INSTITUTO DE PATOLOGIA VEGETAL (IPAVE)

(1)

MEMORIA 2013

Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA CENTRO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

(2)

2

ÍNDICE

1.-

INTRODUCCIÓN ... 3

2.-

PROYECTOS

DE

INTA... 5

CARTERA de Proyectos INTA 2013 ... 6

CARTERA de Proyectos INTA 2009 ... 93

Proyectos Convenio INTA AUDEAS CONADEV ... 99

Programa de Cooperación Internacional INTA – EMBRAPA ... 100

Implementación de un Sistema de Gestión de Calidad en el IPAVE ... 107

3.-

PROYECTOS

CON

SUBSIDIOS/APORTES

EXTRA-INTA ... 109

4.- PUBLICACIONES ... 1165

5.- TESIS ... 129

6.-

VINCULACIONES

TECNOLÓGICAS ... 133

7.-

RELACIONES

INSTITUCIONALES ... 137

8.-

CAPACITACIÓN

BRINDADA ... 145

9.- CAPACITACIÓN RECIBIDA ... 153

10.- EVALUACIONES ACADÉMICAS Y CIENTÍFICAS ... 158

11.- SERVICIOS ESTRATÉGICOS ... 163

(3)

3

1.-INTRODUCCIÓN

Durante el año 2013, se dio comienzo a la nueva cartera de Proyectos INTA 2013 que ha requerido una fuerte actividad de gestión de todo el personal del IPAVE para responder a las demandas de los territorios y/o adelantarnos a problemas futuros a través de la participación en los Programas Nacionales (PN) y en los Proyectos Regionales con Enfoque Territorial (PReT). Esto originó que los integrantes del IPAVE estén incluídos en 96 líneas de acción, pertenecientes a 26 Proyectos Específicos (PE), de 8 PN, y en actividades compartidas con 16 PReT de 9 CR diferentes, como se detalla a continuación:

1. PN BIOTECNOLOGÍA (PNBIO) 4 PE (7 líneas) 2. PN PRODUCCIÓN ANIMAL (PAANIM) 1 PE (1 línea) 3. PN CEREALES Y OLEAGINOSAS (PNCYO) 6 PE (5 líneas) 4. PN FRUTALES (PNFRU) 2 PE (12 líneas)

5. PN HORTALIZAS, FLORES Y AROMÁTICAS (PNHFA) 6 PE (22 líneas) 6. PN SUELO (PNSUELO) 1 PE (1 línea)

7. PN PROTECCIÓN VEGETAL (PNPV) 4 PE (38 líneas) 8. PN CULTIVOS INDUSTRIALES 2 PE (10 líneas) 1. CR Buenos Aires Norte – 1 PReT BANOR 2. CR Buenos Aires Sur – 1 PReT BASUR 3. CR Catamarca La Rioja – 3 PReT CATRI 4. CR Córdoba – 2 PReT CORDO

5. CR Mendoza San Juan – 3 PReT MZASJ 6. CR La Pampa San Luis – 1 PReT PAMSL 7. CR Patagonia Norte – 1 PReT PATNOR 8. CR Salta Jujuy – 2 PReT SALJU

9. CR Tucumán Santiago del Estero – 2 PReT TUSGO

En esta nueva cartera de proyectos el IPAVE es sede de la coordinación del PN de Protección Vegetal (PNPV), de dos Proyectos Integradores (de los PNIND y PNPV), de cuatro PE (de los PNIND, PNPV, PNSUELO, PNCYO) y tres Módulos (de PE de los PNIND y PNPV). Además, el Instituto continúa siendo sede del Atlas Fitopatológico Argentino, de la Red Nacional de Protección Vegetal y de la Presidencia de la Asociación Argentina de Fitopatólogos (AAF).

El personal del IPAVE, también dirige un Proyecto INTA-AUDEA-CANADEV y dos Proyectos INTA-EMBRAPA, y dirige y/o participa en veinte proyectos extraINTA que permitieron completar el desarrollo de las actividades planificadas en los Proyectos institucionales. Paralelamente, se han llevado adelante siete Convenios de Asistencia Técnica Nacionales y/o Cartas de Acuerdo y dos Convenios Internacionales.

Las líneas de investigación permitieron identificar y caracterizar virus de maíz, trigo, alfalfa, girasol, poroto, maní, batata, cebolla, ajo, chía, tomate, mandioca, cucurbitáceas, frutilla, tomate, pimiento, yerba mate y plantas ornamentales. Se identificaron y criaron diferentes vectores de patógenos con el fin de estudiar la transmisión. Se caracterizaron infecciones simples y aquellas producidas por mezclas de virus y la interacción entre ellos y sus hospedantes. Se produjeron antisueros para virus de batata y mandioca y para la bacteria Leisfonia xyli subsp. xyli causante de la parálisis de la caña de azúcar. Fue implementada una sonda de diagnóstico para Strawberry mottle virus en frutilla.

Se comenzaron trabajos con diferentes virus tendientes a conocer los mecanismos de defensa en plantas mediada por el silenciamiento génico. Fue comprobada una compleja red de infecciones simples y mixtas de begomovirus en tomate y pimiento en el NOA. Se estudió la diversidad intraespecífica de virus presentes en distintos cultivos de Argentina.

Fueron determinados los porcentajes de incidencia, prevalencia de los patógenos en los campos de producción y estudiados los mecanismos de transmisión. A través de estudios de distribución temporal y espacial de los patógenos, se construyeron mapas de distribución, etc. Se evaluó la resistencia/tolerancia a virus de diferentes cultivares de girasol, y de cultivares de ajo ante fitoplasmas y virus.

Se han obtenido exitosamente plantas de Murraya paniculada para la cría artificial del psílido

Diaphorina citri, vector del HLB.

Se identificaron, y se trabaja en la caracterización de fitoplasmas en frutilla, duraznero, remolacha azucarera y se estudian los vectores de estos patógenos en alfalfa y otros hospedantes. Se determinó la

(4)

4 duración del ciclo biológico de Ceresa nigripectus (Membracidae) posible vector del fitoplasma de alfalfa. Se lograron identificar y caracterizar proteínas involucradas en la interacción de los fitoplasmas con su hospedante. Se identificaron y caracterizaron viroides de frutales de pepita y carozo.

Se trabaja en la caracterización de cepas de este hongo aisladas de diferentes regiones del país. Se ajustó la técnica de análisis mediante PCR en tiempo real, qPCR – TaqMan para la detección de

Verticillium dahlieae en olivo. Se ensayaron diferentes estrategias de manejo para el carbón del maní. Se

realizaron estudios epidemiológicos, herramientas tácticas para el control químico y el manejo de las enfermedades.

Se está trabajando en la implementación de una cuarentena sanitaria para germoplasma de caña de azúcar en el IPAVE como un servicio estratégico para los programas de mejoramiento genético.

Se continúan acciones relativas al desarrollo de construcciones capaces de inducir la vía de RNAi o miRNA para generar resistencia a tospovirus.

Se produjeron plantas libres de virus de batata y ajo que fueron entregados a productores como mecanismo de manejo y control de los daños producidos por estos patógenos.

Se completó el ensayo de triple interacción soja/ hongo micorrícico/Fusarium virguliforme. Con la finalidad de relacionar las comunidades microbianas en respuesta a la aplicación de vinaza y la incidencia de enfermedades causadas por hongos de suelo en el cultivo de caña de azúcar, se aplicaron diferentes dosis que posteriormente serán evaluadas. Se evaluó el efecto de prácticas culturales sobre poblaciones de biocontroladores y su relación con la incidencia de enfermedades causadas por hongos de suelo en soja.

Se continuó con la carga de información en el Atlas Fitopatológico Argentino a través de su página web www.fitopatoatlas.org.ar.

Los resultados permitieron la publicación de 19 trabajos en revistas nacionales e internacionales con referato, dos en revistas sin referato, 56 presentaciones a reuniones científicas, tres capítulos de libros, ocho publicaciones de divulgación nacionales y dos internacionales. En este período también se finalizaron dos tesis de Doctorado, y se cuenta con 21 tesis en marcha (14 doctorales, cuatro maestrías y tres de grado).

Dra. Vilma Cecilia Conci

Dir. (Int.) Instituto de Patología Vegetal IPAVE-CIAP-INTA

(5)

5

PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

DE INTA

(6)

6

2.-PROYECTOSDEINTA

Cartera de Proyectos INTA 2013

2.1.PNBIO 1131022. Genómica funcional y biología de sistemas. Coordinador: Sebastian Asurmendi

Unidad Sede: Inst. de Biotecnología

2.1.1. Acción. Análisis comparativo del perfil y la abundancia relativa de los RNAs mensajeros (mRNAs) y RNAs pequeños (sRNAs) que se acumulan en plantas de trigo infectadas y en insectos con el virus del Mal de Río Cuarto (MRCV)

Responsable: Luis de Haro [email protected] (Inst. de Biotecnología)

Participantes: E. Argüello Caro; A. Dumón (IPAVE); G. LLauger (Inst. de Biotecnología).

El MRCV es evolutivamente un virus de insectos que recientemente adquirió la habilidad de replicar en plantas causando infecciones severas (citopáticas) y una alta acumulación viral en plantas e infecciones no citopáticas en el insecto que lo transmite. Por ello, resulta interesante estudiar comparativamente las bases moleculares de dicha diferencia.

Para determinar el perfil transcripcional de los mRNAs y la acumulación de sRNAs en ambos hospedantes, se realizó un ensayo de transmisión 1:1 a plántulas de trigo (cv. ProINTA Federal) con tres repeticiones (Figura 1).

Figura 1. Actualmente, las plantas se mantienen en invernáculo con temperatura controlada (25 ± 3°C) hasta la evaluación de síntomas y análisis posteriores.

2.1.2. Acción. Análisis estructural y funcional de siRNAs (RNAs pequeños interferentes) derivados de begomovirus y tospovirus en infecciones mixtas y diferentes hospedantes y sus consecuencias en la defensa antiviral

Responsable: Paola M. López Lambertini, [email protected] (IPAVE) Participantes: H. Debat, N. Puyané, V. Bornancini, C.G. Vaghi Medina (IPAVE)

Hasta el momento, se han analizado los perfiles de acumulación de RNAs pequeños publicados derivados de tospovirus en Nicotiana benthamiana y Solanum lycopersicum, generando patrones de frecuencia y contrastándolos con análisis estructurales del RNA viral. Es interesante destacar que el análisis bioinformático de acumulación de RNAs pequeños derivados de TSWV presenta diferencias en comparación con los reportados por otras especies virales. Por ejemplo, el patrón de acumulación de RNAs pequeños de TSWV es independiente del hospedante, mientras que la acumulación global si

(7)

7 depende del mismo. Otra característica que presentan son la falta de parcialidad a nivel de polaridad, que la mayoría de los RNAs pequeños derivan de los segmentos genómico M y S y la presencia de regiones distintivas o hotspot de producción masiva de los mismos. En paralelo, se han generado líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan microRNA artificiales cuyo target son diversas regiones que generan diferencialmente RNAs pequeños virales. Se proyecta correlacionar perfiles de acumulación de RNAs pequeños, fenotipos de resistencia/tolerancia a virus y estructura secundaria de virus para, a largo plazo, contar con una plataforma integrada de planificación de blancos eficientes virales para la generación de resistencia a virus.

2.2.PNBIO 1131023. Prospección y caracterización funcional de genes de interés biotecnológico

Coordinador: Cecilia Vazquez Rovere Unidad Sede: Inst. de Biotecnología

2.2.1.Acción. Analizar la participación de las vías de inmunidad innata del insecto en la transmisión del MRCV por Delphacodes kuscheli y analizar la participación de las vías del silenciamiento génico activadas en éste en infecciones simples y mixtas con un rhabdovirus de cereales

Responsable: María Fernanda Mattio, [email protected] (IPAVE) Participantes: A. Dumón, E. Argüello Caro (IPAVE)

Los niveles de infección viral en el insecto vector pueden estar asociados a diferentes factores, como los mecanismos de inmunidad y silenciamiento génico que se activan ante el ataque de un virus y la presencia de un segundo virus en el vector, que puede modificar la capacidad de transmisión de uno o ambos virus.

Para determinar qué genes se activan en D. kuscheli frente a la presencia del MRCV y/o rhabdovirus, se comenzó con la búsqueda y alineamiento de secuencia de genes de inmunidad y silenciamiento génico presentes en otros insectos delfácidos (Nilaparvata

lugens, Sogatella furcifera, Laodelphax striatellus y Peregrinus maidis). A partir de las

zonas conservadas de estos genes, se diseñaron cebadores degenerados que serán posteriormente utilizados para detectar su expresión en D. kuscheli por RT-qPCR. Por otro lado, se cuenta con el material biológico, el cual se obtuvo mediante ensayos de transmisión 1:1 con ejemplares de D. kuscheli (infectados con MRCV o MRCV-rhabdovirus) a plántulas de trigo (cv. ProINTA Federal).

2.3.PNBIO 1131044. Genómica aplicada a estudios de ecología molecular y diversidad genética

Coordinador: Daniela Tosto

Unidad Sede: Inst. de Biotecnología

2.3.1. Acción. Diversidad genética y filodinamia de virus emergentes que infectan solanáceas hortícolas

Responsable: Paola M. López Lambertini, [email protected] (IPAVE) Participantes: C.G. Vaghi Medina, V. Ranieri, N. Puyané, H. Debat (IPAVE)

Los begomovius son parte de la familia Geminiviridae, su genoma es circular y su vector es la mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius). En Argentina se han identificado

(8)

8 begomovirus del Nuevo Mundo, la mayoría de estos poseen genomas bipartitos (DNA-A y DN(DNA-A-B). La recombinación genética tiene un rol importante como mecanismo de evolución de estos patógenos y contribuye a la generación de nuevas especies que pueden presentar mayor virulencia. Se identificó, caracterizó y determinaron los posibles eventos de recombinación que dieron origen a una nueva especie de begomovirus que circula en la región del NOA.

Se estimó la riqueza y diversidad de begomovirus mediante patrones generados por RCA-RFLP en tomate y pimiento en el noroeste argentino (NOA). Se amplificaron mediante círculo rodante (RCA) los genomas de begomovirus de 27 plantas de tomate y 31 de pimiento. Cada producto de amplificación fue digerido con ApaI, BamHI, PstI y

XhoI y sembrado en geles de agarosa al 1,2% obteniendosé patrones polimórficos de

restricción (RFLP). Se calcularon los índices de riqueza y de diversidad de Shannon (H’) y Simpson (1-D). Se comprobó una compleja red de infecciones simples y mixtas de begomvoirus en tomate y pimiento en el NOA.

La diversidad de patrones de RCA-RFLP demuestran una compleja red de infecciones simples y mixtas de begomovirus en tomate y pimiento en la región del NOA.

2.4. PNCYO 1127023. Contaminación con micotoxinas en grano de cereales y oleaginosas en pre y poscosecha: identificación de situaciones de riesgo, desarrollo de pronósticos con base meteorológica y de buenas prácticas de manejo, internalización territorial.

Coordinador: Ricardo Moschini

Unidad Sede: Instituto de Clima y Agua

2.4.1.Acción. Identificación de situaciones de riesgo en precosecha, internalización de la problemática y medidas de manejo para reducir la contaminación con aflatoxinas en grano de maíz

Responsable: María de la Paz Giménez Pecci (IPAVE)

Participantes: I.G. Laguna (IPAVE-CONICET), B. Camiletti (IPAVE-FAC.UNC), F. Maurino (IPAVE-CONICET), M. Vicondo (IPAVE), M. Druetta (IPAVE-EEA Quimilí), J. Raspanti (IPAVE), M. Ferrer Lanfranchi (IPAVE), E. Ruiz Posse (FCA.UNC), E. Lucini (FCA.UNC)

Pudrición de la espiga de maíz por Aspergillus sp.

Obtención de muestras de maíz. Las muestras procedieron de zonas ubicadas en

cercanías a las localidades de Manfredi, General Paz, Jesús María, Cañada de Luque, Despeñaderos y Pampa de Pocho, dentro de la provincia de Córdoba; La Abrita y Sachayoj en la provincia de Santiago del Estero, y Videla, en la provincia de Santa Fe. Cada una estuvo compuesta por 10 mazorcas en estado de grano duro, cosechadas al azar dentro de un mismo lote y transportadas en bolsas para su posterior análisis (Sevúlpeda y Piontelli, 2005). Para las muestras 07 y 09 se colectaron mazorcas con síntomas o sospecha de pudrición. Las muestras fueron colocadas en estufa con circulación de aire forzada a 38ºC durante 72 h hasta que la semilla alcanzó un contenido de humedad del 10% aproximadamente (Quezada et al, 2011). Cuatro espigas de cada muestra fueron trilladas para medir la humedad de sus granos con una balanza higrométrica portátil de alta precisión DelverHD1D21J. Ambas fracciones fueron conservadas a 4ºC. Tabla 1.

(9)

9 Tabla 1. Muestras de mazorcas colectadas para el aislamiento de Aspergillus sp.

Nº Ingreso Provincia Localidad Coordenadas geográficas Cultivar

01 24/06/2013 Sgo del Estero Sachayoj 26⁰ 26´12,5´´ S 61⁰56´21,6´´ O Dow Tropical x Templado

02 24/06/2013 Sgo del Estero Sachayoj 26⁰ 23´0,2´´ S 62⁰0´56,8´´ O Dow Tropical x Templado

03 24/06/2013 Sgo del Estero Sachayoj 26⁰ 26´12,5´´ S 61⁰56´13,7´´ O 747 DK Templado

04 24/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 51´27, 37´´ S 63⁰45´23,66 ´´ O Pioneer 2053Y

05 24/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 51´27, 37´´ S 63⁰45´23,66 ´´ O 2775

06 28/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 52´37, 93´´ S 63⁰44´2,55 ´´ O Pioneer 1780 MG

07 28/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 52´37, 93´´ S 63⁰44´2,55 ´´ O Pioneer 1780 MG

08 28/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 52´37, 93´´ S 63⁰44´2,55 ´´ O NIDERA 852RRMG

09 28/06/2013 Córdoba Manfredi 31⁰ 52´37, 93´´ S 63⁰44´2,55 ´´ O NIDERA 852RRMG

10 01/07/2013 Córdoba Gral. Paz 31⁰ 11´30, 69´´ S 64⁰9´49,85 ´´ O DK747VT3 Pro

11 01/07/2013 Córdoba Jesús María 30⁰ 58´25, 41´´ S 63⁰59´54,32 ´´ O SPS Ciclo Interm. BT Clearfield

12 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O ACA468MGRR2

13 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O LT632MGRR2

14 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O Pisingallo

15 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O Don Mario 2749MGRR2

16 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O Dow 2ª120HXRR2

17 05/07/2013 Córdoba Cañada de Luque 30⁰ 44´21, 98´´ S 63⁰38´17,94 ´´ O DK747VT3 Pro

18 29/07/2013 Córdoba Despeñaderos 31⁰ 48´38, 50´´ S 64⁰20´51,50 ´´ O Agriseed AG 9008 TD Max

19 01/08/2013 Córdoba Pampa de Pocho 31º 27´19,6´´ S 65º16´18,7´´ O MC 210 Baya Casal

20 13/11/2013 Sgo del Estero La Abrita 28º 02´30´´ S 64º23´13´´ O Pioneer P1780Y

21 13/11/2013 Sgo del Estero La Abrita 28º 02´30´´ S 64º23´13´´ O Pioneer P3115H Tr 4 RII

22 13/11/2013 Sgo del Estero La Abrita 28º 02´30´´ S 64º23´13´´ O Monsanto DK 747 VT3P

23 13/11/2013 Sgo del Estero La Abrita 28º 02´30´´ S 64º23´13´´ O Pioneer 30F35H

24 18/11/2013 Santa Fe Videla 28º 02´30´´ S 64º23´13´´ O Germoplasma comercial

Aislamiento de la micobiota natural de granos de maíz. El aislamiento de la

micobiota general fue realizado mediante la técnica de plaqueo directo con desinfección superficial. Se tomaron 100 granos de maíz de cada muestraque se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 2 min y lavaron tres veces con agua destilada estéril. Se colocaron 10 granos por placa.

Un grupo de 18 muestras (01 a 09 y 16 a 24) se plaquearon sobre dos medios de cultivo: diclorán rosa de bengala cloranfenicol (DRBC) (King et al., 1979, Pitt and Hocking, 1997) y diclorán- glicerol al 18% (DG18) (Hocking y Pitt, 1980). Las placas se incubaron durante siete días a 25ºC. Un segundo grupo de muestras (10 a 15) se sembraron en medio de DRBC con 3% de NaCl para favorecer el crecimiento de

Aspergillus flavus. Luego de la incubación se observaron macro y microscópicamente

las diferentes colonias (Tabla 2).

Tabla 2. Porcentaje de colonias obtenidas de la siembra de granos de las espigas cosechadas en los diferentes medios de cultivo

Muestra Nº % Incidencia Aspergillus % Incidencia Penicillium % Incidencia Fusarium 01 DG18: 7/50 DRBC: 0/50 DG18: 0/50 DRBC: 0/50 - 02 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 - 03 DG18:48/50 DRBC: 49/50 DG18:0/50 DRBC: 1/50 - 04 DG18: 00/50 DRBC: 00/50 DG18: 42/50 DRBC: 50/50 DG18: 50/50 DRBC: 50/50 05 DG18: 00/50 DRBC: 00/50 DG18: 20/50 DRBC: 30/50 DG18: 22/50 DRBC: 27/50 06 DG18: 00/50 DRBC: 00/50 DG18: 43/50 DRBC: 50/50 DG18: 50/50 DRBC: 02/50 07 DG18: 00/50 DRBC: 00/50 DRBC: 20/50 DG18: 45/50 DRBC: 45/50 08 DG18: 00/50 DRBC: 00/50 DG18: 50/50 DRBC: 50/50 DG18: 50/50 DRBC: 50/50 09 DRBC: 01/50 DG18: 00/50 DG18: 50/50 DRBC: 05/50 DG18: 50/50 DRBC: 01/50

10 DRBC3%NaCl: 00/50 DRBC3%NaCl: 17/50 DRBC3%NaCl: 26/50

12 DRBC3%NaCl: 01/50 DRBC3%NaCl: 00/50 DRBC3%NaCl: 50/50

(10)

10

15 DRBC3%NaCl:01/50 DRBC3%NaCl: 00/50 No observado

16 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 17 DG18:01/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 18 DG18:1/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 19 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 20 DG18:1/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 21 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 22 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado 23 DG18:1/50 DRBC: 0/50 DG18:1/50 DRBC: 0/50 No observado 24 DG18:0/50 DRBC: 0/50 DG18:0/50 DRBC: 0/50 No observado

Identificación de las especies de Aspergillus aisladas de granos de maíz. Para la

identificación de especies del género Aspergillus, se subcultivaron en agar extracto de malta (MEA) (Pitt &Hocking, 2009) durante 7 días a 25ºC para su posterior identificación en especies (Pitt y Hocking, 2009). A partir de cada cepa desarrollada en MEA, se realizó una suspensión de conidios en 0,5 ml de agar semisólido (Pitt &Hoking, 2009) y, desde allí, se inocularon con ansa “en punta” las placas de Petri con los medios de cultivo MEA, Czapek yeast extract agar (CYA) y Czapek yeast extract agar con 20% sacarosa (CY20S) (Pitt & Hocking, 2009) en tres puntos equidistantes entre sí y del borde de la placa para luego ser incubados a 25 y 37ºC como se indica en la Figura 1. Todas las placas se observaron después de un período de incubación de siete días. Las características macroscópicas observadas fueron: color de las colonias, diámetro de las colonias, color del micelio, formación de esclerocios, formación de cleistotecios, color del reverso y presencia de exudados. Las características microscópicas a observar fueron: presencia de fiálides y/o métulas en el conidióforo, longitud y rugosidad del estipe y, por último, diámetro y forma de los conidios (Klich, 2002).

Figura 1. Esquema de inoculación para la identificación de especies del género Aspergillus (Klich, 2002; Pitt y Hocking, 2009).

Una vez registradas las características macroscópicas y microscópicas de las cepas crecidas en diferentes medios de cultivo se procedió a identificar la especie mediante la clave taxonómica para la identificación de especies del género Aspergillus descripta por Klich (2002).

Resultados

Las colonias aisladas de las muestras 03, 09, 12, 15 y 20 fueron determinadas como cepas de la especie Aspergillus flavus. Estos aislamientos colectados en dos localidades de la Pcia de Córdoba y dos localidades de la Pcia. de Santiago del Estero se mantienen en cultivo.

(11)

11

Bibliografía

Hocking, A.D. and Pitt, J.I. 1980.Dichloran-glycerol medium for enumeration of xerophilic fungi from low moisture foods. Appl. Environ. Microbiol. 39: 488–492. En Pitt, J. I and Hocking, A. D. 2009.Fungi and Food Spoilage.Springer. New York, USA. 519 pp.

King, A.D., Hocking, A.D. and Pitt, J.I. 1979.Dichloranrosebengal medium for enumeration and isolation of molds from foods. Appl. Environ. Microbiol. 37: 959–964. En Pitt, J. I and Hocking, A. D. 2009.Fungi and Food Spoilage.Springer. New York, USA. 519 pp.

Pitt, J.I. and Hocking, A.D. 1997.Fungi and Food Spoilage, 2nd edn. London: Blackie Academic and Professional. En Pitt, J. I and Hocking, A. D. 2009.Fungi and Food Spoilage.Springer. New York, USA. 519 pp.

Pitt, J. I and Hocking, A. D. 2009.Fungi and Food Spoilage.Springer. .CSIRO Division of Food Science and Technology Sydney Accademic, Press.Australia. Tercera edición New York, USA. 519 pp.

Klich M.A. (2002). Identification of common Aspergillus species. Centralalbureauvoor Schimmelculturea, Utrecht, The Netherlands.

Quezada-Viay M.Y., Flores-Oliva A., Arrúa-Alvarenga A.A., Vázquez-Badillo M.E., Moreno-Martínez E.(2011). Resistencia de plantas de maíz a la infección por

Aspergillus flavus Link en Invernadero. Revista Agraria-Nueva Epoca- Año VIII. Vol. 8. No. 2. Mayo-Agosto 2011.

2.5. PNCYO 1127034. Evaluación y desarrollo de sistemas de manejo integrado de las plagas en cultivos de cereales y oleaginosas.

Coordinador: Jorge Frana Unidad Sede: EEA Rafaela

2.5.1. Acción. Evaluación de resistencia y tolerancia de cultivares de trigo al complejo de virus transmitidos por el ácaro Aceria tosichella

Responsable: Vanina Alemandri. [email protected] (IPAVE)

Participantes: G. Truol, S.M. Rodríguez, A. Dumón, E. Argüello Caro (IPAVE).

En Argentina se han detectado, hasta el momento, ocho virus en trigo, entre ellos,

Barley stripe mosaic virus (BSMV), Wheat streak mosaic virus (WSMV) y Wheat mosaic virus (WMoV) (anteriormente conocido como High Plains virus, HPV y

actualmente propuesto como Maize red stripe virus, MRSV). WSMV y WMoV son naturalmente transmitidos por el ácaro Aceria tosichella Keifer (Wheat Curl Mite = WCM), detectado en nuestro país en el año 2004, dos años después de la detección de WSMV. Entre las principales estrategias para el manejo de estas enfermedades se destaca la utilización de genotipos de trigo con resistencia o tolerancia a estas virosis. Desde el momento de su identificación, WSMV en 2002, y WMoV en 2006, se han realizado trabajos sobre incidencia y prevalencia de cultivares en diferentes subregiones trigueras y según fechas de siembra, evaluación de malezas reservorios, porcentaje de transmisión por semilla, ajuste de técnicas de diagnóstico, y desarrollo de nuevo germoplasma de trigo incluyendo diferentes líneas parentales como donantes de genes de resistencia a estas virosis. Por otra parte, BSMV cobra importancia en el marco de las exportaciones por su forma de transmisión, ya que es uno de los virus más eficientemente transmitidos por semillas, lo cual requiere de un relevamiento constante en las zonas productoras y de minuciosos análisis, registrándose en las últimas

(12)

12 campañas diversos cultivares afectados. En este proyecto se avanzará con los estudios para el complejo de virus transmitidos por ácaros ya iniciados en el año 2006. Se estudiará el nivel de resistencia o tolerancia al complejo de virus transmitidos por A.

tosichella de cultivares de trigo disponibles actualmente y de los que serán

desarrollados por otros grupos de investigación utilizando herramientas biotecnológicas. Se incorpora, además, la temática de BSMV con la evaluación de susceptibilidad al virus, y porcentaje de transmisión por semilla en infecciones naturales. En esta campaña, se realizaron muestreos al azar en parcelas de la Red Nacional de Evaluación de Cultivares de Trigo (RET) para la evaluación de la presencia de virus, su incidencia y porcentaje de transmisión por semilla de WSMV y BSMV. Así mismo, se cosechó la semilla en un lote de trigo del cultivar Biointa 3005 infectado con WSMV en la localidad de Leones (Córdoba) y se analizó el porcentaje de transmisión por semilla y el poder germinativo. Se sembraron las semillas y se analizaron 1500 plantulas en 100 grupos de 15 plantas cada uno mediante serología. El 2% de los grupos de 15 plantas resultó positivo para WSMV. Por otra parte, se realizaron cuatro repeticiones de 100 semillas sobre papel de filtro humedecido en un germinador con tapa y a 20 ºC constante para evaluar el poder germinativo. Del mismo modo, se analizaron las semillas sanas del mismo cultivar. Luego se realizó un recuento de las semillas germinadas a los 8 días. Las semillas enfermas expresaron un promedio de germinación del 60% y las enfermas del 87% .

2.5.2. Acción. Prospección y detección de virus y mollicutes emergentes y prevalentes en cultivos de maíz de territorios templados y subtropicales

Responsable: María de la Paz Giménez Pecci, gimenez.Marí[email protected] (IPAVE)

Participantes: F. Maurino, I.G. Laguna, M. Ferrer Lanfranchi, J. Raspanti (IPAVE), M. Druetta (IPAVE-EEA Quimilí), M.P. Ruiz Posse (IPAVE)

Presencia, prevalencia e incidencia de Spiroplasma kunkelii (CSS) y Mal de Río

Cuarto virus (MRCV)

a) Distribución de CSS y MRCV en cultivos de maíz en la campaña 2012/13. La

continuidad geográfica de los cultivos, desde el extremo norte del país hasta la zona agrícola núcleo e incluso hasta las puertas de la Patagonia, que se ha generado durante la última década en Argentina, plantea un contexto diferente al analizado hasta el momento en el análisis de la epidemiología de las enfermedades de los cultivos.

Las barreras que antes podían estar actuando, tal como los ambientes naturales con inexistencia de cultivos de una amplia franja del centro del país, impidiendo el paso de inóculo desde una zona a otra, se fueron reduciendo hacia el oeste de esta franja y quebrando hacia el este, debido al empleo de las nuevas tecnologías y estrategias de manejo que permitieron que la agricultura avanzara sobre tierras antes dedicadas a la ganadería o pastizales y monte natural.

Actualmente pueden plantearse dos corredores agrícolas con orientación N-S en el área subtropical del país: uno al pie del sistema montañoso del oeste (Umbral al Chaco: Salta, Jujuy, Tucumán, este de Catamarca, oeste de Santiago del Estero) y otro en la región del Chaco subhúmedo (Formosa, centro del Chaco, este de Sgo del Estero, oeste de Santa Fe). Este último corredor agrícola se prolonga en la zona de transición del clima subtropical al templado (centro de Santa Fe, SO de Sgo. del Estero y norte de Córdoba), también de reciente desarrollo en la agricultura, que desemboca directamente en la zona maicera núcleo templada (Figura 1).

(13)

13 Figura 1. Corredores agrícolas del oeste de Argentina y del Chaco subhúmedo, que dan

continuidad geográfica N-S a los cultivos de maíz en el país. Mapa http://geointa.inta.gov.ar/

Figura 2. Plantas de maíz con Achaparramiento del maíz (Spiroplasma kunkelii) (derecha) y con

Mal de Río Cuarto virus (MRCV) (izquierda)

A esta continuidad geográfica actual de las tierras cultivadas se agrega la del germoplasma empleado en estas zonas de transición entre el subtrópico y la zona templada. Esta situación ha permitido el avance de las enfermedades del norte hacia el sur y viceversa.

Este es el caso de las enfermedades del maíz transmitidas por vectores: Mal de Río Cuarto y Achaparramiento (Figura 2); una viral y la otra causada por un mollicute (procarionte), ambas son transmitidas por chicharritas auquenorrincos.

La característica principal que se observa en los cultivos de maíz ubicados en las zonas de avance de estas dos enfermedades, es que las plantas afectadas presentan muy escasa sintomatología, que no es detectada fácilmente, aún bajo mirada experta, en la actualidad.

(14)

14 Sin embargo, las plantas afectadas no tienen producción o la misma está reducida. La serología permite detectar la presencia de estas enfermedades, conocer su incidencia (porcentaje de plantas afectadas en un lote) y prevalencia (porcentaje de lotes con al menos una planta enferma en una zona). Los resultados del período agrícola 2012/2013 son presentados en las Figuras 3 y 4.

Figura 3. Presencia e incidencia del achaparramiento del maíz causado por

Spiroplasma kunkelii (CSS), en lotes de maíz

de la campaña 2012/13, determinado por serología.

Figura 4. Presencia e incidencia del Mal de Río Cuarto (MRCV), en lotes de maíz de la campaña 2012/13, determinado por serología.

En la Figura 3 se observa que el achaparramiento está afectando los cultivos en las provincias de Santiago del Estero, Chaco, Tucumán y Córdoba, registrándose la mayor incidencia en Santiago del Estero con 63%. En la Figura 4 se observa la presencia del Mal de Río Cuarto en Salta, Tucumán y Córdoba, con registros de mayores valores de incidencia en Córdoba (17%).

Se ha prevenido a la comunidad agropecuaria sobre estas dos enfermedades y se dispone de mapas actualizados para ser ofrecidos a la comunidad interesada.

Mal de Río Cuarto virus y Spiroplasma kunkelii están presentes en todo el territorio

agrícola del país, siendo en el norte marcadamente evidente el achaparramiento y en la zona pampeana mucho más severo e importante el Mal de Río Cuarto Virus. Ambos patógenos se han detectado desde la localidad de Yaví en la Provincia de Jujuy hasta Hilario Ascasubi, en el sur de la Provincia de Buenos Aires.

b) Estudio comparativo de cuatro períodos agrícolas sobre la incidencia y prevalencia de Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y Spiroplasma kunkelii (CSS) en muestras de maíz analizadas mediante serología (campañas 2009/10 a 2012/13). Es posible encontrar a ambas enfermedades a lo largo de todo el país, que se manifiestan con diferentes niveles de intensidad dependiendo de la zona y las condiciones ambientales de las diferentes campañas. Para evaluar su intensidad se determinan los valores de prevalencia: porcentaje de lotes con presencia de la enfermedad (con al menos una planta enferma) en una zona determinada, e incidencia: es el porcentaje de plantas enfermas en un lote. El término incidencia máxima hace referencia al mayor valor de incidencia encontrado para una campaña. En el cuadro 1 se observan los valores de estos índices para las tres últimas campañas (2010/11 – 2012/13).

(15)

15 Los máximos valores de prevalencia e incidencia de MRCV en estos años fueron alcanzados durante la campaña 2010/11 para ambas zonas. Ambos índices fueron disminuyendo durante los tres años considerados. En la primer y segunda campaña, MRCV presentó mayor prevalencia en la zona templada, mientras que durante la última, las dos exibieron valores muy similares (83%) (Figura 5; Gráfico A). En cuanto a la Incidencia máxima de este patógeno la zona templada presentó mayores valores que la subtropical en todas las campañas consideradas. (Figura 5; B).

A B

C D

Figura 5. Prevalencia e incidencia de Spiroplasma kunkelii (Corn stunt spiroplasma, CSS) y Mal

de Río Cuarto virus (MRCV) analizados por serología en cultivos de maíz durante las ultimas

tres campañas (2010/11; 2011/12; 2012/13). A: prevalencia de MRCV; B: Incidencia de MRCV; C: prevalencia de CSS; D: incidencia de CSS.

Durante la primera campaña, la prevalencia de CSS fue superior en la zona templada, presentando un valor muy bajo en la subtropical. En la siguiente se presentaron

valores muy similares en ambas regiones, mientras que en la última campaña

muestreada, la zona subtropical mantuvo la misma prevalencia que el año anterior, el que fue menor en la zona templada (Figura 5; C). La incidencia máxima para CSS en la zona subtropical, se registró en la presente campaña (2012/13), siendo muy superior al valor determinado en la templada. En la campaña anterior (2011/12) la zona

templada registró el mayor valor, mientras que en la primer campaña los valores fueron similares para ambas 2 regiones. (Figura 5; D).

c) Muestreos de delfácidos en avena y bordura en la región endémica de MRCV.

Recordando que en la última campaña (2012/13) se apreció un grado diferente de infestación en la zona norte respecto a la infestación en la zona centro y sur de la parcela experimental localizada en Suco, Provincia de Córdoba, en la presente campaña se muestreó la parcela experimental (avena nueva) en dos zonas: norte y sur, con muestreos en cada una de ellas. Los de la bordura se efectuaron sobre dos puntos: avena implantada los primeros días de octubre (bordura 2), (bordura 1). Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Zona Subtropical Zona Templada

2010/11 2011/12 2012/13 Campaña 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 Pre va le n ci a MR C V (% ) 57,0 14,0 9,3 75,0 39,0 9,1 57,0 14,0 9,3 75,0 39,0 9,1

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

2010/11 2011/12 2012/13 Campaña 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 In ci d e n ci a Ma xi ma MR C V (% ) 60 8 4 83 23 17 60 8 4 83 23 17

2010/11 2011/12 2012/13 Campaña 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 Pre va le n ci a C SS (% ) 0,9 14,0 14,0 24,0 13,0 9,0 0,9 14,0 14,0 24,0 13,0 9,0

2010/11 2011/12 2012/13 Campaña 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 In ci d e n ci a Ma xi ma C SS (% ) 10,00 3,00 63,00 8,00 10,00 6,25 10,00 3,00 63,00 8,00 10,00 6,25

C D

(16)

16 Se realizaron siete muestreos comenzando la última semana de octubre y el lote se visitó para tomar muestras de plantas en dos momentos: 1- Durante el establecimiento de la población de delfácidos, y 2- en febrero, para observar sintomatología y tomar las muestras para estudios de fitomejora.

Figura 6. Presencia de delfácidos en muestreos de Avena sativa L. y bordura (1: avena guacha y malezas; 2: avena granada) en parcela experimental de Suco, Provincia de Córdoba, entre el 21 de octubre y 09 de diciembre de 2013. A.N. Norte: avena nueva norte, A.N. Sur: avena nueva sur. La siembra de maíz para infección natural se realizó el 09/12/2013, cuando la población de delfácidos estuvo compuesta en su mayoría por estados adultos, predominando los macrópteros (adultos con capacidad de dispersión), indicando el fin de la colonización y comienzo de la dispersión de la misma. A siembra, las poblaciones de delfácidos, en ambos bloques, fueron muy similares (30 individuos bloque sur y 24 bloque norte). Se están desarrollando la toma de muestras sospechosas o sintomáticas, para corroborar relación síntomas-infección (aprox.10) y de muestras al azar de las parcelas elegidas, así como los análisis serológicos para determinar el porcentaje de infección de MRCV. 2.6. PNCYO 1127045. Obtención y Desarrollo de Germoplasma Experimental y

Cultivares de Oleaginosas

Coordinador: Daniel Alvarez Unidad Sede: EEA Manfredi

2.6.1. Acción. Búsqueda de resistencia y tolerancia genética en girasol al Sunflower

chlorotic mottle virus (SuCMoV)

Responsable: Fabián Giolitti, [email protected] (IPAVE)

Participantes: F. Giolitti y V. Trucco (IPAVE). M.l Cantamutto y M. Poverene (Univ. Nac. del Sur). D. Alvarez y D. Cordes (EEA Manfredi)

Se sembraron 14 entradas de girasol compuestas por híbridos entre materiales silvestres y destacados del banco de germoplasma de la EEA-Manfredi, más un control de inoculación (híbrido susceptible al virus, Advanta). Las semillas fueron sembradas a Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil A.N. Norte A.N. Sur Bordura 1 Bordura 2

294 302 308 322 331 336 342

Fecha (días julianos)

0 25 50 75 100 125 150 N º d e d e lf á ci d o s 23 24 51 30 14 7 23 24 51 30 14 7 A.N. Norte A.N. Sur Bordura 1 Bordura 2

21 oct 29 oct 04 nov 18 nov 27 nov 02 dic 09 dic Fecha (calendario)

(17)

17 campo, en macetas protegidas en jaula anti-insectos. Cuando todas las plantas presentaban el primer y/o segundo par de hojas verdaderas bien desarrolladas se las inoculó mecánicamente usando una pistola a presión (5-8 bar). Como inóculo se usó un extracto de hojas de girasol con síntomas sistémicos de la enfermedad, macerado 1/10 en tampón de inoculación (0.01M Na2HPO4, pH 7 + 0.1% Na2SO3) y filtrado con gasa.

Se adicionó carburo de silicio como abrasivo. Muestras del material inoculado fueron evaluados serológicamente (DAS-ELISA) 30 días después de la inoculación, para establecer si la sintomatología observada era causada por el SuCMoV y para descartar que las plantas inoculadas para asintomáticas estuvieran crípticamente infectadas. Los porcentajes de infección variaron entre 33 a 100%, detectándose la manifestación de dos tipos de síntomas diferenciales (común y atenuado) (Figura 1) y plantas inmunes a la enfermedad (Tabla 1). Las plantas asintomáticas (inmunes) podrían actuar como fuente de resistencia/tolerancia genética a la enfermedad.

Tabla 1: porcentajes de infección y tipo de síntoma por entrada de girasol evaluada.

ID Nº pl. sin síntomas / Nº de pl. evaluadas Nº pl. síntomas común Nº pl. con síntomas atenuado % de infección 1 1/7 - 6 85,71 2 0/2 - 2 100 3 1/9 7 1 88,89 4 3/7 2 2 71/43 5 0/8 4 4 100 6 0/10 10 - 100 7 0/8 6 2 100 8 2/10 - 8 100 9 1/10 2 7 100 10 4/5 - 1 80 11 1/6 - 5 83,33 12 1/10 - 9 90 13 0/10 1 9 100 14 2/3 - 1 33,33 Control 0/20 20 - 100

Figura 1: plantas de girasol inoculadas con el SuCMoV a) síntoma común y b) síntoma atenuado.

(18)

18 2.7.PNFRU 1105072. Generación y desarrollo de tecnologías para minimizar el

riesgo de introducción de plagas cuarentenarias ausentes y asegurar el manejo eficiente de plagas cuarentenarias presentes

Coordinador: Mirta Rossini Unidad Sede: EEA Alto Valle

2.7.1.Acción. Estudio epidemiológico del patosistema Plum pox virus en frutales de carozo de San Juan y Mendoza

Responsable: Angélica Dal Zotto [email protected] (IPAVE)

Participantes: J.M. Raigón, D. Marini, R. Farrando, L. Porcel, E. Mazzitelli y M. Rossini

Estudios epidemiológicos del virus de la enfermedad de sharka, se continuaron en San Juan según lo planteado en la cartera 2009, mediante los relevamientos de fincas productoras de ciruelo japonés Prunus salicina susceptible a Plum pox virus seleccionadas en 2009. Además, en esta línea, se incorporó un estudio similar en un monte de ciruelos europeos Prunus domestica cv D´agen de la localidad de San Rafael en Mendoza.

Los objetivos de esta acción son:

1-Estudiar la dispersión espacial y temporal del virus PPV en montes de ciruelo susceptibles por análisis serológicos (DAS-ELISA), identificados alrededor de áreas donde el virus ha sido detectado previamente.

2-Identificar las especies vectoras de PPV involucradas en la dispersión del virus.

Muestreo de fincas de ciruelo japonés en San Juan. El área de trabajo se ubicó entre

los 10 a 40 km del área foco inicial de infección (Dpto Pocito), determinándose en función de la presencia de fincas con ciruelos en producción, cuatro zonas o áreas de relevamiento:*Zona Norte: Dpto Albardón (cuatro fincas), *Zona NO: Dpto Ullúm (una finca)*Zona NE: Dpto San Martín (dos fincas) *Zona Oeste: Dpto Zonda (dos fincas). Se implementó el muestreo jerárquico propuesto por Hughes et al. 2002, al cual se le realizaron modificaciones y las plantas se analizaron para PPV mediante DAS-ELISA. Por cada finca se delimitaron lotes de 400 plantas y se tomaron 100 plantas en grupos de cuatro (cuadrado de 2 x 2), lo cual constituyo 25 unidades experimentales (u.e) por lote. Se evaluaron nueve lotes en total.

Análisis estadístico aplicado al estudio de la incidencia de sharka. Para evaluar la

incidencia de sharka en los lotes muestreados se consideró cada nivel jerárquico establecido por separado. Se determinaron lotes positivos para PPV y se estimó la incidencia del virus mediante tablas de contingencia en dos niveles jerárquicos: 1º nivel entre grupos de árboles dentro del lote, y 2º nivel jerárquico, entre todos los grupos de todos los lotes (225 grupos) (entre lotes), utilizando el software estadístico InfoStat.

Los resultados del análisis realizado en 2013 indicaron:

o Nivel jerárquico entre grupo de árboles dentro del lote: Los análisis serológicos por DAS-ELISA efectuados en 2013 en las fincas seleccionadas, indicaron la presencia de PPV en ciruelo Prunus salicina cv Red Beauty, en los lotes que ya habían resultado positivos para PPV en 2012. De los nueve lotes evaluados, dos resultaron positivos (11 u.e) pertenecientes al dpto Albardón, uno con ocho u.e positivas y el otro con tres u.e positivas.

(19)

19 o Nivel jerárquico entre lotes: involucramos Incidencia en lotes y el número de

grupos a través de todos los lotes, utilizando la incidencia entre lotes (225 u.e) que se mide como la cantidad de grupos enfermos o PPV(+) a través de todos los lotes, sobre el total de grupos evaluados teniendo en cuenta todos los lotes. Entre todos los lotes muestreados resultaron 11 unidades experimentales positivas. La incidencia de sharka entre todos los lotes muestreados el quinto año (2013) (de los cuales dos resultaron positivos) fue del 0,04.

Relevamiento de vectores en la región NE de San Juan. En trampas amarillas de

agua para insectos, colocadas en la AER del Dpto San Martín, durante la primavera-verano del 201, para la recolección semanal de áfidos vectores de sharka, se detectaron las especies de áfidos Myzus persicae, Brachycaudus helychrysi, Aphis craccivora, y

Aphis sp igual que en 2012 . Las mismas son consideradas vectoras de PPV.

En un lote de 750 plantas (marco de plantación de 3 x 4 m), se analizaron todas las plantas del lote por la técnica de DAS- ELISA (Bioreba) para PPV entre 2007 y 2011. Los resultados de los análisis serológicos, se tomaron para comparar los niveles de incidencia de la enfermedad entre los cinco años mediante un modelo generalizado mixto. Los porcentajes de incidencia acumulados fueron de 2,7 % (2007), 4,5 % (2008), 6,4 % (2009), 6,9 % (2010) y 8,3 % (2011), Figura 1. El análisis de la dispersión espacial del virus está siendo evaluado mediante los estadísticos K de Ripley y Join count.

Figura 1. Incidencia acumulada del PPV durante cinco años de estudio

2.8.PNFRU 1105073. Generación y desarrollo de tecnología para la detección, seguimiento, predicción, prevención y control de vectores, plagas emergentes y/o limitantes de la producción frutícola argentina

Coordinador: Gonzalo Segade Unidad Sede: EEA San Pedro

2.8.1.Acción. Prospección de plantaciones de fruta fina para el estudio de la presencia de patógenos sistémicos

Responsable: Angélica Dal Zotto, [email protected] (IPAVE)

Participantes: C. Cobello, A. Cardozo

El objetivo de este estudio es evaluar la condición sanitaria de las plantaciones de fruta fina: frambuesa (Rubus ideaus), mora (Rubus fruticosus), mora hibrida (Rubus

loganobaccus), grosellero (Ribes rubrum),y arándano (Vaccinium sp.) que se producen

2007 2008 2009 2010 2011 Year 0 2 4 6 8 10 In ci d e n ce ( % )

(20)

20 en el sur de Argentina, en la Región de la Comarca Andina de El Bolsón, Lago Puelo, El Hoyo y Epuyén. Estas especies son susceptibles a patógenos que producen enfermedades sistémicas afectando la producción, rendimientos y cosecha de frutos. En diciembre de 2013, se realizó un relevamiento de fincas de la localidad de El Bolsón, en las cuales se encontraron plantaciones de moras y frambuesas con síntomas de clorosis internerval, y generalizada en forma de manchones entre las filas. Se tomaron muestras a los fines de evaluar la presencia de patógenos virales.

2.8.2.Acción. Prospección de los viroides Peach latent mosaic, Apple scar skin y

Peach latent mosaic en manzanos, perales y duraznos en Argentina

Responsable: Claudia Nome, [email protected] (IPAVE)

Los viroides Apple scar skin viroid (ASSVd) y Pear blister canker viroid (PBCVd), afectan a cultivos de manzano y peral, disminuyendo la calidad comercial de sus frutos y reduciendo la vida útil de los árboles. Ante el informe de SENASA de su primera detección en la provincia de Río Negro por parte del INTA, en el año 2011, se inició un trabajo conjunto entre ambos organismos, con el objetivo de verificar la condición de estas plagas consideradas, hasta ese momento, cuarentenarias ausentes para la Argentina. En este marco, personal de SENASA realizó el muestreo sistemático de hojas en cultivos de peral y manzano, en las principales zonas productoras de estas especies, durante los meses de marzo de 2012 y febrero y marzo de 2013. Las muestras fueron analizadas en el Instituto de Patología Vegetal del INTA. Se tomaron en total 278 muestras (127 en 2012 y 151 en 2013), distribuidas en las provincias de Mendoza (108), San Juan (ocho), Río Negro (140), Neuquén (doce) y Misiones (diez). Diecinueve muestras de peral, resultaron positivas para PBCVd en las provincias de Mendoza, San Juan y Río Negro y cuatro fueron positivas para ASSVd en San Juan y Río Negro, en tanto que tres muestras de manzano resultaron positivas para ASSVd en Mendoza. De acuerdo con estos resultados, se modificó la condición fitosanitaria relativa a los viroides ASSVd y PBCVd en la Argentina, que actualmente se consideran plagas presentes.

2.8.3. Acción. Diagnóstico de enfermedades del Pecán

El cultivo del pecán es relativamente reciente en la República Argentina, pero su superficie cultivada se expande rápidamente, localizándose en regiones templadas con abundantes precipitaciones como el litoral argentino, la pampa húmeda y el NOA. El inicio del cultivo ha significado también la aparición de enfermedades relacionadas con el mismo. Durante 2012 se comenzaron los estudios de una nueva sintomatología observada en los pecanes de a región de La Plata (Figura 1). Este material fue analizado por personal del IPAVE y se concluyó que la patología no era de origen viral. Las corridas electroforéticas en geles de poliacrilamida confirmaron la presencia de un viroide. En el marco de una pasantía, con el Prof. Ricardo Flores de la Universidad Politécnica de Valencia, España, se trabajó en este tema, y se concluyó que se trata de un nuevo viroide. Los estudios se están realizando en forma conjunta. Debido a la relevancia que presenta este cultivo para el país y la inexistencia de estudios realizados sobre estas sintomatologías se plantea abordar su estudio y dilucidar su importancia.

(21)

21 ..

Figura 1. Hojas de pecán infectados con el viroides en estudio. Con síntomas de clorosis y mosaico cálico

2.8.4. Acción. Viroides de la vid

En diferentes países se han reportado cinco viroides en el cultivo de vid: Grape vine

yellow speckle I y II (GYSVd I y II) y Australian grapevine viroid (AGVd), exclusivos

del cultivo de vid, y una variante del Hop stunt viroid (HSVd-g) y Citrus exocortis

viroid (CEVd-g) que están dispersos en diferentes cultivos.

La coinfección de GSVd I y II ocasiona la enfermedad de la mancha amarilla (Yellow speckle disease) que suele causar síntomas de puntos amarillos o manchas amarillas dispersas en las hojas. El problema se acrecienta frente la presencia del virus Grapevine

fanleaf, al coexistir los tres agentes infecciosos ocurre un sinergísmo que deriva en un

severo daño en las nervaduras de las hojas.

Los viroides CEVd y HSVd, si bien producen infecciones asintomáticas en el cultivo de vid, pueden infectar otros cultivos como cítricos y hortícolas, es por ello que se considera de esta manera fuente de difusión a cultivos anexos.

La transmisión de estos agentes se produce principalmente por daños mecánicos, como por ejemplo herramientas de cosecha. Los viroides GYSVd I y II, AGVd, y CEV pueden ser transmitidos por semilla.

En Argentina, se han detectado los viroides Citrus exocortis viroid (CEVd), Hop stunt

viroid (antes Citrus viroid II) en citricos, no obstante la presencia de los mismos en vid

no ha sido evaluada aún. Resta realizar estudios de dispersión y severidad de los aislamientos locales detectados, y evaluar la existencia de los restantes. Para lograrlo se cuenta con un plásmido con los insertos de AGVd, HSVd y GYSVd. A partir del mismo se realizará una polisonda. También se cuenta con sonda para CEVd. Esta línea se planea ejecutar conjuntamente con SENASA. Los muestreos no se han ejecutado aún. Durante el 2013 se recuperó el plásmido con la sonda enviado por el Dr. Zhang Zhixiang del Instituto de protección vegetal, Beijing, China. El plásmido fue enviado sembrando una microgotagota de DNA plasmídico sobre un papel de filtro whatman. A partir del mismo, se purificó el DNA sembrado, se clonó, multiplicó y purificó. En el 2014 se elaborará la sonda con el kit de DIG-RNA probe de Roche.

2.8.5. Acción. Evaluación de la tolerancia frente a Verticillium dahliae de variedades de olivo e identificación molecular de materiales promisorios

Responsable: María Laura Otero, [email protected] (IPAVE)

(22)

22 Una de las estrategias de manejo de la verticilosis consiste en la utilización de

variedades tolerantes. La evaluación del comportamiento varietal requiere el empleo de técnicas de diagnóstico altamente sensibles y específicas.

Se ajustó la técnica de análisis mediante PCR en tiempo real, qPCR – TaqMan para la detección de V. dahlieae en olivo.

La mezcla de la reacción de PCR se compuso por: Real master mix Buffer 2X (Applied Biosystems), Vdf 1 uM, Vdr 1 uM, sonda TaqMan 0,1 uM, ADN 2 ul, agua 3 ul en un volumen total de 20 µl.

Los iniciadores utilizados para la amplificación fueron los citados por Bilodeau

(2012):Vd-FCGTTTCCCGTTACTCTTCT y Vd-R GGATTTCGGCCCAGAAACT; la sonda: Vdhrc FAM [5′ 6-FAM] CACCGCAAGCAGACTCTTGAAAGCCA [3′

IB®FQ-ZEN] (IDT-Integrated DNA Technologies).

Se ajustaron algunos parámetros a las condiciones de trabajo de laboratorio, como la concentración de la sonda que se fijó en 0,1 µM. Las condiciones de ciclado que se utilizaron fueron: 95° C por 10min; y 55 ciclos de 95 °C por 15 seg, 60°C por 45 seg. Las pruebas se realizaron en un termociclador Corbett Rotor Gene 6000.

Para la validación del método de qPCR se consideraron los parámetros de: selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, rango de linealidad.

Se realizó la curva de calibración mediante diluciones seriales de ADN del hongo correspondientes a 1000 pg, 100pg, 10 pg, 1 pg , 100 fg, 10 fg y 1 fg, comprobando que la eficiencia de los iniciadores es de 94% con un R^2 de 0.99799, el límite de linealidad llega hasta 100 fg de ADN templado partiendo al menos menos de 1ng. El límite de detección se observó en 10 fg que fue cuando comenzó a existir variabilidad en las mediciones.

El método ajustado resulta altamente sensible y específico en el diagnóstico de V.

dahliae en pruebas de comportamiento varietal, como así también en diagnóstico de

materiales de vivero.

Referido a las pruebas de comportamiento varietal, se comenzó a trabajar con la inoculación de plantines de olivo con V. dahliae.

Los muestreos para identificación de materiales promisorios se realizaron en el departamento Cruz del Eje, Pcia de Córdoba. Los huertos prospectados de las localidades de Media Naranja, Las Playas, Paso Viejo y Guanaco Muerto, fueron elegidos según su composición varietal heterogénea y manejo cultural tradicional. Se detectaron, marcaron y geo referenciaron diez plantas/genotipo de olivo de buen estado sanitario respecto de las próximas con severos síntomas de verticilosis.

Las plantas/genotipos promisorios fueron identificados provisionalmente bajo la denominacion varietal de: Arauco, Arbequina, Manzanilla, Manzanilla Gigante, Frantoio, Farga y Nevadillo.

De un total de 30 estacas semileñosas de Farga Las Playas, Farga Romero, Frantoio 4 Soles y Manzanilla Gigante puestas a enraizar bajo condiciones controladas de luz y temperatura, se obtuvieron al menos 15 plantines con buen desarrollo para realizar las inoculaciones. Los plantines de cada genotipo/variedad, enraizados se inocularon con una suspensión de conidios (inóculo) activos Se inocularon siete plantas, cinco por cada variedad y dos controles con suspensiones del hongo.

Para la inoculación, se cultivó la cepa del hongo en medio caldo papa glucosa (CPG) y se cultivó a 25 ºC, en agitación a 150 rpm. A los siete días la suspensión obtenida se cuantificó en la cámara de Neubauer, ajustando el número de conidios por ml de suspensión a una concentración de 1 x 10 7 conidios/ml. Las plantas se descalzaron y