocromáticas con el ADN satélite de los cromosomas eucarióticos han aportado información sobre aspectos de gran interés sobre diferencias y homologías interespecíficas e intraespecíficas, tanto aquellas que afectan al genoma completo, como a los cromosomas y brazos cromosómicos, por ejemplo:
a.- Aspectos asociados a las diferencias de composición de las regiones heterocromáticas cromosómicas, aún en especies filogenéticamente relacionadas. Así, el ADN satélite concentrado en la región del brazo hetrocromático adicional de Peromyscus eremicus resultó homólogo al de Peromyscus collatus, pero estaba prácticamente ausente en los bloques centroméricos de Peromyscus crinitus y Peromyscus stephani1.
b.- Aspectos relacionados con homologías en el ADN satélite de la heterocromatina en especies filogenéticamente emparentadas. Tal es el caso de ovinos y caprinos, en los cuales el ADN satélite de la heterocromatina presentaban notables homologías. Además, algunos de ellos resultaron homólogos al ADN de los bloques heterocromáticos de vacuno2.
c.- Aspectos estructurales. Como es el caso del ADN satélite rico en pares de bases G-C, concentrado en las regiones heterocromáticas, de los equidos3.
1
Hazen, M.M., Arrighi, F.E. y D.A. Johnston (1977).
2 Kurnit, D., Brown, F.L. y J.J. Maio (1978). 3
d.- Aspectos de conservación evolutiva de las familias de ADN repetitivo, localizadas tanto en la heterocromatina como dispersas a lo largo de los cromosomas, y que están caracterizadas por diferentes grados de conservación. Sin embargo, hay que mencionar que algunos tipos de secuencias repetitivas dispersas presentaban un alto grado de homología incluso entre diferentes ordenes de mamíferos1.
En resumen y según unos estudios realizados en carnívoros utilizando hibridación "in situ" ADN/ADN, tanto sobre cromosomas de especies con grandes bloques heterocromáticos y sin ellos, ha sido demostrado que2:
- Las regiones heterocromáticas pueden contener ADNs de diferente complejidad, repetitividad y conservadurismo evolutivo.
- El ADN repetitivo no disperso, presenta amplificación no asociada a la amplificación de la heterocromática.
- El ADN repetitivo disperso, es variable tanto en estructura como en repetitividad. Además, en los mamíferos, el ADN repetitivo disperso parece ser más conservativo que aquel que se localiza en las regiones céntricas.
1
Singer, M.F. (1982). Gillespie, D., Donehohower, L. y D. Strayer (1982). Lomidze, N.V., Kramerov, D.A. y A.P.
Riscov (1986). Fanning, T. y M.F. Singer (1987).
2 Potapov, V.A., Ivanov, S.V., Graphodatsky, A.S., Kudryashova, N.V. y A.G. Romaschenko (1987). Graphodatsky,
De estas observaciones, se han planteado algunas hipótesis de la funcionalidad de esta clase de cromatina que intentan explicar la diversidad que afecta tanto a las repeticiones y como a la heterocromatina de las especies animales más modernas. Aunque algunos autores asumen que todas estas hipótesis serán simultáneamente ciertas, pese a su contradictoriedad1. Así, podemos aceptar las siguientes hipótesis sobre la funcionalidad de esta clase de ADN2:
1. Papel estructural: MANUELIDIS (1982) sugirió, dado el alto grado de conservación del ADN repetitivo disperso dentro de un ADN eucariótico también muy conservado, que este ADN repetitivo disperso participa en la organización del cromosoma interfásico.
2. Papel activador génico: GRAPHODATSKY (1989) sugirió que los cambios en el tamaño de los bloques y del contenido total de la heterocromatina puede supuestamente influir en la actividad funcional de los genes y así proporcionar un material de importancia para la selección y la evolución.
1 Graphodatsky, A.S. (1989). 2
Desde principios de siglo, ha ido adquiriendo importancia la investigación y el estudio citogenético de las diferentes especies de la familia Bovidae y sus relaciones evolutivas1. Uno de los motivos de tal interés es el hecho de que esta familia presenta la mayor diversidad de especies dentro de las nueve familias de Artiodáctilos, con 45 géneros y 124 especies2. A patir de la demostración del patrón de bandas-C en vacuno, ovino y caprino3, han aparecido gran cantidad de estudios sobre el cariotipo de otras especies de bóvidos como el bisón, búfalo africano, eland, kudú, oryx, banteng y búfalo de agua4.
III.4.1.- Los cariotipos de la familia de los Bóvidos presentan una gran similitud
Las tres especies principales de la familia Bovidae podemos encuadrarlas en dos subfamilias diferentes5:
❋ Subfamilia Bovinae para Bos taurus.
❋ Subfamilia Caprinae para Ovis aries y Capra hircus.
Se ha deducido que el mecanismo primario de la evolución del cariotipo de toda la Familia Bovidae ha sido la translocación Robertsoniana6, dado que el número de brazos autosómicos (NBA) en el cariotipo de ambas subfamilias es notablemente constante (NBA=58). Por otro lado, la vía de la translocación Robertsoniana no es el mecanismo habitual de evolución de los cromosomas sexuales, siendo la teoría más
1 Moreno Millán, M. y A. Rodero (1990). 2
Vaughan, T.A. (1986).
3
Evans, H. J., Buckland , R.A. y A.T Sumner (1973).
4
Bongso, T.A. y M.A. Hilmi (1982). Buckland, R.A. y H. J. Evans (1978 a y b). Di Berardino, D. y L. Ianuzzi (1981). Pathak, S. y N.M. Kieffer (1979).
5 Morris, D. (1965). 6
aceptada el reordenamiento cromosómico para el gonosoma X1 e incierto el origen del cromosoma Y2.
Los cariotipos de estas tres especies se conocen desde hace mucho tiempo. Así, el vacuno doméstico (Bos taurus, L.) posee un cariotipo con 58 autosomas todos acrocéntricos y dos cromosomas sexuales, submetacéntrico el X y metacéntrico y de pequeño tamaño el Y, dada la posición del centrómero aproximadamente en la región mediana3. La cabra doméstica (Capra hircus, L.) es una de las especies de mayor dificultad de estudio pues posee 60 cromosomas, de ellos 58 autosomas son acrocéntricos, como los de vacuno, y el cromosoma sexual X también morfológicamente acrocéntrico, en cambio el Y es el más pequeño del complemento y metacéntrico4. La oveja doméstica (Ovis aries, L.) posee un cariotipo constituido por tres pares de cromosomas metacéntricos (números 1, 2 y 3), formados por fusiones céntricas5, y veintitrés pares de acrocéntricos que constituyen une serie decreciente dividida, según la clasificación de la conferencia de Reading6 en cinco rangos y con cromosomas sexuales semejantes a los del caprino7.
La identificación de sus cromosomas, por medio de técnicas de bandeo-G, fueron recogidas con ocasión de la 1ª conferencia para la normalización de los cariotipos bandeados de los animales domésticos que tuvo lugar en Reading, Inglaterra (1976)8, y posteriormente modificada, y ampliada con bandeo-R, por el ISCNDA
1
Hayes, H., Petit, E. y B. Dutrillaux (1991). Kaftanovskaya, H. M. y O. L. Serov (1994).
2
Gallagher, D.S., Derr, J.N. y J.E. Womack (1994).
3
Popescu, P.C. (1989).
4
Moreno Millán, M. y A. Rodero (1990). Popescu, P.C. (1989).
5 Wurster, D.H. y K. Benirschke (1968). Bruèrè, A.N., Chapman, H.M., Jaine, P.M. y R.M. Morris (1976). Schnedl, W.
and R. Czaker (1974).
6
Ford C.E., Pollock, D.L. y I. Gustavson (1980).
7
Kaftanovskaya, H. M. y O. L. Serov (1994).
la ordenación de los cromosomas 8-9 y 19-20 de los ovinos.
En las citadas conferencias, tomó cuerpo la idea de que los cariotipos de los bovinos, ovinos y caprinos domésticos presentan un alto grado de similitud, tanto en el número fundamental de brazos autosómicos (NBA=58) como en el patrón de bandas-G y -R de la gran mayoría de los brazos cromosómicos3. Esto ha propiciado que los cromosomas de ovino, caprino y vacuno se considerasen equivalentes, desde el punto de vista citogenético. Tanto es así, que si exceptuamos los tres cromosomas metacéntricos propios del cariotipo ovinos, las diferencias en cromosomas que se mostraron no equivalentes observadas entre caprino y ovino, por un lado y vacuno, por otro, establecieron una dualidad para los cariotipos de los bóvidos denominándolos tipo caprino y tipo vacuno, respectivamente4.
Las siguientes ilustraciones son una reproducción del idiograma normalizado de bandas-G propuesto por la ISCNDA (1989), con las indicaciones de equivalencias cromosómicas y el modelo de bandas-G y bandas-R.
1 ISCNDA, (1990). 2 Long, S. (1985). 3
Evans, H. J., Buckland , R.A. y A.T Sumner (1973). Schnedl, W. y R. Czaker (1974). Buckland, R.A. y H. J. Evans
(1978a). Di Berardino, D., Ronne, M., Burguete, I., Lioi, M.B., Taibi, L. y D. Matassino (1987). Menscher, S.H., Bunch, T.D. y A. Maciulis (1989).
4
IDIOGRAMA Nº autosómico
bovino
Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
1q 1q/1q cuatro 21 bandas-G *Dos bandas centrales negativas (31, 33)
separadas por una positiva (32), una banda terminal negativa (45) y un estrecho telómero positivo. 21 bandas-R *Revertido IDIOGRAMA Nº autosómico bovino Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
2q 2q/2q cuatro 20 bandas-G *Cuatro bandas positivas (13,15,22,24)en
la mitad proximal, 13 y 15 frecuentemente unidas; cuatro positivas (34,36,42,44) en la mitad distal, 42 y 44 prominentes, telómero negativo.
20 bandas-R *Revertido, destaca en intensidad las bandas 21, y 43 y 45 unidas.
IDIOGRAMA Nº autosómico
bovino
Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
3q 3q/1p tres 15 bandas-G *Banda positiva subcentromérica (12), dos
bandas positivas centrales prominentes (24, 32) separadas por una amplia banda negativa (31).
17 bandas-R *Revertido, notable banda 31, separando la 24 y 32. IDIOGRAMA Nº autosómico bovino Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
4q 4q/4q tres 19 bandas-G *Cuatro bandas positivas (12, 14, 16, 18)
en la mitad proximal con amplia banda negativa que separa 14 y 16; dos prominentes positivas (21, 31) separadas adicionalmente por otra positiva (23) en la mitad distal.
19 bandas-R *Revertido, destaca un bloque de tres bandas reunidas terminales.
IDIOGRAMA Nº autosómico
bovino
Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
5q 5q/3q tres 15 bandas-G *Dos bandas negativas centrales anchas
(21, 31) separadas por tres bandas positivas (22, 24, 26) de igual distribución, un telómero negativo (35).
15 bandas-R *Revertido, banda 35 procede de fusión de bandas. IDIOGRAMA Nº autosómico bovino Equivalencias Caprino/Ovino
Nº Regiones Nº de bandas Modelo de bandas
6q 6q/6q tres 17 bandas-G *tres bandas positivas (12, 14, 21) de igual
distribución en la mitad proximal del cromosoma; la mitad distal semejante a cromosoma 4 con dos bandas positivas (21, 31) separadas por una banda positiva (25).