Guía de Trabajos Prácticos N 1 Cristalización y Crecimiento Cristalino

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Guía de Trabajos Prácticos N°1

Cristalización y Crecimiento Cristalino

Introducción

La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas, átomos o iones se ordenan de un modo natural de forma repetitiva y periódica en tres dimensiones dando lugar a lo que denominamos cristal. Existen diversas técnicas que permiten obtener material cristalino y en este curso nos concentraremos en las que dan lugar a la obtención de monocristlaes o cristales únicos. En general, la preparación de monocristales presenta dificultades peculiares y se requieren numerosos ensayos para fijar las condiciones óptimas de trabajo en un método dado, sin que esto quiera decir que sea previsible el resultado en un caso aislado. La obtención de monocristales de tamaño diverso resulta de interés para diferentes campos y está vinculada con diversas aplicaciones tanto industriales como en el ámbito de la ciencia básica. Por ejemplo, monocristales de germanio de gran tamaño se obtienen industrialmente y se utilizan para el desarrollo industrial de dispositivos optoelectrónicos, monocristales de diamante son obtenidos artificialmente por métodos de cristalización a alta presión y temperatura y son destinados principalmente para usos decorativos, la obtención de monocristales de diferentes moléculas que van desde pocos átomos como pueden ser óxidos metálicos, pasando por moléculas orgánicas de decenas de átomos, hasta macromoléculas como las proteínas con cientos de átomos, son el objetivo de muchos grupos de investigación de ciencia básica como aplicada de diferentes disciplinas.

En los laboratorios de química principalmente y en la industria, el proceso de cristalización también es aplicado como método de purificación, y en este caso se denomina recristalización. Para llevar a cabo este proceso, la sustancia a purificar debe disolverse en un solvente adecuado (o mezcla de solventes) a temperatura elevada y después de la eliminación de cualquier material no disuelto (impurezas) por filtración, la solución resultante se enfría lentamente hasta la formación de cristales. Cuanto más lento sea el proceso, mayor será el tamaño de los cristales obtenidos y pureza de los mismos.

En este trabajo práctico se explorarán diferentes técnicas para la obtención de monocristales, empleando además diferentes sustancias a cristalizar.

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PARTE 1. Crecimiento de cristales de lisozima por difusión de vapor en gota

sentada

Hoy en día hay dos métodos fundamentales para determinar la estructura tridimensional de una proteína. Por un lado está la resonancia magnética nuclear (RMN) y, por el otro, la cristalografía de rayos X (difracción de rayos X de monocristal). Con el método de RMN sólo se pueden estudiar moléculas con un peso molecular aproximado de hasta 25.000 Da (25 kDa, o aproximadamente 220 aminoácidos) es por ello que la difracción de rayos X es más apropiada para determinar la estructura de proteínas más grandes o complejos macromoleculares. El primer paso para utilizar esta metodología radica en la obtención de monocristales de tamaño y calidad adecuada. En esta parte del trabajo práctico se llevará a cabo la cristalización de la proteína lisozima por el método de difusión por vapor en gota sentada (“sitting drop”, Fig. 1 derecha). Otro método equivalente es el de gota colgante (“hanging drop”, Fig. 1 izquierda). En ambos, la solución de la proteína se encuentra en una gota ubicada en un compartimento interno (pedestal) de un pocillo (reservorio que contendrá una solución en la cual la proteína es insoluble) o suspendida de la parte inferior de una lámina de microscopio que cubrirá el pocillo. El tamaño de la gota oscila normalmente entre los 0,5 µL y los 20 µL. La solución del pocillo (ca. 0,5-1 mL), reservorio por debajo de la gota o que contiene el pedestal con la gota sentada, posee una elevada concentración de agente precipitante y dispone, por tanto, de una presión de vapor inferior a la de la solución proteica. Durante el experimento, el agua de la gota se evapora y de esta manera, la concentración de proteína de la gota aumenta, junto con la concentración de otros materiales. En condiciones favorables, la cristalización tendrá lugar al cabo de unos días o semanas.

Figura 1. Métodos de cristalización para proteínas

En el trabajo práctico se utilizará lisozima, una proteína muy estable compuesta por 129 aminoácidos con un peso molecular de 14,3 kDa. La misma además, presenta diferentes aplicaciones debido su actividad antibacteriana, antiviral, antinflamatoria, analgésica, antitumoral y antioxidante.

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3 1) Objetivos

Llevar a cabo un método adecuado para la obtención de monocristales de lisozima. Estudiar el efecto de diferentes variables en el proceso de cristalización y en la calidad de los moncristales obtenidos.

2) Materiales

- Placa de cristalización de 24 pocillos “Cryschem” de Hampton Research para gota sentada - Cinta adhesiva transparente

- Lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma #L-6876) disuelta en agua en diferentes concentraciones (30 – 50 – 70 mg/mL)

- Soluciones de cristalización compuestas por buffer acetato de sodio - ácido acético 0.1M pH = 4,0 + cloruro de sodio en concentraciones variables (1.1 – 1.2 – 1.3 – 1.4 M)

- Micropipetas, tips, tubos eppendorf, gradillas

3) Procedimiento

1. Pipetear 500 μL de solución de cristalización rotulada “1.1M” (Buffer acetato de sodio – ácido acético 0.1M pH = 4,0 + cloruro de sodio 1.1M) en los reservorios principales de los pocillos A1,

A2 y A3. Utilizar la tabla 1 como guía y para registro de resultados posteriormente.

Tabla 1

2. De forma análoga, pipetear 500 μL de las soluciones “1.2M”, “1.3M” y “1.4M” en los reservorios principales de los pocillos B1-B2-B3, C1-C2-C3, y D1-D2-D3, respectivamente.

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4. Adicionar al pedestal 3 μL de lisozima (30 mg/mL) mezclando sin formar burbujas. Procurar que la gota quede lo más redonda posible.

5. Cubrir el pocillo completamente con cinta adhesiva transparente. Sellar presionando con una pequeña porción de papel, espátula de goma, etc.

6. Repetir los pasos 3, 4 y 5 para los otros 11 pocillos, teniendo especial cuidado que cada uno lleve su correspondiente solución de cristalización y su correspondiente concentración de lisozima, tal como se indica en la tabla 1.

7. Incubar la placa (idealmente) en una sala de cristalización termostatizada a 18-21 ºC en ausencia de vibraciones.

8. Ver la placa al microscopio a tiempo cero y a diferentes días y hacer las anotaciones de los resultados en la tabla de la página anterior.

4) Informe

Presentar los resultados obtenidos utilizando la tabla 1 como guía. Discutir lo observado utilizando las siguientes preguntas como referencia:

¿Se formó precipitado instantáneamente? ¿Aparecieron cristales/dendritas/separación de fases? ¿Son todos los cristales iguales? ¿Hay alguna tendencia al modificar la concentración del precipitante y/o proteína?

5) Referencias

Este trabajo práctico se basa en el material y experiencia proporcionada por el Dr. Sebastián Klinke del Instituto Leloir.

Sitio web: http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html

Trabajo: Dessau M.A., Modis Y. (2011). Protein Crystallization for X-ray Crystallography. JoVE. 47. http://www.jove.com/details.php?id=2285, doi: 10.3791/2285

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PARTE 2. Obtención de monocristales de CuSO

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.5H

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O por método de semilla

El sulfato de cobre tiene varios usos y aplicaciones, entre los cuales se destaca su utilización en fungicidas, insecticidas, estimulación del crecimiento en la agricultura, la esterilización del suelo, desinfección, conservantes, antisépticos, productos farmacéuticos, la prevención de enfermedades y colorante. Por otro lado, mediante diferentes métodos de cristalización es posible obtener sin grandes dificultades monocristales de la sal pentahidratada de gran tamaño y calidad.

1) Objetivos

Explorar el método de obtención de monocristales por medio de los métodos de evaporación lenta de solvente y utilizando semillas. Evaluar la calidad de monocristales. Utilizar curvas de

2) Materiales - Vasos de precipitados - Cristalizadores - Placas de Petri - Manta calefactora - buretas

- Varilla de vidrio, espátula, termómetro, parafilm - Recipientes varios

3) Procedimiento Obtención de semillas.

1. Pesar aproximadamente 5 gramos de sulfato de cobre y utilizando la curva de solubilidad de la Tabla 2 preparar una solución sobresaturada en un vaso de precipitados (considerar un 5-10% de sobresaturación) a temperatura ambiente. Calentar con agitación para obtener una solución homogénea. Filtrar si fuera necesario. Utilizar la manta calefactora, varilla y termómetro.

2. Verter cuidadosamente la solución a un cristalizador o placa de Petri. Tapar con parafilm y realizar pequeños orificios.

3. Dejar cristalizando durante unos días en lugar libre de vibraciones.

Cristalización utilizando método de semilla

4. Elegir un monocristal adecuado para utilizarse como semilla en el proceso de cristalización 5. Sujetar la semilla a una tanza, pelo o hilo en un dispositivo como el de la Fig.2 .

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6. Preparar una solución sobresaturada de sulfato de cobre como se procedió en el paso 1, pero partiendo de 30-50 g.

7. Dejar enfriar (¿porqué?) y trasvasar al dispositivo de cristalización de a Fig. 2. 8. Dejar cristalizando durante unos días en lugar libre de vibraciones.

9. Evaluar los resultados obtenidos en relación a las características del/los cristal/es obtenidos.

Tabla 2

Figura 2

4) Informe

Incluir las masas, volúmenes y temperaturas utilizados y las características del/los cristales obtenidos. Incluir los criterios utilizados para la selección de los cristales. Si es posible incluir tamaños, ángulos de los cristales obtenidos.

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PARTE 3. Curva de solubilidad y variables en experimentos de cristalización de

nitrato de potasio (KNO

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El nitrato de potasio es mayoritariamente utilizado como fertilizante pero también se emplea en la conservación de alimentos y posee algunos usos terapéuticos. La creencia popular dice que el nitrato de potasio es un afrodisíaco, pero en realidad no tiene esa clase de efectos en los humanos

. Finalmente, químicamente el nitrato de potasio es el agente oxidante y aunque se utiliza para producir pólvora mezclándolo con azufre y carbón, por sí mismo no es combustible ni inflamable.

1) Objetivos

Explorar diferentes regiones de la curva de solubilidad de KNO3(s). Evaluar el efecto de

diferentes variables como T y concentración en el proceso de crecimiento cristalino y en la forma del material cristalino obtenido.

2) Materiales

- Vasos de precipitados - Tubos de ensayo - Manta calefactora - buretas

- Varilla de vidrio, espátula, termómetro, parafilm

3) Procedimiento

1. Registrar la temperatura ambiente. En base a la curva de solubilidad que se muestra en la Fig. 3 y la tabla 3, preparar 5 mezclas de KNO3(s) y agua destilada en tubos de ensayos agitando

cuidadosamente. Observar y registrar los cambios (¿el sólido se disuelve, la solución se enturbia?). 2. Para los tubos que no se solubilizó todo el sólido, calentar a baño María cuidadosamente utilizando una varilla de vidrio sumergida en el tubo hasta disolución completa. Para el baño María utilizar un vaso de precipitados con agua previamente calentada. Una vez que se obtienen las soluciones homogéneas dejar enfriar a temperatura ambiente. La solución del tubo 4, dejar enfriar unos minutos y luego acelerar el enfriamiento utilizando baño de hielo. Interpretar los resultados (¿se observa sólido? ¿Qué aspecto tiene?)

4) Informe

Incluir las masas, volúmenes y temperaturas utilizadas y las observaciones experimentales. Interpretar los resultados utilizando la tabla 3 y la Fig. 3

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8 Figura 3 Tubo # Masa KNO3(s) (g) Masa H2O (g) C (g KNO3/100 g agua) Observación a TA luego de preparar la mezcla T de obtención de solución homogénea Método de enfriamiento Observación a TA luego de enfriar 1 0,5 3 mL 2 1,5 3 mL 3 2,5 3 mL 4 4 3 mL 5 5 3 mL Tabla 3 y = 6E-05x3 + 0.0086x2 + 0.8486x + 12.804 0 50 100 150 200 250 300 0 20 40 60 80 100 120 C (g K N O3 /100 g agu a) T (°C)

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PARTE 4. Microscopía óptica de polarización y montaje y manipulación de

material cristalino

El análisis de los monocristales que son utilizados para realizar estudios por difracción de rayos X de monocristal, se realiza con el microscopio o lupa de polarización. Estos instrumentos, además de la óptica microscópica, tienen un cristal polaroide, denominado polarizador, debajo de la platina que transmite luz polarizada N-S, y otro polaroide, denominado analizador, montado en el tubo situado encima de la platina, que transmite sólo la luz polarizada E-O (Fig. 4 y anexos). El material que se usa para los polarizadores son prismas de Nicol o prismas de Glan-Thompson (ambos de calcita), que dejan pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los dos polaroides estén paralelos o cruzados.

Figura 4

1) Objetivos

Identificar material cristalino en general y apto para realizar estudios de difracción de rayos X de monocristal (monocristales adecuados). Manipular material cristalino utilizando lupa y/o microscopio y herramientas típicas. Aprender las nociones básicas de montaje demonocristales para realizar determinaciones estructurales mediante difracción de rayos X de monocristal. Caracterizar material cristalino mediante microscopía de polarización.

2) Materiales

- Lupa y/o microscopio de polarización - Material cristalino provisto por los

docentes

- Porta objetos de vidrio

- Pinzas, espátulas, agujas, etc. - Vaselina, aceite de inmersión - Loops, pines, etc.

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10 3) A. Manipulación de manterial monocristalino y montaje de monocristales

1. Utilizando el material cristalino proporcionado por los docentes y las lupas y/o microscopios, identificar y seleccionar monocristales. Manipularlos, cortarlos si fuera necesario para obtener material cristalino apto para realizar determinación de DRX de monocristal. Utilizar las herramientas adecuadas, porta objetos y vaselina o aceite de inmersión.

2. Proceder al montaje de los monocristales seleccionados utizando la técnica de pegado del cristal a una fibra de vidrio. Para ello, previamente se procederá al armado de la fibra de vidrio sujeta sobre un pin metálico. Luego se procederá al pegado del monocristal.

B. Caracterizar las siguientes muestras cristalinas completando la tabla 4, que se indica a continuación Muestra Análisis KBr NaNP 1 Ácido Cinámico Sacarosa Film plástico KDP 2 Birefringente Dichroismo Activo ópticamente Tipo de extinción: Isotrópica, uniaxial, Biaxial Sistema cristalino Grupo espacial Muestra apta para DRX de monocristal

1: Nitroprusiato de Sódio Na2[Fe(CN)5(NO)]; 2: Fosfato diácido de potasio KH2PO4

4) Informe

Figure

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