EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS, FLAVONOIDES TOTALES PRESENTES EN LOS EXTRACTOS METANÓLICOS DE LA CORTEZA Y LAS HOJAS SECAS DE Protium
aracouchini (Aubl.) Marchand (ANIME).
HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
SINCELEJO-SUCRE 2018
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS, FLAVONOIDES TOTALES PRESENTES EN LOS EXTRACTOS METANÓLICOS DE LA CORTEZA Y LAS HOJAS SECAS DE Protium
aracouchini (Aubl.) Marchand (ANIME).
HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO
Trabajo presentado como requisito para optar al título de Biólogo
DIRECTOR (A)
RITA LUZ MÁRQUEZ VIZCAÍNO Química Farmacéutica
M. Sc Ciencias Biológicas U.P.J.
Co-director
OSNAIDER JOSE CASTILLO CONTRERAS Biólogo
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
SINCELEJO-SUCRE 2018
NOTA DE ACEPTACIÓN
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FIRMA DEL PRIMER JURADO
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FIRMA DEL SEGUNDO JURADO
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FIRMA DEL TERCER JURADO
SINCELEJO 3 DE SEPTIEMBRE DEL 2018
A mis padres Betzaida Pacheco, Víctor Recuero, a mi hermana Esther, y a mi abuela Noris Marín, que son mi motivación y fuente de inspiración para seguir luchando, creciendo, y caminando en este largo y no tan sencillo
camino al cual llamamos Vida que a pesar de las adversidades sigue siendo hermosa y siempre nos deja enseñanzas y momentos para recordar.
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme el regalo de la vida, por ayudarme a cumplir cada una de mis metas y por darme la bendición de estar rodeado de personas de buen corazón que me aprecian mucho.
A mi abuela, mis padres, mi hermana, tíos y primos, por estar pendientes de mí, darme su apoyo incondicional para cumplir cada uno de mis sueños.
A mí amada Angels por siempre estar a mi lado brindándome todo su amor y apoyo.
“siempre serás la fuente de mi inspiración”
A la universidad de sucre por darme la oportunidad de alcanzar este logro tan importante para mi vida.
A mi querida profesora y tutora Rita Luz Márquez Vizcaíno, por sus grandes enseñanzas, apoyo, tiempo y por recibirme con los brazos abiertos en Gipnus, por ser un gran ser humano ejemplo de rectitud, firmeza y cariño.
A mi tutor y gran amigo Osnaider José Castillo Contreras, por todo su apoyo y ayuda sin condiciones, y por ser un gran ejemplo de superación.
A mí querida profesora y gran amiga María Stella Parejo Alcocer, por sus concejos, paciencia, tiempo y dedicación.
A GIPNUS ya que al pasar del tiempo se han convertido en mi familia, les agradezco por todos los momentos que eh hemos vivido juntos.
A mis compañeros, amigos y hermanos: Cindy Lorena Mora Herazo, Paula Andrea Calderón Salazar, Maryuris Tuiran, Carolina Bertel, Hernando Cárcamo, José Carlos Ricardo Molina y Carlos Mario Hernández Mendoza por su gran amistad desde el principio de nuestro
camino en la universidad de sucre y que a pesar de tomar caminos distintos aún seguimos unidos y compartiendo grandes momentos juntos.
“ÚNICAMENTE LOS AUTORES SON LOS RESPONSABLES DE LAS IDEAS
EXPUESTAS EN EL PRESENTE TRABAJO”
(ART 12 RES. 02 - 2013)
CONTENIDO
pág.
RESUMEN ... 1
ABSTRACT ... 2
1. INTRODUCCIÓN ... 3
2. OBJETIVOS ... 5
2.1 GENERAL ... 5
2.2 ESPECÍFICOS ... 5
3. MARCO REFERENCIAL ... 6
3.1 PRODUCTOS NATURALES ... 6
3.2 FAMILIA BURCERACEAE... 7
3.2.2 Protium aracouchini. ... 8
3.3 COMPUESTOS FENÓLICOS Y FLAVONOIDES ... 8
3.4 RADICALES LIBRES ... 9
3.4.1 Radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). ... 9
3.4.2 Radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-etilbenzotialzolina–6-sulfónico) (ABTS). .. 10
3.5 AGENTES ANTIOXIDANTES. ... 10
4. ANTECEDENTES ... 11
5. DISEÑO METODOLÓGICO ... 15
5.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN. ... 15
5.2 ZONA DE ESTUDIO ... 15
5.3 PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL. ... 15
5.4 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ... 16
5.5 ESTUDIO QUÍMICO ... 16
5.5.1 Obtención de los extractos metanólicos ... 19
5.5.2 Screening fitoquímico preliminar. ... 19
5.5.3 Cromatografía Flash... 19
5.5.4 Histoquímica Vegetal... 16
5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS. ... 20
5.6.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. : ... 20
5.6.2 Determinación de la actividad captadora de radicales libres: ... 21
5.6.3 Determinación de fenoles totales. ... 24
5.6.4 Determinación de flavonoides.. ... 24
5.6.5 Test estadístico.. ... 25
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 26
6.1 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ... 26
6.2 ESTUDIO QUIMICO ... 27
6.2.1 Obtención de los extractos y tamizaje fitoquímico. ... 34
6.2.2 Cromatografía flash.. ... 35
6.2.3 Histoquímica. ... 27
6.3 ACTIVIDAD BIOLÓGICA. ... 36
6.3.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. ... 36
6.3.2 Actividad antioxidante. ... 39
7. CONCLUSIONES... 73
8. RECOMENDACIONES ... 76
9. REFERENCIAS ... 77
10. ANEXOS ... 87
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1 Metabolitos secundarios presentes en órganos vegetales evaluados ... 28
Tabla 2 Metabolitos secundarios presentes en los extractos metanólicos evaluados ... 35
Tabla 3 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de hoja ... 36
Tabla 4 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de corteza ... 36
Tabla 5 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de hoja ... 37
Tabla 6 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de corteza ... 37
Tabla 7 Concentración que actuó en la actividad antioxidante ... 39
Tabla 8 Test de normalidad Shapiro-wilks ... 41
Tabla 9 Porcentaje DPPH remanente de los distintos tratamientos ... 42
Tabla 10 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos... 43
Tabla 11 Concentración donde los extractos atrapan el 50% de los radicales DPPH ... 45
Tabla 12 Cuadro de análisis de varianza... 47
Tabla 13 Test de tukey ... 47
Tabla 14 Porcentaje de ABTS remanente de los distintos tratamientos ... 49
Tabla 15 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos... 50
Tabla 16 Test de Kruskal-Wallis ... 51
Tabla 17 Concentración efectiva para atrapar el 50% de los radicales catiónicos ABTS ... 52
Tabla 18 Porcentaje de inhibición del decoloramiento del β-caroteno ... 55
Tabla 19 Kruskal-Wallis ... 56
Tabla 20 Datos para la curva de calibración con ácido gálico ... 58
Tabla 21 Concentración de compuestos fenólicos en eq g GA/g de extracto ... 59
Tabla 22 Test de Kruskal Wallis ... 60
Tabla 23 Datos para la curva de calibración con quercetina. ... 65
Tabla 24 Concentración de flavonoides totales en eq g Q/g de extracto ... 66
Tabla 25 Test de Kruskal-Wallis ... 67
LISTA DE GRÁFICAS
pág.
Gráfica 1: %DPPH remanente vs Concentración de la fracción metanólica de las hojas. ... 44
Gráfica 2: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical DPPH. ... 46
Gráfica 3: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical ABTS. ... 53
Gráfica 4: Inhibición del decoloramiento del β-caroteno ... 56
Gráfica 5: Curva de calibración con ácido gálico. ... 59
Gráfica 6: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de hoja vs Contenido de fenoles totales en la fracción metanólica de la hoja en P. aracouchini. ... 61
Gráfica 7: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de corteza vs Contenido de fenoles totales en la fracción metanólica de la corteza en P. aracouchini. ... 61
Gráfica 8: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante ... 62
Gráfica 9: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante ... 63
Gráfica 10: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante ... 63
Gráfica 11: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante ... 64
Gráfica 12: Curva de calibración con quercetina. ... 66
Gráfica 13: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja vs Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de Protium aracouchini. ... 68
Gráfica 14: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja vs Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de Protium aracouchini. ... 68 Gráfica 15: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza vs Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de Protium aracouchini. ... 69 Gráfica 16: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza vs Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de Protium aracouchini. ... 69 Gráfica 17: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante ... 70 Gráfica 18: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de la especie P.
aracouchini Vs actividad antioxidante. ... 71 Gráfica 19: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante. ... 71 Gráfica 20: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de la especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante. ... 72
LISTA DE IMÁGENES
pág.
Imagen 1: Hoja y tallo normal ... 29
Imagen 2: Celulosa con azul de toluidina. ... 29
Imagen 3: Detección de almidón con lugol. ... 30
Imagen 4: Detección de lípidos con sudan III ... 30
Imagen 5: Detección de mucilago y pectina. ... 31
Imagen 6: Detección de compuestos fenólicos FeCl3. ... 31
Imagen 7: Detección de lignina. ... 32
Imagen 8: Detección de taninos. ... 32
Imagen 9: Detección de terpenos. ... 33
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo A. Certificado de la clasificación taxonómica de la especie en estudio. ... 87 Anexo B. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para la especie Protium aracouchini. ... 88 Anexo C. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para la especie Protium aracouchini ... 89 Anexo D. Clasificación de la toxicidad según CYTED ... 90
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS = ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) CE50 = Concentración efectiva media
TCE50 = Tiempo necesario para que la CE50 llegue a estado estacionario EA = Efectividad antioxidante
% DPPH REM = Porcentaje de DPPH remanente
% AAO = Porcentaje de actividad antioxidante EPA = US Environmental Protection Agency DPPH = 2,2-difenil –1-picrylhydrazyl
COL = Herbario Nacional Colombiano DMSO = Dimetilsulfoxido
μL = Microlitro mL = Mililitro
CL50 = Concentración letal media nm = Nanometro
ac. g = Acido galico µg = Microgramos
CYTED = Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo
RESUMEN
En la familia de las Burseraceae se han encontrado metabolitos secundarios del tipo triterpenoides, y fenoles “flavonoides, cumarinas y lignanos” (Ruiz y Susunaga. 2000), donde los metabolitos pertenecientes al grupo de los polifenoles, se caracterizan por ser agentes antioxidantes con una alta capacidad captadora de radicales libres (Flores, 2011). Es por ello que en el presente trabajo se evaluó la actividad antioxidante de los extractos metanólicos totales y las fracciones metanólicas de la corteza y hoja seca de la especie Protium aracouchini, donde se encontró que la fracción metanólica de corteza presenta una CE50 de 8,07 µg/mL en la captura del radical libre DPPH y una CE50 de 2,57 µg/mL en el ensayo con el radical ABTS. En la acción protectora del ß-caroteno el extracto metanólico total de la hoja fue el que presentó una mejor actividad con una CE50 de 15,63 µg/ mL. Además de medir la actividad antioxidante, también se estimó el contenido de fenoles totales (µg GA/g de extracto) y de flavonoides totales (µg Q/g de extracto), siendo la fracción metanólica de la corteza quien presento una concentración de 8,71034483 eq µg GA/g de extracto, y 1,73874717 µg Q/g de extracto. De los datos obtenidos en esta investigación, la especie Protium aracouchini (Burseraceae) reportada por primera vez en el departamento de Sucre, Colombia, es fuente promisoria de agentes antioxidantes.
Palabras clave: ABTS, ß-caroteno, CE50, DPPH, fenol, flavonoide.
ABSTRACT
In the Burseraceae family, secondary metabolites of the triterpenoid type and phenols
"flavonoids, coumarins and several lignans" have been found (Ruiz and Susunaga, 2000), where the metabolites belonging to the group of polyphenols are characterized as being antioxidant agents with a high capacity to capture free radicals (Flores, 2011). That is why in the present work we evaluated the antioxidant activity of the methanol extracts in methanol and methanol fractions of the bark and dry leaf of the species Protium aracouchini, where it was found that the methanol fraction of bark has a high effectiveness free radical scavenger with an EC50 of 8.07 µg / mL, while in the test with the radical ABTS the methanol fraction presented an EC50 of 2.57 µg / mL, and in the protective action of ß-carotene the extract The total methanol content of the leaf showed the best activity with an EC50 of 15.63 µg / mL. In addition to measuring the antioxidant activity, the content of total phenols (eq µg GA / g of extract) and total flavonoids (eq µg Q / g of extract) was also estimated, with the methanol fraction of the cortex showing a concentration of 8.71034483 eq µg GA / g of acid extract, and 1.73874717 eq µg Q / g of extract.
From the data obtained in this research, the species Protium aracouchini (Burseraceae) reported for the first time in the department of Sucre, Colombia, is a promising source of antioxidant agents.
Key words: ABTS, ß-carotene, DPPH, EC50, flavonoid, phenol.
1. INTRODUCCIÓN
Las plantas se caracterizan por tener la capacidad de destinar el carbono y energía obtenida para la síntesis de una variedad de moléculas que no tienen relación directa con sus procesos primarios, a estas moléculas se les da el nombre de metabolitos secundarios y no todas las especies vegetales producen el mismo tipo, estas sustancias poseen funciones ecológicas y medicinales por lo que también se les da el nombre de productos naturales o fármacos, de estos compuestos químicos de origen vegetal podemos destacar al grupo de los polifenoles, que se caracterizan por ser agentes antioxidantes con una alta capacidad captadora de radicales libres (Ávalos, 2009).
Colombia es un país que tiene una gran diversidad de especies vegetales que cuentan con un gran potencial medicinal que puede ser usado para el control y prevención de ciertas enfermedades cardiovasculares, trastornos neurodegenerativos, cáncer entre otras. Este tipo de enfermedades son producto de un desequilibrio homeostático generado por la toxicidad que provocan las altas concentraciones de radicales libres (Viada, Gómez, y Campaña, 2017), por tal motivo se hace indispensable el estudio de nuevos fármacos de origen vegetal que ayuden a controlar y disminuir este tipo de patologías que en la actualidad se originan por medio de la radiación UV, la contaminación provocada por el hombre, el uso de ciertos químicos como conservantes, los grupos hidroxilos (-OH), y súper óxidos (O-2) que provocan en los organismos aeróbicos daños irreversibles a nivel de membrana celular (Cárdenas y Pedraza, 2006; Castillo, 2016), desestabilizando la estructura y función celular. Para contrarrestar dichos efectos, las células sintetizan enzimas como la superóxido dismutasa, peroxirredoxina, catalasa y la glutatión peroxidasa (antioxidantes endógenos) quienes capturan y estabilizan a los radicales
libres (Santa y Camargo, 2016); cuando la concentración de los agentes oxidantes supera a los antioxidantes endógenos se genera un desequilibrio homeostático dando origen a enfermedades degenerativas como: la arterosclerosis, daños neurológicos (Alzheimer) y cáncer (Constanza y Muñoz, 2012). Para evitar la acción oxidativa de los radicales libres, es necesario buscar agentes antioxidantes exógenos de origen natural, y es aquí donde encontramos la planta de anime (Protium sp.) ubicada en el bosque de Santa Inés, San Marcos, Sucre, esta especie vegetal pertenece a la familia de las Burseraceae dentro de la cual se han reportado una variedad de sustancias polifenólicas entre ellos flavonoides, por esta razón se infiere que este organismo en estudio puede ser fuente promisoria para buscar moléculas con actividad antioxidante. Es por ello que este trabajo de investigación tiene como objetivo determinar el contenido de fenoles totales en los extractos metanólicos de la planta de anime, con el fin de determinar la actividad antioxidante de estos metabolitos, este trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de productos naturales de la Universidad de Sucre.
2. OBJETIVOS
2.1 General
Evaluar la actividad antioxidante y cuantificar los compuestos fenólicos presentes en los extractos metanólicos de hojas y corteza de Protium aracouchini (Anime).
2.2 Específicos
Establecer cualitativamente los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en los extractos metanólicos obtenidos de corteza y hoja.
Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de corteza y hoja.
Determinar el contenido de fenoles totales y flavonoides presentes en los extractos obtenidos de Protium aracouchini.
3. MARCO REFERENCIAL
3.1 Productos naturales
Las plantas distribuyen el carbono y la energía obtenida durante el proceso de la fotosíntesis a la producción de varias moléculas orgánicas que no tienen una función directa con los procesos de fotosíntesis, transporte, asimilación de nutrientes, y síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, pero que le ayudan a adaptarse a los cambios que presenta el ambiente, a dichas moléculas orgánicas se les conoce como metabolitos secundarios, y no se encuentran en igual concentración entre una planta u otra, ya que se sintetizan en cantidades pequeñas dependiendo de la familia, genero e incluso a nivel de especies puede variar la producción de los metabolitos secundarios (Ávalos, 2009).
La síntesis de metabolitos secundarios está restringida a periodos de estrés o desarrollo de la planta y se clasifican en cuatro grupos según su biogénesis o ruta metabólica de origen de los cuales encontramos: A) alcaloides (procedentes de diversas rutas metabólicas), B) policetidos (procedentes de la ruta del policétido), C) terpenos o terpenoides (procedentes de las rutas del ácido mevalónico o del metileritritol fosfato), y D) los fenilpropanoides o fenoles (procedentes de las rutas del ácido shíkimico o del malónico)(Ávalos, 2009). Muchos de los productos del metabolismo secundario son usados en las industrias farmacéuticas y en la elaboración de fragancia, aditivos alimentarios y como biocidas en general.
3.2 Familia Burceraceae
Representa un grupo que posee 20 géneros y más de 600 especies distribuidas en regiones tropicales, con una mayor diversidad en América, el norte y sur de África y en Malasia. Desde el punto de vista económico algunas burseráceas son importantes por las resinas y aceites esenciales que producen, usadas por el hombre en diversas actividades ya sean medicinales o religiosas, un ejemplo del uso de resinas de la familia Burseraceae es la especie Bursera bipinnata (Copal) cuya resina es utilizada como incienso en ceremonias religiosas en algunas ciudades de México, la resina también es usada en la cosmetología y en la medicina popular (De la Cerda, 2011). La familia Burseraceae se caracteriza por poseer árboles o arbustos con prominentes ductos de resinas. Hojas en espiral, raramente opuestas, pinnadas o trifoliadas, raras veces presentan estipulas, inflorescencia en tirso, flores bisexuales, frutos en drupa (Pérez, 2016).
3.2.1 Género Protium. Posee 80-100 especies, este género es nativo de Sudamérica, y sur de Asia, con centro de diversificación genética en la amazonia. A veces presentan árboles o arbustos resiníferos, con hojas imparipinadas o unifoliadas; foliolos opuestos. Inflorescencias axilares, raramente terminales, flores unisexuales raramente hermafrodita, de 4-5 meras, sésiles o pecioladas, pétalos libres, frutos drupáceos indehiscentes, en ocasiones con dehiscencia septicida (Rzedowsk y Guevara, 1992; Rüdiger, 2007). Para las especies que pertenecen al género Protium se han reportado los siguientes compuestos: terpenos, flavonoides, lignanos. Las sustancias químicas que han sido aisladas y caracterizadas de los aceites esenciales presentes en la resina son: α−thujeno, α−pineno, D-limoneno, canfeno, sabineno, p-menth-3-en-1,2,3-triol, β−pineno,
α−felandreno, α−terpineno, p-menth-1-eno para Protium alstonii (Rüdiger, 2007; Courtois, 2009;
Olivera et al., 2014; De Amorim et al., 2016).
3.2.2 Protium aracouchini. Su distribución va desde Costa Rica hasta Bolivia, presenta arboles resinosos de aproximadamente 20 metros de altura, hojas imparipinadas, glabras;
peciolos semi terete, delgados; hojuelas oblongo-lanceolado (oblongo-elíptico), a veces ligeramente estrechado en el ápice, margen entero, ondulado; nervadura primaria pronunciada, nervaduras secundarias prominentes; inflorescencia axilar, ramificada desde la base 5- 10 cm raramente 20 cm, pedúnculos delgados en teretes, pedicelos teretes 1-2 mm, flor pentámera, cáliz cupuliforme, pétalos oblongos; fruto en drupa glabra, ovoide, con resina muy abundante y olorosa (Dueñas y Nieto 2010). En algunas localidades indígenas la resina de esta especie es usada como medicina para la enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis), de su composición química tenemos que se ha obtenido α-amireno en extractos metanólicos de raíz, corteza y hoja (Rodríguez et al., 2016).
3.3 Compuestos fenólicos y flavonoides
Los compuestos fenólicos o también llamados polifenoles, tienen en su estructura un anillo aromático el cual determina la actividad antioxidante de estas sustancias gracias a la variedad de grupos hidroxilos que poseen (Khoddamiet al., 2013), estos grupos ceden electrones o átomos de hidrógenos para neutralizar a los radicales libres. El grupo más importante de los compuestos fenólicos son los flavonoides, incluyendo a los flavanoles (catequinas), antocianinas, flavonoles, flavonas e isoflavonas (Castro et al., 2015).
3.4 Radicales libres
Los radicales libres (RL), o especies reactivas de oxigeno (ERO), son moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón o varios electrones impares desapareados en el orbital externo, ocasionándole a la molécula cierta inestabilidad, estas especies reactivas son: anión superóxido (O2-
), peróxido de hidrogeno (H2O2), radical hidroxilo (OH-), oxigeno singlete (1O2) (Maldonado et al., 2010;Cruz et al., 2011); aunque el oxígeno es un elemento imprescindible para la vida de todos los organismos aeróbicos, también es fuente de radicales libres, ya que existen varias vías metabólicas donde producirlas: la mitocondria el orgánulo más importante para la formación de RL, los peroxisomas, leucocitos polimorfonucleares, entre otras. Si los RL y ERO no se neutralizan adecuadamente, disminuye la capacidad antioxidante (desequilibrio entre antioxidantes y agentes oxidantes)(Constanza y Muñoz, 2012), originando un estrés oxidativo, que posteriormente va a ocasionar lesiones en la membrana celular generando múltiples enfermedades como el cáncer, el Alzheimer, la diabetes, etc. (Mayor, 2010).
3.4.1 Radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Es un radical libre susceptible a la sucesión de un átomo de hidrogeno por parte de un agente antioxidante a través de una reacción de pseudo-primer orden que se puede monitorear midiendo sus absorbancias, donde el radical libre tendrá un color morado y posteriormente con la acción del agente antioxidante disminuirá su absorbancia hasta obtener una coloración amarilla1. Esta medición permite observar una fase rápida seguida de una fase lenta producto de una dimerización de los productos de la reacción (Guija et al. 2015):
1)
[DPPH*] + [AOH] [DPPH-H] + [AO*]
3.4.2 Radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-etilbenzotialzolina–6-sulfónico) (ABTS). Es una molécula susceptible a cualquier tipo de agente oxidante (peróxidos) para formar el catión radical1 ABTS.+, el cual presenta un color verde-azul, este radical es soluble en medios polares y apolares, y como no es afectado por las fuerzas iónicas, mide la actividad antioxidante de moléculas antioxidantes lipofílicas e hidrofílicas (Rodríguez, Andrade, y Díaz 2015), para el monitoreo de la actividad antioxidante se mide la absorbancia la cual pasa de un color verde-azul a transparente2:
1) ABTS + K2S2O8 ABTS.+
2) ABTS.+ + [AOH] ABTS + AO* + H+
3.5 Agentes antioxidantes.
Un antioxidante es una sustancia que se encuentra en bajas concentraciones, con respecto a las biomoléculas oxidables, y a su vez retarda la oxidación de estas moléculas, debido que el agente antioxidante sede un electrón al reaccionar con un radical libre, oxidándose y de esta forma se transforma en un radical libre débil (no toxico) (Gómez, 2014), debido a la gran variedad de antioxidantes dietarios podemos destacar que dentro de los más importantes se encuentran: el ácido ascórbico (vitamina C), los tocoferoles, los carotenos y sus derivados y las sustancias fenólicas, fundamentalmente los polifenoles (Robaszkiewicz et al., 2010).
4. ANTECEDENTES
Las especies vegetales pertenecientes a la familia de las Burseraceae son útiles gracias a que sintetizan un gran rango de compuestos químicos con propiedades farmacológicas, entre los cuales podemos mencionar a los triterpenos presentes en la oleo-goma-resina que exudan la mayoría de las plantas que se agrupan en esta familia, y los compuestos fenólicos que son otro tipo de metabolito secundario abundante en los individuos de este taxón, de los cuales podemos encontrar a los flavonoides, cumarinas y lignanos (Ruiz y Susunaga. 2000)
Como la familia Burseraceae posee una variedad de compuestos químicos, lo que ha incentivado al estudio químico y dinámica que presentan los metabolitos secundarios de individuos agrupados en este taxón.
En Colombia solamente se han reportado estudios sobre la flora de ciertas regiones del país, dentro de estos reportes encontramos uno realizado en el 2007 por Cárdenas, donde describe la vegetación y flora Iniridense del Guainía, Colombia, donde se reportaron 18 especies de la familia Burseraceae, dentro de las cuales tres especies pertenecen al género Dacryodes, una al género Trattinnickia, y catorce especies para el género Protium, donde se incluye a la especie Protium aracouchini.
En el 2008 un estudio realizado en Venezuela por padilla y colaboradores, determinaron la actividad antioxidante en las especies: Brosimum utile, Protium neglectum y Podocalyx loranthoides, donde la especie P. neglectum presento mejor eficiencia captadora de radicales
libres y un mayor contenido de flavonoides, indicando la estrecha relación que hay entre el contenido de flavonoides totales con la actividad antioxidante de los extractos.
En el 2009 Carvalho et al., analizaron los componentes químicos presentes en los aceites esenciales de tres especies de Burseraceae (Crespidospermum rhoifolium, Trattinnickia rhoifolia, Protium elegans), donde los aceites esenciales de las hojas de C. rhoifolium, ramas de T.
rhoifolia, hojas y ramas de P. elegans las obtuvieron por hidrodestilación y fueron analizadas por GC-MS. Los componentes principales identificados en los aceites de las hojas y ramas de P.
elegans fueron trans-cariofileno (35.90% y 6.78%), óxido de cariofileno (27.09% y 55.83%), α- humuleno (12.60% y 2.80%), respectivamente. Las hojas de C. rhoifolium fueron ricas en α- copaeno (19.44%) y germacreno B (13.12%) y ramas de T. rhoifolia en trans-cariofileno (29.60%), α-copaeno (16.37%) y γ-cadineno (15.07%).
Da Camara et al., en el 2011 realizaron un estudio en Pernanmbuco, Brasil, donde analizaron la composición química de los aceites esenciales de las especies Protium giganteum y P. aracouchini determinado por primera vez por GC-MS. De la especie P. giganteum se encontraron 32 componentes donde el 93,6% fueron sequiterpenos, mientras que para la especie P. aracouchini se encontraron 29 componentes donde el 95,9% fueron sequiterpenos.
Serrano et al., en el 2012 evaluaron el efecto anti-inflamatorio y antioxidante de la especie Bursera morelensis, la cual es usada por los habitantes de puebla Coxcaltlán en México, para tratar las heridas de la piel. Para evaluar el efecto anti-inflamatorio y antioxidante del extracto metanólico de la corteza en esta especie vegetal, se indujo inflamación en las patas de los ratones
con carragenano, y como estándar se usó la indometacina, el extracto a una dosis de 50 mg/Kg mostró un efecto anti-inflamatorio del 28,01%, esta misma dosis presento un efecto analgésico en los ratones y una alta actividad captadora de radicales libres del tipo DPPH con una CE50 de 3,05 µg/mL similar a la quercetina. La eficiencia de las actividades biológicas fueron atribuidas a los compuesto fenólicos del tipo fenilpropanoides y los flavonoides que están presentes en la especie B. morelensis,
En la Amazonia brasilera Da silva et al., 2012 evaluaron la composición fisicoquímica y antibacteriana de los aceites esenciales obtenidos de las muestras comerciales del vegetal breus (Protium), se extrajeron los aceites esenciales por hidrodestilación usando un cleverger modificado, y posteriormente analizado por cromatografía de gases acoplado a masas, de este estudio p-cimeno fue el principal constituyente de todas las muestras con concentraciones que van desde 21,9 hasta 51,9%, otros monoterpenos comunes fueron ß-felandreno, α-felandreno, ß- pineno, trans-dihidro-α-terpineol, α-terpineol, α-terpineno, de las muestras comerciales analizadas el aceite esencial de la variedad breu negro fue la única que presento actividad antimicrobiana.
En la Amazonia occidental, Moreno en el 2013 evaluó la actividad antioxidante de algunas plantas medicinales, las especies usadas para este trabajo fueron: Bertholletia excelsa, Eleutherina bulbosa, Piper obliquum, Protium subserratum y Protium trifoliolatum, usando el método de captura del radical libre DPPH. De este trabajo, las plantas Piper obliquum, Protium subserratum, Protium trifoliolatum y la cáscara de la Bertholletia excelsa presentaron un resultado cercanos a los obtenidos por el patrón (Ginkgo biloba) en la inhibición del DPPH,
mientras que las fracciones cloroformo de estas plantas que presentaron una CE50 por encima de la obtenida por el patrón, en las plantas Eleutherina bulbosa y Bertholletia excelsa no presentaron resultados significativos.
En el 2016 Tirumani, Rajashekhar y Rayu, determinaron el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante de las hojas de Bursera Penicillata, para evaluar la actividad antioxidante se usó el método de captura del radical libre DPPH, ABTS, y para determinar el contenido fenolico total usaron el método de reducción del reactivo Folin-Ciocalteu. Las hojas de B. penicilata mostraron una alta actividad captadora de radicales libres como lo demuestran los bajos valores de su CE50 en DPPH 142.36 ug / mL, en ABTS 39.25 ug / mL y alto contenido de fenoles totales 39.32 mg GAE / g.
Honorata et al., en el 2017 analizaron la composición química del aceite esencial de Bursera graveolens y también evaluaron su actividad anti-microbiana con las especies Staphilococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis y Candida albicans y su actividad antioxidante frente al radical DPPH. Este estudio determinó que la especie B. graveolens posee propiedades antimicrobianas significativas, mientras que su actividad antioxidante fue muy débil con una CE50 de 545,25 µg/mL, para analizar la composición química del aceite esencial, fue sometida a hidrodestilación y análisis por cromatografía de gases equipada con un detector de ionización de llama (FID), donde se identificaron 26 compuestos donde el mayoritario fue el α-terpineno (31.57%).
5. DISEÑO METODOLÓGICO
5.1 Tipo de investigación.
Esta investigación es del tipo experimental, debido que presenta:
Manipulación de variables.
Medición de las variables
Evaluación de las variables en un ambiente controlado.
5.2 Zona de estudio
Las hojas y cortezas de la especie vegetal Protium aracouchini fueron colectadas en el mes de Septiembre en la reserva del bosque del corregimiento de Santa Inés, Sucre (N 8º 42’ 48.9”, O 75º 3’ 35.3”), con registros de temperatura promedio mensual de 28ºC, con humedad relativa del 85% y precipitación anual de 2300 mm (Blanco et al, 2012).
5.3 Preparación del material vegetal.
Las partes colectadas para el estudio de Protium aracouchini se removió el material no deseado como polvo, arena, entre otras, con agua destilada. Posteriormente fue sometido a secado por un periodo de aproximadamente 8 días a temperatura ambiente. Una vez secas fueron molidas en un molino industrial y finalmente tamizadas, el material vegetal a utilizar será el obtenido con la maya 40.
5.4 Identificación taxonómica del material vegetal.
Se enviaron los ejemplares del espécimen al Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá D.C, para su respectiva clasificación.
5.5 Estudio químico
5.5.1 Histoquímica Vegetal.
Para determinar cualitativamente en que tejidos vegetales están presentes los metabolitos secundarios, se utilizaron cortes histológicos de hojas y tallos frescos, para cada se hicieron réplicas de 5 de los cortes histológicos, tomando aquellos que mostraron con claridad resultados positivos, aplicando la metodología descrita por Johansen (1940), Demarco (2015), González (2015) y, Bertel (2017):
Ensayo para la determinación de celulosa (Azul de toluidina). a un corte transversal de
los órganos vegetales (Hoja y Tallo), se le adicionó una gota del reactivo azul de toluidina, pasado un minuto se removió el exceso del reactivo con agua destilada, posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio.
Color azul para celulosa, azul turquesa lignina, y morado, azul-lila o rosa-violeta para hemicelulosa.
Detección de almidón (Lugol). Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y Tallo), y se le adicionó una gota de lugol, el exceso del reactivo fue removido con agua
destilada, y posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Reacción positiva: coloración azul dentro de las vacuolas.
Detección de lípidos. Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y Tallo), y
se le adicionó una gota sudan III, pasado 3 minutos el exceso del reactivo fue eliminado con etanol al 70%, posteriormente se hizo el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Positivo si hay presencia de gotas de grasa color rojo o amarillo.
Determinación de Mucilago y Pectina. Se tomó un corte transversal de los órganos
vegetales (Hoja y Tallo), y se le agrego una gota de ácido tánico, pasado 20 minutos se removió el exceso del reactivo con agua destilada, posterior mente se adicionó una gota de FeCl3, después de 5 minutos se eliminó el exceso del reactivo con agua destilada y se realizó el montaje con glicerina para luego ser observado en el microscopio. Tejidos que tengan coloración negra indican resultado positivo para este ensayo.
Lignina. Se realizó un corte transversal del mesofilo de la hoja y del tallo, posteriormente se
le añadieron unas gotas de floroglucina en presencia de HCl, después de 3 minutos el exceso del reactivo fue removido con agua destilada, posterior mente se hizo el montaje con agua destilada y se realizó el montaje en el microscopio. Positivo para la presencia de color fucsia o lila en el tejido.
Saponinas. Se tomó un corte transversal del mesofilo de la hoja y del tallo, y le agregaron
unas gotas de H2SO4, el exceso del reactivo fue removido inmediatamente con agua destilada, `posterior mente se hizo el montaje con agua destilada y se observó al microscopio.
Presencia de coloración amarilla indica resultados positivos.
Determinación de compuestos fenólicos. Se tomó un corte transversal de los órganos
vegetales (Hoja y Tallo), y se adicionó una gota FeCl3, pasado un minuto el exceso del reactivo se eliminó con agua destilada, y se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Resultado es positivo para aquellos tejidos que toman un color castaño o negro.
Determinación de Terpenos. a un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y Tallo),
se le agregó una gota de la combinación de los reactivos Baljet A y Baljet B, pasado un minuto el exceso del reactivo se removió con agua destilada, y posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Los tejidos que tengan presencia de sustancia del tipo terpeno tomaran una coloración naranja o amarillo.
Determinación de taninos. Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y
Tallo), y se dejaron sumergidos en una solución que contiene 1 mL de HCl y 1 mL de n- Butanol por 5 minutos, luego se removió el exceso de la solución con agua destilada, posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Coloración roja para aquellos tejidos que tengan presencia de taninos.
5.5.2 Obtención de los extractos metanólicos.
70 gramos de material vegetal (hoja) previamente molidos y tamizados. Fueron sometidos a una extracción solido-liquido por el método de Soxleth utilizando metanol (ºEMSURE) como solvente extractor, realizando cada 24 horas monitoreos del extracto para observar el agotamiento del material vegetal, Posteriormente el extracto fue filtrado, y concentrado a presión reducida en rota evaporador (RE 100-Pro), obteniéndose un extracto de consistencia pastosa con el que se realizó el tamizaje fitoquímico, fraccionamiento por cromatografía flash y ensayos biológicos en el Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad de Sucre. De igual manera se procedió con la corteza de Protium aracouchini.
5.5.3 Screening fitoquímico preliminar.
El tamizaje fitoquímico de los extractos obtenidos se ejecutó tomando 1 gramo de cada extracto concentrado y seco aplicando la metodología descrita por Jimenéz y Tamara (2017).
5.5.4 Cromatografía Flash.
Los extractos de metanol de las partes investigadas para Protium aracouchini se fraccionaron por cromatografía flash con solventes de polaridad creciente (Bencina de petróleo, Cloroformo, Acetato de Etilo y Metanol), se prepararon 2 gramos de los extractos totales disolviéndolos en 5mL de metanol más 5 gramos de silicagel 60 G (para cromatografía en capa fina), seguidamente fue sembrada en una columna (diámetro: 6.5 cm, altura: 7 cm).
5.6 Ensayos biológicos.
5.6.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina.
Para este ensayo se siguió el protocolo descrito por Meneses y Rivera (2015):
Preparación del montaje. Se preparó 1 litro de agua marina artificial con un pH que se
encontrara en el rango de 7-8, con temperatura de 26ºC, almacenada en una pecera con luz blanca artificial, y una bomba con burbujeo lento, donde se adicionaron 0,041 gramos de huevos de Artemia salina.
Una vez eclosionado los huevos de A. salina, se evaluaron las concentraciones de los extractos metanólicos de las hojas y corteza de Protium aracouchini., a 1000, 500, 100, y 10
µg/mL, que se encontraban disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) cada concentración se realizó por triplicado y se compararon con un blanco que contenía 125 µL de DMSO, cada unidad experimental contó con 10 nauplios de Artemia salina, 50 µL de alimento (levadura), extracto total repartido en volúmenes de 500, 250, 50, y 5 µL para cada concentración, y se completaba con agua marina hasta obtener un volumen final de 5000 µL por vial, después de las 24 horas de exposición se contabilizó los individuos muertos en cada unidad experimental. La CL50 se calculó mediante el software EPA probit analisys program versión 1,5.
5.6.2 Determinación de la actividad captadora de radicales libres:
Evaluación de la actividad antioxidante por el ensayo DPPH •. Siguiendo la metodología descrita por Castillo (2016) con algunas modificaciones: Preparar una solución metanólica de DPPH a 26 mg/L con una absorbancia mayor de 0.7 y menor que 1, posteriormente hacer una lectura contra un blanco (metanol) a 517 nm. Las soluciones a evaluar fueron los extractos metanólicos preparados a concentraciones de 500, 250, y 125 µg/mL. El patrón utilizado fue el ácido ascórbico en concentraciones de 200, 100 y 50 µg/mL. La reacción para la evaluación del ensayo inicia al incorporar directamente en la cubeta 2900 µL de DPPH y 100 µL de la muestra, se monitoreo la reacción a 517 nm, el tiempo usado para cada ensayo depende de cada muestra en llegar a su estado estacionario. La absorbancia control corresponde a la primera medida de absorbancia hecha antes de incorporar la muestra a la solución DPPH. Para medir el rendimiento de los extractos se realizó un cálculo de %DPPH remanente y % Atrapamiento con las siguientes ecuaciones:
%DPPH remanente= (
)
%Atrapamiento = (
) Dónde:
Ass= absorbancia en el estado estacionario A0= absorbancia del grupo control.
La CE50 (concentración de antioxidante necesario para disminuir en un 50% la concentración inicial DPPH), se determinó gráficamente %DPPH remanente vs concentración, posteriormente se determinó gráficamente el tiempo necesario para que la CE50 alcance su estado estacionario (TCE50), con estos dos parámetros se determinó la eficiencia antioxidante con la siguiente formula:
EA= (
) Dónde:
CE50= concentración efectiva media
TCE50= tiempo necesario para que CE50 alcance su estado estacionario.
Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Actividad captadora del catión radical ABTS•+. Aplicando la metodología descrita por Nossa y colaboradores (2016) con algunas modificaciones: Para activar el radical se preparó una solución de ABTS a 7 mM dejar reaccionar con persulfato de potasio a 2.45 mM por 12 horas antes de ser usada, posteriormente preparar 5 mL de este reactivo para cada ensayo, diluyéndose con metanol hasta obtener una absorbancia a 0,7 + (0,02) a una longitud de onda de 732 nm, en una celda de cuarzo agregar 2900 µL de la solución del radical ABTS y una alícuota de 100 µL de las soluciones a evaluar con las concentraciones de 500, 250, y 125 µg/mL, se usó como patrón 100 µL de ácido ascórbico a concentraciones de 50, 25 y 12,5 µg/mL, cada ensayo se realizó por triplicado, la capacidad captadora de radicales libres (%ABTS remanente y % Atrapamiento), la CE50, TCE 50 y EA se calcularon de la misma manera que en el ensayo DPPH.
Ensayo del blanqueamiento del β-caroteno. Se siguió la metodología descrita por Perea (2013) con algunas modificaciones: Esta metodología se basa en la pérdida de coloración del β-caroteno ya que este tiende a estabilizar los radicales libres que se forman gracias a la oxidación del ácido linoleico. La velocidad de decoloración del β-caroteno dependerá de la concentración de agentes antioxidantes que estén presentes en los extractos. Se agregan 2 mg de β-caroteno en 20 mL de cloroformo (ºEMSURE), seguidamente tomar 4 mL de esta
solución y mezclar con 40 mg de ácido linoleico y 400 mg de tween 20. Remover el cloroformo por completo, y adicionar 100 mL de agua nanopura (ºLiChrosolv) oxigenada, agitar vigorosamente hasta obtener una emulsión. para el ensayo se usaron 1300 µL de la emulsión añadidos en un frasco eppendorf, y 100 µL de los extractos a diferentes concentraciones 500, 250 y 125 µg/mL, el control fue preparado con 100 µL de disolvente, como estándar se usó una solución de α-tocoferol a 200, 100 y 50 µg/mL. Luego se incubaron a 50ºC por 120 minutos para ser leídos posteriormente a 470 nm contra un blanco el cual fue preparado como la emulsión, pero sin β-caroteno. El % de actividad antioxidante fue medido en términos del blanqueamiento de β-caroteno con la siguiente formula:
% Inhibición= (
) Dónde:
At y Ct corresponde a los valores medidos para la muestra y el control después de los 120 minutos de incubación, y C0 es el valor de la absorbancia para el control en tiempo cero, los resultados son expresados como CE50 (concentración que evita la decoloración del β-caroteno en un 50%).
5.6.3 Determinación de fenoles totales.
De acuerdo a la metodología propuesta por Tovar (2013): Para medir la concentración total de los compuestos fenólicos presentes en los vegetales se utiliza el reactivo de Folin- Ciocalteu que en medio básico reacciona con las sustancias fenólicas dando una coloración azul.
el reactivo de Folin-Ciocalteu se diluye con agua destilada 1:50 V/V, luego tomar 500 µL del reactivo y 500 µL de ácido gálico para realizar una curva de calibración usando las siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL, para acelerar la reacción se usó 1000 µL de NaOH (0.35 M) como medio básico y así formar el complejo coloreado, en el caso los extractos se usó una concentración de 50 µg/mL de la cual se tomó 500 µL. Cada ensayo fue hecho por triplicado, y dejado en oscuridad durante tres minutos, posteriormente se midió la absorbancia a una longitud de onda de 760 nm.
5.6.4 Determinación de flavonoides.
Tovar en el 2013 designa hacer reaccionar los OH presente en los flavonoides con él Al+3, dando como resultado un complejo rosado que es medido a una longitud de onda de 500 nm luego se hace una curva de calibración con quercetina a concentraciones de 5, 10, 20, y 40 µg/mL, para llevar a cabo esta reacción el ensayo se realizó de la siguiente manera: a 1350 µL del estándar y las muestras adicionar 75 µL de NaNO2 al 5%, y homogenizar, dejar reaccionar durante 5 minutos, posteriormente adicionar 300 µL de AlCl3 a 2.5%, agitar vigorosamente hasta homogenizar y dejar reaccionar exactamente por 6 minutos e inmediatamente añadir 500 µL NaOH 1 M y 500 µL de agua destilada, homogenizar y leer la absorbancia después de 5 minutos.
5.6.5 Test estadístico.
Para el análisis estadístico se usó el software estadístico InfoStat. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado y al ser una población menor de 50 y mayor de 10 se utilizó el test de shapiro-wilks para determinar si los datos presentan o no una distribución normal. Posteriormente se realizaron pruebas estadísticas para establecer si hay o no diferencias significativas para cada tratamiento en los diferentes ensayos, se utilizó el test no paramétrico (no asume normalidad) de Kruskal-wallis para aquellos ensayos que no presentaron normalidad, y para aquellos datos que presentaron una distribución normal se usó la prueba paramétrica de análisis de varianza (ANAVA).
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Identificación taxonómica del material vegetal.
El sistemático botánico Giraldo Cañas en el Herbario Nacional Colombiano, determinó que la especie en estudio es Protium aracouchini y el número de colección es COL 583966.
Reino: Plantae.
Phylum: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Orden: Sapindales.
Familia: Burseraceae.
Género: Protium.
Epíteto: aracouchini.
Autor del Epíteto específico: Marchand.
Véase Anexo A.
Es una planta que en Colombia crece normalmente en los departamentos de Amazonas, Guainía, Antioquia, Cauca, Choco, Vaupés, Caquetá, Bolívar, Córdoba, Meta, Guaviare, y San- tander (Herbario Nacional Colombiano), siendo este el primer reporte para el departamento de Sucre.
6.2 Estudio químico
6.2.1 Histoquímica.
En los cortes histológicos de tallo y hoja en P. aracouchini se observan metabolitos primarios: almidón (imagen 3) lo cuales se encuentran en los amiloplastos del tejido parenquimático de las hojas y tallos, ubicándose en mayor concentración en el parénquima medular del tallo, en las plantas también se acumula energía en forma de lípidos almacenados en estructuras celulares como los oleosomas, estas no se encuentran en mayor proporción en los tejidos vegetales de P. aracouchini (imagen 4), celulosa(imagen 2), mucilago y pectina(imagen 5), estos últimos metabolitos estructurales se pueden apreciar con mayor claridad alrededor de todos los tejidos vegetales tanto en las hojas como en el tallo; el mucilago y la pectina se encuentran distribuidos en la mayoría de los tejidos de los órganos vegetales, va desde la epidermis, colénquima, parénquima cortical, células acompañantes de los tubos resiníferos, células acompañantes del xilema y del floema y en el tejido del parénquima medular, esto se debe a que la pectina es un polisacárido que está involucrado en los procesos de crecimiento, morfología, desarrollo y defensa de las plantas (García 2013).
En la identificación de los metabolitos secundarios, podemos notar que los compuestos fe- nólicos (imagen 6), se encuentran almacenados en los tejidos del xilema, floema, tubos resinífe- ros y en las células acompañantes tanto en tallo como en las hojas, dándole protección a la planta sobre agente patógenos como las bacterias, virus, hongos, y depredadores como insectos según lo explica Tapia et al., (2014); se evidenció que no hay reacción positiva para la identificación de saponinas; la lignina (imagen 7) se encuentra en los tejidos de la epidermis, esclerénquima, ha- ces vasculares; en las hojas la celulosa se puede observar en el colénquima, parte del parénqui-
ma, y en las células acompañantes de los tubos resiníferos, en el tallo la celulosa se encuentra en los tejidos del parénquima cortical, parénquima medular, células acompañantes de los tubos resi- níferos; el ensayo para la identificación de terpenos (imagen 9), dio positivo en los tubos resiní- feros para las hojas y para tallo en el cambium vascular y tubos resiníferos, estas sustancias volá- tiles en algunas ocasiones ayudan en la polinización de las plantas, y a su vez la defienden de los depredadores, condiciones medioambientales (adaptación) y ciertas patologías, también hacen parte de las resinas de muchas especies vegetales como lo explican Ormeño y Fernández (2012);
en la identificación de taninos (imagen 8), observamos en la hoja una reacción positiva en los tubos resiníferos y sus células acompañantes, en el tallo los taninos se acumulan en el parénqui- ma medular, xilema, floema, cambium vascular, tubos resiníferos y sus células acompañantes, la razón por la cual hay mayor concentración de taninos en el tallo es que estas moléculas forman enlaces con la celulosa de la madera y de esta forma mejora sus propiedades físicas lo cual le da mayor estabilidad dimensional tal como lo describe Quiroz y Magaña (2015).
Tabla 1
Metabolitos secundarios presentes en órganos vegetales evaluados
Metabolito Hoja Corteza
Celulosa + +
Lignina + +
Lipidos + +
Almidón + +
Compuestos fenólicos + +
Saponinas - -
Terpenos + +
Mucilago y pectina + +
Taninos + +
Nota: - ausente, + abundante, ++ abundancia media, +++ muy abundante
Imagen 1: Hoja y tallo normal
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo.
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 2: Celulosa con azul de toluidina.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima, positivo para ligni- na; P.A: parénquima medular, positivo para lignina; X: xilema, positivo para celulosa; C.X: células acompa- ñantes del xilema, positivo para lignina; E: esclerénquima, positivo para lignina; C: colénquima, positivo para celulosa; C.A: células acompañantes del tubo resinífero, positivo para celulosa.
A B
A B
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 3: Detección de almidón con lugol.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja (haces vasculares y parénquima), B: corte transversal del tallo (parénquima medular).
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 4: Detección de lípidos con sudan III
A: corte transversal del mesofilo de la hoja (tubo resinífero), B: corte transversal del tallo (parénquima medu- lar).
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
A B
A B
: Imagen 5: Detección de mucilago y pectina.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja (xilema), B: corte transversal del tallo. P.A: parénquima medular;
X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C: Colénquima.
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 6: Detección de compuestos fenólicos FeCl3.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima; P.A: parénquima medular; X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C.A: células acompañantes del tubo resinífero; P.C:
parénquima cortical; C: colénquima; EP: epidermis.
A B
A B
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 7: Detección de lignina.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima; P.A: parénquima medular; C.X: células acompañantes del xilema; E: esclerénquima.
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 8: Detección de taninos.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima; P.A: parénquima medular; X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C.R: tubo ó conducto resinífero; C.A: células acom- pañantes del tubo resinífero; C: colénquima; EP: epidermis.
A B
A B
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
Imagen 9: Detección de terpenos.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. C.V: cambium vascular; C.R: tubo o conducto resinífero
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
A B
6.2.2 Obtención de los extractos y tamizaje fitoquímico.
En el proceso de extracción de los extractos totales de corteza y hoja de la especie en estudio se logró obtener un rendimiento del 7.5% para la corteza y un 14.10% para las hojas. En la caracterización in situ de los metabolitos presentes en P. aracouchini se validaron los resultados obtenidos en la histoquímica fitoquímico (Tabla 1). Las pruebas realizadas para la determinación cualitativa de los metabolitos secundarios nos indican que hay presencia de sustancias del tipo polifenoles (taninos, flavonoides, cumarinas), terpenos (Tabla 1), confirmando lo reportado por la literatura para la familia Burseraceae con los estudios realizados por Kubmarawa et al,. (2007), Aliyu (2007), Sarfaraz et al,. (2009), Beltrán, Díaz, y Gómez (2013), Siraj et al. (2016), para esta especie la presencia de alcaloides no fue notoria, esto se puede presentar porque la concentración a la cual esta especie sintetiza estas moléculas es muy baja para la época en las que fueron colectadas y por eso el kit de reactivos no fue tan sensible al momento de hacer el ensayo para la detección de alcaloides, Álvarez y Pava (2010) encontraron quinonas y un resultado positivo para alcaloides en la especie Protium ecuadorense.
Hay una mayor manifestación de las sustancias polifenólicas y de terpenos en la corteza donde la especie acumula resina rica en este tipo de metabolitos; esta resina es usada como pro- tección de la planta frente al ataque de insectos que lesionan sus tejidos, la resina actúa como barrera para evitar infecciones de patógenos o parásitos fitófagos (Sepúlveda, Porta, y Rocha.
2004).
Tabla 2
Metabolitos secundarios presentes en los extractos metanólicos evaluados
Metabolito Hoja Corteza
Compuestos fenólicos +++ +++
Flavonoides +++ +++
Cumarinas ++ ++
Cardenolidos + +
Terpenos / esteroles + +
Quinonas - -
Saponinas - -
Alcaloides - -
Nota: - ausente, + poco abundante, ++ abundancia media, +++ muy abundante.
6.2.3 Cromatografía flash.
En la búsqueda del objetivo de esta investigación fue necesario realizar el fraccionamiento del extracto total para obtener una subfracción rica en compuestos fenólicos y flavonoides, y determinar las pruebas de toxicidad en Artemia salina, actividad antioxidante, contenido de compuestos fenólicos y flavonoides totales.
6.3 Actividad biológica.
6.3.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina.
Para este bioensayo se utilizó el extracto metanólico y las subfracciones metanólicas de corteza y hoja de P. aracouchini, y se determinó la toxicidad de los extractos metanólicos obtenidos de la especie vegetal en estudio sobre los nauplios de A. salina calculándose la CL50
tal como se muestra en las tablas (Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6).
Tabla 3
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de hoja
Concentración Población expuesta Número de individuos afectados
0 µg/mL 30 0
10 µg/mL 30 3
100 µg/mL 30 6
500 µg/mL 30 10
1000 µg/mL 30 14
Concentración letal 50 1907,720
Tabla 4
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de corteza
Concentración Población expuesta
Número de individuos afectados
0 µg/mL 30 0
10 µg/mL 30 6
100 µg/mL 30 10
500 µg/mL 30 14
1000 µg/mL 30 17
Concentración letal 50 703,980
Tabla 5
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de hoja
Concentración Población expuesta
Número de individuos afectados
0 µg/mL 30 3
10 µg/mL 30 3
100 µg/mL 30 4
500 µg/mL 30 12
1000 µg/mL 30 19
Concentración letal 50 707,927
Tabla 6
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de corteza
Concentración Población expuesta
Número de individuos afectados
