Análisis funcional del gen
nab
en el desarrollo de
Drosophila melanogaster
Memoria presentada por
Javier Terriente Félix
Para optar al grado de Doctor en Ciencias
por la Universidad Autónoma de Madrid
Diciembre de 2006
Director de Tesis:
Fernando Jiménez Diaz-Benjumea
Tutora de Tesis:
Ana Ruiz Gómez
Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”
(CSIC-UAM)
Facultad de Ciencias
“I should like to work like the archaeologist who pieces together the fragments of a lovely thing which are alone left to him. As he proceeds, fragment by fragment, he is guided by the conviction that these fragments are part of a larger whole which, however, he does not yet know.” Embryonic Development and Induction
Hans Spemann (1938) “The number of embryologist working on pattern formation has always been small and they have tended to be eccentric people.” The making of a fly
Peter Lawrence (1992)
Cuando emprendas tu viaje hacia Ítaca debes rogar que el viaje sea largo, lleno de peripecias, lleno de experiencias. No has de temer ni a los lestrigones ni a los cíclopes,
ni la cólera del airado Poseidón. Nunca tales monstruos hallarás en tu ruta si tu pensamiento es elevado, si una exquisita
emoción penetra en tu alma y en tu cuerpo. Debes rogar que el viaje sea largo, que sean muchos los días de verano; que te vean arribar con gozo, alegremente, a puertos que tú antes ignorabas. Que puedas detenerte en los mercados de Fenicia,
y comprar unas bellas mercancías. Acude a muchas ciudades del Egipto para aprender, y aprender de quienes saben. Conserva siempre en tu alma la idea de Ítaca: llegar allí, he aquí tu destino. Mas no hagas con prisas tu camino;
mejor será que dure muchos años, y que llegues, ya viejo, a la pequeña isla, rico de cuanto habrás ganado en el camino. No has de esperar que Ítaca te enriquezca: Ítaca te ha concedido ya un hermoso viaje. Sin ella, jamás habrías partido; mas no tiene otra cosa que ofrecerte. Y si la encuentras pobre, Ítaca no te ha engañado.
Y siendo ya tan viejo, con tanta experiencia, sin duda sabrás ya qué significan las Ítacas.”
Itaca Konstantínos Kavafis
Agradecimientos
A Fernando por haber sido mi maestro. Espero que su dedicación y valiosos consejos, no sólo profesionales, hayan servido para convertirme en un científico riguroso y en una persona con criterio independiente.
A Ana Ruiz por su apoyo en el desarrollo de este trabajo.
A David por aguantar con infinita paciencia todas mis preguntas por estúpidas que fueran, y, sobre todo, por saber responderlas. A Daniel porque sólo enseñando puedes saber cuánto conoces, y por su ayuda. A Marta Magariños, por ser tan maja y porque su experiencia nos ha sido de enorme utilidad.
A todos los moscólogos grandes y pequeños, por vuestra ayuda y consejos. Sin vosotros mi tesis hubiera sido aún más complicada de lo que ya ha sido. Un agradecimiento especial a Ginés Morata por su apoyo cuando más lo necesité. A Antonio Baonza y Joaquín Culí por demostrarme con su ejemplo que un moscólogo puede coger una pipeta y no perder la compostura. Y un recuerdo para los viejos roqueros Magali, Héctor, Paco, Anni, Marco, Pichón, Ainoha, David F. e Inma, y a mis nuevas conquistas los Maculinos, incluida la abeja reina. Por las risas y bailes que nos hemos echado… y que nos echaremos.
A Juan Pablo Couso, porque en su laboratorio tome la confianza que necesitaba para seguir adelante. A Thomas Scheemann, porque su ayuda fue clave para iniciar esta carrera. A Santiago Carrillo, porque su ayuda fue vital cuando llegue.
A Dioni por ayudarme siempre que se lo pido y siempre con una sonrisa. Al resto de gente del CBM que me ha aportado su experiencia científica y vital.
A los Redondeles por ser mis amigos cuando era un pobre emigrante con maleta de cartón.
A Jose, Irene, Aitor, JuanFra y Laura por ser mi sostén en las largas horas que se pasan aquí, hacerme reír y ayudarme en todo… y un poco más. Aún nos quedan muchos cartuchos que disparar…
A mis Amigos, que son viejos amigos, Paco, Béril, Búlen, Arturo, Carlos, Paula, Sara, Mercedes, Santi, Belen y Lola. Ya me sois imprescindibles. A Alonso, Luisote, Ingrid y Zandu, porque la distancia ha dejado indemne
Agradecimientos
nuestra amistad. A Manolo y Virtu, porque con las amistades pasa como con los vinos, si son buenos con los años son mejores.
A mi familia nueva, por vuestro cariño y porque no habéis dudado de que era un buen hombre para vuestra Eva.
A Jose Carlos y Fuencis porque os quiero, y porque me disteis cobijo cuando más lo necesité. A mis primos hermanos, y también a sus cónyuges, por ser más hermanos que primos. A la Tata porque ha empezado una vida nueva, y eso no es tan fácil
A mi hermanita chica Paloma por demostrar que la inocencia mueve los corazones. A Anita, por ser tan buena hermana, y sobre todo por ser mi amiga del alma. Os quiero enanas.
A mis padres, por su apoyo continuo, por su amor incondicional, por su generosidad y por haberme dado las herramientas necesarias para ser libre.
Esta tesis va dedicada especialmente a mi mujer, Eva. Sin ti ningún esfuerzo hubiera valido la pena. Has sido un soplo de aire fresco que cada día sigue sorprendiéndome. Con tu amor y confianza se que puedo. Te ailobiu mi niña.
No quiero dejar de recordar a mis abuelos, se que os hubierais sentido orgullosos de mi. Os echo de menos.
Índice SUMMARY 1 ABREVIATURAS Y GLOSARIO 3 INTRODUCCIÓN 5 1. Prefacio 6 2. La identidad celular 7 3. La regulación genética 8
4. Los elementos reguladores 10
5. La maquinaria de transcripción 11
6. Complejo Activador y Represor 12
7. La familia de proteínas Nab 16
MATERIALES Y MÉTODOS 21
1. Materiales y Métodos Genéticos e Histológicos 22
1A. Medios de cultivo 22
1B. Estirpes de Drosophila melanogaster: 22 1C. Generación de nuevos mutantes nab: 22
1D. Análisis clonal: 23
1E. Detección inmunohistoquímica 24
1F. Hibridación In situ de ARN 26
1G. Adquisición y tratamiento de imágenes 27
1H. Generación de líneas transgénicas 28
2. Materiales y Métodos Bioquímicos 29
2A. Materiales y métodos básicos de manipulación de ADN 29
2B. Vectores 30
2C. Construcción de Plásmidos 30
2D. Purificación de las proteínas GST-Nab, GST y 6Xhis-Nab 33
2E. Generación de anticuerpos contra Nab 35
2F. Interacción proteína-proteína 35
2G. Mapeo de Inserciones EP 36
2H. Mapeo molecular de deficiencias nabR# 37
RESULTADOS 38
1. Desarrollo proximidistal del ala de Drosophila melanogaster 41
Índice
4. nab se expresa en el ala hasta el límite distal del Anillo Interno de wg: 47
5. Caracterización de alelos de falta de función nab 49 6. Nab restringe la expresión de wg en el anillo interno 50
7. nab sólo afecta el elemento regulador del Anillo Interno de wg 51
8. nab depende de vg 53 9. Posible función de zfh2 en la especificación de nab 54
10. nab no regula la expresión de zfh2 55 11. nab interacciona genéticamente con rn 56 12. Interacción genética nab/rn en el disco imaginal de ala 58
13. Homología entre las proteínas Rn, Roe y Sqz 59
14. Relación entre nab y roe 60
15. Desarrollo del Sistema Nervioso Central 62
16. Funciones de sqz en el desarrollo del SNC 64
17. Patrón de expresión de nab en el SNC 67
18. Patrón de expresión de nab en el grupo Tv embrionario 68 19. Patrón de expresión de nab en el grupo Tv larvario 69 20. nab colabora con sqz en la especificación del número de neuronas del
grupo Tv 70
21. nab colabora con sqz en la activación de FMRFa en la neurona Tv 71 22. nab interacciona físicamente con Rn y Sqz a través del dominio C 72
23. sqz actúa en el desarrollo del ala como un posible represor de rn 74 24. dCtBP podría estar implicado en la función represora de Nab. 77
DISCUSIÓN 79
1. Nab funciona en el desarrollo mediante su interacción con Sqz y Rn 80 2. Papel de Nab en el desarrollo proximodistal del ala 80
3. El desarrollo proximodistal del ala 82
Índice
5. Otras funciones de Nab en el desarrollo de Drosophila 85 6. Mecanismo molecular de la interacción de Nab con Rn y Sqz 86
7. Consideraciones finales 87
CONCLUSIONES 89
BIBLIOGRAFÍA 91
Summary
Nab proteins form an evolutionarily conserved family of transcriptional co-regulators implicated in multiple developmental events in various organisms. They lack DNA binding domains and act by associating with other transcription factors, but their precise roles in development are not known. In this project we analyze the role of Nab in Drosophila development. By employing genetic and molecular approaches we found that nab is required for proximodistal patterning of the wing imaginal discs and also for determining specific neuronal fates in the embryonic Central Nervous System.
We identified two targets of Nab: the products of the zinc finger-encoding genes rotund and squeeze. Both gene products belong to the Kruppel family, as the vertebrate partners of Nab: the EGR transcription factors. Nab is co-expressed with squeeze in a subset of neurons in the embryonic ventral nerve cord and with rotund in a circular domain of the distal-most area of the wing disc. Our results indicate that Nab acts as a co-activator of Squeeze, so is required to limit the number of neurons that express the LIM-homeodomain gene apterous, and to specify the Tv neuronal fate through the activation of the FMRFa neuropeptide. Conversely, Nab act as a co-repressor of Rotund in wing development, and is required to limit the expression of the gene wingless/WNT in the wing hinge, where Wg plays a mitogenic role. We demonstrate the requirement of vg in the activation of nab in the wing disk, and the limitation of its expression by zfh2.
We show by pull-down assays that Nab binds directly to Rotund and Squeeze via their conserved C-terminal domain. Going further in the molecular mechanism underling the repression of the targets of Rn by Nab, we show preliminary results that involve the general corepressor dCtBP as a possible partner of Nab.
Abreviaturas y Glosario
ADN: ácido desoxiribonucleico ARN: ácido ribonucleico
ARNm: ácido ribonucleico mensajero pb: pares de bases
Kb: kilobases Tª : Temperatura nt : nucleótido aa/s: aminoácido/s
ER: elemento regulador (enhancer) ZF: dedos de zinc
SNC: sistema nervioso central CNV: cuerda nerviosa central AP: anteroposterior
DV: dorsoventral PrD: próximodistal AI: anillo interno AE: anillo externo MA: margen del ala
FTG: factores de transcripción generales HAT: histona acetil transferasa
Introducción 1. Prefacio
Gran parte de los genes implicados en el desarrollo de Drosophila melanogaster están conservados evolutivamente. Un ejemplo de ello lo encontramos en los apéndices de vertebrados. Su desarrollo requiere la acción de los ortólogos de algunos genes necesarios para la formación de extremidades en Drosophila (Mercader et al., 1999). Es decir, mediante el estudio de la genética del desarrollo de Drosophila aumenta la comprensión sobre el desarrollo de otros organismo (Bilen and Bonini, 2005; Briscoe et al., 2001; Gwack et al., 2006).
Del total de genes que forman el genoma de un organismo, sólo una porción mínima estarán encargados de su desarrollo, y serán miembros o moduladores de un número reducido de rutas de señalización. Este hecho resulta contradictorio, si tenemos en cuenta la enorme cantidad de sucesos que se precisan para la construcción de un organismo adulto desde el embrión. La explicación a esta paradoja la encontramos en que las rutas de señalización multiplican y diversifican sus funciones, a lo largo del desarrollo, ejerciendo distintas labores dependiendo de donde y cuando se activan… o se reprimen. Ello se lleva a cabo en gran medida mediante la presencia de genes moduladores (cofactores). El control temporal y espacial de la expresión génica es clave en el desarrollo de un organismo, pues, aunque todas las células que lo forman comparten los mismos genes, es su expresión selectiva lo que diferencia el destino de una célula o un tejido de otro. Como ejemplo de ello tenemos la regulación de la expresión de la ruta de wingless/Wnt a lo largo del desarrollo de Drosophila. Su regulación será determinante en el destino de las células que reciben su señalización. En los estadios larvarios, su activación en zonas distintas del disco imaginal de ala está controlada por diferentes elementos reguladores, que responden a combinaciones diversas de factores de transcripción. La ruta ejerce funciones distintas dependiendo de la zona donde se expresa. En la zona que da lugar a la articulación del ala tiene un papel mitogénico: su sobreexpresión provocará un aumento en la proliferación celular, y su falta de función provoca la delección del tejido (Neumann and Cohen, 1996a). Sin embargo, en el margen de ala, tiene un papel inverso al que presenta en la axila, pues controla la parada de
Introducción
proliferación en las células que reciben una alta cantidad de señal (Johnston and Edgar, 1998) (Fig. 1).
2. La identidad celular
La identidad de las células que forman parte de un tejido depende de manera directa de su apogenoma o conjunto de genes activos en una célula. Los patrones espaciales y temporales de expresión de los genes se encuentran regulados de forma precisa. El solapamiento o restricción espacial en la expresión de los distintos genes genera una combinatoria de expresión génica que define la identidad de las células (Fig. 2A).
Figura 2.- La identidad celular. A) La identidad de las células 1, 2 y 3 depende respectivamente, de su inclusión en el patrón de expresión A, B o A más B. B) Esquema de un embrión de Drosophila melanogaster. Izq. es anterior y arriba es dorsal. La flecha marca una célula con bajos niveles de bcd y altos de dl, y por tanto, con identidad posterior/ventral.
Figura 1.- Expresión de wingless en el disco imaginal de ala. Marcado con anticuerpo frente a la proteína (rojo). wg se expresa en el ala de Drosophila por la activación simultanea de tres elementos reguladores: Margen de ala, anillo interno y anillo externo.
Introducción
La identidad, por lo tanto, se asocia con la posición de la célula respecto a las coordenadas espaciales del tejido del que forma parte: anterior/posterior, dorsal/ventral y proximal/distal. Un ejemplo de cómo la acción combinatorial de patrones de expresión génicos da identidad a las células lo encontramos en la formación de ejes en el desarrollo del embrión de Drosophila. Desde la fecundación del oocito se establecen unos gradientes de concentración de proteínas que especifican los ejes anteroposterior (AP) y dorsoventral (DV) (Courey and Huang, 1995; St Johnston and Nusslein-Volhard, 1992). La acción combinatorial de estos gradientes generan un mapa bidimensional donde la posición de una célula en cada gradiente define su destino (Fig. 2B). Así, una célula con alta concentración de Dorsal (Dl) (Steward, 1987) y baja de Bicoid (Bcd) (Struhl et al., 1989) (flecha Fig. 2B) adquiere identidad ventral posterior. La alteración de estos gradientes produce en esa célula un cambio de destino.
3. La regulación genética
En los apartados anteriores hemos reflexionado sobre la relevancia de la regulación de la expresión génica en la adquisición del destino celular. Las señales combinadas que definen la actividad de un gen pueden ser activadoras o represoras y afectan al conjunto de procesos biológicos implicados en la síntesis de la proteína codificada por él. Por tanto, los niveles de expresión y la capacidad funcional de una proteína, así como su patrón de expresión, pueden ser controlados en distintas fases (Fig. 3).
La transcripción del gen es el nivel básico de regulación de la expresión (1, Fig. 3). En este nivel el control de la expresión depende de la acción de factores de transcripción mediante su unión a secuencias específicas de nucleótidos presentes en el ADN, los elementos reguladores (enhancers), y del reclutamiento de complejos proteicos que les permita llevar a cabo su función activadora o represora. Un ejemplo de la amplia diversidad reguladora que hay en este nivel es la ruta de wg. El elemento final de esta ruta es el factor de transcripción codificado por el gen pangolin/dTCF (pan/dTCF) (Brunner et al., 1997; van de Wetering et al., 1997). Este puede actuar como activador o
Introducción
como represor dependiendo de que la ruta este o no activada (Cavallo et al., 1998).
La regulación génica también actúa sobre la traducción de la proteína (2, Fig. 3). Un ejemplo de ello es la expresión del gen hunchback (hb). Su ARN mensajero se encuentra presente de forma ubicua en estadios tempranos del desarrollo del embrión, pero su traducción está controlada por el gradiente de concentración de la proteína Bcd (Houchmandzadeh et al., 2002).
Otro aspecto es el procesamiento intracelular (3, Fig. 3), una serie de modificaciones postraduccionales necesarias para la síntesis de una proteína activa. Una muestra de ello es la adición de azucares a los ligandos del receptor codificado por el gen Notch (N). Estas modificaciones por adición de azucares se llevan a cabo en el aparato de Golgi y son necesarias para que los ligandos puedan reconocer al receptor (Fortini, 2001).
La capacidad de las proteínas que se secretan para difundir en el medio extracelular es otro aspecto importante dentro de la regulación de la actividad génica (4, Fig. 3). Este aspecto es muy crítico en aquellas proteínas que actúan como ligandos de rutas de señalización. Un ejemplo de ello es el efecto de las proteínas Division abnormally delayed (Dally) y Dally-like (Dlp) en la estabilidad y difusibilidad en el espacio extracelular de los ligandos Wg, Decapentaplegic (Dpp) y Hedgehog (Hh) (Lum et al., 2003; Takei et al., 2004).
Figura 3.- Fases en la regulación genética. 1)
Transcripción de ARNm.
2) Traducción, en el ribosoma (R), del ARNm
en proteína (P). 3) Procesamiento de la proteína en el Golgi y Retículo Endoplasmático (G/ER) 4) Interacción con proteínas de membrana y de la matriz extracelular, si la proteína es difusible.
Introducción 4. Los elementos reguladores
Cada gen se estructura en una región reguladora y otra codificante. A su vez, la región reguladora se compone de (a) promotor, que está 3’ del inicio de transcripción del ARN mensajero, y (b) elementos reguladores, que se pueden encontrar dispersos a distintas distancias de él, pudiendo estar 3’, 5’, o incluidos en los intrones de la región codificante (Fig. 4A).
Los elementos reguladores de la transcripción son estructuras modulares. A estos módulos se unen distintas combinaciones de factores de transcripción, lo que permite que un gen se active en un tipo celular, y en una etapa del desarrollo, en función del contexto proteico unido a su región reguladora. Esto ocurre con dpp, su activación en el embrión o en los discos imaginales responde a distintas combinaciones de proteínas. Además, los elementos reguladores responsables de una u otra activación se encuentran situados en distintas regiones del gen (Padgett et al., 1987), pudiendo aislarse el elemento regulador responsable de su expresión en discos imaginales del elemento regulador responsable de su activación en el embrión (Staehling-Hampton et al., 1994) (Fig. 4B). También es posible que la expresión de un gen en distintos tejidos dependa de un único contexto proteico, así, si volvemos a la activación de dpp, nos encontramos que responde a la ruta de Hh en todos los discos imaginales (Basler and Struhl, 1994). Por el contrario, wg sólo se activa por esa ruta en la pata y de manera temprana en ala y halterio, donde su expresión se hará más compleja en estadios más avanzados del desarrollo al estar mediada por otros elementos reguladores independientes de la acción de Hh (Fig. 4B).
En ocasiones patrones de expresión aparentemente compactos están generados por la activación de diferentes elementos reguladores en dominios colindantes. Una muestra de ello es la activación de vestigial (vg) en el ala. Este gen se activa en el margen del ala por un elemento regulador temprano que responde a la ruta de Notch, el boundary enhancer, y por la acción de un elemento regulador tardío, el quadrant enhancer, que es activado en el resto del ala por la acción combinada de las rutas de Dpp y Wg (Kim et al., 1996). Ambos patrones dan un patrón de expresión espacialmente continuo. Otro ejemplo es el patrón de expresión del gen acheate-scute (ac-sc) en el notum.
Introducción
Este se activa por la acción combinada de elementos reguladores discretos a los que se unen distintos factores de transcripción. La localización de los elemento sensoriales en el notum adulto dependerá de la combinatoria de factores de transcripción que determinan la posición de cada uno de los grupos proneurales en el disco (Fig. 4C) (Gomez-Skarmeta et al., 1995).
5. La maquinaria de transcripción
La transcripción es la biosíntesis de ARN mensajero (ARNm) a partir del ADN de la célula. El ARNm servirá como molde para construir la proteína mediante el mecanismo de traducción. La transcripción de todo gen comparte una maquinaria proteica basal: el complejo formado por la ARN Polimerasa II (ARN polII) y los Factores de Transcripción Generales (FTG), un ejemplo de estos
Figura 4.- El Gen y sus Elementos Reguladores (ER). A) Estructura de gen, dividida en Región Reguladora (Promotor y ER) y Región Codificante (Exón e Intrón). B) Patrón de expresión de wg y dpp en los discos imaginales de ala, halterio y pata de Drosophila. dpp siempre se expresa en el borde AP por acción de la ruta de Hh, mientras que la activación de wg, solo se activa por la misma ruta en pata, y es más compleja en el resto de los tejidos. C) Organización del locus achaete-scute, y expresión de achaete y scute en el disco de ala, acompañado de su correspondencia con el patrón de macroquetas. Adaptado de Gómez-Skarmeta et al. (1995).
Introducción
FTG forman complejos intercambiables que sirven consecutivamente a la ARN polII en las distintas fases necesarias para la construcción de ARNm. El Complejo Iniciador es necesario para su acoplamiento al promotor, el Complejo de Elongación permite su movimiento sobre la hebra de ADN que codifica el ARNm y el Complejo Terminador para arrancarla del ADN. Pero para que se inicie la transcripción la maquinaria debe ser atraída hacia el promotor. La decisión sobre si se une o no es clave en la regulación génica, pues serán las proteínas encargadas de atraerla o que impidan su unión, respectivamente Complejo Activador y Complejo Represor, las responsables de que gen y en que momento del desarrollo se transcribirá. Estas proteínas se unirán de manera específica a los elementos reguladores de la transcripción, generando un contexto proteico específico para cada momento y tejido. El resultado de todo ello es que cada gen tiene un patrón de expresión específico y singular, que es regulado de forma precisa a lo largo del desarrollo.
6. Complejo Activador y Represor
El material genético de las células eucariotas se estructura en un complejo nucleoproteico llamado cromatina compuesto por la combinación de ADN e histonas. Para que se una la ARN polII y comience la transcripción se requiere un paso previo de descondensación de la cromatina, es decir, la separación física entre ADN e Histonas. La descondensación de la cromatina necesita la acetilación de las Histonas que se da mediante proteínas con actividad Histona Acetil Transferasa (HAT). Por el contrario la condensación requiere de proteínas con actividad Histona Desacetilasa (HDAC), por tanto, el estudio de la regulación de la transcripción une dos campos que antes eran dominios exclusivos: 1) La estructura de la cromatina y 2) Los factores de transcripción con sitios de unión específicos a ADN.
Se ha comprobado que, tanto la activación como la represión de un gen, comparten un mecanismo común y conservado evolutivamente: Un factor de transcripción se une a una secuencia específica de ADN, con él interacciona una proteína sin dominios de unión a ADN, coactivador o correpresor, que sirve de puente o forma parte de un complejo de remodelación de la
Introducción
cromatina (acetilasas o desacetilasas). Todas estas proteínas forman los
complejos activadores y represores. Si el factor de transcripción que se une a ADN es un activador el resultado final será el desenrollamiento de la cromatina y la unión del complejo activador a la maquinaria de transcripción, que así podrá ser atraída al promotor del gen y comenzar su actividad. Si el factor de transcripción es un represor se reclutarán complejos proteicos que condensarán la cromatina, impidiendo la unión de la maquinaria de transcripción. No obstante existen varias excepciones a esta regla, como discutiremos más adelante. Se ha postulado la existencia de dos tipos de represión. Una represión de “amplio rango” o silenciamiento que incluye el reclutamiento de complejos remodeladores de la cromatina que afectan a la activación de varios elementos reguladores, incluso a todo un locus. También una represión de “corto rango” o amortiguamiento (Quenching), que ocurre cuando un represor bloquea la unión de un activador a un elemento regulador cercano al promotor, permitiendo la independencia de elementos reguladores más alejados. Este tipo de represión es más flexible que el otro y sólo afecta al grado de expresión de una proteína (Courey and Jia, 2001; Gray and Levine, 1996).
Dentro de los factores de transcripción que se unen directamente a los elementos reguladores, existen varias clases funcionales. Encontramos ejemplos de activadores como Mothers against Dpp (Mad) (Sekelsky et al., 1995), y represores como Brinker (Brk) (Campbell and Tomlinson, 1999; Jazwinska et al., 1999; Minami et al., 1999). Pero, también hay factores de transcripción que pueden comportarse como activadores o como represores, en función del contexto proteico, así actúan pan, del que ya hablamos en el apartado 3, o Ventral nervous system defective (Vnd), que actúa como un activador junto a Dichaete (D) (Yu et al., 2005) o como un represor junto a Groucho (Gro) (Weiss et al., 1998).
Pese a que hay algunas evidencias de activadores, que se unen directamente a la maquinaria de transcripción (Lagrange et al., 1996; Zhou et al., 1998), en la mayoría de los casos, la activación de un gen está mediada por su interacción con complejos proteicos coactivadores con actividad HAT. Un ejemplo de este tipo de coactivador es CBP (CREB Binding Protein),
Introducción
perteneciente a la familia CBP/p300 (Arany et al., 1994), una proteína con actividad HAT, y con capacidad adicional de unirse directamente a la maquinaria de transcripción (Agalioti et al., 2000; von Mikecz et al., 2000), aunque también forma complejos con más proteínas HAT como p/CAF (p300/CBP Associated Factor) (Scolnick et al., 1997), u otras que no son HAT, como ARC (Activator Recruited Factor), que sirven de vínculo con la maquinaria de transcripción (Naar et al., 1998). ARC tiene homología con proteínas del complejo Mediador de levaduras. La interacción con todas ellas permite que CBP pueda mediar la acción de un activador, aunque éste se una a una secuencia específica, situada a varias Kb del promotor. Hay múltiples estudios que conceden a CBP un papel central en el desarrollo de Drosophila, ejemplos de ello son su papel mediador en la activación de twist (twi) por Dl (Akimaru et al., 1997) o su función en el desarrollo del ojo (Kumar et al., 2004).
Los correpresores más estudiados en Drosophila melanogaster, merced a sus fenotipos pleiotrópicos que se corresponden con el gran número de represores con los que interactúan, son dos proteínas que pertenecen a familias conservadas evolutivamente: (a) Groucho, que interacciona con Hairy (H) (Paroush et al., 1994), Pan (Cavallo et al., 1998) o Brk (Zhang et al., 2001) en otras, y (b) dCtBP (drosophila C-terminal Binding Protein) (Nibu et al., 1998; Poortinga et al., 1998), que actúa como correpresor de Brk (Hasson et al., 2001), Tramtrack69 (Ttk69) o Zfh-1 (Postigo and Dean, 2000), entre otros. Gro y dCTBP reprimen la transcripción mediante su relación con complejos HDACs, así ocurre con la interacción entre Gro y Rpd3 (Chen et al., 1999), o la existente entre el homólogo de ratón de dCtBP y las proteínas HDAC-2 y HDAC-3 (Subramanian and Chinnadurai, 2003). Aunque ambas proteínas también reprimen la transcripción con independencia de los complejos HDACs, bien reclutando a proteínas del complejo Polycomb, como hace CtBP (Srinivasan and Atchison, 2004), o interaccionando directamente con histonas como hace Gro (Flores-Saaib and Courey, 2000; Palaparti et al., 1997). En cualquier caso y pese a la importancia en el desarrollo de ambos correpresores existen varios ejemplos donde sus proteínas diana mantienen una cierta acción represora independiente de ellos (Kobayashi et al., 2001;
Introducción
Nagel et al., 2005; Nibu et al., 2003). En la Figura 5 se muestra un esquema general de la transcripción en organismos eucariotas, donde tienen cabida todas las proteínas y complejos proteicos que hemos introducido.
Aunque a lo largo de este capítulo hemos descrito muchas de los comportamientos generales y de los elementos implicados en la activación y en la represión transcripcional, de manera simultanea hemos planteado una serie de excepciones a la regla como la posible doble función como activador o represor en función del contexto proteico de algunos factores de transcripción con sitios de unión específicos a ADN, la independencia de algunos activadores respecto a los complejos de proteínas con actividad HAT y la independencia de correpresores respecto a las HDACs o de represores
Fig 5.- La Transcripción en organismos eucariotas. Los activadores se unen a la cromatina a través de secuencias de ADN específicas, los ER, e interactúan con complejos coactivadores (HAT), para descondensar el ADN y ensamblar la maquinaria de transcripción (RNA polimerasa II y Factores de transcripción Generales). Los genes silenciados se localizan en zonas condensadas, donde se impide la unión de la Maquinaria de transcripción al promotor. Alternativamente, las proteínas represoras inhiben la iniciación de la transcripción interaccionando con la Maquinaria, o con complejos multiproteicos que condensan la cromatina (HDAC). Adaptado de (Lodish et al., 2003)
Introducción
respecto a los correpresores con los que normalmente funcionan. Estos comportamientos, alejados de la norma, muestran una variabilidad enorme lo que nos lleva a concluir que los estados de represión o de activación de la expresión génica no son nunca estados absolutos.
7. La familia de proteínas Nab
En este trabajo hemos estudiado la función del gen nab en el desarrollo de Drosophila melanogaster. El gen nab fue originalmente identificado en ratón y su nombre proviene por su capacidad de unión al factor de transcripción NGF1-A (NGF1-A Binding Protein) (Russo et al., 1995), también conocido como Krox-24/EGR1, integrante de la familia de proteínas EGR (Early Growth Factor). La familia EGR la forman factores de transcripción del tipo dedos de zinc de la familia Krüppel. Estos dominios se unen a ADN mediante el reconocimiento de secuencias específicas. Se ha mostrado que los factores EGR están implicados en una variedad de procesos que incluyen proliferación celular (Abdulkadir et al., 2001), apoptosis (Krones-Herzig et al., 2003) y diferenciación celular (Levi et al., 1996). En ratones mutantes para alguno de estos genes se observan defectos en el desarrollo del sistema nervioso y reproductivo, con fenotipos tales como infertilidad femenina (Lee et al., 1996; Topilko et al., 1998), mielinización anormal del sistema nervioso periférico (Topilko et al., 1994) y defectos en la segmentación del cerebro posterior (Schneider-Maunoury et al., 1997; Schneider-Maunoury et al., 1993; Swiatek and Gridley, 1993). Además, el análisis de ratones mutantes en varios genes EGR sugiere que su función es crítica para el desarrollo general del sistema nervioso central (SNC). La búsqueda de nab surgió al percibirse que existía una región de 35 aminoácidos que se denominó R1, situada 5´ del dominio ZF de EGR1. Mutaciones en esta región producían una sobreexpresión de los genes diana. Se postuló que R1 podría ser un dominio necesario para la unión de un represor (Gashler et al., 1993). Usando esta región como cebo se realizó un ensayo de “doble híbrido” mediante el que se identificó el gen nab (Russo et al., 1995). Las proteínas Nab también interaccionan con el otro miembro de la familia EGR que comparte el dominio R1, Krox-20/EGR2, pero no con EGR3 ni con EGR4, que carecen de este dominio (Russo et al., 1995).
Introducción
En vertebrados existen dos genes nab: nab1 y nab2 (Svaren et al., 1996). Sólo existe un gen nab en Caenorhabditis elegans (Svaren et al., 1996) y en Drosophila melanogaster (Clements et al., 2003). Las proteinas Nab de invertebrados sólo comparten una alta homología de secuencia en los dominios con actividad conocida de sus ortólogos de vertebrados: NCD1 (78% de homología), que es el dominio a través del cual se une a sus proteínas diana y que también permite su multimerización (Svaren et al., 1998), y NCD2 (59%), que es un dominio necesario para su función como correpresora (Swirnoff et al., 1998) o como coactivadora (Sevetson et al., 2000) (Fig. 6). En Nab1 y Nab2 no se han identificado dominios de unión a ADN, por lo que se piensa que ejercen su función mediante su interacción con las proteínas EGR, aunque en ratones doble mutantes para nab1 y nab2 se han descrito fenotipos de hiperplasia epidérmica que no se muestran en mutantes EGR. Este hecho sugiere que las proteínas Nab deben tener otras diana distintas a EGR (Le et al., 2005).
Los resultados obtenidos en el análisis genético y molecular de las
Figura 6.-Comparativa entre las secuencias de aminoácidos entre los dominios NCD1 y NCD2 de las distintas proteínas Nab presentes en el reino animal. Los dominios NCD1 y NCD2, de la proteína Nab de Drosophila melanogaster, comparten un 78% y un 59% respectivo de homología con sus ortólogos (Clements et al., 2003).
Introducción
como en organismos completos (Mechta-Grigoriou et al., 2000), muestran que actúan como represoras de la actividad EGR. Se ha visto que la represión que ejercen se ve apoyada por su capacidad para unirse al subdominio CHD4 de la proteína NuRD, que es un correpresor transcripcional con actividad HDAC (Srinivasan et al., 2006). Más recientemente se ha encontrado que también pueden actuar como coactivadoras en procesos en los que está implicada la familia EGR. Ejemplos de ello son la coactivación de genes diana de EGR, como la hormona luteinizante beta (LHbeta) (Sevetson et al., 2000), o de
genes implicados en mielinización (Le et al., 2005).
En Drosophila melanogaster existe un único estudio previo donde se
identificó al ortólogo de la familia Nab de vertebrados y se mostró su patrón de expresión en el SNC embrionario y en los discos imaginales, pero no consiguieron identificar ninguna función (Clements et al., 2003). En el genoma de Drosophila sólo existe un miembro de la familia EGR codificado por el gen
Klumpfuss (klu) (Klein and Campos-Ortega, 1997; Yang et al., 1997). Su
putativo dominio R1 está conservado sólo parcialmente y además su patrón de expresión no es coincidente con el de nab. Resultados de ensayos de doble híbrido han mostrado que Klu no interacciona físicamente con Nab (Clements et al., 2003). Tampoco hay otras proteínas que, sin ser de la familia EGR, contengan un dominio similar a R1. Por tanto, para analizar las posibles funciones de nab en Drosophila será necesario conocer en detalle los contextos biológicos en los que Nab tiene una función, el desarrollo próximodistal del ala y el desarrollo del SNC, así como identificar las posibles proteínas a las que puede unirse para ejercer su función.
Objetivos
El objetivo de este trabajo es la búsqueda, identificaciónn, aislamiento y caracterización de nuevos genes implicados en el desarrollo proximodistal del ala de Drosophila. Los pasos que se han realizado son:
1. Mutagénesis para la identificación de nuevos genes. El método utilizado ha sido la expresión ectópica de nuevas inserciones EP portadoras de secuencias UAS y que cuando se combinan con una línea GAL4 activan la transcripción del gen adyacente. Se seleccionaron aquellas líneas que mostraban fenotipos que alteración del patrón proximodistal del ala.
2. Generar las herramientas necesarias para llevar a cabo el proyecto desde un punto de vista genético y molecular: identificación del gen afectado por la inserción, generación de alelos de perdida de función, carcaterización molecular del gen y de los alelos mutantes obtenidos, experimentos de expresión ectópica, purificaciónn de la proteína para estudios in vitro y generación de anticuerpos.
3. Análisis del patrón de expresión durante el desarrollo mediante hibridación in situ de RNA o mediante inmunomarcaje.
4. Análisis fenotípico de la falta de función mediante clones de recombinación mitótica y de la expresión ectópica mediante clones inducidos por el sistema UAS/GAL4. Este análisis se hará con el estudio de los fenotipos adultos y con el estudio del patrón de expresión de otros genes.
5. Análisis de las interacciones moleculares entre este gen con otros genes involucrados en los mismos procesos.
Materiales y Métodos
1. Materiales y Métodos Genéticos e Histológicos
1A. Medios de cultivo
Todos los cruces se han llevado a cabo en medios de cultivo estándar de Drosophila en un incubador a 25ºC y 75% de humedad relativa del aire.
1B. Estirpes de Drosophila melanogaster:
Para el desarrollo de este trabajo se han usado las siguientes estirpes de moscas ya existentes: y w1118; CyO, EP#720/dpp[d12] (Rorth et al., 1998); wg[spd-fg] (Couso et al., 1994); spd-LacZ (Neumann and Cohen, 1996a); rn[20] (Agnel et al., 1989); rn-LacZ, rnGAL4 y UAS-rn (St Pierre et al., 2002); nub[1] (Ng et al., 1995); nubGAL4[AC62] y DllGal4[MD23] (Calleja et al., 1996); vg[83b27R] (Williams et al., 1993); UAS-vg (Kim et al., 1996); yw ; UAS Zfh2-RNAi/S-T/UAS Zfh2-RNAi (amablemente cedido por la Dra. M. Suzanne) ; dppGAL4 (Staehling-Hampton et al., 1994) ; eyeless Gal4 (Bonini et al., 1997) ; mas[xs76] (Murugasu-Oei et al., 1996) ; nab[l(3)SH143LacZ] (Oh et al., 2003),
nab[NP3537GAL4] y NabGal4[NP1316] (Gal4 Enhancer Trap Insertion
Database) ; sqz[lacZ02102], sqzGal4 y UASsqz[#7.2] (Allan et al., 2005) ; FRT82 dCtBP[87De-10] / TM6, Tb (Hilliker et al., 1980) ; Canton-S, y w[1118],
w[1118] ; Δ2-3, Sb/TM2, UASGFP, y w[1118]hsFLP[122] ; UbiGFP FRT80/TM2
(Bloomington Drosophila Stock Center) ; y w hs-FLP122 ; Act>y+>GAL4UAS-GFP / SM6-TM6b (Ito et al., 1997). Yw FLP[122] ; FRT82 M(3R)w ArmLacZ / Tm6, Tb
Además se han generado las líneas: UAS-nab, nab[EP#13], nab[R52] y UAS-RnΔ894.
1C. Generación de nuevos mutantes nab:
Para conseguir delecciones en la región codificante de nab hicimos saltar con ayuda de una trasposasa la línea EP#13, que contiene un elemento EP insertado a 86 pb del inicio de la transcripción de nab. No todos los saltos, que se reconocen por una reversión hacia w, generan deficiencias asociadas, pero habrá una porción de ellos en los que el elemento P no se escinde de manera limpia y arrastra consigo una porción de genoma generando una
Materiales y Métodos
delección. Normalmente las delecciones son unidireccionales, es decir, se generan hacia un lado o hacia el otro de la inserción, pero no en ambos. Para identificar la existencia de delección y también su orientación respecto a la inserción, es decir, saber si es un nuevo alelo de nab o si lo es de mas, lo cruzamos con alelos ya existentes de ambos genes. De esta forma se seleccionaron 3 nuevos alelos de nab (nab[R]) (Fig. 7)
1D. Análisis clonal:
1D.1. Clones de Expresión Ectópica:
Para inducir clones de expresión ectópica se utilizó el método FLP-out (Struhl and Basler, 1993). Se cruzaron hembras con el genotipo y w hs-FLP122; Act>y+>GAL4UAS-GFP / SM6-TM6b, con machos de genotipo correspondiente a cada uno de los análisis realizados: UAS-vg, UAS-rn, UAS-nab. En larvas de entre 24h y 48h de desarrollo se induce la recombinación mitótica mediante choque térmico en baño de agua a 34,5 ºC durante 12 minutos.
Figura 7. Esquema de cruces para la consecución de nuevos alelos mutantes para el gen nab.
Materiales y Métodos 1D.2. Clones de falta de función:
Los análisis clonales de falta de función se llevaron a cabo mediante el método FLP/FRT (Xu and Rubin, 1993). En larvas entre 24h y 48h se induce la recombinación mitótica mediante choque térmico en baño de agua a 37ºC durante 60 minutos. Los genotipos analizados fueron:
- y w hs-FLP122 ; rn ∆2-2 FRT[80] / Ubi-GFP FRT[80] para los clones rn-. - y w hs-FLP122 ; nub 1 FRT[40A] / Ubi-GFP FRT[40A] para los clones nub-. Los clones homocigóticos mutantes pueden distinguirse en el adulto por la homocigosis para el marcador cuticular f36a (forked) que altera la morfología de los tricomas y las quetas. En todos los casos los clones en disco imaginal pueden distinguirse por la falta de expresión de GFP (Green Fluorescent Protein), que se activa de forma ubicua bajo el control de secuencias reguladoras de gen ubiquitin (transgen Ubi-GFP) (Davis et al., 1995)
1E. Detección inmunohistoquímica
Esta técnica es utilizada para detectar la proteína codificada en un gen mediante anticuerpos específicos (anticuerpos primarios), que a su vez, serán detectados con la ayuda de anticuerpos que reconocen su cadena pesada (anticuerpos secundarios). Los anticuerpos secundarios están acoplados a fluoróforos, si la detección se hace mediante microscopía confocal, o a Biotina, si la detección se hace mediante una reacción química visible. Los anticuerpos usados en esta tesis han sido:
• Anticuerpos Primarios: ratón anti-Nub; conejo anti-Nab; conejo anti-Vg (Williams et al., 1991); ratón anti-Wg (Brook and Cohen, 1996); conejo Galactosidasa (Cappel); ratón β-Galactosidasa y pollo β-β-Galactosidasa (Promega); ratón anti-Dl (Hibridoma bank). Oveja- Anti-Digoxigenina (Roche)
• Anticuerpos Secundarios: Biotina-anti-ratón, Biotina-anticonejo y Biotina anti-pollo (Vector); Fluoresceína-anti-ratón y Cy5-anti-ratón (Jackson Inmunoresearch); Alexa 488-anti-Cy5-anti-ratón, Alexa 594-Anti-ratón, Alexa 488-anti-conejo, Alexa 594-anti-conejo, Alexa 594-anti-rata, (Molecular Probes).
Materiales y Métodos
La existencia del corion y la membrana perivitelina en embriones hace obligatorio un tratamiento previo (Decorionización y Desvitalinización), para obtener una adecuada fijación e hibridación con el/los anticuerpos primario/s. A su vez, para obtener un correcto marcaje con anticuerpos en discos imaginales, se requiere de la rotura de la larva y exposición al medio de los discos (Disección). Una vez finalizado uno u otro tratamiento, el protocolo para la detección inmunohistoquímica es idéntico en embriones y en discos imaginales larvarios:
Sólo en embriones:
- Recogida: Se recogen los embriones de las placas de puesta con un pincel.
- Decorionización: Con lejía comercial 40 s. Se lavan los restos de lejía abundantemente, primero con agua y después con agua + 1 % Tritón.
- Fijación: Se transfieren los embriones a un vial de “centelleo” con 2 ml de Solución de Fijado (180 mM Hepes, 4 mM MgSO4, 2 mM EGTA, pH 9), 1,4 ml de Formaldehído al 10 % y 5 ml de Heptano. Agitar vigorosamente durante 20 min.
- Desvitelinización: Remover la fase acuosa (abajo). Añadir 10 ml Metanol. Agitar vigorosamente. Quitar la fase de Heptano (arriba). Añadir Metanol y agitar. Los embriones desvitelinizados deberían estar en el fondo. Recoger y llevar a un tubo eppendorf de 1,5 ml. - Lavado: 3 X 5 min, Metanol.
Sólo en larvas:
- Disección: Las larvas se disecan en PBT (PBS +0’3 % Tween 20) un máximo de 30 min en hielo.
- Fijación: Durante 20 min en formaldehído al 4 % en PBT. A Tª ambiente.
Común a ambos:
- Lavado: 3 x 10 min con BBT 250 (PBT + 0,2 % BSA + 250 mM NaCl). A Tª ambiente.
Materiales y Métodos
- Incubación Anticuerpo Primario: Se incuba con anticuerpo primario durante 12h-16h. A 4 ºC.
- Lavado: 6 x 10 min con BBT 250. A Tª ambiente.
- Incubación con Anticuerpo Secundario: 2h en BBT 250. A Tª ambiente.
- Lavado: 6 x 10 min con PBT. A Tª ambiente.
- Revelado: Las tinciones con anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos no requieren ningún tratamiento de revelado. El revelado con H2O2/DAB requiere una incubación de las larvas en una mezcla equimolecular de estreptavidina y peroxidasa biotinilada. Después se lava y se revela la tinción en H2O2 al 0,004 % + DAB 0,5 mg/ml en PBT.
- Montaje: Los discos imaginales se equilibran y se montan en glicerol al 90 %.
1F. Hibridación In situ de ARN
Esta técnica permite visualizar, mediante la hibridación con una sonda sintetizada in vitro, la expresión de ARNm en un tejido (Tautz and Pfeifle, 1989). Las hibridaciones in situ realizadas en los discos imaginales se llevaron a cabo con sondas de ARN marcadas con digoxigenina y se revelo su presencia mediante una reacción química visible.
Construcción de la sonda:
- Linealización: 1 μg de cADN se linealizó mediante digestión con una enzima de restricción.
- Transcripción (en 20 μL): Para el marcaje de la sonda se llevó a cabo una reacción de transcripción a partir del cADN linealizado (1
μg) con la ARN polimerasa correspondiente (Roche, DIG RNA Labelling Kit (SP6/T7), Cat. # 11 175 025 910). 2 hrs. a 37 ºC.
- Precipitación y Resuspensión: Añadir 100 μL H20, 7.7 μL de ADN de Esperma de salmón, 16 μL LiCl 5M y 600 μL EtOH 100 %. Mezclar y dejar toda la noche a -20 ºC. Precipitar 15 min. Lavar con EtOH 70% y resuspender precipitado en 150 μL de Mezcla de Hibridación (50%
Materiales y Métodos
Formamida, SSC 5X, 100 μg/ml ADN de esperma de salmón, 50
μg/ml heparina y 0,1% Tween20) (MH) Hibridación in situ:
- Disección: Las larvas se disecan en PBT (PBS + 0.3 % Tween 20) un máximo de 30 min en hielo.
- Fijación: 20 min en formaldehído al 4 % en PBT. A Tª ambiente. - Lavado: 3 x 10 min en PBT. A Tª ambiente
- Prehibridación: En MH a 55 ºC durante un periodo mínimo de 1 hr. - Hibridación: Con 2 μl de sonda en 100 μl de MH durante toda la
noche a 55 ºC.
- Lavado: 10 min en MH a 55 ºC
- Lavado: 3 x 10 min en PBT:MH (1:3, 1:1 y 3:1). A Tª ambiente - Lavado: 3 x 10 min en PBT. A Tª ambiente
- Lavado: 2 x 10 min en Tampón 1 (100 mM Tris-HCl pH 7.5 y 150 mM NaCl). A Tª ambiente
- Detección de la sonda: Incubación durante 2 horas a Tª ambiente con anticuerpo Oveja anti-Digoxigenina (Roche) en una dilución 1:4000.
- Lavado: 6 x 10 min en PBT. A Tª ambiente
- Lavado: 2 x 10 min en Solución de Color (100mM NaCl, 50mM MgCl2, 100mM Tris-HCl pH 9,5 y 0,1% Tween20). A Tª ambiente
- Revelado: se empleó Solución de Color a la que se añadió NBT y BCIP (Roche). El tiempo de revelado fue entre 5 minutos y 1 hora. - Lavado: 2 x 10 min en PBT. A Tª ambiente
- Montaje: Los discos imaginales se equilibran y se montan en glicerol al 90 %.
1G. Adquisición y tratamiento de imágenes
Todas las fotografías de discos imaginales están orientadas con la región dorsal hacia arriba y anterior hacia la izquierda excepto si se indica lo contrario. Las fotografías de alas adultas están orientadas con la región anterior hacia arriba y proximal hacia la izquierda. Las imágenes se muestran
Materiales y Métodos
a la máxima amplificación posible para identificar los detalles, por lo que las fotografías no están a escala.
Las imágenes de microscopía convencional fueron tomadas en un microscopio Leica DMLB acoplado a una cámara fotográfica digital Nikon CoolPix 990. Las imágenes de microscopía confocal fueron tomadas mediante un sistema confocal Microradiance de BioRad acoplado a un microscopio vertical Zeiss Axioskop2 (dos canales) o mediante un sistema confocal Radiance 2000 de BioRad acoplado a un microscopio invertido Zeiss Axiovert S100 TV (tres canales). Las imágenes han sido tratadas digitalmente mediante la aplicación Photoshop (Adobe).
1H. Generación de líneas transgénicas
Para generar líneas transgénicas portadoras de las construcciones
UAS-nab y UAS-Rn∆894, se emplearon moscas de genotipo y w (Spradling and Rubin,
1982). Se realizaron puestas de 30 minutos y los embriones recolectados se decorionaron durante 40 segundos con lejía, lavándose posteriormente con agua. Estos embriones se microinyectaron con 1 μg de la construcción UAS junto con 0,3 μg del vector pUC Δ2-3 como fuente de transposasa. A las 48 horas se recogieron larvas, y los adultos supervivientes se cruzaron con moscas y w. De la progenie se seleccionaron las moscas transformantes de fenotipo w+. Para generar líneas estables y discernir en qué cromosoma se ha insertado la construcción UAS, se empleó la estirpe w; CyO / If; MKRS / TM6b
Materiales y Métodos 2. Materiales y Métodos Bioquímicos
2A. Materiales y métodos básicos de manipulación de ADN
Digestión: Todas las digestiones se realizaron a 37 ºC en 50 μL con 1 μL de Enzima de Restricción (ER) durante al menos 2 hrs. Todas las ER son provistas por Roche.
Amplificación de ADN: Se llevo a cabo mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Todas las reacciones se generaron siguiendo las instrucciones del fabricante provistas en el High Fidelity PCR Master Kit (Roche, Cat # 2140314), usando la temperatura de hibridación adecuada para cada par de oligos y empleando un termociclador GeneAmp PCR System 9700 de Applied Biosystems.
Ligación: Todas las ligaciones se realizaron con T4 DNA Ligasa (New England Biolabs, Cat # M0202L). A 4 ºC toda la noche para las ligaciones de fragmentos de PCR con pGEM®-T Easy y a 16 ºC toda la noche para el resto de los clonajes (ver aptdo. B3).
Análisis de digestión y PCR: Se realizó corriendo el ADN en un gel de 0.9 % de Agarosa en TBE.
Purificación de ADN desde gel y desde PCR: Para la purificación se usaron columnas provistas en el Quiaquick Gel Extraction Kit (Quiagen Cat.# 28704) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Transformación de bacterias: La transformación de plásmidos para su replicación en E. coli se realizó en cepas de XL1-Blue MRF’ {Δ(mcrA)183,
Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endA1, supE44, thi-,recA, gyrA96, relA1, lac, λ -,
[F´,proAB, lacIqZΔM15, Tn10, (tetr)]}, manipuladas para ser
Materiales y Métodos 2B. Vectores
A continuación se enumerarán todos los vectores utilizados y el uso que se les ha dado en el desarrollo de esta tesis:
• pGEM®-T Easy (Promega, Cat.# A1360): Clonaje de fragmentos de
PCR, para ser subclonados posteriormente en otros plásmidos.
• p[UAS] (Brand and Perrimon, 1993): Generación de líneas
transgénicas de expresión ectópica de nab y Rn∆894.
• pET-14b (Novagen, Cat.# 69660-3): Generación de una proteína
de fusión de nab con a una cola de 6Xhis, con el fin de purificarla para generar un anticuerpo frente a ella.
• PGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia Biotech, Cat.# 27-4581-01):
Generación de una proteína de fusión de nab con GST, y usar esta proteína de fusión en experimentos de interacción de proteínas (pull down).
• pCDNA3FLAG (Invitrogen), cedido por la Dra. Maria Navarro:
Clonaje de las proteínas Rn, Rn∆894 y Sqz, para su uso en ensayos de interacción de proteínas.
2C. Construcción de Plásmidos
En este apartado daré cuenta de la metodología que se ha seguido para clonar todos los plásmidos usados en el desarrollo de la tesis y de los oligonucleótidos que han sido necesarios para su construcción. Los cADNs de las genes nab y sqz se obtuvieron mediante PCR usando como molde los clones de las colecciones del Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP) LP2227 y RE47124 respectivamente. El cADN de rn se obtuvo usando como molde el vector pUAS-Rn, cedido por el Dr. S. Thor (St Pierre et al., 2002). En todas las PCRs se usaron parejas de oligos que contienen las secuencias de inicio (Forward) y finalización (Reverse) de la transcripción, diseñándose de forma que respetaran el marco de lectura de los péptidos o proteínas (His, GST y Flag) contenidas en los vectores de destino (ver aptdo. 2B). Además, en el oligo se añadió una cola de ADN con una secuencia diana para una enzima de restricción. Esta secuencia diana fue elegida porque no esta presente en el
Materiales y Métodos
interior del cADN y si en el “Sitio Múltiple de Clonaje” (MCS) del vector donde se insertará finalmente el cADN. Una vez realizada cada PCR, el fragmento obtenido se clonó en el vector pGEM®-T Easy. Cuando se seleccionó un clon positivo, marcado por la ausencia de actividad β-Galactosidasa (colonia blanca) y confirmado posteriormente mediante digestión y secuenciación, se cortó con las enzimas de restricción cuyas dianas estaban presentes en la pareja de oligos y se subclonó en el vector correspondiente, cortado con las mismas enzimas (Fig. 8).
La nomenclatura de los oligos usados hace referencia al gen que amplifican, y a la diana que contienen:
Clonaje de nab en pET-14b: Para su clonaje en pGEM-T Easy se usaron los oligos:
NabF_NdeI(His): ATCATATGCATTTCGTCCTGGTTCTTTGTG
NabR_EcoRI(His): ATGAATTCTAAGTCTCTGGTGAAGCAGC
Posteriormente nab se clonó en pET-14b a partir del plásmido pGemT Easy nabHis. Se cortaron vector y fuente de inserto con NdeI y EcoRI para su ligación. La cola 6Xhis se situó en el extremo N terminal.
Figura 8.- Protocolo para el clonaje de plásmidos. El cADN amplificado se clona en el vector pGem-T Easy. Una vez clonado, se usa este vector como fuente para amplificar el inserto y clonarlo en el vector de destino.
Materiales y Métodos
Clonaje de nab en pGEX-4T-2 y pUAS: Para su clonaje en pGEM®-T Easy se usaron los oligos:
NabF_EcoRI(GST): ATGAATTCTAATGCATTTCGTCCTGGTTCTTTG
NabR_SalI(GST): ATGTCGACCTAAGTCTCTGGTGAAGCAGCACTC
Después nab se clonó en pGEX-4T-2 y pUAS a partir del plásmido pGemT Easy nabGST. Se cortaron vector y fuente de inserto con EcoRI y SalI para su ligación. La proteína GST se situó en el extremo N terminal.
Clonaje de rn en pCDN3FLAG: Para su clonaje en pGEM®-T Easy se usaron los oligos:
RnF_XbaI: AATCTAGACATGGTACCTGGTACAAGGG
RnR_SalI: ATGTCGACCTATCCCTTGTCCTTCCCAG
A continuación rn se clonó en pCDNA3FLAG a partir del plásmido pGem-T Easy rn. Se cortaron vector y fuente de inserto con XbaI y SalI para su ligación. La etiqueta FLAG se situó en el extremo N terminal.
Clonaje de sqz en pCDNA3FLAG: Para su clonaje en pGEM®-T Easy se usaron los oligos:
SqzF_XbaI: AATCTAGACCCAGCGGCGATTATCTG
SqzR_SalI: ATGTCGACCTATTGCGCCTTTTCTTTGGC
Posteriormente sqz se clonó en pCDNA3FLAG a partir del plásmido pGem-T Easy sqz. Se cortaron vector y fuente de inserto con XbaI y SalI para su ligación. La etiqueta FLAG se situó en el extremo N terminal.
Mutagénesis dirigida para generar la proteína truncada Rn∆894: La proteína se generó cambiando los aminoácidos Asn894 y Lys895 del cADN de rn por dos codones de parada. Se usó como molde pCDNA3FLAG_rn, de forma que el plásmido resultante fuera idéntico excepto en la zona mutagenizada, y así poder usarlo en experimentos de interacción proteína-proteína y, que además sirviera también como molde para clonar rn∆894 en pGEM®-T Easy (pGEM-T Easy rn∆894), usando de nuevo los oligos RnF_XbaI y RnF_SalI.
Para clonar el plásmido con la proteína truncada y diseñar los oligos necesarios se siguieron las instrucciones de “QuickChange®Site-Directed
Materiales y Métodos
Mutagénesis Kit” (Stratagen Cat. #200519) (Fig. 9). En negrita se marcan los nucleótidos que difieren de la cadena original y que al ser intercambiados generan un cambio de codón:
RnStopF: GCCATCAGCTTCCCGTAGTAGAACGTGAACCAGAACAACG
RnStopR: CGTTGTTCTGGTTCACGTTCTACTACGGGAAGCTGATGGC
Clonaje de Rn∆894 en pUAS: rn∆894 se clonó en pUAS a partir del plásmido
pGem-T Easy rn∆894. Se cortó el vector con XhoI y la fuente de inserto con
SalI para su ligación, ambas enzimas dan extremos protuberantes y compatibles entre sí.
2D. Purificación de las proteínas GST-Nab, GST y 6Xhis-Nab
Los pasos iniciales de inducción y purificación son comunes para todas las proteínas, así como los análisis de concentración, tamaño y grado de purificación de todas las proteínas purificadas, que se realizaron en geles al 10 % de SDS PAGE.
Inducción Común:
- Transformación: En cepas E.coli BL-21 {F-,ompT, hsdSB( rB-mB-) gal, dcm(DE3)}
- Inoculación: Se inocula una colonia en 10 mL de LB + Ampicilina + 40 mM Glucosa. La Glucosa se añade para evitar expresión de proteina, ya
Figura 9.- Esquema del protocolo “en un día” de mutagénesis dirigida para un cambio de codón. Adaptado del manual de instrucciones de “QuickChange® Site-Directed Mutagénesis Kit”
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que cuando la bacteria expresa proteina decae su tasa de proliferación. Toda la noche a 30 ºC.
- Crecimiento del cultivo: Se crece el cultivo mediante la adición de 4 mL del inóculo anterior a 200 mL de LB + Amp (1/50). A 30 ºC hasta D.O. = 0.6-0.8.
- Inducción de la proteina: Se añade 0.5 mM IPTG. 2 hrs. A 30 ºC.
- Precipitación: Se centrifugan los 200 mL de cultivo a 6000 rpm durante 15 min.
6Xhis-Nab: El gen nab se clonó en el vector pET-14b. La proteína se purificó para obtener un anticuerpo policlonal frente a ella. Se usó el péptido de 6Xhis pues permite su purificación incluso en condiciones desnaturalizantes, evitándose la necesidad de que deba ser soluble para poder purificarla, como sí ocurre con las proteínas de fusión con GST. De esta forma pueden conseguirse, con mayor facilidad, las altas cantidades requeridas para la obtención de un anticuerpo. La purificación de 6Xhis-Nab se continúa, después de la precipitación del cultivo, mediante las instrucciones provistas por el fabricante para la purificación de proteínas de fusión insolubles (Pagina 90, The QIAexpressionistTM), y merced a su capacidad de unión a bolas de Ni-NTA Agarosa (Quiagen, Cat #1018244). No se eluye la proteína de las bolas. GST-Nab: El gen nab se clonó en el vector pGEX-4T-2. Se utilizó la proteína de fusión unida aún a las bolas de Sefarosa Glutation (Amersham Bioscieces, Cat # 17-5279-01) necesarias para su purificación, con el fin de usarla como cebo en experimentos de interacciones proteína-proteína. Posterior a la precipitación del cultivo se siguieron los siguientes pasos para su purificación:
- Resuspensión: En 10 ml de Tampón STE (10 mM tris-HCl pH 8, 1mM EDTA y 150 mM NaCl).
- Incubación: Añadir 100 μL de Solución de Lisozima (10 mg/ml en H2O). Incubar 15 min en hielo
- Sonicación: Añadir 1.4 ml de 10 % Sarkosyl (Sigma, Cat # L9150) y sonicar 6 X 10 s.
Materiales y Métodos
- Incubación: Transferir el sobrenadante a un tubo hermético de 50 ml (Falcon, Cat # 352098). Añadir 4 ml de Tritón X-100 y llegar hasta 20 ml con Tampón STE. Incubar 30 min a Tª ambiente.
- Incubación: Añadir 1 ml bolas de Sefarosa Glutation preparadas en PBS (Precipitar 2 ml de las bolas suministradas por el fabricante a 2000 rpm, lavarlas con 50 ml de PBS, precipitarlas a 2000 rpm y resuspenderlas en 1 ml de PBS). Incubar a Tª ambiente durante 1 hr en agitación.
- Lavado: 3 X 50 ml de PBS
- Almacenaje y Uso: Resuspender las bolas unidas a Nab-GST con 1 ml PBS. Guardar con 10 % Glicerol a -70 ºC.
GST: Se uso como control negativo en experimentos de interacción proteína-proteína. Se purificó de la misma manera que Nab-GST.
2E. Generación de anticuerpos contra Nab
La proteína 6Xhis-Nab, unida a las bolas de agarosa Ni NTA (ver Aptdo. 2D), se desnaturalizó y separó de las bolas en Tampón de Carga para geles de SDS PAGE. Se resolvió en un gel de 10 % con un único pocillo. Una vez fijado y teñido el gel, se recortó la banda de la proteína y se homogenizó para inyectarse directamente a los conejos que iban a ser inmunizados. Para obtener el anticuerpo frente a Nab se inmunizaron dos conejos distintos con 70 μg Proteína/inyección. Se practicaron tres inmunizaciones, la primera mezclando el antígeno 1:1 con adyuvante completo (Freund’s Adjuvant, Complete, Sigma, Cat # F5881), y las dos restantes a intervalos de 15 días mezclándolo con adyuvante incompleto (Freund’s Adjuvant Incomplete, Sigma, Cat # F5506). 10 días después de la última inyección se sangraron los conejos y se extrajo el suero inmune.
2F. Interacción proteína-proteína
Se realizaron ensayos de interacción molecular entre las proteínas Nab/FLAG-Rn, Nab/FLAG-Sqz, y Nab/FLAG-Rn∆894. La proteína GST-Nab fue el cebo, purificada y unida a bolas de Sepaharosa-Glutation (ver aptdo. 2D), y el resto la presa, obteniéndose in vitro mediante el “TNT T7
Materiales y Métodos
Coupled Reticulocyte Lysate Kit” (Promega, Cat #L4600), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para ello se usó el promotor T7 que se encuentra aguas arriba de la etiqueta FLAG en el vector pCDNA3FLAG. En su traducción se uso [S-35]Met, por lo que únicamente las proteínas traducidas están marcadas radiactivamente. Protocolo a seguir en el ensayo:
- Incubación: 15 μL de GST-Nab + 5 μL de Presa en 200 μL de Tampón A (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 100 mM NaCl), 300 mM KCl y 0.1 % (v/v) TX100). Durante 2 hr a 4 ºC
- Precipitación: Se precipitan las bolas, cualquier proteína no unida debería permanecer en el sobrenadante
- Lavados: 4 X 1.5 ml Tampón A.
- Elución: Se desnaturalizan todas las proteínas unidas a las bolas, mediante Tampón de carga para geles de SDS-PAGE.
- Detección: Se cargan en un gel y se detectan la presencia de proteínas mediante auto radiografía.
Como control positivo de la transcripción/traducción de las presas se cargó en el gel un 5 % de la cantidad de extracto de TnT con que se incubó el cebo. Como control negativo, para demostrar que la unión es específica, se repitieron todos los ensayos incubando las presas con bolas unidas sólo a GST.
2G. Mapeo de Inserciones EP
Para la identificación del sitio de inserción del elemento EP#13 se extrajo ADN genómico de 30 moscas y se resuspendió en 70 μl de H2O, siguiendo la metodología estándar de extracción de ADN de la BDGP (http://www.fruitfly.org/about/methods/inverse.pcr.html). Para asegurarnos un mayor porcentaje de éxito se hicieron en paralelo dos reacciones distintas de PCR inversa. La mitad del ADN genómico (35 μL) se cortó con la ER HinpI y la otra mitad con la ER MspI. Las reacciones de restricción se llevaron a cabo durante 4 horas y las enzimas se inactivaron durante 20 minutos a 65 ºC. Se aumentó el volumen hasta 250 μl para su ligación, que se llevo a cabo a 4 ºC toda la noche y se precipitó y limpió de sales mediante EtOH, resuspendiéndose el precipitado en 30 μl. Para cada reacción de PCR inversa se usaron 5 μl de ligación en un volumen final de 50μl, tal que: 95ºC/5 min;
Materiales y Métodos
35 ciclos: 95ºC/45 s., 55ºC/1 min y 72ºC/2 min; y 72ºC/10 min Se utilizaron los oligonucleótidos específicos del extremo 3’ del elemento-EP:
Pry1: CCTTAGCATGTCCGTGGGGTTTGAAT
Pry4: CAATCATATCGCTGTCTCACTCA
Se secuenciaron con el oligonucleótido:
Spep1: GACACTCAGAATACTATTC
Con la secuencia obtenida, se realizó una búsqueda para identificar la región de ADN adyacente al elemento EP mediante el programa BLAST, en el genoma de D. melanogaster (http://flybase.net/blast/).
2H. Mapeo molecular de deficiencias nabR#
Para conocer el alcance de la deficiencia generada en los revertiente
nabR# se extrajo ADN genómico de embriones homocigóticos, que se utilizó
como molde para amplificar mediante PCR las regiones genómicas adyacentes al sitio de inserción del elemento-P l(3)SH143, que se encuentra insertado en el primer exón de nab. Se diseñaron oligos que amplifican regiones de 5, 10 y 15 Kb a la izquierda de la inserción, enfrentándose siempre al mismo oligo del lado derecho (Nab_rev), según la dimensión de la delección.
Nab_rev: TTGCCCCGGCTGATAGAAAACG
Nab5Kb: TTTCGCAGAGACCTGCAAGTAACAAG
Nab10Kb: TTATCCCATTTAGAAATCAAGGAGTGTGC
Nab15Kb: AACTGCAAATTCAATTTAAATCAATGCC
El máximo tamaño de ADN amplificable mediante “High Fidelity PCR Master Kit” es 5 Kb, así, si no se amplifica ADN mediante el primer par de oligos (Nab_rev: Nab5Kb), se intenta con el siguiente (Nab_rev: Nab10Kb), y así consecutivamente. El DNA amplificado se secuenció con Nab-rev. Con la secuencia obtenida, se realizó una búsqueda, para identificar la región de ADN adyacente al elemento p{LacW} que ha sido deleccionada, mediante el programa BLAST en el genoma de Drosophila (http://flybase.net/blast/
Resultados
En el desarrollo del ala participan todas las rutas de señalización necesarias para el desarrollo general, por ello es un buen modelo para estudiar el desarrollo de extremidades, pero también para encontrar nuevos genes incluidos en esas rutas y comprender la interacción entre ellas (Irvine and Rauskolb, 2001; Klein, 2001; Lawrence and Struhl, 1996). Las células que formarán el ala comienzan su desarrollo como un primordio de disco que se especifica durante la embriogénesis (Cohen et al., 1993), proliferan durante los estadios larvarios y sufren metamorfosis en el estadio pupal. Una vez especificado el disco imaginal de ala, formado por un epitelio plano pseudoestratificado de células columnares, se producen en él interacciones genéticas que generan dos restricciones de linaje que resultan en cuatro compartimentos, fenómeno producido cuando el patrón de expresión de un gen, que se heredará por linaje, define a un grupo de células con un comportamiento, que las difiere y separa del resto impidiendo su mezcla (Garcia-Bellido et al., 1973). Estas restricciones marcarán las coordenadas tridimensionales futuras del ala y notum adultos (Basler, 2000; Brook et al., 1996). La primera restricción separa las células con destino anterior de las posteriores, se realiza durante la embriogénesis, y requiere la expresión del complejo engrailed/invected para la determinación del destino posterior (Garcia-Bellido and Santamaria, 1972; Lawrence and Morata, 1976; Morata and Lawrence, 1975). La segunda se produce en segundo estadio larvario, separa las células dorsales de las ventrales y requiere la expresión del gen apterous (ap) para la determinación del destino dorsal (Cohen et al., 1992; Diaz-Benjumea and Cohen, 1993). También se ha postulado la existencia de otras restricciones de linaje proximal/distal y notum/ala (Cifuentes and Garcia-Bellido, 1997), pero estudios posteriores no han permitido confirmar estos resultados. De esta forma, el dominio ala se subdivide en diferentes subdominios caracterizados por una diferente combinación de factores de transcripción, dándonos un nuevo ejemplo en el desarrollo, de la importancia que tiene la combinatoria entre patrones de expresión. Una de las consecuencias más importantes que tiene esta subdivisión en dominios de expresión génica, es la interacción entre células en las fronteras de los compartimentos, un fenómeno de gran importancia en el desarrollo, pues
