Evaluación de la calidad espermática del semen bovino congelado por la penetración de óvulos de ratona

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(1)EVALUACION DE LA CALIDAD ESPERMATICA DEL SEMEN BOVINO CONGELADO POR LA PENETRACION DE OVULOS DE RATONA. José L Estrada L , Hernando Gullérrez De La R • José I Ramos D •. RESUMEN. En el Laboratotto de Flslologfa y Genética AOImal dellCA en Tibaltatá, se utilizó semen bovmo congelado y óvulos de ratón para evaluar una técnica de laboratono, basada en la cuantificación de óvulos penetrados por espermatozoides de toro A las ratonas donantes de óvulos, se les aplicaron 10 UI de gonadotropma de suero de yegua preñada (PMSG}y 48 horas después 10 UI de gonadotropma cortomca humana (HCG) para favorecer el creCimIento folicular La tasa de penetración, difirió Significativamente (P..::: 0.05) entre los óvulos recuperados a las 20 horas (57 7%) Y los recuperados a las 16 y 13 horas (42 9 Y 38 1% respectIvamente) después de la myección de HCG AdIcIonalmente, se evaluaron tres medios de cultivo' Ham F-10 Rmgery PBS con un mejor resultado en cuanto a penetracIón ovular de los medIos Rmger y PBS (56 2 Y 50 4% respectivamente), los cuales dIfieren slgOlflcatlVamente (Pe::: O 05) del medio Ham F-10 (32.1%) El desarrollo de esta tecnologra permitirá adelantar posteriores trabajOS que establezcan a OIvel de laboratOrio patrones de evaluaCión más ajustados sobre la capaCidad fertilizadora del semen bovino. Palabras Claves AdIcIOnales OOCltO semen bovino penetración espermática. ABSTRACT. Mouse ova Penetratlon Test forthe Evaluatlon o, Frozen Bull-Semen Quahty. Bovme frozen semen collected at the AOImal Physlology and Genetlcs Laboratory, was used to assess a new tecOlque for semen evaluatlon,based on the use of mlce ova to evaluate the penetratlon rate Ova were collected from female mlce myected wlth 10 IU of PMSG and 10 IU of HCG, 48 hours later They were recovered 13, 16 or 20 hours after HCG inyectlon SlgOlflcant dlfferences were observed among ova collected 20 hours (57 7% pe-. • MV MS Ph o. MV MS Ph o y MVZ MS Programa de Flslologla y Genéllca Animal ICA·. Tlbaltatá A A 161123 El Dorado Bogotá. 287.

(2) REVISTA ICA. Vol. 26. Julio - Diciembre 1991. netraUon rote) after HCG InyecUon and those collected 16 and 13 hours (42.9 and 38.1 qll penetratlon rate respectlvely) after HCG InJecUon. Additlonally, three culture media were evaluated (Ham F·10, Ringer and PBS). Rlnger (56 20/0) and PBS (50 40/0) media showed better spermatic penetratlon rate (P<O 05), than Ham F-10 (32.1%) medium. This technique Is a very useful tool to develop new standards to evaluate the fertllizatlon rate of bovine semen In the lab. Addltlonal Index Words. Oocyte. semen. bovme, sperm penetratJon. El semen bovmo. antes de su procesamiento y después de su dilución y congelación, debe ser evaluado para determmar por métodos en su mayorla subjetivos su capacidad fertilizante Sm embargo los métodos tradicIonalmente empleados, que Incluyen rutmanamente la motllrdad tanto masal como mdlvldual. el porcentaje de espermatozoides VIVOS, el porcentaje de espermatozOIdes morfológlcamente normales y algunas otras pruebas empleadas esporádicamente, tales como el mvel de transammasa glutámlca-oxalacétlca (GOT) y el metabolismo espermático por la reducCión del azul de metlleno. (Hafez, 5) no refleja el real comportamiento del semen frente al óvulo en el tracto reproductivo de la vaca como lo muestran las bajas correlacIones eXistentes entre estas evaluaCiones y el Indice de no retorno, lmdford, et al (9) Boatman y Bavlster (3) observaron una alta correlación entre la expresión motllldad hlperactlVada de espermatozoides de mono rhesus y su habilidad para penetrar la zona pelucrda de óvulos de rhesus in vltro, además Rogers (12), encontró que los espermatOZOides de algunas especies como el ratón, rata, cobayo y humano ganan la ha bllrdad de fertllrzar óvulos cuando son inCUbados en un mediO relativamente Simple desde el punto de vista qUlmrco los espermatOZOides capaCitados In vltro.. 288. están en condiCiones de penetrar el óvulo para lo cual tienen que atravesar la corona de células y la zona peluclda que es una capa protélca no celular que rodea el 00Cito de los mamlferos (Wrrght, W Jr et al, 15). Se ha reportado dificultad en la penetración cruzada de OOCltos de ratón por espermatozOIdes de rata y hamster (Hanada y Chang, 6) Sin embargo. experimentos de este orden no se han reahzado con semen de animales doméstiCOS Sm embargo. la penetración cruzada de OOCltos de hamster. ha Sido utilizada con buenos resultados para evaluar la fertilidad del semen humano (Wolf 13) Por tal motivo. se planteó el presente expenmento, buscando una técnrca. que aunque también "m vitre", semejará más los eventos que se suceden en el proceso de la fertilizaCión, dentro del tracto genital de la hembra bovma. MATERIALES Y METO DOS. El expenmento se realizó en los laboratonos del Programa de Flslologfa y Genética Anrmal del ICA en el CI TlbaJtatá Se utilizó semen bovmo procesado y congelado en paJillas, las cuales fueron descongela-.

(3) ESTRADA L., J.L. "al. Calidad espcnnátlca del semen bovino.. das en agua a 37'C y evaluada su motlhdad y estructura acrosomal. mente con duraCión de 10 minutos cada una. Los óvulos fueron recuperados de ratonas de la cepa "Albinos SUIZOS" con edades entre 6 y 10 semanas Estas ratonas fueron Inyectadas Intrapentonealmente con 10 UI de PMSG (Gonadotroplna de Suero de Yegua Preñada) y 48 horas después recibieron una myecclón de 10 UI de HCG (Gonadotropma Canónica Humana) para mduclr la ovulación. La evaluación estadlstlca Incluyó un anáhSls de varianza, con una prueba de Tukey para establecer las diferencias entre los tratamientos. Los OOCltOS fueron recuperados directamente de los ovanos de las ratonas Se evaluó la respuesta a la penetración espermática, empleando tres diferentes tiempos de recuperación de los óvulos, después de que la ratona reclbla la inyección de HCG. GRUPO I Ovulas recuperados a las trece horas GRUPO 11 Ovulas recuperados a las dleClselS horas GRUPO 111 Ovulas recuperados a las veinte horas. Se empleó un diseño completamente aleatoTlo con un arreglo factorial 3 x 3, en donde los factores fueron Factor 1 Tiempo de extracción de los óvulos 3 niveles Ao = 13 horas At = 16 horas A2 20 horas. =. Factor 2 Medios de cultivo. 3 niveles Bo = Medio Rmger. Bt = Medio Ham B2 = Medio PBS. Tratamiento. Una vez recuperados los óvulos, se pasaron a su respectivo medio de cultiVO, se lavaron y finalmente se depOSitaron en mediO limpiO para maduración por ocho horas antes de ser expuestos a los espermatozoIdes Tres medios de cultivo fueron empleados Medio I Ham F-10 (Laboratorio GIBCO) Medio 11 Rlnger Mela 111 P B S La capacitación espermática se hiZO por centrifugación segun 10 descTlto por Noyes et al (10), utilizando tres etapas de centnfugaclón de 150, 550 Y 715 9 respectiva. RESULTADOS Y DISCUSION. Para evaluar los tres medios propuestos, se emplearon como variables, la moti l/dad iniCial y final de los espermatozOIdes y el numero de óvulos penetrados Los resultados se presentan en la Tabla 1. 289.

(4) REVISTA leA. Vol. 26, Julio - Diclcmbrc 1991 TABLA 1. Medio. Ham F 10 Rlnger. PBS. Erecto del medio sobre la penetración espermática In vltro. Motllldad Inicial (%). Motllldad final (%). Ovulos penetrados (%). 255. 29 O a385 b 330 b. 562 b 50 4 b. 31 O 340. 321. a. • Promedios con distinta letra difieren slgnlrlcatlvamente (P.e. O 05). Se observa una mejor motlhdad cuando los espermatozoides son suspendidos en el mediO Rlnger dado que es un mediO que SI bien no posee un nivel tan alto de Na + como el PBS O el Ham F 10 tiene la relación Na/K más alta, lo cual Influye directa mente en la activaCIón espermática como lo demostraron Wong y Lee (14). qUienes encontraron una inhibiCIón de la motllrdad espermática cuando se elevaban los niveles de K y se dlsmlnula los de Na- COincide también con los trabajOS de Frazer (4) qUien encontró que la hlpermotllrdad espermática era redUCida cuando se elevaban los ",ve les de K +. esto está también correlaclo nado con condiciones In VIVO como un mecanismo de protección de la supervIvencia espermática. ya que mantiene los es permatozoldes en estado de rnactlVldad hasta que llegan al ampula, en donde se en cuentran los mayores valores de la relaCión Na+/K+ y es el SitiO en donde se realrzará el encuentro con los óvulos Esta hlperactlvaclón de los espermatozoides en un mediO especifico es un buen mdlcador de la capaCitación espermátIca como lo expresan Boatman y Bavlster (3) Un mayor contenido de Ca- + puede ser otro factor determinante para los mejores re sultados obtenidos con el mediO Rmger Yanaglmachl y USUl (16) demostraron que la ausenCIa de Ca +- en el mediO previene la hlperactlvaclón de los espermatozOides La penetración espermática fue evaluada. 290. segun los cntenos expuestos por Bavlster (2) es deCir. por la presenCia de espermatozoides en el Vitelo (FIgura 1) Con base en el cnteno antenor. para la evaluaCión de la penetración espermática se observa en los resultados de la Tabla 1. la misma tenden cla del efecto del mediO, con un mayor porcentaJe de óvulos penetrados. cuando los óvulos y espermatozOides eran suspendIdos en el medIO Rmger o en el mediO PBS con diferenCia estadlstlcamente Significativa (P"- O 05) frente al mediO Ham F-10 En este caso nuevamente el calCIO Juega un papel preponderante ya que mtervlene directamente en la reacción acrosómlca, convlr tiendo Junto con la ATPasa. la proacrosma biológicamente activa y fUSionando la mem brana plasmática con la membrana acrosó mica externa (Yanaglmachl y USUl, 16) y asegurando que el espermatozOide se adhiera a la zona peluclda del óvulo (Heffner, et al 7) La relativa buena respuesta del mediO PBS está ayudada en parte por la presencia de glucosa como fuente de energla que segun Pavlok (11) Hoppe, (8) y Bavlster y Yanaglmachl (1) es determinante en la reacción acrosómlca de los espermatozol des En la Tabla 2 se encuentran los resultados obtenidos sobre el efecto que la hora de recuperación de los óvulos tuvo sobre la penetración espermática.

(5) ESTRADA L., J.L.. el. al. Calidad espennática del S€men bovmo.. a que los óvulos tuvieron más tiempo para completar su proceso de maduracIón Además, las células del cumulus presentaban un aspecto menos denso y compacto que las de horas más tempranas, demostrando mayor grado de maduracIón permitIendo un mejor acceso de los espermatozoIdes al óvulo En la Tabla 3 se presentan los resultados obtemdos con cada medio en cada una de las horas de recuperacIón de los óvulos FIGURA 1. espermatozoide bovino con la cabeza. Se observa que no eXiste ninguna correlaCIón interacCión entre el medio utilizado y la hora de recuperación de los óvulos econtrándose que los óvulos recuperados a las 20 horas son los que permiten una meJor penetracIón espermática independIentemente del medIo utilizado, y que Jos mejores mediOS se comportan como tajes con cual· qUIera de los tres tIempos de recuperacIón. °. dentro del citoplasma del ooclto de rae tona (400x contraste de fase). Se observa una tendencia a aumentar el porcentaje de penetración, en la medIda en que se Incrementa el Intervalo en horas entre la aplicación de la HCG y la recupera Clón de los óvulos, lo cual se puede deber TABLA 2. Efecto de la hora de recuperación de los óvulos sobre el porcentaje de penetración. Horas post-HOC. No Total óvulos. No óvulos penetrados. " óvulol3 penetrados. 13. 30. 11. 36 7 a·. 16. 30 30. 13. 43 3 a. 17. 567 b. 20. • Letras distintas difieren slgnlrlcaUvamente (P<. 005) TABLA 3. Penetración espermática con tres medios y tres Intervalos de recuperación de los óvulos.. Porcentaje de óvulos penetrados. 13 horas. medio Ham F 10 Rlnger PBS. 27 O A·. a-·. 4588 a 4158 a. 16 horas. 20 horas. 273 A* a. 421 A* a. a a. 6898 b 6228 b. 5388 4768. Letras mayusculas de las columnas dIfIeren slgnUlcaUvamente (P¿ O OS) Letras mlnusculas distintas en las filas dHleren significativamente (P<O 06). 291.

(6) REVISTA ICA. Vol 26. Julio - Diclembre 1991 sorne reactlon and hyperac!lvated mOllllly In vi· Iro J Reprod FerUl 69539·553. CONCLUSIONES. Con base en la InformacIón obtenIda se pueden establecer las sIguIentes observacIones - El medIo Arnger fue el que mejor se com portó tanto en la motllldad espermátIca como en el porcentaje de óvulos penetra dos, y el medIo pas se presenta como una buena alternativa en este tipO de tra baJO La recuperación de los óvulos a las 20 ha ras post-HCG mostró los mejores resultados de penetracIón espermática independientemente del medIo utilizado Esta es una técnrca que puede emplearse para la evaluacIón del semen bovrno aun que debe validarse empleando semen de toros con un grado de fertilidad conOCIdo por su tasa de fertilidad en vacas - Se abre la neceSidad de congelar óvulos de ratona y tenerlos disponibles para práctica rutlnana en el laboratOrio REFERENCIAS BIBLlOGRAFICAS. 6. Hafcl, E S E 1987 Semen evaluaUon En Re· productlon In farm anlmals E S E Harez 5a edlc Lea Faberger. Phlladelphla pp 455-480. 6. Hanada, A , Chang, M C 1978 Penetratlon 01 the zona free or Intact eggs by lorelgn sperma tozoa and the fertlhzatron of deer mouse eggs in vltro J Exp Zool 203 277 286. 7. HeUner, LA, Sallng, P M ,Slorey, B.l 1980 Separatlon 01 calclum eflecls on motll1ty and zona biOdlng ablhty al mouse spermalozoa J Exp Zool 21253-60. 8. Hoppe. P C 1976 Glucose requenment for mouse sperm capacJlatlon In Vltro Blol Reprad 1539-45. 9. Llndford. E, Glover, FA. Bishop, e, Ste1976 The relallonshlp belween se men evaluatlon methads and fertlhty 10 the bull J Reprad Fert 47283-291. wart. o L. 10. Noyes, R W , Walton, A, Adams, C E 1958 Capacltatlon of rabblt spermalozoa J Endoerl nol 17374380. 11. Pavlok, A 1968 Fertlhzatlon 01 mouse ova In vltro I Erreet 01 sorne lactors on fertlhzatlon J Reprod Fertll 16401-408. 12. Rogers, B J 1978 Mammallan sperm capaCI taliOn and fertllizallon In vltro A critique 01 met hodology Gemele Res 1 165-223. 1. Bavlster,B D, Yanagimachl, R 19n Theel fects 01 sperm extracts anCl energy sources on lhe mOllh!y anCl acrosome reaCllon 01 hamster spermatozoa 10 vltro Blol Reprod 16 228-237. 13. Wolt. O P 1988 Assessment 01 human sperm fertlhty potentlal En WolI, O P In vltro lertlll zatlon and embryo lransler Plenum Press N Y pp 125-136. 2. Bavlsler, B o 1981 Analysls al culture media lor In vltro fertlhzallon anCl entena lor success En Fenllrzatlon and embryonlc developmenl In Vltro Edil LUlgl MaslrOlanOl Jr and John O Blg gers Plenum Press N Y 37 P. 14. Wong, P y O ,Le~, W M 1983 Potasslum movement dunng sodlum Induced motlllty rnlllallon In Ihe ral caudal epldldymal spermatozoa 8101 Reprod 28206-212. 16. 3. Boatman, DE, Bavlster. B O 1984 Stlmula tlon 01 rhesus monkey sperm eapaeltallon by cy chc nucleotld medlators J Reprod Fertll 71357366. Wrlght, R W Jr 1977 Comparatlve propertles 01 the solublhty 01 the zona pelluclda on lertlh zed mouvrne ovrnl and bovrne eggs J Amm SClence 44 850-853. 16. Yanaglmachl, R , Usul, N 1974 Calclum de pendence 01 the acrosome reaCllon and activa Ilon 01 gUinea plg spermatozoa Exp Gell Res 89161 174. 4. 292. Frazer, l R 1983 Potasslum lons modulate ex presslon of mouse sperm fertlhzlng ablhty acro-.

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