RESOLUCIÓN OIV/OENO 343/2010

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Texto completo

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RESOLUCIÓN OIV/OENO 343/2010

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN DE ISÓTOPOS 13C/12C DEL GLICEROL EN LOS VINOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA O CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN EN FASE LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE RELACIÓN ISOTÓPICA (GC-C-IRMS O HPLC-IRMS)

LA ASAMBLEA GENERAL,

Visto el artículo 2 apartado 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la Organización Internacional de la Viña y el Vino,

Según propuesta de la Subcomisión « Métodos de análisis »,

DECIDE completar el anexo A del Compendio Internacional de los métodos de análisis con el método de tipo IV siguiente:

Título método Tipo de

Método para la determinación de la relación de isótopos 13C/12C

del glicerol en los vinos mediante cromatografía en fase gaseosa o cromatografía de alta resolución en fase líquida acoplada a espectrometría de masas de relación isotópica (GC-C-IRMS o

HPLC-IRMS)

IV

1. ÁMBITO DE APLICACIÓN

Los presentes métodos utilizan la cromatografía en fase gaseosa [1] o la cromatografía en fase líquida [2] acopladas a un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (GC-C-IRMS o HPLC-(GC-C-IRMS) para medir la relación de 13C/12C del glicerol. Cuando también sea necesario cuantificar simultáneamente el glicerol, se debe utilizar la GC-IRMS.

El uso de 1,5-pentanodiol como patrón interno, permite determinar la concentración de glicerol al mismo tiempo que la relación de 13C/12C.

2. DEFINICIONES

 13C/12C: relación isotópica de carbono-13 (13C) con carbono-12 (12C) para una muestra determinada.

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 δ13C: contenido de carbono 13 (13C) expresado en partes por 1000 (‰, por mil).  GC-C-IRMS: técnica de cromatografía gaseosa acoplada mediante una interfase de

combustión a espectrometría de masas de relación isotópica.

 HPLC-IRMS: técnica de cromatografía de alta resolución en fase líquida acoplada a espectrometría de masas de relación isotópica.

 V-PDB: Vienna-Pee-Dee-Belemnite. PDB es el material de referencia primario para medir las variaciones naturales del contenido isotópico de carbono-13, consistente en carbonato de calcio del fósil belemnite rostrum procedente de la formación cretácea Pee Dee en Carolina del Sur (USA). Su relación isotópica 13C/12C o RPDB es 0.0112372. Las reservas de PDB se han agotado desde hace mucho tiempo, pero sigue siendo la referencia primaria para expresar las variaciones naturales del contenido isotópico de carbono 13 y con la que se calibra el material de referencia disponible en la IAEA (Agencia Internacional de Energía Atómica) en Viena (Austria). Las indicaciones isotópicas de carbono 13 natural usualmente se expresan en relación con V-PDB.

3. FUNDAMENTO

Existe una diferencia significativa entre la cantidad de carbono-13 presente en los hidratos de carbono de plantas C3 y C4, cuyas rutas fotosintéticas son distintas. La mayoría de las plantas, como la vid y la remolacha, son de tipo C3, mientras que el maíz y la caña de azúcar son de tipo C4. Existe una correlación entre la cantidad de carbono 13 presente en los hidratos de carbono y la que aparece en los metabolitos correspondientes (etanol y glicerol), que resultan de la fermentación.

Midiendo la concentración de carbono 13 del glicerol, se podría detectar la adición de glicerol procedente de maíz (C4) o de origen sintético (fuentes fósiles) en vinos y bebidas espirituosas.

Para separar el glicerol del vino se utiliza un cromatógrafo de gases o de líquidos.

En el caso de la GC-C-IRMS, tras pasar por la columna de cromatografía, la muestra se somete a una etapa de combustión y reducción pasando por los hornos de oxidación y de reducción de la interfase de combustión. Para evitar daños en los hornos e interferencias en los cromatogramas, una válvula expulsa todos los componentes, excepto el glicerol, durante el proceso. El contenido de carbono-13 se determina en el gas de dióxido de carbono que resulta de la oxidación del glicerol contenido en la muestra. Una vez que se oxida el glicerol, se producen CO2 y H2O. El agua producida durante la combustión es eliminada a través de una trampa de agua, que consiste en una membrana Nafion®. El dióxido de carbono es transportado mediante un flujo de helio a la fuente IRMS para el análisis 13C/12C.

En el caso de la HPLC-IRMS, tras la separación cromatográfica, la muestra se oxida en la interfase antes de separarla de la fase móvil. El CO2 que se forma se separa de la fase móvil mediante una membrana de intercambio gaseoso y es arrastrado por un flujo de helio. El flujo de helio y CO2 atraviesa una membrana de Nafion® que retiene el agua y llega a la fuente de ionización del espectrómetro de masas de relaciones isotópicas a través de un dispositivo de división del flujo (open split).

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La combinaciones posibles de los isótopos 18O, 17O, 16O y 13C, 12C se reflejan en la masa 44 correspondientes al isotopómero 12C16O2, la masa 45 que corresponde a las especies 13C16O2 y 12C17O16O y la masa 46 al isotopómero 12C16O18O. Las combinaciones 13C17O16O y 12C17O

2 no se tienen en cuenta, pues aparecen en muy baja abundancia. Las corrientes iónicas correspondientes se miden en tres detectores distintos. La corriente iónica correspondiente a m/z = 45 se corrige para tener en cuenta el aporte de 12C17O16O, que se calcula en función de la intensidad de la corriente de m/z = 46, considerando las concentraciones relativas de 18O y 17O (corrección de Craig). El uso de un patrón interno cotejado con el patrón internacional V-PDB permite calcular la concentración de carbono 13 en la escala relativa δ13C ‰.

4. REACTIVOS

Se deben utilizar los siguientes reactivos y patrones: 4.1. Etanol (anhidro) (Núm. CAS 64-17-5).

4.2. Glicerol puro ≥ 99 % (Núm. CAS 56-81-5). 4.3. 1,5-pentanodiol (Núm. CAS 111-29-5).

4.4. Disolución de 1,5-pentanodiol (4.3) en etanol (4.1), a una concentración determinada (entre 0,5 y 1,0 g l-1). Se utiliza para disolver las muestras de vino.

4.5. Ácido ortofosfórico

4.6. Peroxodisulfato de sodio, que se utiliza como oxidante.

4.7. Helio (Núm. CAS 07440-59-7), que se utiliza como gas portador.

4.8. Oxígeno (Núm. CAS 07782-44-7), como gas regenerante para el reactor de combustión.

4.9. Bala de dióxido de carbono (CAS 00124-38-9), que se utiliza como patrón secundario para la medida de carbono-13.

4.10. Patrones de glicerol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con patrones internacionales de referencia.

4.11. Patrones de 1,5-pentanodiol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con patrones internacionales de referencia.

5. INSTRUMENTAL

5.1. Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas

Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (IRMS), capaz de analizar la relación de 13C en CO2 con una precisión interna de 0,05 ‰ como mínimo (véase el apartado número 8). Por precisión interna entendemos la diferencia entre dos medidas de una misma muestra de CO2. El espectrómetro de masas que se utiliza para medir relaciones isotópicas dispone de un detector triple, lo que permite medir simultáneamente las intensidades de los tres valores de m/z (44, 45 y 46). El espectrómetro consta también de un programa informático que controla el análisis, gestiona los datos y procesa los resultados para calcular las relaciones isotópicas.

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5.2. Cromatógrafo de gases

Cromatógrafo de gases (GC) acoplado, mediante un sistema de combustión, a un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (5.1).

El cromatógrafo de gases debe estar provisto de una columna capilar polar de cromatografía de gases para separar el glicerol del resto de sustancias del vino (ej. columna capilar de sílice fundida Chrompack WCOT con recubrimiento de polietilenglicol CP-Wax-57 CB, 25 m, 0,25 mm di, 0,20 μm de espesor).

El sistema de combustión consta generalmente de un reactor de oxidación (tubo de cerámica con hilos de níquel, platino y cobre) y un reactor de reducción (tubo de cerámica con hilos de cobre).

5.3. Cromatógrafo de líquidos

Cromatógrafo de líquidos (LC) conectado a un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (5.1) mediante una interfase LC Isolink.

El cromatógrafo de líquidos debe estar provisto de una columna para separar cromatográficamente el glicerol del resto de sustancias del vino sin utilizar disolventes orgánicos ni aditivos (ej. HyperREZ Carbohydrate H+, 30 cm, 8 mm).

La interfase Isolink consta de un reactor capilar en el que se produce la reacción de oxidación y de un intercambiador formado por 3 membranas.

5.4. Material

Material común de laboratorio y en particular:

- Jeringuillas para inyectar las muestras o inyector automático.

- Matraces aforados, filtros de 0,2 µm, viales de cromatografía y una jeringuilla de 10 µl. No obstante, se pueden utilizar otros instrumentos o materiales que tengan las mismas prestaciones.

6. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

6.1. Determinación de la relación de 13C/12C del glicerol mediante GC-C-IRMS

Para filtrar las muestras de vino se utilizan filtros de 0,2 μm. Después, se toma una alícuota y se diluye (1:4) con etanol. Se vierte cada muestra en un vial de cromatografía adecuado. Se tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C) hasta que se vayan a analizar.

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6.2. Relación de 13C/12C del glicerol y cuantificación mediante GC-C-IRMS

Para filtrar las muestras de vino se utilizan filtros de 0,2 μm. Después, se toma una alícuota y se diluye (1:4) con la solución de 1,5-pentanodiol (4.4). Se vierte cada muestra en un vial de cromatografía adecuado. Se tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C) hasta que se vayan a analizar.

6.3. Determinación de la relación de 13C/12C del glicerol mediante HPLC-IRMS

Para filtrar las muestras de vino se utilizan filtros de 0,2 μm. Después, se toma una alícuota y se diluye con agua. Se vierte cada muestra en un vial de cromatografía adecuado. Se tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C) hasta que se vayan a analizar.

7. PROCEDIMIENTO 7.1 GC-C-IRMS

La siguiente descripción se refiere a los métodos que se suelen utilizar para determinar la relación isotópica 13C/12C del glicerol con los sistemas automatizados de GC-C-IRMS disponibles en el mercado.

Los distintos procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios que introduzcan los fabricantes. Los volúmenes, la temperatura, los caudales y los tiempos indicados son orientativos y se deben ajustar los valores según las recomendaciones del fabricante. 7.1.1. Condiciones de trabajo

Si se utilizan la columna y el sistema de combustión descritos en el ejemplo (5.2), se pueden aplicar los parámetros siguientes:

A. La temperatura de inyección es de 270 °C.

B. El ciclo de temperatura comienza a 120 °C y se mantiene durante 2 minutos. Después aumenta progresivamente, a razón de 10 °C por minuto, hasta los 220 °C. Esta temperatura final se mantiene durante 2 minutos. Cada ciclo dura 14 minutos, si no se tiene en cuenta el tiempo de enfriamiento.

C. Se utiliza helio como gas portador.

D. La temperatura de los reactores de combustión y de reducción del sistema de combustión conectado al cromatógrafo de gases se ajusta a 960 °C y 640 °C respectivamente.

E. En cada inyección se introducen 0,3 μL de solución de la muestra en la columna en modo high-split (120 mL min-1).

Se debe someter el reactor de oxidación a un proceso de reoxidación con O2 con regularidad (una vez a la semana, por ejemplo); la frecuencia dependerá de la cantidad de sustancias que pasen por él.

7.1.2. Relación de 13C/12C del glicerol

Con cada análisis 13C/12C se introducen al menos dos pulsos de CO2 patrón (4.9) de la bala. Existe una cadena ininterrumpida de calibraciones entre este patrón, los patrones V-PDB y

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los patrones internacionales del IAEA. El CO2 patrón puede también calibrarse frente a patrones internos.

Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.1). Se deben incluir muestras de control adecuadas en cada serie.

Ejemplo de una serie típica: • Muestra de control • Muestra de control • Muestra 1 • Muestra 1 • Muestra 1 • Muestra 2

Cada muestra se analiza 3 veces • … • Muestra 6 • Muestra 6 • Muestra 6 • Muestra de control • Muestra de control

La muestra de control es una disolución de glicerol en etanol cuya concentración de carbono 13 (δ13C) se ha determinado con mucha precisión (por medio de un analizador elemental- IRMS, por ejemplo) y permite comprobar posibles desviaciones durante la serie de medidas por revisar y la corrección de los resultados.

7.1.3. Relación de 13C/12C del glicerol y cuantificación

Cuando además de medir la relación isotópica también sea necesario cuantificar el glicerol, se aplicará a las muestras, preparadas según se indica en el apartado 6.2, el procedimiento descrito en el apartado anterior (7.1.2).

El 1,5-pentanodiol (4.3) permite determinar la concentración de glicerol. Además, pueden utilizarse los valores de δ13C del patrón interno para corregir las inyecciones y controlar de calidad del análisis isotópico y de la etapa de combustión.

Para obtener la concentración de glicerol de las muestras de vino se utiliza el método del patrón interno. Se prepara una curva de calibrado usando una concentración constante y conocida de patrón interno (1,5-pentanodiol) y serie de 5 disoluciones de glicerol de concentraciones distintas conocidas, de 0,50 a 10 g l-1. Estas disoluciones se preparan en matraces aforados: se pesan el glicerol (4.2) y el 1,5-pentanodiol en una balanza y se disuelven en etanol (4.1). Se analizan sucesivamente y por triplicado cada una de las disoluciones de la serie, para asegurarse de que la respuesta es lineal.

7.2. HPLC-IRMS

La siguiente descripción se refiere a los métodos que se suelen utilizar para determinar la relación isotópica 13C/12C del glicerol con los sistemas automatizados de HPLC-IRMS disponibles en el mercado.

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Los distintos procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios que introduzcan los fabricantes. Los volúmenes, la temperatura, los caudales y los tiempos indicados son orientativos y se deben ajustar los valores según las recomendaciones del fabricante.

7.2.1. Condiciones analíticas

Si se utilizan la columna y el sistema descritos en el ejemplo (5.3), se pueden aplicar los parámetros siguientes:

A. Ajustar el caudal del eluyente a 400 μl min-1.

B. Ajustar el caudal del ácido y del oxidante en la interfase LC a 40 μl min-1y 30 μl min-1, respectivamente.

C. Ajustar la temperatura del reactor de la interfase a 99,9 °C y la de la columna a 65 °C. D. Ajustar el caudal de helio de la unidad de separación a 1 μl min-1.

Hay que desgasificar las botellas de reactivos con helio a lo largo de todo el proceso de separación cromatográfica.

7.2.2. Relación de 13C/12C del glicerol

Con cada análisis 13C/12C se introducen al menos dos pulsos de CO2 patrón (4.9) de la bala (véase ejemplo de cromatograma en 11.2). Existe una cadena ininterrumpida de calibraciones entre este patrón, los patrones V-PDB y los patrones internacionales del OIEA. El CO2 patrón puede también calibrarse con patrones internos.

Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.3). Se deben incluir muestras de control adecuadas en cada serie.

Ejemplo de una serie típica: • Muestra de control • Muestra de control • Muestra 1 • Muestra 1 • Muestra 1 • Muestra 2

Cada muestra se mide 3 veces • … • Muestra 6 • Muestra 6 • Muestra 6 • Muestra de control • Muestra de control

La muestra de control es una disolución de glicerol cuya concentración de carbono-13 (δ13C) se ha determinado previamente con mucha precisión (por ejemplo, mediante un analizador elemental-IRMS) y que permite comprobar posibles desviaciones a lo largo de la serie de medidas y, así, corregir los resultados.

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8. CÁLCULOS

8.1. Relación 13C/12C

La relación isotópica 13C/12C puede expresarse a partir de la desviación que presenta con respecto a un patrón interno. La desviación isotópica del carbono-13 (δ13C) se calcula en una escala delta por mil ( δ ‰), comparando los resultados obtenidos para la muestra analizada con los de un patrón interno previamente calibrado con el patrón primario internacional (V-PDB). Durante el análisis isotópico, se introduce CO2 patrón, existiendo una cadena de calibraciones entre este patrón y los patrones V-PDB.

Los valores de δ 13C se expresan en función del patrón interno como se explica a continuación:

 13C

muestra/ref ‰= (Rmuestra / Rref

- 1) × 1000

donde Rmuestra y Rref son respectivamente las relaciones isotópicas (13C/12C) de la muestra y del dióxido de carbono utilizado como patrón (4.9).

Los valores de δ 13C se expresan en función del patrón V-PDB como se explica a continuación:

δ 13C muestra/V-PDB ‰ = δ 13C muestra/ref + δ 13C ref/V-PDB + (δ 13C muestra/ref × δ 13C ref/V-PDB)/1000 dondeδ13Cref/V-PDB es la desviación isotópica del patrón interno con respecto del V-PDB determinada anteriormente.

Al efectuar las mediciones en serie pueden observarse ligeras variaciones debidas a cambios en las condiciones instrumentales. En ese caso, los valores de δ 13C de las muestras se deben corregir en función de la diferencia entre el valor de δ 13C medido en el patrón y su valor real, calibrado previamente con respecto al V-PDB mediante algún material de referencia internacional. Se puede considerar que la variación entre dos mediciones del patrón y, por consiguiente, la corrección que hay que aplicar a los resultados obtenidos de las muestras, son lineales. El patrón debe medirse al principio y al final de las series, de modo que pueda calcularse la corrección para cada muestra por interpolación lineal.

8.2. Concentración de glicerol mediante GC-IRMS

Al elaborar la curva de calibración, para cada inyección, el parámetro medido que es tenido en cuenta es el área S (en V*s) dado por el espectrómetro. Calcular la relación R tal como se muestra en la ecuación 1 que aparece a continuación y dibujar la gráfica de R frente a la concentración de glicerol respecto al patrón interno (IS) C glicmuestra. La gráfica ha de ser

lineal y el coeficiente de correlación, al menos 0,99.

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En las condiciones experimentales descritas (7.1.1), el tiempo de retención del glicerol es de 460 segundos (véase el ejemplo de cromatograma del apartado 11.1) y el del 1,5-pentanodiol, que es menos polar, es de unos 310 segundos.

La concentración del glicerol de cada inyección se calcula con la ecuación siguiente:

Ecuación 2

Cglic.

muestra=

K . C1,5PD

muestra .

mu estra mu estra PD glic

S

S

5 , 1 x Factor de dilución En la cual:

Cxmuestra es la concentración en g L-1 de la especie química en la muestra Sxmuestra es el área de los picos obtenidos

K es el factor de respuesta. Se calcula como sigue:

K

= t S S t t S S t glic PD PD glic

S

S

C

C

1,5 5 , 1

Ecuación 3 (véase 8.2)

El subíndice St se refiere a las concentraciones y áreas del 1,5-pentanodiol y del glicerol en la serie de cinco disoluciones patrón empleado en la calibración (7.1.3).

Factor de dilución: según las condiciones descritas de preparación de muestras (7), el factor de dilución es 4.

La concentración en g l-1 de cada muestra es la media de las tres inyecciones.

9. GARANTÍA Y CONTROL DE LA CALIDAD 9.1. GC-C-IRMS

Para cada muestra se deben medir tres viales consecutivamente y comprobar que la desviación típica (SD) es inferior a 0,6 ‰. El resultado final para una muestra dada es la media de las tres medidas. Si la desviación es superior a 0,6 ‰, se debe repetir la medida. Ecuación 1

R

=

IS

pico

Área

glicerol

pico

Área

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Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.

9.2. HPLC-IRMS

Comprobar el valor de 13C del patrón interno: si difiere en más del 0,5 ‰ del valor admisible, se debe verificar que el espectrómetro esté correctamente ajustado y, en caso necesario, reajustarlo.

Para cada muestra se deben medir tres viales consecutivamente y comprobar que la desviación típica (SD) sea inferior a 0,6 ‰. El resultado final para una muestra dada es la media de las tres medidas. Si la desviación es superior a 0,6 ‰, se debe repetir la medida.

Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.

10. CRITERIOS DE EFICACIA 10.1. GC-C-IRMS

10.1.1. Precisión

Se han llevado a cabo varios estudios preliminares con 4 disoluciones sintéticas de vino (agua-etanol-glicerol), con muestras de glicerol de distintos orígenes y cuyo valor δ 13C se ha determinado mediante EA-IRMS. Para la GC-C-IRMS se aceptó una desviación estándar ≤ 0,6 ‰ para las 3 repeticiones (n = 3).

En los vinos dulces la precisión puede verse afectada debido al solapamiento entre el 1,5-pentanodiol y otros componentes o subproductos del vino.

10.1.2. Determinación de la concentración de glicerol

Se han usado 2 disoluciones de glicerol para validar el método. Dado que la concentración de glicerol del vino seco está normalmente entre 4 y 10 g l-1, las concentraciones de las dos disoluciones están comprendidas en este intervalo. Para la primera disolución (4,0 g l-1) se obtuvo un valor experimental de 3,6 g l-1 (SD = 0,2, n = 8). Para la segunda disolución (8,0 g l-1) se obtuvo un valor experimental de 7,9 g l-1 (SD = 0,3, n = 8).

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Por otra parte, para comprobar el método, se analizaron 5 muestras de vino (A, B, C, D y E) cuya concentración de glicerol ya se había determinado por otros métodos ( BIPEA Proficiency Test). Las conc entr acio nes de glice rol obte nida s por G C-IRM S corresponden a los valores obtenidos utilizando otras técnicas analíticas, como la determinación enzimática o HPLC.

10.2. HPLC-IRMS

10.2.1. Validación interna del método HPLC-IRMS

Para la validación del método por HPLC-IRMS, se han utilizado las siguientes muestras: un patrón de glicerol, tres vinos sintéticos con diferentes concentraciones de glicerol dentro del rango típico encontrado en vinos y un vino.

La precisión de la medida de δ13C del glicerol se determinó mediante diez medidas de cada muestra, bajo condiciones de repetibilidad y en tres días diferentes, bajo condiciones de reproducibilidad (Tabla 2).

Tabla 1: Comparación de la concentración de 5 vinos analizados

Muestra A B C D E

Tipo blanco rosado blanco tinto blanco

Intervalo 6,2 – 8,4 4,8 – 6,6 5,7 – 7,7 6,3 – 8,5 4,6 – 6,2

Valor medio 7,3 5,4 6,7 7,4 5,4

GC-C-IRMS 6,4 5,4 6,7 7,8 5,4

* Los análisis del BIPEA se realizaron mediante HPLC, análisis enzimático o ambos. Las concentraciones están en g l-1. n > 3 y SD < 0,6.

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Tabla 2. Exactitud y precisión de valores δ13C de glicerol obtenidos mediante HPLC-IRMSa

aValores de δ13C expresados en vs V-PDB

bValor del glicerol (estándar) por EA-IRMS: -28.02 + 0.09 ‰

La precisión en la determinación del δ13C del glicerol se obtiene a partir de una muestra de vino:

- Repetibilidad r: 0,60 ‰ - Reproducibilidad R: 0,62 ‰

HPLC-IRMS

Día 1 Día 2 Día 3 Precisión

Muestra Repeticiones por muestra Media δ13C

(‰) SD (‰) Media δ13C (‰) SD (‰) Media δ13C (‰) SD (‰) (‰) r (‰) R Glicerol (estándar)b 10 -27.99 0.05 -27.94 0.04 -27.95 0.08 0.17 0.18 Vino sintético (6 g/l) 10 -28.06 0.13 -28.14 0.12 -28.14 0.11 0.34 0.35 Vino sintético (8 g/l) 10 -28.11 0.12 -28.18 0.07 -28.21 0.07 0.25 0.28 Vino sintético (10 g/l) 10 -28.06 0.06 -28.06 0.09 -28.05 0.09 0.23 0.24 Vino 10 -28.88 0.10 -28.85 0.27 -28.72 0.23 0.60 0.62

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11. ANEXOS 11.1. Ejemplo de cromatograma (GC-C-IRMS) de análisis del glicerol del vino

pulsos de CO2 patrón

1,5-pentanodiol

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11.2 Ejemplo típico de cromatograma de un análisis HPLC-IRMS de glicerol

pulsos de CO2

patrón

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Certificado conforme

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Calderone G., Naulet N., Guillou C., Reniero F., “Characterization of European wine glycerol: stable carbon isotope approach”. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, 5902-5906

2. Cabanero A.I., Recio J.L., Ruperez M. ¨Simultaneous stable carbon isotopic analysis of wine glycerol and ethanol by liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry¨. Journal of Agricultural and Food chemistry, 2010, 58, 722-728.

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