UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL FACTOR MASCULINO EN LOS TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA MEDIANTE INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE
ESPERMATOZOIDES
TESIS DOCTORAL
ELISA ESCALANTE BERMÚDEZ
MADRID 2015
Dña Antonia María Fernández Peralta, Catedrática de Genética del Departamento de
Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, y Dña Laura de la Fuente Bitaine, Coordinadora de la Unidad de Reproducción Humana del Hospital 12 de Octubre y Profesora Asociada de la Universidad Complutense de Madrid, certifican que Dña Elisa Escalante Bermúdez ha realizado, bajo su dirección, el trabajo de Tesis Doctoral
titulado: "Evaluación del factor masculino en los tratamientos de reproducción asistida mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides".
Revisado el presente trabajo, consideran que tiene la debida calidad para su presentación y defensa.
Dra. Dña. Antonia María Fernández Peralta Dra. Dña. Laura de la Fuente Bitaine
A Uxío
Caminante, son tus huellas el camino, y nada más;
Caminante, no hay camino, se hace camino al andar.
ANTONIO MACHADO
sólo lamento que no puedas verlopapá.
Gracias a la Dra. Fernández Peralta y a la Dra.dela Fuente Bitaine que me han guiado y acompañado durante el camino. Sin su ayuda la culminación de este proyecto no hubiera sido posible.
Gracias Juanjo y Toñi, por vuestra dedicación, porque fuisteis vosotros los que me introdujisteis en el mundo de la ciencia, los que me enseñasteis a desenvolverme en un laboratorio hace ya mucho, mucho tiempo. Por ser un ejemplo al que intentar parecerme, por vuestro cariño y por vuestro apoyo en este y en otros muchos momentos importantes de mi vida.
Gracias Laura por tu presencia, tu disponibilidad absoluta, por caminar conmigo por la vida, por la suerte de tenerte a mi lado.
Gracias a mis compañeras de trabajo por vuestrainmensa paciencia, por vuestra compresión, por vuestra generosidad infinita, por empujarme cuando me desanimaba.
Por los buenos ratos que pasamos juntas, por tantas risas y porque sois una parte importante de me guste mi trabajo.
Gracias Pilar por tu sensatez sin límites, por facilitarme tanto las cosas, por tus consejos y por tu apoyo constante, por disfrutar conmigo de los momentos buenos y apoyarme en los malos, por la suerte que tuve al conocerte.
Gracias Nerea por estar siempre dispuesta, por ayudarme en muchos momentos y aspectos de este trabajo, por sustituirme cuando no he podido estar en dos sitios a la vez y por asumir en muchas ocasiones mi trabajo con una sonrisa.
Gracias a mis amigos y a mis amigas por alegrarme la vida, por vuestro interés, por vuestra preocupación, por los miles de buenos momentos que hemos compartido.
A Bruno, a Marta y a Alicia porque hacéis mi vida mejor, por lo agradecida que estoy de que forméis parte de ella y por todo lo que nos queda por vivir juntos . A mis
amigas Isabel y Esther por todo lo que hemos vivido juntas, por poder contar con vosotras en los buenos momentos y en los no tan buenos y por la suerte que tuve de que aparecieseis un día en mi vida. A Cris, Jaime, Itziar y todo el resto de amigos y familiares por poder contar siempre con vosotros y por estar siempre a mi lado.
Gracias a mis padres por ser un ejemplo de esfuerzo y de trabajo y por apoyarme en todas los proyectos que he ido emprendiendo en la vida. Gracias a mis abuelos por su cariño infinito, porque todo lo que somos os lo debemos a vosotros.
Gracias a mi madre por ser un ejemplo, por lo orgullosa que me hacía sentir cuando era pequeña que fueras médico y lo que eso influyó en mis ganas de estudiar una carrera y de trabajar como tú y porque, sin ti, mamá, no sería quien soy.
Gracias a mi padre por llevarme hacia el mundo de la medicina, por ser un ejemplo de superación profesional, por insistir tanto y por la certeza de que te habrías sentido muy orgulloso de mí en este momento y hubieras disfrutado un montón con esto. Papá, si siguieras aquí, esto seguramente no habría sido tan largo, te echo muchísimo de menos y me hubiese encantado que estuvieras conmigo.
Gracias a mis hermanas por ser una parte tan importante en mi vida, porque los malos momentos son menos malos al dividirse entre tres y los buenos son mejores al multiplicarlos. Por la tranquilidad que me da saber que podría pediros cualquier cosa, porque todo es mejor al contar con vosotras, por lo que enriquecéis mi vida y porque yo iría al fin del mundo por vosotras. Por haber aprendido juntas a reírnos de todo y porque juntas podemos con todo.
Gracias a mi hermana Susana por ser una de las mejores personas que conozco, porque te he tenido siempre a mi lado, porque durante mucho tiempo estábamos siempre juntas y he tenido la suerte de compartir un montón de cosas contigo, por enriquecer, junto con Jose, nuestra vida con Julia y Alberto.
Gracias a mi hermana Virginia por todo el tiempo que me has dedicado,por cederme tu cerebro privilegiado durante tantas horas, por estar siempre dispuesta a
Gracias a Uxío, por tu apoyo y tu insistencia, por confiar siempre en mí, por recoger el testigo de mi padre y no dejarme flaquear. Por obligarme a relativizar, porque nada es tan grave y todo es mejor al estar tú. Por el lujo de vivir la vida contigo, por todo lo que significas en mi vida, por todo lo que me haces reír yporque me haces ser mejor persona y por tantas y tantas cosas...
Gracias a todos vosotros y a muchos más porque mire donde mire siempre hay gente dispuesta a rescatarme.
RESUMEN
La esterilidad es un problema que afecta, aproximadamente, al 9-15% de las parejas, pudiendo ser responsable el factor masculino del 50% de los casos.
El factor masculino se evalúa fundamentalmente mediante el estudio de las características seminales. El análisis de la integridad del ADN espermático se ha incorporado, en los últimos años, al diagnóstico de la infertilidad masculina.
En esta tesis, se han estudiado 41 parejas con objeto de determinar la relación entre los parámetros seminales convencionales y la integridad del ADN espermático, así como la influencia que en estos tienen la edad y el consumo de tabaco. Se ha evaluado cómo afecta la técnica de recuperación espermática de swim-up a los niveles de fragmentación basal de las muestras. Se ha analizado el efecto que tienen tanto los parámetros seminales, como la fragmentación basal del ADN espermático y la fragmentación post swim-up (ambas medidas mediante el test SCD), en los resultados del ciclo ICSI.
La evaluación de los parámetros clásicos del seminograma que definen la calidad seminal, como son el volumen del eyaculado, la concentraciónespermático, motilidad progresiva y morfología espermática, y el REM, se han mostrado como factores que no permiten predecir el grado de integridad del ADN espermático. Esto indicaría que los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático son variables independientes, mientras que la edad del varón ejerce una influencia, incrementando el daño del ADN espermático.
La técnica swim-up de procesamiento de muestras seminales disminuyósignificativamente los porcentajes de fragmentación del ADN espermático y esta disminución de los niveles de fragmentación es proporcionalmente mayor cuanto mayor sea el porcentaje de fragmentación basal del paciente. Esto indicaría que la técnica de procesamiento mejora la calidad de la muestra en cuando al porcentaje de fragmentación del ADN, aun cuando dicha técnica se estableció en su origen para seleccionar una muestra enriquecida en espermatozoides con mejor movilidad y mejor morfología.
Finalmente se ha valorado el resultado de los ciclos de ICSI mediante los parámetros tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y gestación, y su relación con las variables masculinas analizadas (factor masculino). Se encontró que la tasa de fecundación guardó relación inversa con la edad y relación directa con la morfología espermática. La tasa de gestación y la normozoospermia se comportaron como variables positivamente dependientes. Sin embargo, el resultado de los ciclos de ICSI no se correlacionó con la fragmentación del ADN de la muestra seminal, con lo que el nivel de integridad del ADN espermático se mostró como un factor independiente del éxito del tratamiento de reproducción asistida mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides.
ÍNDICE
Índice
INTRODUCCIÓN ... 3
1. Esterilidad e infertilidad ... 3
2. El factor masculino ... 4
3. Espermatogénesis y espermiogénesis ... 5
4. El espermatozoide humano ... 7
5. El ADN espermático ... 9
5.1. El ADN nuclear y la cromatina del espermatozoide ... 9
5.2. El ADN mitocondrial ... 15
6. Análisis y alteraciones del semen ... 15
7. Fragmentación del ADN espermático ... 17
7.1. Mecanismos de inducción de la fragmentación del ADN espermático ... 18
7.2. Técnicas de detección y cuantificación de la f. del adn espermático ... 24
7.3. Significado clínico de la fragmentación del ADN espermático ... 34
8. Técnicas de reproducción asistida ... 36
OBJETIVOS ... 37
MATERIAL Y MÉTODOS ... 41
1. Población de estudio ... 43
2. Seminograma ... 43
3. Preparación de las muestras (swim-up) ... 53
4. Test SCD (sperm chromatin dispersión) ... 55
5. Tinción ... 56
6. Evaluación de la fragmentación ... 56
7. Recuperación y preparación de los ovocitos ... 58
8. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ... 60
9. Evaluación de los embriones ... 62
10. Transferencia embrionaria ... 65
11. Criopreservación embrionaria ... 66
12. Análisis estadístico ... 70
RESULTADOS ... 71
1. Análisis descriptivo ... 73
1.1. Análisis descriptivo de los varones ... 73
1.2. Análisis descriptivo de las mujeres y del ciclo ICSI ... 75
1.3. Analisis descriptivo de resultados del ciclo ICSI ... 76
2. Análisis de los parámetros del seminograma y características de los varones ... 80
2.1. Normozoospermia ... 80
2.2. Alteraciones en los parámetros del seminograma ... 81
2.3. Recuento de espermatozoides móviles (REM) ... 83
2.4. Correlaciones entre los parámetros seminales. ... 84
3. Fragmentación del adn espermático y parámetros masculinos ... 86
3.1. Análisis de la fragmentación basal... 86
3.1.1. Fragmentación basal y calidad seminal ... 89
3.1.2. Fragmentación basal y REM ... 91
3.1.3. Fragmentación basal y correlación con los parámetros seminales ... 92
3.2. Análisis de la fragmentación post swim-up ... 93
3.2.1. Fragmentación post swim-up y calidad seminal ... 96
3.2.2. Fragmentación post swim-up y rem ... 97
3.2.3. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ... 98
3.2.4. F. post swim-up y correlación con la f. basal y los parámetros seminales ... 99
3.3. Variación de la fragmentación tras el procesamiento mediante swim-up ... 100
3.3.1. Variación de la fragmentación y calidad seminal ... 103
3.3.2. Variación de la fragmentación y rem ... 105
3.3.3. Variación de la fragmentación y fragmentación basal ... 106
3.3.4. Variación de la fragmentacion y correlaciones ... 106
4. Resultado de los tratamientos de reproducción asistida (TRA) mediante ICSI ... 108
4.1. Resultados de los TRA mediante ICSIy parámetros seminales ... 112
4.2. Resultados de los TRA mediante ICSI y fragmentación del adn espermático 118 4.2.1. Fragmentación basal y resultados de ICSI ... 118
4.2.2. Fragmentación post swim-up y resultados de ICSI ... 122
4.2.3. Variación de la fragmentación y resultados de ICSI ... 125
4.3. Resultados de tra mediante ISCI en mujeres de buen y mal pronóstico ... 127
4.3.1. Tasa de fecundación en mujeres de buen y mal pronóstico ... 127
4.3.2. Embriones de buena calidad en mujeres de buen y mal pronóstico ... 127
4.3.3. Tasa de implantación en mujeres de buen y mal pronóstico ... 128
4.3.4. Gestación en mujeres de buen y mal pronóstico ... 128
DISCUSIÓN ... 131
1. Parámetros seminales y características de los varones ... 133
1.1. Parámetros seminales y edad ... 134
1.2. Parámetros seminales y tabaquismo ... 136
2. Fragmentación basal del ADN espermático ... 139
2.1. Fragmentación basal y parámetros seminales ... 140
2.2. Fragmentación basal y edad ... 142
2.3. Fragmentación basal y tabaquismo ... 144
3. Fragmentación del ADN espermático tras el procesamiento mediante swim-up .. 146
3.1. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ... 148
3.2. Variación de la fragmentación, edad y tabaco ... 151
3.3. Variación de la fragmentación y características seminales ... 152
4. Factor masculino en los resultados de los ciclos de ICSI ... 153
4.1. Resultados del ciclo ICSI y edad del varón ... 153
4.2. Resultados del ciclo ICSI y características seminales ... 154
4.3. Resultados del ciclo ICSI y fragmentación del adn espermático ... 155
5. Factor femenino en los resultados de ciclos de ICSI ... 158
CONCLUSIONES ... 161
BIBLIOGRAFÍA ... 165
ABREVIATURAS ... 185
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
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1. ESTERILIDAD E INFERTILIDAD
La esterilidad se define como la imposibilidad de concebir tras 1 año de relaciones sexuales regulares sin emplear ninguna medida anticonceptiva,mientras que la infertilidad se refiere a la incapacidad para completar un embarazo. Tanto la American Society of Reproductive Medicine (ASRM) como laOrganización Mundial de la Salud (OMS/WHO) la catalogan como una enfermedad del sistema reproductivo que inhibe la capacidad del cuerpo de cumplir con la función básica de la reproducción(Zegers- Hochschild et al, 2009). Aunque la ASRM, la Sociedad Española de Fertilidad (SEF),la Sociedad Española de Obstetricia y Ginecología (SEGO) y la OMSestán de acuerdo en establecer el límite en 12 meses (OMS, 2000), otras sociedades científicas como la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO)y la European Societyfor Human Reproduction and Embryology (ESHRE) prefieren definir el límite en 24 meses(The ESHRE Capri Workshop, 1996).
Es un problema frecuente que afecta aproximadamente al 9-15% de las parejas(Boivin et al., 2007; Evgeni et al., 2014).Según los últimos datos publicados se estima que la esterilidad afectaba, en el año 2010, a 48.5 millones de parejas a nivel mundial(Mascarenhas et al., 2012).En los países occidentales la prevalencia de la esterilidad es del 10 al 20%, y en España se estima que alrededor de un 14-15% de las parejas en edad reproductiva tienen problemas de esterilidad. El 85% de las parejas que intentan una gestación la consiguen en el periodo de un año, el 92% después de dos años y el 93% tras tres años de relaciones (De la Fuente, 2011).Estos porcentajes de prevalencia de la esterilidad según los expertos se irán incrementando, debido fundamentalmente al retraso en la edad en las que las mujeres comienzan a intentar tener descendencia, pero también a una disminución en la facilidad para concebir y a un deterioro en la calidad del semen en los últimos años señaladopor algunos autores(Andersen et al., 2008). La edad media de maternidad (EMM) se ha ido incrementando hasta situarse en 31,12 años. Todo esto tiene como consecuencia que el número de pacientes que acuden a los centros de reproducción asistida se haya ido incrementando y que se produzca un avance y una mejora continuos en las distintas técnicas de reproducción asistida. Probablemente en el 2020entre un 18 y un 25%de las
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parejas en edad fértil tendrá problemas de infertilidad y se generarán del orden de 18.500 nuevos casos al año(Matorras R., 2011). Como consecuencia se producirá un incremento en la demanda de este tipo de tratamientos y un aumento del número de centros especializados.
En Españala natalidad se redujo a más de la mitad entre 1960 y 2011, pasando de 21,7 a 10,6 nacimientos por mil habitantes y se ha establecido en 9,14 en el 2014(INE, 2015), lo que sitúa al país por debajo de la media de la Unión Europea. El índice de fecundidad (número medio de hijos por mujer), en nuestro país ha descendido paulatinamente hasta llegar a 1,32 hijos por mujer en el 2014 (INE, 2015).Esto está contribuyendo al envejecimiento de la población ya que se establece el número necesario para mantener el tamaño de la población en 2,1 hijos por mujer (nivel de reemplazo generacional) y que esto dará lugar aproblemas socioeconómicos(INE, 2006).
Muchos estudios han demostrado que los problemas de esterilidad afectan tanto a hombres como a mujeres,y queel factor masculino tiene gran importancia y parece ser el responsable, al menos en parte, del 50% de los casos aproximadamente (Cortés- Gutiérrez el al., 2007). De este 50%, el 20% es debido exclusivamente a problemas masculinos y el otro 30% se debe a una combinación de factores masculinos y femeninos(Poongothai et al., 2009).
2. EL FACTOR MASCULINO
Con este término se engloba el conjunto de causas atribuibles al varón que inciden de forma completa o parcial sobre la esterilidad de la pareja. En la práctica puede considerarse sinónimo de infertilidad masculina. A pesar de agrupar normalmente un variado conjunto de alteraciones seminales también puede aparecer cuando el seminograma es normal (Practice committee of ASRM, 2015).
Aunque la infertilidad se considera un problema de pareja, en los últimos años el llamado factor masculino ha ido incrementando su importancia, un cambio que ha sido acompañado por una mayor concienciación por parte del varón. Efectivamente, la responsabilidad del varón en el descenso de la natalidad parece cada vez más evidente debido a un deterioro en la salud reproductiva masculina, tanto por el descenso de
INTRODUCCIÓN
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lacalidad del semen (Irvine et al., 1996) como por enfermedades asociadas al aparato reproductor.
La infertilidad masculina es un síndrome multifactorial que abarca una amplia variedad de trastornos. Aunque en más de la mitad de los varones infértiles se desconoce el origen de esa infertilidad (idiopática) ya sea congénita o adquirida (Poongothai et al., 2009), existen muchas causas posibles de que afectan a la producción espermática, al transporte o a la función espermática. Entre las causas más comunes encontramos: varicocele, anomalías que afectan al aparato reproductor (criptorquidia,obstrucciones, traumatismos, etc.), eyaculación retrógrada, enfermedades infecciosas o infecciones del tracto reproductor que pueden ser o no de transmisión sexual (epididemitis, orquitis, prostatitis, vesiculitis), disfunciones sexuales, efectos adversos de determinados medicamentos, factores ambientales y estilo de vida (exposición a contaminantes, tabaco, alcohol, drogas, etc.), enfermedades o alteraciones genéticas que se asocian, directa o indirectamente, con anomalías en el semen, disfunciones hormonales y alteraciones en el semen.
Cuando una pareja acude a una consulta de esterilidad hay que realizar un estudio de los dos miembros de la pareja. El estudio básico del varón debe incluir una completa historia médica, una exploración física y al menos dos seminogramas realizados con un intervalo de 2 a 4 semanas (Bassas Arnau, 2011).
3. ESPERMATOGÉNESIS Y ESPERMIOGÉNESIS
La espermatogénesis o gametogénesis masculina es el proceso mediante el cual se desarrollan los gametos masculinos o espermatozoides,y tiene lugar en la gónada masculina llamada testículo.La espermatogénesis empieza en la pubertad y desde entonces tiene lugar de manera continua hasta la vejez.Este proceso tiene lugar en los túbulos seminíferos, situados en el interior delos testículos, donde también se encuentran las células de Sertoli que dan sostén, nutren y protegen a las células germinales formando la barrera hematotesticular. La espermatogénesis consta de tres etapas: etapa de proliferación, etapa meiótica o fase de reducción y etapa de diferenciación o espermiogénesis (Fig. 1).
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En la etapa de proliferación, como su propio nombre indica, las células germinales primordiales ogonocitos, proliferan y se multiplican mediante divisiones mitóticas y dan lugar a las espermatogonias.Algunas espermatogonias, las espermatogonias tipo A, se dividen mitoticamente de forma continuada para producir más espermatogonias, mientras que las de tipo B dan lugar a los espermatocitos primarios (espermatocitos I o espermatocitos de primer orden), que son células de mayor tamaño que entrarán en meiosis. Durante toda esta etapa se mantiene la dotación cromosómica diploide de todas las células que se van generando, ya que únicamente se dividen mediante divisiones mitóticas. Como resultado final de esta fase nos encontramos con unas células diploides llamadas espermatocitos primarios.
La fase meiótica se caracteriza por la reducción en el número de cromosomas. Se parte de espermatocitos primarios, que son células diploides (2n), y el producto final son espermátidas, que tienen una dotación cromosómica haploide (n). Como cualquier división meiótica hay que diferenciar dos periodos, la primera y al segunda división.La primera división meiótica comienzaa partir de espermatocitos primarios,ypor cada uno de ellos que inicia este proceso se obtienecomo resultado dos espermatocitos secundarios (espermatocitos II o espermatocitos de segundo orden). Los espermatocitos secundarios son ya células haploides (n) ya que esta primera etapa de la meiosis, la meiosis I, es la etapa reductora, se separan los homólogosy disminuye el número de cromosomas a la mitad. En la segunda división meiótica a partir de cada espermatocito secundario, ya haploide, se obtienen dos espermátidas también haploides. En resumen, partir de cada espermatocito primario diploide que se incorpora a la fase meióticase obtienen cuatro espermátidas haploides como resultado final.
La última etapa es la de diferenciación, también conocida como espermiogénesis.
Es la fase final de la espermatogénesis y comprende la diferenciación y especialización de las espermátidas que culminancon la formación de los espermatozoides ya libres del epitelio germinal. Durante esta fase se producen un serie de cambios, como la condensación de la cromatina nuclear, la formación del acrosoma y el desarrollo del flagelo,que van a posibilitar la liberación de los espermatozoides de los túbulos seminíferos. Esta liberación de las espermátidas maduras, ahora llamadas
INTRODUCCIÓN
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espermatozoides, se denomina espermiación y está controlada por las células de Sertoli.A partir de cada espermátida haploide (n), que entra en la espermiogénesis, se originan dos espermatozoides, también haploides (n).
La espermatogénesis es un proceso altamente organizado con una cinética específica que dura 74 días. Los espermatozoides, una vez liberados, son transportados a través del epidídimo durante otros 12 días más. Por lo tanto, un ciclo de espermatogénesis completo, desde espermatogonia a espermatozoide maduro tiene una duración mínima de 86 días (Holstein et al.,2003).
Figura 1.- Espermatogénesis
4. EL ESPERMATOZOIDE HUMANO
El espermatozoide maduro, o gameto masculino, es una célula haploide, altamente especializada cuya función es la formación del cigoto al fusionar su núcleo con el del gameto femenino, para lo que es deseable que la copia del genoma paterno
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se cree, se transporte y llegue hasta el ovocito en perfecto estado. En el proceso de fecundación es fundamental no sólo la integridad genética materna sino también la paterna, y la transmisión de la molécula de ADN integra e intacta del espermatozoide al óvulo es crucial tanto para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito (Cortés-Gutiérrez et al., 2007), como para que se desarrolle correctamente el embrión y el feto.
Para que un espermatozoide se considere normal según las directrices de la OMS(1999), la cabeza, el cuello, la pieza media y la cola tienen que ser morfológicamente normales. La cabeza del espermatozoide normal tiene que ser lisa, de contorno regular y en general de forma ovalada, con una longitud entre 4,0 y 5,0µm y su anchura debe estar entre 2,5 y 3,5µm. El coeficiente largo/ancho debe ser de 1,5 a 1,75.
La cabeza está constituida por el acrosoma y el núcleo. La región acrosómica debe estar bien definida,de color más claro, y ocupar entre el 40 y el 70% del área total de la cabeza. La pieza media(también llamada pieza intermedia) tiene que ser delgada,regular, con una anchura menor que 1µm y de longitud generalmente similar a la de la cabeza (y como máximo no superando la longitud de una cabeza y media) a la que se debe unir axialmente(los ejes mayores de la cabeza y de la pieza intermedia deben de estar alineados entre si).Si existecitoplama residual (también llamado gota citoplásmica), éste no debe superar el volumen de media cabeza normal. La cola o flagelodel espermatozoide debe tener un grosor uniforme a lo largo de toda su longitudy sermás estrecha que la pieza media. Su longitud tiene que ser de 45µm y debe estar desenrollada.
INTRODUCCIÓN
9 Figura 2.-Espermatozoide humano
5. EL ADN ESPERMÁTICO
El espermatozoide humano contiene en su interior dos tipos de ADN con una organización muy diferente, el ADN nuclear(ADNn) y ADN mitocondrial (ADNmt).
Mientras que ADN mitocondrialespermático no ha sido muy estudiado, el ADN nuclear ha sido objeto de numerosas investigaciones, en parte para relacionarlo con los resultados de las técnicas de reproducción asistida (TRA) (Morris et al., 2002; Miller et al., 2010; Wright et al., 2014).
5.1. EL ADN NUCLEAR YLA CROMATINA DEL ESPERMATOZOIDE
La estructura de la cromatina contenida en el núcleo del espermatozoide tienecaracterísticas diferenciales con respecto a las células somáticas(Fuentes-Mascorro et al. 2000; Boissonneault, 2002) tanto en su composición como en su enorme compactación, hasta 6 veces superior a la que encontramos enloscromosomas mitóticos (Cortés-Gutiérrez et al., 2007), su escaso volumen (40 veces menos que una célula somática) y su gran estabilidad (Gil Villa et al., 2007).Mientras que el ADN de las células somáticas está asociado a un tipo de proteínas llamadas histonas el del espermatozoide lo hace a otro tipo de proteínasdenominadas protaminas.Las protaminas son las responsables de este grado de compactación ya que generan bucles de menor tamaño que los que generan las histonas en las células somáticas. Durante la espermiogénesiscasi todas las histonas son reemplazadas por unas proteínas llamadas
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de transición y éstas serán posteriormente sustituidas a su vez por protaminas. Aunque el proceso de permuta de las histonas por protaminas ha sido estudiado por muchos investigadores no se sabe exactamente como se desarrolla. Se han diseñado numerosos modelos para tratar de explicar el gran empaquetamiento que sufre el ADN para que se pueda introducir en el núcleo del espermatozoide.
Para sustituir a las histonas es necesario eliminar los nucleosomas que forman la cromatina y,aunque no se conoce el mecanismo molecular exacto por el que se produce,si parece que tienen lugar una serie de procesos comoacetilación, metilación, fosforilación o ubiquitinización.Al ir eliminando los nucleosomas es necesario deshacer la tensión provocada por el superenrrollamiento de la molécula de ADN. Una vez que los nucleosomas se han eliminado, las histonas se sustituyen por proteínas de transición (Meistrich et al.,2003). Las proteínas de transición son un grupo heterogéneo de proteínas básicas, de las quese han identificado cuatro aunque las más conocidas son TP1 y TP2. LaTP1 es una proteína rica en lisina, serina y arginina (Brewer et al., 2002).La TP2 es una proteína de mayor tamaño que la TP1. Aunque su función exacta no se conoce parece que in vitroactúan en la reparación de roturas (Caron et al., 2001;
Boissonneault, 2002), en la descondensación del ADN en los nucleosomas (TP1) (Singh and Rao, 1988), en la posterior condensación del ADN (TP2) y en su estabilización(Kundu and Rao, 1995).Hay autores que defienden que la ausencia de una de estas dos proteínas queda compensada por una mayor presencia de la otra aunque no hay certeza de ello (Adham et al., 2001).
El siguiente paso es la sustitución de las proteínas de transición por las protaminas. Las protaminas son nucleoproteínas básicas insolubles de bajo peso molecular cargadas positivamente que sustituyen, casi totalmente, a las histonas a las que está asociado normalmente el ADN y que, además, estabilizan la estructura mediante los puentes disulfuro que forman entre ellas.Son responsables del empaquetamiento del ADN en el núcleo del espermatozoide maduro.La compactación del ADN espermático en el interior del núcleo es una cuestión muy relevante a la hora de analizar la fragmentación del ADN. En mamíferos se han identificadodos tipos de protaminas, P1 y P2, productos de los genes PRM1 y PRM2, respectivamente.P1 se
INTRODUCCIÓN
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expresa en todos los mamíferos y es una proteína rica en arginina y cisteina. P2, de mayor tamaño que P1, sólo se expresa en algunos mamíferos, entre ellos en humanos(Balhornet al., 1977; Balhorn, 2007; Oliva, 2006) y es rica en histidina.Elespermatozoide maduro es el único tipo celular en el que están presentes las protaminas. Se ha demostrado la elevada protección que estas proteínas aportan a la cromatina del espermatozoide cuando se unen a ella (Kuretake et al.,1996).Parece que proporcionan protección mecánica al ADN al unirse ael y formar los complejos ADN- protaminas. Para formar estos complejos las protaminasse unen a lo largo del surco menor de la molécula de ADN y con su carga positiva neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato de manera que pueden unirse unos complejos a otros (Balhorn, 1982).
En el ADN del espermatozoide, para eliminar los nucleosomas y intercambiar las histonas por protaminas,se necesita hacer frente al fenómeno de superenrollamiento, que produce tensiones por excesiva torsión que van a dificultar la compactación.
Eliminando los superenrollamientos las protaminas pueden acceder al ADN y sustituir a las histonas(McPherson and Longo, 1993), previamente reemplazadas por las proteínas de transición. Para eliminar los superenrollamientos hay autores que han descrito la existencia de roturas en la molécula de ADNque aparecen en etapas intermedias de la espermiogénesis y que posteriormente deben ser repararadas porque se ha comprobado que no se mantienen durante todo el proceso (McPherson and Longo, 1993; Sakkas et al.,1995; Marcon and Boissonneault, 2004). Las roturas pueden ser tanto de cadena sencilla como de cadena dobleyla enzima que parece originar las roturas y posteriormente repararlases la topoisomerasa II (Laberge and Boissonneault, 2005). Se han propuesto varios modelos complejos para intentar explicar la regulación de estas roturas (Meyer-Ficca et al.,2011).
Una vez sustituidas las histonas por protaminas, estas empaquetan y compactan el ADN en unas estructuras denominadas toroides, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 50 kb de ADN (Hud et al.,1993).Según la cantidad de protaminas presenteshabrá mayor o menor grado de compactación. Se desconoce el modo exacto en el que se constituyen y se organizan los toroides de protaminas para formar la
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estructura final de la cromatina del espermatozoide. Sí se sabe que se establecen una serie de bucles llamados dominios que se unena la matriz nuclear cada 20-120 kb (Ward, 2010). Cada bucle o dominio contiene ADN funcional, corresponde a un toroide y se unen entre ellos por una secuencia de ADN (toroid linker),asociada a histonas,que es mássensible a la acción enzimática de determinadas endonucleasas como la DNAsa I(Sotolongo et al., 2003). Estas secuencias son también los sitios por los que los toroides de protaminas, además de unirse entre ellos, se anclan a la matriz nuclear, y reciben el nombre de matrix attachment regions (MARs) (Fig.3). La matriz nuclear espermática está formada por una estructura proteica que no se conoce completamenteaunque hay evidencia de la existencia entre otros componentes de topoisomerasa IIB, actina, miosina, citoqueratinas, espectrinay posiblemente algunos enzimas como la transcriptasa inversa entre otros.Cada vez se incide más sobre suimportancia en la organización estructural del ADN y en su relación con la función nuclear.Juega un papel crucial en la regulación de la fragmentación y la degradación del ADN espermático antesde la fecundación (Sharman et al., 2007). También parece que debe actuar para mantener de la integridad del ADN espermático tras la fecundación (Ward, 2010).Es necesaria para la replicación del ADNdel pronúcleo masculinoque se forma en el ovocito una vez fertilizado y para que los embriones que se originen sean viables (Sharman et al., 2007).
INTRODUCCIÓN
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Figura 3.- Tres principales elementos estructurales de la cromatina espermática. A: Durante la espermiogénesis, las histonas se sustituyen por protaminas y condensan el ADN en toroides altamente empaquetados. Cada toroide de protamina es un dominio de bucle. B: Los toroides de protamina se pueden organizar apilándose unos al lado de otros. Algunas secuencias grandes de ADN conservan histonas (solenoide verde) que pueden ser dominios de bucle enteros que no se condensan por protaminas. C: Las cadenas de ADN que unen los toroides de protamina son sensibles a lasnucleasas y pueden estar unidos a histonas; son las regiones de unión a la matriz (MARs) (Ward, 2010).
Aunque la gran mayoría, el 85%, del ADN espermático está unido a protaminas formando toroides, como ya hemos visto hay algunas histonas que no son reemplazadas por protaminas y se conservan en el espermatozoide maduro. Estas secuencias de ADN asociadas a histonas no se distribuyen al azar y parecen tener funciones específicas, pudiendo corresponder a telómeros o a genes funcionales de la espermiogénesis o de la fecundación, o de alguna función en el embrión(Arpanahi et al.,2009; Hammoud et al.,2009).
Se desconoce si estas histonas que permanecen asociadas al ADN espermático se mantienen en el zigoto tras la fecundación aunque hay modelos como el de Ward del
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2010 que sugieren que algunas estructuras de ADN espermático unido a histonas y asociado a la matriz nuclear se mantienen en el momento de la reestructuración de la cromatina durante la formación del pronúcleo masculino y es necesaria para que se produzca la replicación del ADN del pronúcleo masculino (Ward et al., 1999) y para proteger el ADN del espermatozoide una vez que ha fecundado al ovocito (Ward, 2010) (Fig. 4).
Figura 4.- Herencia de los elementos estructurales de la cromatina espermática.Arriba:En espermátidas redondas las histonas empaquetan el ADN. En medio:Durante la espermiogénesis, la mayoría de histonas se sustituyen por protaminas (rojo). Abajo: Después de la fertilización, se eliminan las protaminas y son reemplazas por histonas suministradas por el ovocito (verde claro). Sin embargo, algunas histonas que se mantienen en el espermatozoide (verde oscuro) probablemente también se mantenganen el pronúcleo paterno, al igual que las regiones de anclaje a la matriz nuclear (MARs) (Ward, 2010).
INTRODUCCIÓN
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Las protaminas que están asociadas al ADN espermático se eliminan y son sustituidas completamente por histonas del ovocito poco tiempo después, entre 2 y 4 horas, de producirse la fecundación(Perreault and Zirkin, 1982).
5.2. EL ADN MITOCONDRIAL
El ADN mitocondrial presente en el espermatozoide está localizado en la pieza media dentro de las mitocondrias. Es una molécula circular de doble cadena que contiene 16.5 kb. En ella encontramos 37 genes que codifican 2 ARNr, 22 ARNt y 13 polipéptidos que forman distintas subunidades de enzimas que intervienen en la fosforilación oxidativa. Este ADN está involucrado en que las mitocondrias provean al espermatozoide del ATP necesario para la propulsión flagelar. No está asociado ni a histonas ni a protaminas, es muy susceptible al daño por ROS, aunque también puede producirlo durante el proceso de formación de ATP. Los daños que se pueden ocasionar en el ADN mitocondrial por el efecto de ROS se pueden traducir en un cambio en el potencial de membrana de las mitocondrias que afectará a la motilidad y al desplazamiento del espermatozoide (Henkel, 2011).Este ADN mitocondrial es destruido, tras la fecundación, en las primeras etapas del desarrollo embrionario por lo que no afectará mucho al embrión (Aitken and Krausz, 2001).
6. ANÁLISIS Y ALTERACIONES DEL SEMEN
Para evaluar y diagnosticar el factor masculino en parejas que acuden a la consulta de esterilidad se recurre rutinariamente al análisis del semen mediante elseminograma que actualmente sigue siendo la prueba más importante que se realiza en los laboratorios de andrología para estudiar la infertilidadmasculina. El seminograma o espermiograma es un examen del esperma que consiste en el analizar una muestra de semen que corresponda a un eyaculado completo. En este procedimiento se examinan una serie de parámetros que corresponden no sólo a los espermatozoides contenidos en esa muestra si no a todo el conjunto de la misma. En un seminograma básico se estudian tanto aspectos macroscópicos como microscópicos de la muestra. Dentro de las características macroscópicas se evalúan los siguientes parámetros: volumen,
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viscosidad, liquefacción, color y pH de la muestra. El examen microscópico consiste en analizar los siguientes aspectos: concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides.Todas estas determinaciones, una vez evaluadas, se comparan con los estándares de normalidad que publica y actualiza periódicamentela OMS, lo que nos permitirá tomar una serie de decisiones sobre la trayectoria a seguir y las opciones más adecuadas que podremos ofertar al paciente. Aunque el seminograma hoy por hoy sigue siendo la prueba por excelencia que se realiza en el laboratorio de andrología para analizar la calidad espermática, no permite determinar a ciencia cierta si un individuo es fértil o no lo es.Parámetros básicos como concentración, motilidad y morfologíano son capaces de diagnosticar la esterilidad masculina (Guzick et al., 2001). Los estándares de referencia que publica la OMS no son valores de referencia de esterilidad o de fertilidad;
hay varones con valores inferiores al umbral mínimo establecido por la OMS cuya fertilidad está demostrada y, viceversa, hay muchos varones cuyos valores están dentro de los límites marcados y no logran conseguir un embarazo.Se calcula que alrededor de un 15% de los varones con parámetros seminales dentro de los límites de la normalidad son estériles(Guzick et al., 1998;Cortés-Gutiérrezel al.,2007). Sin embargo, los hombres fértiles tienen, por lo general, valores medios de los parámetros seminales (concentración, movilidad y morfología) más elevadosy normalesque losde los hombres infértiles(Zini et al., 2001a).
Como hemos dicho anteriormente, utilizando únicamente los resultados del seminograma para valorar la capacidad reproductiva de un individuo se escapan alteraciones quepadecen los espermatozoidesy que afectan a la fertilidad masculina.
Como el seminograma carece de capacidad absoluta para diagnosticar la esterilidad, actualmente no se cuenta con una prueba definitiva que se pueda utilizar en los laboratorios de andrología para determinar si un varón es fértil o infértil.Ante la necesidad de disponer de pruebas diagnósticas precisas capaces de diagnosticar la infertilidad masculina, y predecir el potencial fértil de un varón, continuamente se están estudiando nuevos marcadores que ayuden a proporcionar información adicional sobre la capacidad fecundante de los pacientes y a predecir, según las características del semen, los resultados de las TRA. Entre las técnicas que han suscitado,en las últimas
INTRODUCCIÓN
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décadas, mayor interés para estudiar la calidad espermática entre los profesionales de la reproducción asistida está, sin lugar a dudas, la integridad del ADN y de la cromatina espermática.
7. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
Se conoce como fragmentación del ADN espermático al fenómeno que tiene lugar cuando se producen roturas tanto de cadena sencilla como de doble cadena en la molécula de ADN del espermatozoide. Como consecuencia de las roturas en el material genético del espermatozoide se produce una fragmentación en el ADN del mismo.Existen multitud de estudios que intentan establecer como el daño producido en el ADN podría influir en la infertilidad masculina y en que medida afectaríaa las posibilidades de embarazo y a los resultados de los tratamientos de reproducción asistida en general.
Hay numerosos estudios que comparan la fragmentación del ADN espermático con los principales parámetros analizados en el seminograma. Algunos de estos estudios aseguran que existe una relación negativa directa entre la fragmentación cromosómica y parámetros seminales tales como la concentración, la motilidad o la morfología(Irvine et al., 2000; Zini et al., 2002; Smit et al.,2007; Evgeni et al.,2014).Otros autores no encuentranrelaciónentre la mala calidad seminal y el daño del ADN espermático (Evenson et al.,1999;Salehet al., 2002a; Benchaib et al., 2007).La existencia de alteraciones en el ADN, como los fallos en la condensación de la cromatina, las anomalías en la integridad, la fragmentación del ADN en una o en las dos cadenas, o las anomalías cromosómicas (aneuploidías o reordenaciones estructurales) afectan a la fertilidady hay evidencias del impacto negativo que tiene la fragmentación del ADN de los espermatozoides sobre la fertilidad (Zini et al., 2001b; Zini et al., 2002) y sobrelos resultados de los tratamientos de reproducción asistida, tanto en las tasas de fertilización como en las de embarazo(Bellver et al., 2010; Simon et al., 2011). Incluso la fragmentación puede relacionarse también con enfermedades que afectan a la descendencia (Aitken and Krausz, 2001;Silber and Repping, 2002; Cortés-Gutiérrez et al., 2007).Aunque realmente el fenómeno de fragmentación es algo común y se observa en
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el ADN espermático de los varones en general, lo que hacediferentes a unos individuos de otros es que se produce en distinta proporción. Al ir aumentando el número de lesiones en el ADN van disminuyendo las posibilidades de éxito de las técnicas de reproducción asistida. Así se ha descrito que índices de fragmentación superiores al 30%
dan lugar a anomalías en el desarrollo embrionario y a fallos de implantación, y que los hombres infértiles tienen un porcentaje mayor de espermatozoides con el ADN fragmentado que los varones fértiles. (Irvine et al. 2000, Saleh et al.,2002a,Zini et al., 2006). En parejas con tasas de fragmentaciones altas (30-40%) se observa un potencial muy bajo de fertilidad natural (Evenson et al., 1999; Spano et al., 2000; Zini et al., 2002;
Zini et al., 2006).El ovocito tiene capacidad, en sí mismo, para reparar el daño que presenta el ADN del espermatozoide tras la fecundación y en algunos casos es capaz de hacerlo. La competencia del ovocito a la hora de reparar una determinada lesión va a depender del tipo de rotura, del porcentaje de fragmentación y de la propia calidad del ovocito. El problema viene enlos casos en los que el ovocito no es capaz de reparar las lesiones en el material genético del espermatozoide, en cuyo caso esas alteraciones pasarán al embrión con los consiguientes efectos que esto suponga para el desarrollo del embrión y, en el caso de que se produzca un embarazo y este llegue a término,en el feto (Sakkas and Álvarez,2010).
En la actualidad hay numerosos estudios que analizan y comparan las distintas técnicas de las que se dispone para el análisis de la fragmentación del ADN espermático.
Muchos son los centros que, analizando las ventajas y desventajas de cada una de ellas, intentan dilucidar cuál de ellas es la que más se adapta a sus condiciones y cuál de ellas es la más apropiada para su medio de trabajo.
7.1. MECANISMOS DE INDUCCIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
El origen de la fragmentación del ADN espermático es de naturaleza multifactorial aunque se desconoce el mecanismo exacto que la produce. Hay autores que han propuesto hasta seis mecanismos distintos que pueden inducir la fragmentación del ADN, tanto nuclear como mitocondrial, del espermatozoide (Sakkas and Álvarez, 2010) (Fig. 5).
INTRODUCCIÓN
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La primera causa es la apoptosis producida durante la espermatogénesis. La apoptosis es un proceso de muerte celular programada que permite eliminar células que no son necesarias, senescentes o aberrantes (Kerr et al., 1972). Es un mecanismo genético que provoca una serie de alteraciones morfológicas y bioquímicas en la célula, que la conducen al suicidio (Nagata, 1997; Sinha Hikim et al., 1999).
Durante el proceso de maduración espermática las células de Sertoli inducen la apoptosis que elimina aproximadamente el 50 o 75% de las células germinales. Este mecanismo es necesario en la espermatogénesis normal para poder mantener el equilibrio necesario entre células de Sertoli y células germinales y que éstas últimas no proliferen excesivamente, controlando así la calidad de la espermatogénesis (Russell and Peterson, 1984; Braun, 1998; Aitken and Baker, 2013). Las células germinales sobrantes y/o defectuosas entran en apoptosis y van a ser destruidas por la vía extrínseca (Fas/FasL), expresando elreceptor Fas (CD95)que es reconocido y al que se unen las células de Sertoli y así las fagocitan (Billig et al., 1996; Pentikäinen et al., 1999).Cuando este mecanismo por algún motivo falla se generan espermatozoides con el ADN defectuoso (aunque pueden ser morfológicamente normales) que, aunque no deberían conseguirlo, pasan al eyaculado, fenómeno denominado apoptosis abortiva (Sakkas et al., 1999; González-Marín et al., 2012).
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Figura 5.- Principales mecanismos de inducción del daño Del ADN en espermatozoides. Durante la producción o el transporte: (i) apoptosis durante la espermiogénesis; (ii) roturas durante la remodelación de la cromatina espermática durante la espermiogénesis; (iii) fragmentación post-testicular inducida principalmente por los radicales de oxígeno, durante el transporte de los espermatozoides a través de los túbulos seminíferos y del epidídimo (incremento del daño señalizado según el tamaño los rayos rojos y la intensidad del oscurecimiento en el recorrido); (iv) fragmentación inducida por caspasas y endonucleasas endógenas; (v) daño inducido por radioterapia y quimioterapia; y (vi) daños inducidos por sustancias tóxicas ambientales. (Sakkas and Álvarez, 2010)
En segundo lugar, como otra posible causa del daño en el ADN espermático, tenemos las roturas ocasionadas mientras se produce la remodelación de la cromatina en la espermiogénesis. Durante el proceso de espermiogénesis se tiene que condensar mucho el núcleo de la espermátida para transformarse en un espermatozoide. Se pueden producir fallos en el complejo intercambio de histonas por protaminas que podrían dar lugar a daños en el ADN espermático ya que para realizar este intercambio y liberar el estrés torsional que se provocaes necesario que se produzcan roturas que luego tienen que reparase (Meyer-Ficca et al.,2005;Meyer-Ficca et al.,2011). Si falla el mecanismo que controla este proceso de cortar y ligar el ADN nos podemos encontrar con un porcentaje variable de espermatozoides que presentan roturas residuales, no
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reparadas, y alteraciones en el empaquetamiento de la cromatina, cuya existencia está asociada a varios grados de subfertilidad (Meyer-Ficca et al.,2009). La existencia de roturas en el material genético puede apuntar a una maduración incompleta de los espermatozoides durante el proceso de espermiogénesis(Nijset al., 2009; Sakkas et al., 2010).
El tercer mecanismo intervendría ya a nivel post-testicular yes la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el paso de los espermatozoides a través del epidídimo. Las ROS son agentes oxidantes (radical hidoxilo, anión superóxido, peróxido de hidrógeno etc.), altamente reactivos, generados como resultado del metabolismo del oxígeno que tienen, a pesar de que su vida media es muy corta, la capacidad de oxidar otras moléculas muy rápidamente. Niveles altos de ROS pueden provocar lesiones en el ADN,tanto nuclear como mitocondrial (Sawyer et al.,2003), debido a la gran sensibilidad que tienen los espermatozoides al estrés oxidativo y a que al liberarse del testículo ya no cuentan con la protección que supone la capacidad antioxidante que presentan las células de Sertoli. Numerosos autores defienden la utilización de espermatozoides de testículo para su uso en técnicas de reproducción asistida frenteal uso de espermatozoides procedentes de eyaculado en pacientes con valores elevados de fragmentación de ADN y fallo de FIV o ICSI. Estos autores aseguran que estos últimos pueden experimentar un daño de gran trascendencia clínica al pasar por el epidídimo que los espermatozoides testiculares no tendrían (Álvarez, 2007). Valores elevados de ROS puedendañar, además del ADN,la membrana plasmática del espermatozoide (Ollero et al., 2001; Aitken et al.,1989).El que estas ROS lleguen a ocasionar estrés oxidativo se produce por una falta de equilibrio entre el volumen de producción de especies reactivas de oxigeno y la capacidad que tiene la célula de eliminarlas utilizando los mecanismos antioxidantes de defensa que posee(Gharagozloo and Aitken, 2011). Hay estudios que demuestran que espermatozoides inmaduros que producen niveles elevados de ROS pueden inducir daño en el ADN de espermatozoides maduros cuando están en contacto con ellos, por ejemplo durante la migración de espermatozoides maduros e inmaduros juntos desde los túbulos seminíferos al epidídimo (Ollero et al., 2001). A pesar de lo cual también hay evidencias de que se necesita,al menos, una
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pequeña cantidad de ROS para que se provoquen mecanismos tan importantes en la fecundación como la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosómica en los espermatozoides (de Lamirande and Gagnon, 1995; Lamirande et al.,1997).
Una vez que los espermatozoides ya están inmersos en el plasma seminal se benefician de las altas propiedades antioxidantes que este tiene. Hay otras células como los leucocitos o incluso los espermatozoides inmaduros,que generan cantidades de ROS elevadas (Gharagozloo and Aitken, 2011).A esto hay que unir el que en las muestras espermáticas, ya procesadasque utilizamos para las técnicas de reproducción asistida losmetabolitos procedentes de los espermatozoides que deberían pero que no han sido eliminados por apoptosis se acumulan y tienen un efecto negativo enel resto de espermatozoides (Cortés-Gutiérrezet al., 2007). Además estas manipulaciones que requieren la preparación de las muestras para utilizarlas en las Técnicas de reproducción asistida (TRA), como por ejemplo centrifugaciones,hacen que coexistan, en contacto directo, espermatozoides inmaduros, que liberan gran cantidad de ROS, con espermatozoides maduros(Aitken et al., 1994) que ven su ADN dañado significativamente como consecuencia de esta exposición in vitro a valores elevados de ROS.
Además de las roturas en el ADN de cadena sencilla y de doble cadena, las ROS pueden producir también otros tipos de daño como son modificaciones o pérdidas de alguna bases, interacciones entre una o entre varias cadenas de ADN o interacciones entre ADN y proteinas (Aitken et al., 2010; Gharagozloo and Aitken, 2011) (Fig.6).
Numerosos autores aseguran que el daño observado en la línea germinal masculina está fundamentalmente motivado por el daño oxidativo (Thomson et al.,2011).
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Figura 6.- Tipos de lesiones que podrían encontrarse en el ADN de espermatozoides humanos. (Aitken et al., 2010)
El cuarto mecanismo implicadoes causado por las caspasas y endonucleasas endógenas, propias del espermatozoide (Sakkasand Álvarez, 2010). Las caspasas son proteasas implicadas en la apoptosis y, junto con las endonucleasas, pueden inducir la fragmentación del ADN del espermatozoide al ser activadas por ROS. Estos dos tipos de enzimas también se pueden activar por factores fisicoquímicosexternos como son la temperatura y determinados agentes ambientales tóxicos (Sakkas and Álvarez, 2010).
En quinto lugar tenemos la radio y la quimioterapia como causas externas. La exposición, como consecuencia de tratamientos médicos, a agentes quimio o radioterápicos puede inducir la fragmentación del ADN espermático (Cai et al., 1997;
Harrouket al., 2000). Además puede también afectar negativamente a la fertilidad masculina al reducir el número de espermatozoides por el efecto citotóxico que estos agentes tienen en el testículo (Morris, 2002). En ambos casos las consecuencias, tanto a
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corto como a largo plazo dependerán de los fármacos utilizados, de las dosis y de la duración del tratamiento.
Por último se situaríaotra causa externa, la sexta, que son los tóxicos ambientales que podrían aumentar el estrés oxidativo. Están dentro de este apartado agentes como la contaminación atmosférica, exposición a pesticidas y otros agentes tóxicos, el tabaquismo, las ondas electromagnéticas de los teléfonos móviles etc.(De Iuliis et al., 2009; Taha et al., 2012; Pant et al., 2014).Su efecto en el incremento del daño en el ADN espermático dependerá del tipo de exposición y del tipo de contaminante.
7.2. TÉCNICAS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DELA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
Actualmente existen numerosos y diferentes métodos para analizar la integridad del ADN espermático y cuantificar elgrado de fragmentación que presenta el ADN de los espermatozoides (Fig. 7).
Las metodologías que miden la fragmentación del ADN se pueden englobar en tres grupos:
1.Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de la molécula de ADN.Entre ellas se encuentran: TUNEL y ISNT.
2.Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado al exponerlo a distintos tratamientos.En este grupo se incluyen: SCSA,ensayo COMETA, test SCD y DBD-FISH.
3.Otras técnicas, menos utilizadas, que se basan en los efectos de distintos colorantes. A este grupo corresponden: NA, AT y CMA.
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Figura 7.-Metodologías utilizadas para evaluar alteraciones en el ADN espermático. (Cortés-Gutiérrez et al., 2007)
1. Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de la molécula de ADN:
-TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyUridine triphosphate- Nick-End Labelling)
Introducida por Gorczyca en 1993 (Gorczycaet al., 1993). Esta técnica, al igual que el test SCD, también está comercializada en kit para su aplicación en espermatozoides. Radica en la incorporación denucleótidos, a partir de desoxiuridina trifosfato (dUTP)marcada con fluorocromos (biotina o digoxigenina), a los puntos de rotura de ADN (en los extremos 3´OH de las cadenas afectadas), tanto de cadena doble como de cadena sencilla mediante la acción de una enzimatransferasa terminal, la desoxinucleotidil transferasa (TdT). Los resultados se analizan o bien con un microscopio de fluorescencia (Fig. 8) o bien con un citómetro de flujo. En este caso, se cuantifica la
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cantidad de nucleótidos incorporados, de manera quecuántas más roturas mayor será la incorporación deestosnucleótidos y mayor la intensidad de la señal fluorescente.Mediante microscopía de fluorescencia se cuantifica el número de espermatozoides verdes (con ADN fragmentado e incorporación de la fluoresceína), mientras que las cabezas azules corresponden a espermatozoides con ADN íntegro contrateñidos con DAPI (4’,6-diamino-2-phenylindole). Los resultados obtenidos se comparan además respecto a un control negativo, incubando en ausencia de la TdT, y a un control positivo de muestras tratadas previamente con DNasa I (Evenson et al., 2002).
Figura 8.-Técnica TUNEL. Núcleos espermáticos con ADN fragmentado (verde) y núcleos espermáticos con ADN íntegro (azul). (Jee et al., 2011)
En cualquier caso,para poder utilizar esta metodología se necesitan equipos sofisticados y personal especializado. Además, presenta otros inconvenientes, entre los que destacan que es necesario fijar la cromatina para poder realizar esta técnica, y que los kits comerciales se desarrollaron para células somáticas, cuyo ADN presenta un grado de compactación mucho menor que el espermático,lo que puede dificultar el acceso de la enzima a la cromatinay puede subestimarse el daño. Hay diversos estudios
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sobre el valor predictivo de este ensayo adaptado para mejorar la sensibilidad de la técnica en las TRA, tanto en IAH (Duran et al., 2002) como en ICSI (Evenson et al., 2002).
-ISNT (In SituNick Translation)
Fue implantada por Bianchiy colaboradores en 1993 (Bianchi et al., 1993).Consiste en la incorporación de nucleótidos de desoxiuridina trifosfato (dUTP) marcados con un biotina o digoxigenina a las roturas de cadena sencilla,usando como molde la cadena complementaria de ADNmediante la acción exonucleasa (5’-3’) y polimerasa de la ADN polimerasa I. Identifica la cantidad de ADN dañado cuantificando la intensidad de señal producida (Gorczyca et al., 1993). Los resultados se analizan con un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo. Esta tecnología tiene la misma base y los mismos inconvenientes que el ensayo TUNEL aunque la incorporación de nucleótidos en este caso es mayor.
2. Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado al exponerlo a distintos tratamientos:
-SCSA (SpermChromatin Structure Assay)
El ensayo de la estructura de la cromatina espermática se introdujo en 1980 por el grupo de Evenson para analizar la cromatina espermática en mamíferos (Evenson et al, 1980). La tecnología se fundamenta en el incremento de susceptibilidad a la desnaturalizaciónin situ de la cromatina que se produce como consecuencia delas roturas en el ADN.
Se deja actuar una solución ácida o una temperatura elevada sobre las cabezas de los espermatozoidespara así desnaturalizar su ADN y posteriormente se tiñe. Mide la susceptibilidad a desnaturalizarse, se desnaturalizará el ADN que presente roturas, mientras que el que está intacto no se descondensa.La tinción se realiza con naranja de acridina (NA), fluorocromo que puede intercalarse entre las dos cadenas de ADN y que tiene la cualidad de ser metacromático, capaz de teñir de un color distinto al propio colorante. Emite fluorescencia verde o roja a distinta longitud de onda y esta dependerá de si el ADN esta en forma de doble cadena o de cadena sencilla, intacto o fragmentado, respectivamente. Si este fluorocromo se incorpora a ADN de cadena sencilla lo hace formando agregados y emite color rojo-anaranjado y si lo que emite es color verde se
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ha incorporado a cadenas dobles de ADN en forma de monómero. Se analizan 5000 espermatozoides utilizando un citómetro de flujo que calcula el cociente entre fluorescencia roja y la fluorescencia total (fluorescencia verde+fluorescencia roja) (Evensonet al., 1980). Lo que mide es laratio de cadena simple y cadena doble en cada espermatozoide, la relaciónentre espermatozoides con el ADN fragmentadoeintacto, respectivamente. Un mayor grado de desnaturalización indica un ADN con estructura más frágil, es decir una proporción de cadena sencilla mayor que la proporción de cadena doble.El porcentaje de fragmentación de ADN (%DFI: ADNFragmentation Index) que proporciona esta técnica indica la proporción de espermatozoides que tiene el ADN desnaturalizado en un porcentaje medio-alto. Como resultado de esta técnica también obtenemos otro parámetro, el HDS (Hight DNA stability), que indica el porcentaje de espermatozoides inmaduros.A la hora de aplicar esta técnica a la práctica clínica y como resultado de numerosas investigaciones se estableció el punto de corte en 30 que corresponde a un porcentaje de fragmentación (30%) por encima del cual el individuo vería comprometida su fertilidad (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000). Índices superiores al 30% están relacionados además con abortos en el primer trimestre.Actualmente las muestras se clasifican en calidad excelente, con %DFI menor o igual al 15%, buena calidad si el %DFI se encuentra entre 15 y 30% y por último calidad pobre si el índice supera al 30% (Evenson and Wixon, 2006a).
-Ensayo COMETA(comet assay) oSCGE (Single Cell Gel Electrophoresis)
Se introdujo por primera vez en 1984 por Ostling y Johanson (Ostling and Johanson, 1984). Se basa en el mismo principio que la electroforesis de ADN desnudo,en que las moléculas de ADN tienen distinta capacidad para moverse a través de un gel al ser sometidas a un campo eléctrico dependiendo de su tamaño.
La técnica consiste, básicamente, en incluir la muestra de espermatozoides dentro de un microgel de agarosa sobre un portaobjetos. Se desnaturaliza y a continuación se somete a una solución de lisis con un agente reductor de grupos sulfidrilo, por ejemplo el ditiotreitol (DTT). La cromatina se descondensa al romperse lospuentesdisulfuro existentes en las protaminas de los espermatozoides por la acción del DTT. Después,el microgel es sometido a una electroforesis y tras eso se realiza una
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tinción sobre el mismo con un fluorocromo del tipo DAPI (4,6 diamino-2-phenylindole), IP (Ioduro de Propidio) o SYBR-Green. Al someter al ADN descondensado de un espermatozoide a la acción de un campo eléctrico se mueve desde el polo negativo al positivo. Los múltiples fragmentos de ADN de los núcleos de los espermatozoides fragmentados se van desplazando formando una imagen que recuerda a la cola de un cometa (de ahí su nombre), de mayor tamaño a medida que el grado de fragmentación es mayor. Por el contrario, los núcleos de los espermatozoides que no presenten roturas no generan colas o las que generan son muy discretas (Fig. 9). La cantidad de daño o el porcentaje de fragmentación se cuantifican midiendo la longitud y densidad de la cola del cometa (Singh et al., 1988). Los resultados se analizan con un microscopio de fluorescencia y pueden ser interpretados o bien por un observador experimentado o bien utilizando un software de análisis de imágenes específico. Esta técnica debido a su compleja metodología se utiliza fundamentalmente en investigación.
Sise realiza la desnaturalización en condiciones neutras de pH se evidencian las roturas de cadena doble, pero si lo hacemos en condiciones alcalinastambién podremos visualizarroturasde cadena sencilla y la existencia de puntos lábiles alcalinos,ya quelos ambientes con pH altos ayudan a desnaturalizar el ADN. Existe una variante de esta técnica, el ensayo cometa bidimensional, que combina los dos tipos de desnaturalización; en primer lugar se utilizan condiciones neutras y posteriormente condiciones alcalinas evidenciando así tanto las roturas de cadena sencilla como de cadena doble.
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Figura 9.- Ensayo COMETA.Arriba: Núcleo espermático con ADN íntegro. Abajo: Núcleo espermático con ADN fragmentado, se observa el desplazamiento de los fragmentos de ADN al ser sometidos al campo eléctrico. (Cortés-Gutiérrez et al., 2007)
- Test SCD (Sperm Chromatin Dispersion test)
Fue introducido por Fernández y colaboradores en 2003 (Fernández et al., 2003).Existe una versión comercial y se conoce comoel kit Halosperm® (Fernández et al., 2005).Se basa en que al romper los puentes disulfuro que forman las protaminas, y utilizar una solución de lisis que extraiga las proteínas, los bucles de ADN se relajan y forman halos alrededor del núcleo.Los espermatozoides con ADN fragmentado ven impedida la relajación de los bucles y muestran halos muy reducidos o inexistentes, contrariamente a lo observado en espermatozoides sin fragmentación.
Técnicamente,los espermatozoides se fijan con un gel de agarosa de bajo punto de fusión en un portaobjetos pretratado. Se somete a las preparaciones a una solución ácida que induce la desnaturalizacióndel ADN en losespermatozoides. Tras ese tratamiento inicial y por el efecto de una solución de lisis se desproteiniza la preparación eliminando la mayor parte de las proteínas nucleares. Las preparaciones se lavancon una solución tamponada, se deshidratan y se dejan secar al aire. Como último pasose tiñen las preparaciones conel kit Diff-Quik o concolorante deWrighten el caso de ir a utilizar microscopía de campo claro, o con fluorocromos específicos tipo DAPI si se recurre a un microscopio de fluorescencia. En las cabezas de los espermatozoides cuyoADN no está
