El Papel de la Trehalosa en la Criopreservación de Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E C Hansen Edición Única

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(2) INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y AGRICULTURA. EL PAPEL DE LA TREHALOSA EN LA CRIOPRESERVACION DE Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen. TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:. MAESTRIA EN CIENCIAS ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA. EDGARD OSWALDO CALDERÓN ARCE. FEBRERO DEL 2002.

(3) INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY. CAMPUS MONTERREY. DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA. PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA Los miembros de este comité recomendamos que la presente tesis del Biol. Edgard Oswaldo Calderón Arce, sea aceptada como requisito parcial para obtener el grado académico de Maestría en Ciencias con Especialidad en: BIOTECNOLOGÍA COMITÉ DE TESIS. Dra. Rosamaría López-Franco. M en C Luis Cástulo Damas Buenrrostro SINODAL. ASESOR. M en C Martha Alejandra Morgado Munguia SINODAL. APROBADO Dr. Federico Ángel Viramontes Brown Febrero del 2002.

(4) INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y AGRICULTURA. EL PAPEL DE LA TREHALOSA EN LA CRIOPRESERVACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen. TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:. MAESTRÍA EN CIENCIAS ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA. EDGARD OSWALDO CALDERÓN ARCE. Febrero del 2002.

(5) ÍNDICE ÍNDICE. I. ÍNDICE DE TABLAS. vii. ÍNDICE DE FIGURAS. ix. 1. INTRODUCCIÓN. 1. 1.1. Generalidades de Saccharomyces cereviseae. 1. 1.2. Métodos de almacenaje de cepas. 4. 1.3. Criopreservadores. 5. 1.4. La trehalosa. 7. 2. ANTECEDENTES. 11. 3. OBJETIVOS. 16. 3.1. Objetivo general. 16. 3.2. objetivos particulares. 16. 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. Microorganismo de estudio. 17 17. 4.1.1. Preparación y almacenaje de resguardos. 17. 4.1.2. Reactivación de la cepa. 17. 4.1.3. Cinética de crecimiento. 18. 4.2. Porcentaje de células muertas. 18. 4.2.1.1.. Interpretación. 19. 4.2.1.2.. Cálculo de los resultados. 19. 4.3. Análisis fisiológico: Asimilación de aminoácidos y carbohidratos para levaduras. 19. 4.3.1. Pruebas de asimilación de aminoácidos. 20. iii.

(6) 4.3.2. Interpretación de resultados. 20. 4.3.3. Pruebas de asimilación de carbohidratos. 21. 4.3.4. Método Api 20 AUX. 22. 4.4. Determinación de trehalosa. 22. 4.4.1. Pasos preparativos para la extracción de trehalosa. 22. 4.4.1.1.. Preparación de crisoles. 22. 4.4.1.2.. Obtención de 12 mg de células (peso seco). 23. 4.4.1.3.. Extracción de la trehalosa. 23. 4.5 Determinación de azúcar intracelular. 24. 4.5.1 Cuantificación de azúcares por el método del reactivo de Antrona. 24. 4.5.1.1. Curva de calibración. 24. 4.5.1.2. Análisis de las muestras tratadas. 26. 4.5.2 Determinación de trehalosa mediante el método enzimático para la determinación de glucosa (Peroxidasa oxidasa). 25. 4.5.3 Contenido de trehalosa intracelular total. 26. 4.6. Análisis morfológico. 27. 4.7. Número de cicatrices. 27. 4.8. Tratamientos térmicos. 28. 4.9. Tratamiento 40 °C. 29. 4.10 Tratamiento 10 °C. 29. 4.11 Estrategia experimental tratamiento térmico a 10 °C. 30. 4.12 Estrategia experimental tratamiento térmico a 40 °C. 31. 4.13 Preparación de las cepas para congelación. 32. 4.14 Reactivación de los tratamientos. 33. 4.15 Análisis estadístico y evaluación. 33. 4.16 Diseño experimental. 34. 5 Resultados. 36. 5.1 Diagnóstico inicial: características morfológicas y fisiológicas. 36. iv.

(7) 5.1.1 Diagnostico inicial. Cinética y porcentaje de células muertas 5.1.2 Diagnostico de los viales de resguardo. 36 36. 5.1.3 Análisis de las características morfológicas y fisiológicas. 37. 5.1.4 Determinación del número de cicatrices. 38. 5.1.5 Asimilación de aminoácidos. 39. 5.1.6 Asimilación de carbohidratos. 40. 5.2 Características de la cepa previa a los tratamientos térmicos (cél/ ml_, número de cicatrices y contenido de glucosa y hexosas totales. 41. 5.3 Contenido de azúcares totales, glucosa y trehalosa posterior al tratamiento térmico. 43. 5.4 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos (obtenidos por el método de Peroxidasa oxidasa). 45. 5.4.1 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos (obtenidos por el método de Antrona) 5.5. 46. Resultados de los análisis elaborados después de 60 días de almacenaje a -86 °C. 5.6. 47. Porcentaje de células muertas y su comparación entre tratamientos. 47. 5.6.1 Porcentaje de células muertas vs. contenido de trehalosa 5.7. 48. Número de cél/mL respecto a la condición de almacenaje después de su reactivación. 51. 5.8 Pruebas fisiológicas (asimilación de aminoácidos y carbohidratos antes y después del almacenaje a -86 °C 5.8.1. 54. Pruebas de asimilación de aminoácidos. 54. 5.8.2 Pruebas de asimilación de carbohidratos. 55. 5.8.3 Pruebas rápidas de identificación Api 20 C AUX. 56. 6 Discusiones. 57. V.

(8) 7 Conclusiones. 65. 8 Bibliografía citada. 67. 9 Anexos. 71. vi.

(9) Índice de tablas No.. Descripción. Pag.. 1. Carbohidratos y aminoácidos a usar en las pruebas de asimilación. 21. 2. Curva estándar para cuantificar azúcares totales por el método de antrona. 25. 3. Condiciones de almacenamiento. 32. 4. Diagnóstico base para la asimilación de aminoácidos. 39. 5. Diagnóstico base para la asimilación de carbohidratos. 40. 6. Diagnóstico base de las pruebas fisiológicas mediante el sistema. 41. rápido Api 20C AUX. 7 8. Número de cél/ mL, frecuencia y contenido de glucosa y hexosas totales de la cepa antes del tratamiento térmico Contenido de trehalosa en los tratamientos térmicos con y sin. 42 43. trehalosa incluida en el vehículo de tratamiento. 9. Determinación de trehalosa (mg/gcel) por dos diferentes métodos. 44. antrona y trehalasa 10. Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes tratamientos provenientes del método de Peroxidasa oxidasa (por el método de muestras pareadas de t-studen, SPSS para Windows versión 9). 45. 11. Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes tratamientos Por el método de antrona 40 °C (por el método de muestras pareadas de t-student, SPSS para Windows versión 9). 46. 12. Asimilación de aminoácidos para el control de 10 °C después de 60 días de almacenamiento. 72. 13. Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C sin la adición de trehalosa al medio después de 60 días de almacenamiento. 73. 14. Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C con adición de trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento. 74. vii.

(10) 15. Asimilación de aminoácidos para el control de 40 °C, después de 60. 75. días de almacenamiento. 16. Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C sin adición de trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento. 76. 17. Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C con adición de trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento. 77. 18. Asimilación de carbohidratos para el control 10 °C después de 60 días de almacenamiento. 78. 19. Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C sin la adición de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento. 78. 20. Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C con la adición de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento. 79. 21. Asimilación de carbohidratos para el control de 40 °C después de 60 días de almacenamiento. 79. 22. Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C sin la adición de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento. 80. 23. Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C con la adición de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento. 80. 24. Pruebas Api 20 C AUX para el control de 10 °C después de 60 días de almacenamiento. 81. 25. Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 10 °C sin la adición de. 81. trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento 26. Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 10 °C con la adición de. 82. trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento 27. Pruebas Api 20 C AUX para el control de 40 °C después de 60 días de. 82. almacenamiento 28. Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C sin la adición de. 83. trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento 29. Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C con la adición de. 83. trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento 30 31 32. Constituyentes del medio basal para las pruebas de aminoácidos y carbohidratos Cantidades en gramos de los aminoácidos usados en las pruebas de fisiológicas Cantidades en gramos de los carbohidratos usados en las pruebas de fisiológicas. 90 91 91. viii.

(11) Índice de figuras No. _. Descripción. Pag.. Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisea: Esporulación. Cuando se aparean células hapoides de diferente tipo sexual, se obtienen células diploides. Estas pueden dividirse mitóticamente, en el último caso se obtienen cuatro esporas haploides (Gonzáles, 2000). 2 Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Las células haploides y diploides pueden tener diferentes vías de desarrollo. Las señales fisiológicas están implicadas en la diferenciación tanto hacia el crecimiento pseudohifal como al invasivo (Gonzáles, 2000). 3 Representación de la acción protectora de la Trehalosa (Lodato, ef al.,. 9. 1999). 4 Biosíntesis de la Trehalosa en Saccharomyces cerevisiae (Arguelles,. 10. 2000). 5 Observación del desempeño de la cepa de S.cerevisiae al ser. 36. reactivada del vial original aportado por CCM. 6 Diagnostico de los viales de resguardo. 37. Observación del número de cicatrices en una cinética de 48 h. 38. 7. 8. Porcentaje de células muertas en función de la condición de almacenaje según la nomenclatura de la estrategia experimental de las. 48. Figuras 4.11 y 4.12.. ix.

(12) 9. Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosa. 50. para el tratamiento térmico a 40 °C. 10 Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosa. 50. para el tratamiento térmico a 10 °C. 11 Número de células por mililitro agrupadas por serie, al reactivar los. 52. tratamientos después de 60 días de almacenamiento 12. Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la serie de tratamientos térmico a 40 °C después de de la reactivación de la. 53. cepa. 13 Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la serie. 54. de tratamientos térmico a 10 °C después de la reactivación de la cepa 14 15. Relación de los aminoácidos en los que no se observó crecimiento para las diferentes series (a excepción de la Usina) Resultado de la asimilación de Trehalosa por medio de la prueba rápida de identificación Api 20 AUX en las diferentes series. 55 56. 16 Observación de las cicatrices en levadura por medio de la tinción de Blanco de calcoflour a un aumento de 40X. 88. Observación de las cicatrices al microscopio de florescencia (flechas amarillas y rojas). 88. Observación de células muertas. Flechas verdes indican a las células. 00. 17. 16 vivas. Flechas anaranjado indica células muertas. X.

(13) 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Generalidades de Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras son hongos de la subdivisión Ascomycotina, clase Ascomycetes,. orden. Endomycetales,. pertenecientes. a. la. familia. Saccharomycetaceae (Winter, 1881). Están agrupadas en 28 géneros y 159 especies.. A nivel de género se caracterizan por presentar células. vegetativas que se reproducen por gemación, partición multilateral y/o elipsoidal.. Las ascosporas o estructuras reproductoras sexuales son. similares a las células vegetativas, sin cadenas bien definidas, más o menos globosas y presentan de una a cuatro esporulaciones persistentes; las ascosporas son usualmente esféricas, a menudo ornamentadas con un surco ecuatorial (Ainsworth y Bisby, 1995). A nivel especie, se diferencian por su capacidad de fermentar azúcares.. Dentro del género Sccharomyces, la especie cerevisiae representa la levadura comúnmente usada y el microorganismo eucarionte mas estudiado. Esta especie se conoce también como la levadura de panadería, ya que se utiliza para preparar el pan. El término levadura proviene del latín levare que significa levantar. El ciclo de vida vegetativo (fase vegetativa), las levaduras se dividen por gemación. La célula hija inicia su crecimiento formando una yema en la célula madre, mientras se lleva a cabo la división nuclear, síntesis de la pared y finalmente la separación de las dos células (Figura 1) (González, 2000)..

(14) Ityo Sexual a. a/* Fusión. Tipo Sexual ct. Wspsnüaáóa. a.. Disección. Esperas faapioidtesr. -C. 4 esporas en una asea. Germinación. Figura 1.- Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae: Esporulación. Cuando se aparean células haploides de diferente tipo sexual, se obtienen células diploides. Estas pueden dividirse mitótica o meioticamente, en el último caso se obtienen cuatro esporas haploides (tomado de González, 2000).. Recientemente se encontró que S.cerevisiae es capaz de formar hifas (pseudohifas) (Figura 2). Aparentemente, la cruzas de poblaciones haploides con diferentes tipos de apareamiento (a y a) y en presencia de algunos estímulos ambientales favorece la síntesis de metabolitos que permiten la expresión de su crecimiento en forma de filamentos o pseudohifas.. Esto. asegura un mecanismo de propagación mas eficiente (Figura 2) (González, 2000)..

(15) Figura 2 Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Las células haploides y diploides pueden tener diferentes vías de desarrollo, ya sea en forma de pseudohifas o levaduriforme. (González, 2000).. El ciclo de vida sexual de S. cerevisiae está determinado por un par de alelos (a y a) heterocigotos denominados MATa y MATa. Si se cultiva una mezcla de los dos tipos de alelos, MATa y MATa, las colonias resultantes serán células diploides heterocigotas MATa/MATa (Figura 3). Las células diploides pueden continuar dividiéndose como heterocigotas, ó debido a estímulos ambientales (como la limitación de nutrientes), pueden esporular y continuar con la fase sexual de la levadura.. Durante la esporulación, las. células diploides se dividen por meiosis, lo que origina cuatro células haploides, contenidas dentro de un saco denominado ascus.. Las aseas. 3.

(16) poseen una pared gruesa que posteriormente se rompe para liberar las células haploides (González, 2000). Entre. las. levaduras. comercialmente. importantes,. se. encuentra. Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, especie que se ha utilizado desde la antigüedad en fermentaciones de azúcares de arroz, avena y maíz. S. cerevisiae es comúnmente usada en la elaboración de pan, y en ocasiones se sugiere como complemento alimenticio, ya que puede contener hasta 50% de proteína, es rica en vitamina B, niacina y ácido fólico (Spelman, 1998).. Destaca actualmente su uso para la producción de. cerveza.. 1.2. Métodos de almacenaje de cepas. En los institutos de investigación y empresas, que utilizan regularmente organismos vivos, existe la necesidad de resguardar y almacenar los organismos. El método de resguardo debe asegurar el mantenimiento de las cepas puras y viables, sin cambios morfológicos ni genéticos. Estos cultivos deben estar disponibles para su uso cuando son requeridos (Gibson, et al., 1986). Por tal motivo, es importante seleccionar adecuadamente el método para conservar y/o almacenar las cepas y así asegurar el abastecimiento continuo de cultivos.. Existen varios métodos de preservación de cepas. son: subcultivo, criopreservación ultracongelación.. en nitrógeno. Los más utilizados. líquido, liofilización y. Las características de sensibilidad y tolerancia de las. diferentes cepas determinan el método de preservación que se deba usar. Algunas características de resistencia de las levaduras se han aprovechado para hacer más eficiente el proceso de almacenaje. S. cerevisiae presenta tolerancia al proceso de congelación durante periodos prolongados de tiempo (Gélinas, et al., 1996).. Se ha tomado ventaja de esta tolerancia en la. industria panadera para la congelación y almacenaje de masas, después de su producción masiva..

(17) 1.2. a. Subcultivo.. Consta en mantener una cepa activa constantemente.. Se realizan. transferencias periódicas, en medio de cultivo apropiado y en condiciones de incubación óptimas. Una vez agotados los elementos nutritivos del medio, se procede a repetir la transferencia o a subcultivar la cepa. Este método es de bajo costo tanto en material como en equipo, sin embargo presenta aspectos desfavorables, como son los cambios genéticos y morfológicos, así como la pérdida de vitalidad y/o viabilidad (Wang, 2000). Con el uso de este método, existe el riesgo de contaminación durante cada transferencia, además de las horas/laboratorista requerido. 1.2.b. Criopreservación en nitrógeno líquido.. Conserva latente los organismos a -196°C.. Las muestras pueden. mantenerse hasta por más de 50 años, sin mostrar reducción significativa de su viabilidad (Smith y Onions, 1994).. Estas se mantienen inmersas en. nitrógeno líquido, constantemente previa con preparación previa a la su congelación.. Este método requiere inversión inicial de equipo para. congelación, además de la necesidad de asegurar el suministro constante del nitrógeno líquido. Aparentemente, los riesgos de mutación se reducen al mantener latente la actividad celular.. Sin embargo, algunas proteínas y. enzimas son vulnerables a las temperaturas tan bajas.. Este método se. considera el más apropiado para el almacenamiento de tejidos animales (Smith y Onions, 1994).. 1.2.c. Liofilización.. Consiste en eliminar el agua del tejido por medio de la sublimación del agua en tiempos relativamente cortos y a una temperatura menor a -20 °C. Simultáneamente, la muestra se somete al vacío, a presione muy altas del material para retener la forma, estructura y actividad del producto. Se ha.

(18) reportado que ésta técnica ofrece mejores resultados en células y tejidos de origen animal. El costo de equipo y operación, aunado a las dificultades intrínsecas asociadas con la conservación en frío es muy elevado, por ello, frecuentemente se descarta éste método. Por otra parte, se ha reportado, la presencia de mutaciones espontáneas en bacterias y levaduras sometidas a este proceso de preservación, además, de la disminución paulatina de su viabilidad conforme se incrementa el tiempo de almacenaje. (Diniz-Mendes, 1998, Smith y Onions, 1994).. 1.2.d. Ultracongelación.. Consiste en mantener los organismos a una temperatura de -86°C. Las muestras. almacenadas. en. ultracongelación,. previa. preparación,. se. conservan por largos periodos de tiempo ya que el metabolismo celular se reduce cuando el agua interna es congelada (Smith y Onions 1994). Este método se caracteriza por ser de fácil manejo y bajo mantenimiento, aunque, requiere la inversión inicial de equipo y permite el fácil acceso a los microorganismos, cuando son requeridos. organismos, por encontrarse. Otra ventaja, es que los. en un estado de latencia, no están,. aparentemente sujetos a cambios morfológicos o fisiológicos. Sin embargo, es indispensable que el proceso de descongelación sea el adecuado, debido al posible daño por la recristalización del agua al pasar por -60°C (Morris, 2000).. 1.3. Criopreservadores.. Los métodos de congelación requieren de la preparación de las muestras para protegerlas de bajas temperaturas y deshidratación. Actualmente, se utilizan agentes que coadyuvan en el proceso de congelación contra el daño debido a la recristalización del agua al pasar por -60°C al momento de descongelarlas. Durante éste proceso, es dónde se origina el daño celular debido a la formación masiva de cristales que atraviesan el interior de las células, lo que afecta membranas, organelos, etc. A la fecha, se conocen y.

(19) utilizan. varias. substancias. permeantes. y. no. permeantes. como. crioprotectores. 1.3.a. Permeantes. Este tipo de crioprotectores, penetran la célula e interactúan con las proteínas celulares. Los crioprotectores previnienen la desnaturalización de las proteínas mediante interacciones hidrofóbicas. Durante el proceso de congelación, se forman complejos agregados entre el crioprotector las moléculas de agua, donde forman pequeñas estructuras cristalinas que, al momento de descongelar a las células, estos inhiben el proceso de recristalización del agua. Ejemplos: glicerol y dimetilsulfonato (Diniz-. Mendes, 1998). 1.3.b. No permeantes. Este tipo de crioprotectores interactúan con las moléculas de agua, de tal forma que durante el proceso de cristalización, se forman enlaces o interacciones similares a puentes de hidrógeno de las moléculas de agua. Estos enlaces, incrementan el número de interacciones moleculares entre el crioprotector y las moléculas de agua, lo que prevé el fenómeno de separación y/o colapso de las membranas celulares, gracias a la mínima exposición de membranas y organelos celulares con las moléculas de agua.. Algunos de éstos crioprotectores son polímeros, proteínas y. disacáridos, entre éstos últimos, está la trehalosa (Conrad y de Pablo, 1998).. 1.4. La trehalosa. Disacárido no reductor (oc-D-glucopiranosil-[1,1] - a-D-glucopiranosa). En la naturaleza, se encuentra comúnmente en aquellas especies adaptadas a condiciones anhídricas y que se mantienen viables en éstas condiciones. Entre otros organismos se encuentran algunos insectos, lactobacilos y.

(20) levaduras, así como, algunas especies de hueveemos de camarón y nemátodos que se ven expuestos a condiciones de desecación durante alguna etapa de su ciclo de vida (Singer, et al., 1998). La trehalosa actúa como protector de las proteínas contra la desecación durante el proceso de congelación.. La trehalosa promueve un efecto destructivo sobre la red. tetraédrica de enlaces de hidrógeno del agua durante el proceso de recristalización (Lodato etal., 1999).. La capacidad de formar interacciones a nivel molecular, que modifican el arreglo de las moléculas de agua citoplásmica, así como su asociación con proteínas, ha sido utilizada para usar la trehalosa como un criprotector. La trehalosa coadyuva en el proceso de desnaturalizacón de las proteíans por efecto de altas temperaturas, debido a que estabiliza el sustrato donde se encuentran éstas, lo que previene o reduce el proceso de agregación de proteínas denaturalizadas (Figura 3). Por otra parte, también se ha visto que puede coadyuvar al proceso de recuperación de la estructura natural de proteínas que se han visto afectadas por la temperatura actuando como una proteína chaperona en este proceso (Singer, etal., 1998).. En general, dada su estabilidad química y capacidad de prevenir en la formación de cristales de hielo durante la recristalización del agua, la trehalosa protege del daño celular al que se ven expuestas las células durante proceso de descongelación (Voet. et al., 1995 y Conrad y de Pablo, 1998). Más aún, se ha reportado que cepas de levaduras almacenadas con trehalosa adicionada al medio como crioprotector, muestran mayores porcentajes de viabilidad al ser reactivadas (Lodato et al., 1999, Arguelles, 2000)..

(21) Figura 3 Representación de la acción protectora de la Trehalosa (Tomado de: Lodato era/., 1999). S.cerevisiae, sintetiza produce trehalosa en el cytosol a través de la acción secuencial de las proteínas Tps1 p y Tps2p que físicamente forman el complejo trehalosa-sintetasa y junto a los complejos TsHp o Tps3p que regulan la actividad del complejo. En este proceso comprende dos pasos catalíticos en los que intervienen: trehalosa-6-fosfato sintasa y trehalosa-6fosfato fosfatasa (Bell, W. et al., 1998). Durante esta reacción los grupos fosfatos son liberados de los anillos de trehalosa y reciclados como fosfatos libres, formando así el disacárido trehalosa (Figura 4). Durante este proceso, la trehalosa ya sintetizada se transporta del citosol al núcleo, donde es acumulada. Lo que muestra que en respuesta a los cambios de temperatura la trehalosa se moviliza de un lugar a otro donde es requerida (Bell, W. et al., 1998). La trehalosa es considerada como un carbohidrato de reserva, la cual es catabolizada cuando el nivel de glucógeno intracelular es bajo (Bell, W. et al., 1998). Por su papel como crioprotector, así como por representar una fuente alternativa de carbohidratos, se considera como gran ventaja, el uso.

(22) de éste disacárido en el proceos de criopreservación. en los bancos de. germoplasma de levaduras.. o-. I HOCHj. "O—p=o O" H |!. HO. G lucose-6- phosphate. Undine-diphosphale-glucose. HN. CH. O=dC. CH. N C'. Q. 0—P—O—P—O—CH^^N.. *- £ OH. H. pi. JN/ OH. HÓ. I. OH. T rehalose-6-p h ospha te Uridine cíphosphate. He o•o—p=o. oH. HO Inorganic phosphcite. Treh alose. Figura 4.- Biosíntesis de 4a Trehalosa en S.cerevisiae ('Arguelles, 2000). 10.

(23) 2. Antecedentes Algunos microorganismos tienen la capacidad de resistir variaciones térmicas debido a la síntesis de compuestos que protegen la integridad de sus biomoléculas. Lodato etal. (1999) describieron que posterior a un estrés térmico las células de S. cerevisiae, mostraron un incremento en el contenido de trehalosa intracelular.. Además correlacionaron el incremento de éste. disacárido con la capacidad de protección a las proteínas citosólicas de la levadura durante las condiciones térmicas desfavorables.. En condiciones nutricionales pobres, las levaduras utilizan la trehalosa externa como material de reserva.. Esta capacidad de utilización de éste. disacárido, depende también de la presión osmótica a la cual están sometidas las células. Bajo ambas condiciones, (altas presiones osmóticas y nutricionales), la trehalosa periplásmica es hidrolizada, en un azúcar asimilable. En condiciones contrarias de baja osmolaridad, la trehalosa es internalizada como trehalosa-6-fosfato por el sistema de transporte fosfotransferasa y posteriormente hidrolizada en glucosa y glucosa-6-fosfato (Horlacher, et al., 1996). Además, también se ha reportado que durante la fase G1, donde se presenta una alta demanda de carbohidratos, el contenido de trehalosa y glucógeno celular disminuye (Silljé, etal., 1999). Esto sugiere que ambos tipos de carbohidratos son metabolizados en situaciones de escasez de alimento o en alta demanda energética de las levaduras. Las levaduras presentan un mecanismo de defensa a condiciones ambientales adversas como agentes químicos y físicos entre otros. (Arguelles, 2000). En condiciones de sequía o de estrés térmico, las células de levadura acumulan trehalosa y esta característica se refleja en la estabilización de las membranas y organelos. Falta Cita bibliográfica aquí.. II.

(24) Fungundas, et al., (1999) observaron el efecto de la trehalosa en fracciones puras de membrana plasmática de Schizosaccharomyces pombe en un estado solubilizado y en un estado reconstituido. Después de incubar éstas fracciones durante 1 min a 51 °C en presencia de trehalosa 1 M, el 50% de la enzima (ATPasa) soluble permanece activa.. En las mismas. condiciones pero sin la presencia de trehalosa, la actividad enzimática esta completamente abolida.. Esto demuestra que la trehalosa incluida en el. medio donde se encuentra la proteína y al someterla a un incremento en temperatura, la proteína no pierde su actividad en el trasporte de iones. Al momento de reconstituir la membrana. y someterla a un incremento de. temperatura, en un medio conteniendo trehalosa observaron que los contenidos de trehalosa internos eran mayores, lo que indica que las levadura pueden sintetizar e internalizar trehalosa como un mecanismo de auto protección.. La resistencia térmica representa una ventaja para cepas que están sujetas a variaciones térmicas extremas. Tracey, et al., (1998), mencionan que cuando las levaduras (S. cereviseae) son expuestas a condiciones de temperatura extremas, se induce el proceso de síntesis de, proteínas denominadas de "choque térmico" y la acumulación intracelular de trehalosa. Aparentemente,. estos compuestos. le confieren. la característica. de. termotolerancia a las células de levadura, ya que se observa un incremento en el porcentaje de sobrevivencia, en condiciones de estrés ambiental. Se ha reportado que la acumulación de trehalosa durante un estrés ambiental previene el daño oxidativo provocado por las altas temperaturas actuando como un componente antioxidante (Benaroudj, et al., 2001). Debido a que las proteínas que se activan mediante un choque térmico y la acumulación de trehalosa están implicadas en la adquisición de termotolerancia en las células, se ha sugerido, que la trehalosa tiene un uso potencial en el proceso de almacenaje. de cepas y conservación. de alimentos,. envasados. congelados, medicamentos y otros productos (Conrad y de Pablo, 1998 ).. 12.

(25) El papel termoprotector de la trehalosa ha sido de gran interés para el almacenaje de masas para pan. Almeida, y Pais (1996), reportan que cepas de Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbrueckii (provenientes de masa de maíz tradicional y masa de pan de centeno), después de haber sido congeladas a -20 °C durante 30 días, no pierden la capacidad de fermentan los azúcares. En estas cepas, se observó que el contenido intracelular de trehalosa presentó un incremento 20% (peso/peso) después del proceso de congelación, y le adjudican la acción de crioprotección a de este azúcar.. En el proceso de preservación y mantenimiento de bancos de germoplasma. generalmente. hay. pérdida. de. viabilidad. de. los. microorganismos durante el almacenaje (Smith y Onions, 1994). Krallish, et al., (1997), también reportan para S. cerevisiae que los niveles de trehalosa intracelular se incrementan durante el proceso de criopreservación, por lo que concluyen que el contenido de trehalosa está relacionado con la capacidad de resistir a procesos de deshidratación/hidratación durante los ciclos de congelación y reactivación de las cepas.. Se ha observado que el contenido intracelular de trehalosa también se incrementa durante otro tipo de estrés. Horlacher, et al., (1996) observaron el incremento de este azúcar en bacterias que se sometieron previamente a un estrés osmótico.. Ribeiro, et al. (1999) pre-acondicionaron células de. Saccharomyces cerevisiae al someterlas a un tratamiento de 40°C por 1 hr y evaluaron el porcentaje de sobrevivencia a condiciones de estrés osmótico en presencia de etanol. Nuevamente, se observó el incremento de trehalosa intracelular, por lo que lo relacionaron como un protector en condiciones de estrés osmótico. Éverson (2000), reporta que la internalización de trehalosa representa una fuente de carbono.. Esto se observa cuando en presencia de otros. 13.

(26) azúcares, la trehalosa no es metabolizada (azúcar no reductor), sin embargo, durante periodos de insuficiencia de alimento, es asimilada a través de la membrana por un sistema de co-transporte. Este sistema de co-transporte que se presenta en situaciones de escasez de alimento se observó la utilización de hexosas y un cierto número de disacáridos como fuente de carbono alterna en situaciones de anaerobiosis. (Efecto Kluyver por la trehalosa). La trehalosa también puede ser internalizada por las levaduras en condiciones normales (sin estrés).. El azúcar es tomado directamente del. medio, por lo que es posible inducir su acumulación interna. Esto se logra al incubar las células en un medio de cultivo rico en trehalosa y así manipular el contenido interno de trehalosa mediante la incubación en presencia de esta en el medio de cultivo. La capacidad de internalización de trehalosa está regulada por la expresión del gen AGT1, que codifica el mecanismo de trasporte a-glucosídico, por medio del cual la trehalosa se internaliza a la célula (Plourde-Owobi, etal., 1999).. Franco, et al., (2000) caracterizaron al gen que codifica la trehalosa-6P sintetasa (tps1), el cual es responsable de los niveles de trehalosa interna en células de levadura. Soto, et al., (1999) demostraron que el sobre-expresión inducido del gen tps1, eleva el nivel intracelular de trehalosa.. Con esta. información, ha sido posible incrementar la resistencia de levaduras a diferentes procesos. de: liofilización, deshidratación, estrés osmótico,. escasez de alimento y niveles tóxicos de etanol. Por lo que se considera que la trehalosa es un metabolito anti-estrés.. Diniz-Mendes, (1998), indica que el uso de trehalosa (adicionada o sintetizada in situ) funciona como crioprotector y ayuda a conservar la viabilidad de los microorganismos almacenados en bancos de germosplama. Las cepas se mantienen homogéneas con mínimos cambios morfológicos y. 14.

(27) genéticos. Es por ello que planteamos la evaluación del uso de trehalosa como un crioprotector durante el proceso de almacenaje de cepas por congelación.. 15.

(28) 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general: •. Determinar el papel de la trehalosa (añadida y sintetizada) como. crioprotector en el proceso de almacenamiento por congelación de cepas de levadura, para asegurar la viabilidad y homogeneidad del inoculo con mínimos cambios morfológicos y fisiológicos.. 3.2. Objetivos particulares 3.1. Determinar el estado original de desempeño fisiológico y morfológico de una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen) para obtener el diagnóstico base. 3.2. Inducir la producción de trehalosa en levaduras mediante tratamientos térmicos y evaluar las condiciones morfológicas y fisiológicas de la levadura post-tratamiento para su congelación. 3.3. Evaluar si la inducción de síntesis trehalosa por tratamientos térmicos ofrece un beneficio en las características morfológicas y fisiológicas posteriores a la congelación. 3.4. Determinar si la adición de trehalosa al medio de cultivo previo a la congelación ofrece un beneficio en las características morfológicas y fisiológicas posteriores a la congelación. 16.

(29) 4. MATERIALES Y MÉTODOS La manipulación de la cepa (inoculaciones, transferencias, preparación de muestras para exámenes y diagnósticos) se llevó a cabo en condiciones de esterilidad dentro de la campana de seguridad biológica. De igual manera se procedió para la preparación de los medios de cultivo. Todos los medios, reactivos, buffers, etc. se esterilizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Sólo cuando se indica, se utilizaron soluciones no estériles. 4.1. Microorganismo de estudio La cepa de Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, fue proporcionada. por el Departamento de Microbiología de. Cervecería. Cuauhtémoc-Moctezuma planta Monterrey, N. L. Esta cepa presentaba aproximadamente 3 meses de almacenaje a 4 °C. 4.1.1. Preparación y almacenaje de resguardos Para obtener suficiente inoculo del vial original se procedió de la siguiente manera: a) se recuperaron las células de levadura de la superficie b) se inoculó un matraz de 250 mL con 150 mL de medio YMB (por sus siglas en inglés yeast maltose broth) c) se incubó durante 48 h a 28° C d) se inocularon por estriación 120 viales inclinados con 5 mL de YMA (yeast maltose agar). Se utilizó una asada por vial e) se incubaron por 48 h a 28 °C f) los viales se almacenaron a 4 °C para su posterior utilización Este método fue recomendado por Damas, L. (comunicación personal). A cada uno de estos viales se les llamó "vial de resguardo." 4.1.2 Reactivación de la cepa Para la reactivación de cada vial de resguardo, se procedió como se indica a continuación:. 17.

(30) a) un vial de resguardo se dejó a temperatura ambiente 20 min b) se inoculó un matraz estéril de 250 mL con 100 mL de medio estéril de YMB con una asada del vial de resguardo c) se agitó vigorosamente en el vórtex d) se incubó a 28°C y 160 rpm durante 48 h. 4.1.3 Cinética de crecimiento Para determinar la evolución de la fermentación se procedió de la siguiente manera: a) De la reactivación previa (4.1.2) se calculó el número de células por mililitro con el hematocitómetro.. Estas cuentas se hicieron por. duplicado. b) se inocularon dos matraces de 250 mL con 100 mL de medio YMB con 5X106células/mL c) se agitaron vigorosamente al vórtex para homogenizar la muestra d) se incubó a 28°C a 160 rpm e) se contaron el número de células cada 12 h f) se graficaron los datos Experimentos previos a esta investigación, arrojaron como resultado que los cultivos alcanzaron un valor máximo a las 48 h (Damas, L., comunicación personal), por tal motivo, La cinéticas de crecimiento en esta investigación se analizaron a las 48 h.. 4.2. Porcentaje de células muertas. Para la determinación del porcentaje de células muertas se procedió a la aplicación del Método Internacional de Tinción de Células Muertas de Levadura (Krallish H. et al., 1997). Esta determinación se llevó a cabo al final de las fermentaciones de la cinética del punto 4.1.3 de la siguiente manera:. 18.

(31) a) se resuspendió un mililitro del cultivo mencionado en un tubo de ensaye 10 mL b) se agregaron 10 mL de la solución de azul de metileno c) se mezcló vigorosamente al vórtex d) se dejó reposar por un min. e) se tomó una alícuota (aproximadamente 10 microlitros) y se depositó en en hematocitómetro f) se procedió a su examen al microscopio con aumento de 20X y 40X g) se contaron 1,000 células por cada muestra y de éstas, se contaron las que tomaron la tinción azul. 4.2.1.1 Interpretación. a) las células teñidas de color azul oscuro se consideraron como células muertas, mientras que las de color azul claro se consideraron como células vivas. b) Las células madres gemando se contaron como una célula, sin considerar el tamaño de la célula hija. 4.2.1.2 Cálculo de resultados. % de células muertas =. No de células teñidas. /. No. total de células. 4.3. Análisis fisiológico: Asimilación de aminoácidos y carbohidratos para levaduras Esta evaluación se llevó a cabo al final de las fermentaciones producto de los tratamientos que se indican mas adelante, de acuerdo al método descrito por. Lavados:. 19.

(32) a) 50 mL de muestra, se transfirieron a un tubo cónico estéril de 50 ml_ para centrifugación b) se centrifugó a 3,000 rpm durante 10mim c) se descartó el sobrenadante d) la pastilla sé resuspendió en 50 mL de buffer de fosfato monosódico a pH 7.0, y se mezclo bien al vortex.. Para eliminar completamente. cualquier nutriente en el medio e) el procedimiento de a)-d), se repitió tres veces f) se resuspendió el botón de la última centrifugación en buffer de fosfato monosódico (pH = 7) en un volumen de 5ml_ Preparación. del. medio. mínimo. basal. (mezcla. de. vitaminas. y. microelementos aun pH 7.27 que permite mantener a la célula en un medio estable sin fuentes de carbono o nitrógeno) (anexo) el cual constituye el medio para las pruebas de asimilación de aminoácidos y carbohidratos: 4.3.1. Prueba de asimilación de aminoácidos El objetivo de esta técnica es incubar a S.cerevisiae un medio de cultivo que contenga como fuente de nitrógeno exclusivamente el aminoácido que se agrega individualmente.. 4.3.2. Interpretación de resultados. Si hay crecimiento de levadura, nos indica que es capaz de utilizar el aminoácido en cuestión como fuente de nitrógeno para llevar acabo sus funciones metabólicas (Krallish H. etal., 1997). a). Se tomo una muestra a una concentración aproximada de 20X106 (proveniente de los 5ml_ de los lavados). Se inoculó cada uno de los aminoácidos y carbohidratos que se enlistan a continuación:. 20.

(33) Tabla 1 Carbohidratos y aminoácidos deasimilación. a. usar. Prolina. Fenilalanina. Arginina. Valina. Alanina. Glucosa. Isoleucina. Maltotriosa. Trehonina. Dextrina. Leucina. Fructuosa. Ac. Glutámico. Control (+). Usina. Control (-). en. las. pruebas. b) los tubos con su respectivo aminoácido e inoculo se incubó a 28°C por 48h. c) se observo la presencia o ausencia de turbidez en cada tubo por comparación con el tubo de control negativo. Si hay turbidez, se lee como (+). 4.3.3. Prueba de asimilación de carbohidratos. El objetivo de esta técnica es incubar a S.cerevisiae un medio de cultivo que contenga como fuente de carbono exclusivamente el azúcar que se agrega individualmente. Si hay crecimiento de levadura, nos indica que es capaz de utilizar el azúcar en cuestión como fuente de carbono para llevar acabo sus funciones metabólicas (Krallish H. et al., 1997) a) se torno una muestra a una concentración aproximada de 20X106 (proveniente de los 5mL del inciso 4.3 ) b) se inoculó cada uno de los carbohidratos (Tabla 1) c) Los tubos con su respectivo carbohidrato e inoculo se incubaron a 28°C por 48h. 21.

(34) d) se observo la presencia o ausencia de turbidez en cada tubo por comparación con el tubo de control negativo. Si hay turbidez, se lee como (+) 4.3.4 Método Api 20CAUX El crecimiento de levaduras en cada tratamiento, determina el desempeño metabólico en relación para determinar la capacidad de asimilación de carbohidratos (Fenn, P. etal., 1994). a) La preparación de la galería se realizó al distribuir 5ml de agua destilada en todos los alvéolos, a fin de crear una atmósfera húmeda. b) Se realizó una suspensión de levaduras de turbidez igual a 2 de McFarland. Para ello se retiró una fracción de colonia mediante una pipeta. c) se depositó una gota de suspensión de levaduras en el RAT Médium (Riz Agar Tween) d) se trasfirió 100 microlitros de la suspensión anterior a una ampolleta de C Médium e) se homogenizó en voortex f) se llenaron las cúpulas con la suspensión en C Médium g) se incubó la tira durante 48 h a 30 °C h) Una cúpula más turbia que el testigo indicó una reacción positiva 4.4. Determinación de Trehalosa. 4.4.1. Pasos preparativos para la extracción de trehalosa. 4.4.1.1. Preparación de crisoles. a) Se desecaron los crisole de porcelana en la mufla a 550°C por 30 min. 22.

(35) b) se trasfirieron los crisoles a un desecador por 20 min c) se registro el peso de cada crisol en una balanza analítica (peso inicial del crisol (Deegenaars, etal., 1998)). 4.4.1.2. Obtención de 12 mg de células (peso seco). a) se reactivó un vial de resguardo de acuerdo al inciso 4.1.2 b) a 50 ml_ de la suspensión de células en cultivo YMB de 48h.. Se. centrifugó a 3,000 rpm por 10 min para eliminar el medio de cultivo c) la pastilla se resuspendió en agua bidestilada (30 mL) estéril y a una temperatura de 4°C, en vórtex d) se repitió el lavado dos veces e) la pastilla obtenida del segundo lavado. Se transfirió al crisol con una espátula, para recuperar la mayor cantidad posible de células f) se introdujeron los crisoles conteniendo el recuperado del inciso e) al horno a 80°C por 48h g) se pesaron los crisoles (+) las células (-peso seco del crisol) = al peso seco de la muestra de células (Lodato, etal., 1999) 4.4.1.3. Extracción deTrehalosa. a) se colocaron 12 mg de células (peso seco) en un tubo ependorí. b) se adicionó 2 mL de ácido tricloro acético 0.5M a una temperatura de 4°C (en refrigeración).. c) se dejó en reposo por 30 min en hielo frape con agitaciones periódicas cada 10 min por inversión (Ferreire et al., 1997, Krallish et al., 1997, Ribeiro etal., 1999) d) se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min e) se recuperó el sobrenadante en un tubo ependorí de 2 mL f) se agregó 0.1 U de trehalasa refrigerada a -20°C. 23.

(36) g) se mezcló por inversión moderada h) se incubó por 1 hr a 37°C en baño maría (Blázquez et al., 1994), con inversiones suaves 3 veces cada 20 min 4.5. Determinación de azúcares intracelular. 4.5.1. Método de cuantificación de azúcares por el reactivo Antrona. Los carbohidratos en presencia de ácido sulfúrico del reactivo de antrona, experimentan deshidratación convirtiéndose en furfurai o hidroximetilfufural. Estos productos al condensarse generan complejos de color verde. La intensidad del color desarrollado esta en función directa de la concentración de carbohidratos presente en la muestra. a) se preparó una curva de calibración con los valores de absorbancia, mostrados por distintas soluciones de concentración conocida de glucosa. 4.5.1.1. Curva de calibración. Se siguió el método sugerido por Krallish, et al., (1997). a) se prepararon seis tubos de ensaye con los siguientes reactivos. 24.

(37) Tabla 2 Curva estándar para cuantificar azúcares totales por el método de antrona Identificación. Concentración. Estándar. del tubo. (mg/mL). glucosa. de. Agua bidestilada. (g/mL). 1. 00. 0.0. 2.0. 2. 10. 0.2. 1.8. 3. 20. 0.4. 1.6. 4. 30. 0.6. 1.4. 5. 40. 0.8. 1.2. 6. 50. 1.0. 1.0. a) se agitó vigorosamente en vortex b) se dejó reposar 10 min en baño de hielo (hielo frape) c) se agregó a cada tubo 4 mL de Antrona al 0.2% en ácido sulfúrico (sin sacar del hielo) d) Se agregó el reactivo de Antrona lentamente por las paredes del tubo inclinado para formar dos fases (inferior amarilla, superior blanca lechosa) Desechar aquellos tubos donde no se haya formado las fases o donde la solución adquiera un color verde. e) Se dejó reposar por 5 min f) Se mezcló vigorosamente en el vórtex g) se regresaron los tubos al baño de hielo (La reacción es exotérmica y se debe evitar el calentamiento. Si esto sucede, la solución se torna verde y se deberá descartar) h) se sumergieron los tubos en un baño de agua hirviendo por diez minutos. La solución cambia a un color verde i) se regresaron al baño de hielo para detener la reacción por cinco minutos. 25.

(38) j) se leyó al espectrofotómetro (una vez fríos) a a 640 nm. Con el tubo 1, se ajusto a cero 4.5.1.2. Análisis de la muestra tratadas a) se utilizó 2 mL de la muestra preparada en el inciso 4.4.1.3 y se desarrollo el protocolo para la curva de calibración, anexando la muestra problema 4.5.2.. Determinación enzimático. de. para. trehalosa la. mediante. determinación. el de. método glucosa. (peroxidasa oxidasa). Se siguieron las instrucciones según el fabricante del Kit para la determinación de glucosa en suero o plasma "Glicemia enzimático" 4.5.3. Contenido de trehalosa intracelular total. a) se reactivó la cepa según el inciso 4.1.2 b) la determinación intracelular de trehalosa se realizó según los incisos pertenecientes 4.4 c) se utilizó para ambos tratamientos térmicos los protocolos descritos en los incisos 4.5.1 y 4.5.2 d) en ambos casos se determinó la glucosa intracelular de la levadura y la glucosa obtenida por la conversión de trehalosa, mediante el uso de la enzima trehalasa. 26.

(39) e) se obtuvo el contenido de trehalosa total por la diferencia entre la glucosa menos la glucosa obtenida a partir de la conversión de trehalosa a glucosa por la enzima trehalasa 4.6 Análisis morfológico Por medio de microscopía y análisis de imágenes, se analizaron alícuotas obtenidas del inciso 4.5.3 de los cultivos para determinar su morfología y número de cicatrices (gemación) (Sinclair, D. etal., 1998).. 4.7 Número de cicatrices Se determinó el número de cicatrices por medio de la tinción de blanco de calcofluor (Campbel y Duffus, 1998). a) se reactivo un tubo del resguardo según el inciso 4.1.2 b) se transfirieron alícuotas de 2 ml_ de la suspensión de células a un tubo ependorí de similar capacidad. c) se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min y se retiró el sobrenadante d) la pastilla se resuspendió en 1 ml_ de buffer de fosfato salino. e) se concentró y se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min f). se descartó el sobrenadante. g) los incisos e)-f) se repitieron 3 veces. h) Tinción de blanco de calcofluor:. el botón del. último lavado se. resupendió en PBS i) se agregó 10 uL de una solución 0.1 ug/mL de blanco de clacofluor. j). se mezcló por inversión del tubo tres veces. k) se dejó incubar por 2 horas I) Conteo de cicatrices.. Se tomó una muestra de 5uL del inciso e),. previamente homogenizada al vórtex m) se observó al micro de florescencia (filtros Barrera 365 - Emisión 450) n) se observó las cicatrices de un mínimo de 60 células o) se obtuvo el promedio (Powell, etal., 2000). 27.

(40) 4.8 Tratamientos térmicos Se siguió la técnica recomendada por Diniz-Mendes, et al., (1999). Debido al número de muestras que se tenían que manejar simultáneamente, los tratamientos de 10 y 40 °C se realizaron con 15 días de diferencia. Los tratamientos de 10 grados se hicieron primero.. a). Se tomó un tubo de resguardo y se reactivó según el inciso 4.1.2 por duplicado. b). se tomó una muestra de 50 ml_ en un tubo cónico estéril para centrifugación. c). se dividió el cultivo original en dos tubos cónicos conteniendo cada uno 50 mL de inoculo. Donde posteriormente cada tubo se sometió al tratamiento térmico correspondiente. d) e). se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min se decantó el sobrenadante (el medio de cultivo YMB) (se marcan las muestras). f). las pastillas se resuspendierón en 50 mL de agua destilada a temperatura de 4 °C y se agitó en vórtex. g). Lavados:. se. duplicaron. los. pasos. c. y. d,. para. eliminar. completamente cualquier nutriente del medio h). se centrifugó 3,000 rpm por 10 min. i). la pastilla de la muestra 1 se resuspendió en 50 mL de trehalosa al 10% en PBS. La pastilla de la muestra 2 se resuspendió en 50 mL de PBS. Cada unos por duplicado.. 1.- sin trehalosa externa 2.- con trehalosa al 10% externa. 28.

(41) Nota: De uno de los dos matraces usados en el tratamiento térmico (con la adición de trehalosa externa y sin trehalosa externa en el medio) se reservaron 20 mL para los posteriores análisis de trehalosa total y para su almacenaje en las diferentes condiciones de almacenamiento (Tabla 3). 4.9 Tratamiento a 40 °C (Deegenaars, L. and K. Watson 1998) a) se realizó el procedimiento del inciso 4.8. b) la suspensión de 50 mL del inciso 4.8 i) se incubó en baño maría con agitación durante 60 min. Posteriormente se procedió a congelar en diferentes condiciones de almacenamiento (ver tabla 3). 4.10 Tratamiento a 10 °C a) Se realizo el procedimiento del inciso 4.8.. b) El duplicado de la suspensión de 50 mL del inciso 6 i) se incubó a 10 °C en hielo frapé y agua, durante tres horas.. Posteriormente se. procedió a congelar en diferentes condiciones (ver tabla 3). Ambos tratamientos se mantuvieron en agitación a cada tratamiento se lleva a cabo por duplicado.. 29.

(42) Reactivación de un vial de respaldo. Resuspender la pastilla en PBS. (10-3) Resuspender la pastilla en una solución de PBS + trehalosa ai 10% Tratamiento térmico a 10 r C por una hora. (10-2) Tratamiento térmico a 10 X por una hora. (10-1) Control del 10 *C. Sin tratamiento térmico. 1. Se lavan las alícuotas por triplicado. Se lavan las alícuotas por triplicado. I. o. Condición de almacenaje. B. 10-2-1 a PBS 10-2-1 bPBS+gly 10-2-1 c PBS+th 10-2-1dPBS+th+gly. Condición de almacenaje. Condición de almacenaje. 10-MaPBS 10-1-ibPBS+gly 10-1-1c PBS+th 10-1-1d PBS+th+gly. 10-3-1 a PBS 10-3-1 b PBS+gly 10-3-1 c PBS+th 10-3-1 d PBS+th +gly. 4.11 Estrategia experimental antes y después del tratamiento térmico a 10 °C. 30.

(43) Reactivación de un vial de respaldo. Resuspender la. (40*3) Resuspender la pastilla en una solución de PBS + trehalosa a!10%. pastilla en PBS. Tratamiento ténnico a 40 *C por una hora. (40-2) Tratamiento térmico a 40 °C por una hora. (40-1) Control del 40 °C. sin tratamiento térmico Se lavan las alícuotas por triplicado. I. Se lavan las alícuotas por triplicado. J Condición de almacenaje. 40-2-1 a PBS 40-2-1 bPBS+gly 40-2-1 c PBS+th 40-2-1 d PBS+th +gly. Condición de almacenaje. Condición de almacenaje. 40-1-1 a PBS 40-1-1bPBS+gly 40-1-1c PBS+th 40-1-1d PBS+th+gly. 40-3-1 a PBS 40-3-1 bPBS+gly 40-3-1 c PBS+th 40-3-1 d PBS+th +gly. 4.12 Estrategia experimental antes y después del tratamiento térmico a 40 °C. 31.

(44) 4.13 Preparación de las cepas para congelación. De la alícuota reservada en los tratamientos térmicos. a) del tratamiento térmico a 40 °C se tomaron alícuotas de 2 ml_ (20X106 cel/mL) b) se prepararon para congelarse a (-) 86 °C en tubos criogénicos de acuerdo a los siguientes tratamientos. Tabla 3 Condiciones de almacenamiento para Sacharomyces cerevisiae. No. En la. No.. Control/Condición/ Tratamiento 10°C. 1. PBS. 2. Control/Condición. estrategia experimental. No. /. Tratamiento. 40°C. No. En la estrategia experimental. 1. PBS. PBS+gly. 2. PBS+gly. 3. PBS+th. 3. PBS+th. 4. PBS+th +gly. 4. PBS+th +gly. 5. 10°C: PBS. 10-1-1a. 5. 40°C: PBS. 40-1-1a. 6. 10°C: PBS+gly. 10-1-1b. 6. 40°C: PBS +gly. 40-1-1b. 7. 10°C: PBS+th. 10-1-1c. 7. 40°C: PBS +th. 8. 10°C:PBS+th+gly. 10-1-1d. 8. 10-1. 40-1. 40-1-1c. 40°C: PBS +th +giy. 40-1-1d. Th = Trehalosa al 10 %, Gly = glicerol al 10 % NOTA: El no. 1 representa el control de las condiciones de almacenamiento 2, 3, y 4. Los nos. 1, 2, 3, y 4 representan los controles de almacenamiento para cada tratamiento térmico: El no. 1 es control del no. 5; el no. 2 es el control del no. 6; el no. 3 es el control del no. 7 y el no. 4 es el control del no. 8. El no. 5, representa el control de las condiciones de almacenamiento 6, 7, y 8. Cada tratamiento se prepara por duplicado y se almacenan a -86°C durante 60 días. 32.

(45) 4.14 Reactivación de los tratamientos. a) una vez transcurridos 60 días de almacenamiento se retiró un vial de cada tratamiento del ultracongelador (-86°C) b) se colocó en un recipiente con agua a temperatura 30°C c) se dejó reposar por 1 min d) para la reactivación de las cepas y análisis correspondiente, se tomó alícuotas de 1 ml_ e) se inoculó 100 ml_ de medio YMB f). se incubó por 48 hr a 28 °C y 160 rpm. g) Al término de las 48 h se tomaron. alícuotas para el análisis. morfológico, porcentaje de células muertas y fisiológicas 4.15 Análisis estadístico y evaluación a) los resultados se analizaron mediante una media estándar T de Student, para muestras dependientes en las cuales se evaluaron todas las muestras (tratamientos y controles) y repeticiones b) el análisis estadístico se realizó entre muestras pareadas siguiendo una distribución normal, con una confianza de 0.05 c) los. resultados. de. ambos. tratamientos. se. analizaron. en. comparación con las muestras control para determinar si la trehalosa (interna o inducida) es un coadyuvante en el proceso de almacenaje de cepas en ultra-congelación d) los resultados se compararon con los obtenidos en los análisis de la fermentación original para evaluar el desempeño del glicerol, trehalosa externa, trehalosa inducida y combinación de éstos. 33.

(46) 4.16 DISEÑO EXPERIMENTAL. RECEPCIÓN DE LA 5.3 Reactivación I 5.4 Preparación de resguardos. 6 Análisis morfológico, fisiológico. I 120 tubos con medio YMA almacenados a 4 °C. DIAGNOSTICO BASE 6 Análisis morfológico, fisiológico. 7 5.4 Resguardo 120 viales en medio. 18 días de almacenaje a 4 °C. 2. 6 Análisis morfológico, físiológico, % de células I muertas v no de cicatrices J. 5.3Reactivación de la cena. Inoculación del material. 34.

(47) Unidades de resguardo a 4 °C Incubación hasta la fase estacionaria. 1 Tratamiento térmico Suspensión de células en 10% de trchalosa. Suspensión de células en 1. Ta 10°C. T a 40 "C J. I. Análisis del contenido de Trehalosa intracelular. Almacenamiento a -8o" °C por 60 días. Reactivación. Análisis morfológico, fisiológico, viabilidad. 35.

(48) 5 RESULTADOS 5.1 Diagnóstico inicial: características morfológicas y fisiológicas. 5.1.1 Diagnóstico inicial. Cinética y porcentaje de células muertas. Al término de las 48 h (Figura. 5). La concentración máxima de células fue una crecimiento de 23.7X106 cel./mL. El porcentaje de células muertas a las 48 h fue de 45% (Figura 5).. 50.00%. 25000000. 40.00%. 20000000 -i. 15000000 ^ u 10000000 « 5000000. o. 0.00% 12. 24. 36. 48. Tiempo (h) de cel. Muertas. •No.de cel/mL. Figura 5 Observación del desempeño de la cepa de S.cerevisiae al ser reactivada del vial original aportado por CCM. 5.1.2. Diagnostico de los viales de resguardo. La concentración máxima de cél/mL a las 48 h fue de 38X106 y el porcentaje de células muertas fue de 10% (Figura 6). En el transcurso de. 36.

(49) ésta cinética se tomaron valores intermedios de células muertas como se observa en la Figura 6.. 12.00% w. § E ai 8 •8. 10.00% 8.00% H 6.00%. 99 /. 4.00%. ninmi wiiiiir. ^^. fifflUMl. y^l 1 0. ^^^^H. 12. fiBSHi. , i. IH. Wm ". H ^ ^ B "*. HHBH. ^^^^B. ^^^^8. i 1 24. 50050000 - 45050000 - 40050000 35050000 30050000 - 25050000 - 20050000 ** 15050000 10050000 * 5050000 50000. 36. j. 1. 0) ü. o c. 48. Tiempo (h) ^ • % c e l muertas —•—No.de cel/mL Figura 6 Diagnostico de los viales de resguardo. 5.1.3 Análisis de las características morfológicas y fisiológicas. El diagnóstico base de los resguardos, después de 18 días de almacenaje a 4 o C, se obtuvieron los siguientes resultados (Figura. 6). A las 12 h se obtiene un número mayor de de cél/mL que en la cinética de la cepa original, con la curva de la cepa original.. Al término de 36 h presentó una. concentración de 43X106 cél/mL. Este valor disminuyó hacia las 48 h. El porcentaje de células muertas alcanza un valor de 5% a las 12 h, el cual decae a las 24h y se incrementa hasta alcanzar valor máximo de 10% a las 48 h.. 37.

(50) 5.1.4. Determinación del número de cicatrices. En la Figura 7 se muestra la frecuencia del número de cicatrices por célula. A 12 h de incubación (Figura 8a) la frecuencia de células con 1 a 2 cicatrices (colores rojo y verde respectivamente), es de 56 y 64%. A las 24 h los valores de frecuencia mayor corresponden a células con 2, ,3 y 4 cicatrices (colores verde, azul y magenta). A las 36 h, los valores de mayor frecuencia se encuentran entre las células con 3, 4, 4, y 5 cicatrices (verde, azul, magenta y azul claro respectivamente). A las 48 h se observa que los mayores valores de frecuencia los presentan las células con 2, 3, y 4 cicatrices (verde, azul y magenta), sin embargo, casi la mitad de las células presentan de 4 a 8 cicatrices. 24hrs de crecimiento. 12hrs de crecimiento. Cinética de cicatrices. Cinética de cicatrices 6.00. 6.00 1.00. 5.00. 5.00. 3.00 2.00. |§|jj||É| 2.00. \. ôo. -i. î. 3.00. (a). (b) 3óhrs de crecimiento. 48hrS de crecimiento. Cinética de cicatrices. Cinética de cicatrices. 1.00. 2.00. 7.00 2.00. 5.00. 3.00. ©. (d). Figura 7 Frecuencia de cicatrices por célula en los viales de resguardo.. 38.

(51) 5.1.5 Asimilación de aminoácidos. De los 10 aminoácidos analizados, la levadura creció en 9 de los 10 aminoácidos.. En el vial de Usina, no se observó crecimiento (Tabla 4).. Estos resultados representan el control para los tratamientos de 10 y 40 °C.. Con respecto a los carbohidratos a los que se sometió la cepa a su análisis Tabla 4 Resultado de las pruebas de asimilación de aminoácidos.. Pruebas de diagnostico base Aminoácido. Control de 10 °C. Control de 40 °C. ~A¡a. +. +. Glu. +. +. Arg. +. +. Isleu. +. +. Leu. +. +. Lys. +. +. Thr. +. +. Val. +. +. Pro. +. +. +. +. Phe. Control (-) Control (+). 39.

(52) 5.1.6 Asimilación de carbohidratos.. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La cepa mostró crecimiento en los dos carbohidratos analizados. Tabla 5 Resultado de las pruebas de asimilación de carbohidratos.. Pruebas de diagnostico base Carbohidratos. Control de 10. Control de 40. °C. °C. Maltotriosa. +. +. Fructuosa. +. +. +. +. Control negativo Control positivo. Las pruebas de diagnóstico de carbohidratos de Api 20 C AUX se muestran en la Tabla 6. Se observó crecimiento en las pruebas de glucosa, maltosa y sacarosa, mientras que no hubo crecimiento en glicerol y lactosa. En el caso de trehalosa, para los controles del tratamiento térmico sin criopreservador (condición 1 de la Tabla 3) a 10 °C, no mostraron crecimiento en la prueba de trehalosa. En contraste, en los controles del tratamiento térmico de 40 °C, si se observó crecimiento en este azúcar.. 40.

(53) Tabla 6 Resultado de las pruebas de asimilación de carbohidratos mediante el método Api 20C AUX Pruebas de diagnostico base Pruebas. Control de 10 °C. Control de 40 °C. +. +. Maltosa. +. +. Sacarosa. +. +. Trehalosa. -. +. Control negativo Glucosa Glicerol Lactosa. 5.2 Características de la cepa previas a los tratamientos térmicos (cél/ mL, número de cicatrices y contenido de glucosa y hexosas totales).. Los resultados de los análisis de diagnóstico (frecuencia de cicatrices y el número de células por mililitro a las 48 h) y determinación de la cantidad de glucosa (método de Peroxidasa oxidasa) y hexosas totales (método de Antrona) se presentan la (Tabla 4). El contenido de glucosa para ambas repeticiones es constante (1.239 y 1.230 mg/g de cel (peso seco)).. El. resultado del contenido de hexosas (método de Antrona) varió entre las dos repeticiones (4.117 y 3.644 mg/g de cel (peso seco)).. 41.

(54) La mayor frecuencia de cicatrices por célula en ambas repeticiones fue de 2 a 4 y el número de células por mililitro fue semejante en ambas repeticiones (31x106 y 33x106 cél/ mL a la 42 h de incubación).. Tabla 7 Número de cél/ mL, frecuencia de cicatrices y contenido de glucosa y hexosas totales de la cepa antes del tratamiento térmico. Glucosa total Número de. (Método. Azúcares totales. Frecuencia de. repetición. Peroxidasa. (Método de Antrona). cicatrices. oxidasa). No. de células/mL a las 48 h. 1.239. 4.117. 33X106. 1.230. 3.644. 31.4X10 6. 42.

(55) 5.3 Contenido de azúcares totales, glucosa y trehalosa posterior al tratamiento térmico. Tabla 8 Contenido de trehalosa observados en los tratamientos térmicos con y sin trehalosa incluida en el vehículo de tratamiento.. Peroxidasa oxidasa Vehículo de tratamiento (1) Control = 10.1 (5)PBS + 10°C = 10.2 (7)10°C+Th=10.3 (1) Control = 40.1 (5) PBS + 40°C = 40.2 (7) 40°C+ Th = 40.3 Método de Antrona Vehículo de tratamiento (1) Control = 10.1 (5)PBS + 10°C = 10.2 (7)10°C+Th = 10.3 (1) Control =40.1 (5) PBS + 40°C = 40.2 (7) 40°C+ Th = 40.3. Glucosa "Glucosa s/Eth. Glucosa + Th **Glucosa c/Eth. Trahalosa Diferencia. 0.214 2.099. 1.596 2.997 9.859. 1.382 0.898 7.76. 0.214 1.852. 1.231 6.032 7.849. 1.017 4.181 5.997. * Antrona s/Eth 0.758 0.715. ** Antrona c/Eth 1.565 1.271 17.378. Diferencia 0.807 0.556 16.663. 0.767 6.168 20.432 (Los datos están dados en mg/g cel) 0.758 0.657. 0.092 5.511 19.774. * Th = Trehalosa ** E-th = Enzima trehalasa. Nota:. Los números en paréntesis indican la condición/tratamiento correspondiente en la Tabla 3. Para las condiciones 2, 3 y 4 el resultado del contenido de trehalosa es el mismo que el no. 1. Para la condición 6 el resultado del contenido de trehalosa es el mismo que el no. 5 y para la condición 8 el resultado de trehalosa es el mismo que el no. 7 (ver Tabla 3).. 43.

(56) Se observó una variabilidad en los resultados de contenido de trehalosa entre las condiciones 1 y 5 por el método de Peroxidasa oxidasa, mientras que en los resultados del método de Antrona, entre estas condiciones, fueron mas homogéneos. El resultado de mayor contenido de trehalosa sin su adición externa (condición 5), se presenta en el tratamiento a 40°C.. Este resultado es. consistente para ambos métodos de cuantificación.. El resultado de mayor contenido de trehalosa con la adición previa de este azúcar (condición 7), se presenta en el tratamiento a 10 °C con el método de Peroxidasa oxidasa, mientras que en el método de Antrona, se presenta en el tratamiento a 40 °C.. El análisis de los métodos para la cuantificación del contenido intracelular de trehalosa (Peroxidasa oxidasa y Antrona) arroja una correlación de 0.790 (Tabla 9). El análisis estadístico t para muestras pareadas, indica que no hay una diferencia significativa (p<0.05) entre ambos métodos. Tabla 9 Determinación de trehalosa (mg/gcel) por dos diferentes métodos Antrona y Peroxidasa oxidasa. Determinación de trehalosa (mg/gcel) por: Tratamiento. Antrona. ôxidas?3. Control 10°C T.t.10°Csmi T.t.10°Ccmi Control 40°C T.t.40°C sfTh T.t.40°C cATh. 0.807 0.556 16.663 0.092 5.511 19.774. 1.382 0.898 7.760 1.017 4.181 5.997. 44.

(57) 5.4 Comparación. del contenido. de trehalosa entre. tratamientos. (obtenidos por el método de Peroxidasa oxidasa). Los resultados de esta comparación se presentan en la Tabla 10. El análisis estadístico de la comparación de métodos de cuantificación de trehalosa para ambos tratamientos térmicos, con y sin uso de trehalosa externa, no presentan diferencia significativa (t = -1.847; p < 0.05, t = -1.673; p < 0.05). Esta comparación se llevó a cabo de acuerdo a la estrategia experimental y nomenclatura de los tratamientos del diagrama de las Figuras 4.11 y 4.12.. Tabla 10 Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes. tratamientos. Peroxidasa. oxidasa. provenientes. (por. el método. del de. método muestras. pareadas de f-student, SPSS para Windows versión 9) a) Para el tratamiento a 40°C Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 40-1. 40-2. 7= 4.503; p>0.05. 40-1. 40-3. 7= 3.404; p>0.05. b) Para el tratamiento a 10°C Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 10-1. 10-2. 7 = 3.343; p>0.05. 10-1. 10-3. r=0.439;p<0.05. c) Entre ambos tratamientos Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 40-1. 10-1. 7=0.626; p<0.05. 40-2. 10-2. 7=-1.673; p<0.05. 40-3. 10-3. T=-1.847;p<0.05. 5.4.1 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos (obtenidos por el método Antrona). 45.

(58) Los resultados de esta comparación se presentan en la Tabla 11.. El. análisis estadístico de la comparación entre ambos tratamientos de 10 °C y de 40 °C con y sin uso de trehalosa, no presentan diferencia significativa (t = 0.083; p < 0.05, t = 0.036; p < 0.05). Esta comparación se llevó a cabo de acuerdo a la estrategia experimental y nomenclatura de los tratamientos del diagrama de las Figuras 4.11 y 4.12. Tabla 11 Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes tratamientos por el método de antrona (por el método de muestras pareadas de f-student, SPSS para Windows versión 9) d) Para el tratamiento a 40°C Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 40-1. 40-2. 7=-1.351;p<0.05. 40-1. 40-3. T= -3.404; p>0.05. e) Para el tratamiento a 10°C Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 10-1. 10-2. T= 0.709; p<0.05. 10-1. 10-3. r=-5.638;p>0.05. f) Entre ambos tratamientos Tratamiento vs. tratamiento. Valor de P. 40-1 40-2. 10-1 10-2. 7= 2.203; p<0.05. 40-3. 10-3. T= 0.036; p<0.05. T= 0.083; p<0.05. Nota: la nomenclatura de los diferentes tratamientos, a la Tabla 3. 46.