LIPASAS COMO BIOMARCADORES EN LA DEGRADACIÓN DE ALCANOS Y AROMÁTICOS

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(1)

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ FACULTADES DE CIENCIAS QUÍMICAS,INGENIERÍA YMEDICINA PROGRAMAS MULTIDISCIPLINARIOS DE POSGRADO EN CIENCIAS AMBIENTALES

AND

COLOGNE UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES

INSTITUTE FOR TECHNOLOGY AND RESOURCES MANAGEMENT IN THE TROPICS AND SUBTROPICS

LIPASAS COMO BIOMARCADORES EN LA DEGRADACIÓN DE ALCANOS Y AROMÁTICOS

THESIS TO OBTAIN THE DEGREE OF

MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES

DEGREE AWARDED BY

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

AND

MASTER OF SCIENCE

“TECHNOLOGY AND RESOURCES MANAGEMENT IN THE TROPICS AND SUBTROPICS

FOCUS AREA “ENVIRONMENTAL AND RESOURCES MANAGEMENT”

DEGREE AWARDED BY COLOGNE UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES

PRESENTS:

BEATRIZ ZAMBRANO MONROY

CO-DIRECTOR OF THESIS PMPCA

DRA. ELSA CERVANTES GONZÁLEZ

CO-DIRECTOR OF THESIS ITT:

PROF. DR. ING. JACKSON ROEHRIG

ASSESSOR:

DR. CÉSAR A. GONZÁLEZ RAMÍREZ

(2)

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ FACULTADES DE CIENCIAS QUÍMICAS,INGENIERÍA YMEDICINA PROGRAMAS MULTIDISCIPLINARIOS DE POSGRADO EN CIENCIAS AMBIENTALES

AND

COLOGNE UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES

INSTITUTE FOR TECHNOLOGY AND RESOURCES MANAGEMENT IN THE TROPICS AND SUBTROPICS

LIPASAS COMO BIOMARCADORES EN LA DEGRADACIÓN DE ALCANOS Y AROMÁTICOS

THESIS TO OBTAIN THE DEGREE OF

MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES

DEGREE AWARDED BY

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

AND

MASTER OF SCIENCE

“TECHNOLOGY AND RESOURCES MANAGEMENT IN THE TROPICS AND SUBTROPICS

FOCUS AREA “ENVIRONMENTAL AND RESOURCES MANAGEMENT”

DEGREE AWARDED BY COLOGNE UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES

PRESENTS:

BEATRIZ ZAMBRANO MONROY

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PROYECTO FINANCIADO POR:

El proyecto “CARACTERIZACIÓN DE LAS LIPASAS DE Pseudomonas sp. Y SU PAPEL EN LA DEGRADACIÓN DE

HIDROCARBUROS DEL PETRÓLERO”

(C10-FAI-05-05.33).

PROYECTO REALIZADO EN:

PROGRAMA MULTIDISCIPLINARIODEPOSGRADOENCIENCIASAMBIENTALES

(PMPCA)

COORDINACIÓNACADÉMICAREGIÓNALTIPLANO(COARA)

UNIVERSIDADAUTÓNOMADESANLUISPOTOSÍ(UASLP)

CON EL APOYO DE:

DEUTSCHER AKADEMISCHER AUSTAUSCH DIENST (DAAD) CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT)

(4)

Erklärung /

Declaración

Name / Nombre: Beatriz Zambrano Monroy Matri.-Nr. / N° de matricula: 011074565

Ich versichere wahrheitsgemäß, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß au

Schriften entnommen sind, sind als solche kenntlich gemacht.

Aseguro que yo redacté la presente tesis de maestría independientemente y no use

referencias ni medios auxiliares a parte

referidas a escritos o a textos publicados o no publicados son reconocidas

Die Arbeit ist in gleicher oder ähnlicher Form noch nicht als Prüfungsarbeit eingereicht worden.

Hasta la fecha, un trabajo como éste o similar no ha

San Luis Potosí, den /el 5 de agosto de 2011

Unterschrift / Firma:

Ich erkläre mich mit einer späteren Veröffentlichung meiner Masterarbeit sowohl auszugsweise, als auch Gesamtwerk in der Institutsreihe oder zu

Rahmen der Öffentlichkeitsarbeit des Institutes einverstanden.

Estoy de acuerdo con una publicación posterior de mi tesis de maestría en forma completa

o parcial por las instituciones con la intención de exponerlos

investigación de las mismas

Unterschrift / Firma:

Declaración

: Beatriz Zambrano Monroy

011074565 (CUAS); 0180208 (UASLP)

Ich versichere wahrheitsgemäß, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten und nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, sind als solche kenntlich gemacht.

Aseguro que yo redacté la presente tesis de maestría independientemente y no use

medios auxiliares a parte de los indicados. Todas las partes, que están

a escritos o a textos publicados o no publicados son reconocidas como tales.

Die Arbeit ist in gleicher oder ähnlicher Form noch nicht als Prüfungsarbeit eingereicht

Hasta la fecha, un trabajo como éste o similar no ha sido entregado como trabajo de tesis.

5 de agosto de 2011

Ich erkläre mich mit einer späteren Veröffentlichung meiner Masterarbeit sowohl auszugsweise, als auch Gesamtwerk in der Institutsreihe oder zu Darstellungszwecken im Rahmen der Öffentlichkeitsarbeit des Institutes einverstanden.

blicación posterior de mi tesis de maestría en forma completa

las instituciones con la intención de exponerlos en el contexto d

Ich versichere wahrheitsgemäß, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle s veröffentlichten und nicht veröffentlichten

Aseguro que yo redacté la presente tesis de maestría independientemente y no use

partes, que están

como tales.

Die Arbeit ist in gleicher oder ähnlicher Form noch nicht als Prüfungsarbeit eingereicht

sido entregado como trabajo de tesis.

Ich erkläre mich mit einer späteren Veröffentlichung meiner Masterarbeit sowohl Darstellungszwecken im

blicación posterior de mi tesis de maestría en forma completa

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AGRADECIMIENTOS

Al Programa Multidisciplinario de Posgrado en Ciencias Ambientales, modalidad internacional, por la oportunidad de seguir con mi preparación.

(6)

DEDICATORIAS

A mis padres.

A mi hermano.

A Arturo.

(7)

RESUMEN

En la presente investigación se evaluó el posible uso de la actividad de enzima

lipasa de la cepa Pseudomonas sp. como biomarcador en el proceso de

degradación de compuestos aromáticos y alcanos. Se emplearon los siguientes

compuestos: n-Hexano, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, indeno, 9,10-dimetilantraceno,

(identificados como parte de la fracción del queroseno); siete más seleccionados por su característica de ser monoaromáticos y heteroaromáticos: dioctilftalato, butil benceno, butil benzoato, benceno, ácido benzoico, tolueno y piridina; y la misma fracción de queroseno. En la primera fase se evaluó la inducción del sistema lipolítico mediante los hidrocarburos antes mencionados, registrándose actividad enzimática únicamente en cuatro ellos (butil-benceno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, n-hexano y benceno); lo anterior al utilizar una concentración de 3000 ppm de cada hidrocarburo, no así cuando se utilizó 5000 ppm, por lo que se deduce que la concentración es determinante para la expresión de la enzima, por lo menos en las concentraciones utilizadas. Adicionalmente, se determinó el efecto de una fuente alterna de energía como lo es la sacarosa y el efecto de un tensoactivo como el Triton X-100, mostrando que su presencia puede beneficiar la inducción de la enzima o bien afectar negativamente y por lo tanto no expresarse, esto dependiendo del hidrocarburo del que se trate.

En la segunda fase se evaluó el efecto del pH (7,8,9), concentración de sacarosa (0.8, 0.9, 1.0 %) y concentración de tres hidrocarburos (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno [1170, 1950, 2730 ppm], butil-benceno [860, 1550, 2240 ppm] y n-hexano

[1300,1570, 1830 ppm]) sobre la actividad enzimática de lipasa de Pseudomonas

sp. a través del diseño experimental de Box-Behnken. En las superficies de

respuesta para la actividad de lipasa empleando 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno se observó que el efecto combinado de la concentración de sacarosa y del

hidrocarburo (p<0.0172) y el efecto del pH (p<0.0172) influyeron significativamente

(8)

respuestas. La actividad de enzima lipasa parecer tener cierta especificidad para el tipo de hidrocarburo. Así mismo, la concentración de sacarosa y la presencia de surfactante parecen tener un efecto benéfico en la inducción de lipasa en los

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ABSTRACT

In the present study the activity of the enzyme lipase in the strain Pseudomonas

sp. was assessed as a biomarker in the degradation of aromatic hydrocarbons and alkanes. The following compounds were used as carbon and energy source:

n-Hexane, 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, indene, 9,10-dimethylanthracene

(identified as part of the kerosene fraction). Moreover, seven additional monoaromatic and heteroaromatic hydrocarbons were selected as carbon and energy source: dioctyl phthalate, butyl benzene, butyl benzoate, benzene, benzoic acid, toluene and pyridine, and the same fraction of kerosene. Also, the effect of the concentration of hydrocarbons, the presence and concentration of an alternate source of energy (sucrose), the presence of a nonionic surfactant (Triton X-100) and the effect of pH; were assessed. In the first phase the lipolytic system

induction of Pseudomonas sp. was assessed, enzymatic activity was observed

only in four of the analyzed compounds (butyl-benzene, 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, n-hexane and benzene) . This result suggests that hydrocarbon concentration is critical for the expression of the enzyme. In the second phase, the effect of pH (7,8,9), concentration of sucrose (0.8, 0.9, 1.0%) and concentration of hydrocarbons (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene [1170, 1950, 2730 ppm ] butyl benzene [860, 1550, 2240 ppm] and n-hexane [1300.1570, 1830 ppm])were assessed through growth kinetics and Box-Behnken designs.

In the response surfaces for lipase activity using 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene was found that the combined effect of sucrose concentration and hydrocarbon

(p<0.0421) and the effect of pH (p<0.0172) influenced significantly on enzymatic

responce. It was observed that by using butylbenzene effect of pH influenced significantly. With n-hexane, both sucrose concentration and pH significantly influenced the obtained response surfaces. Lipase enzyme activity seems to have some specificity for the type of hydrocarbon. Also sucrose concentration and the presence of surfactant appear to have a beneficial effect on the induction of lipase

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ZUSAMMENFASSUNG

In der vorliegenden Untersuchung wurde die Aktivität des Enzyms Lipase des

Stammes Pseudomonas als "Biomarker" beim Abbau von Aromaten und Alkanen

bewertet.Es wurden folgende Verbindungen verwendet: n-Hexan, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin, Inden, 9-10-Dimenthylanthracen (identifiziert als Baustein der "Kerosin-Fraktion") sowie sieben weitere Verbindungen, die aufgrund ihrer monoaromatischen und heteroaromatischen Eigenschaften ausgewählt wurden: Dioctylphthalat, Butylbenzol, Butylbenzoat, Benzol, Benzoesäure, Toluol und Pyridin und der gleiche Anteil von Kerosin. Es wurde die Aktivität des Enzyms

Lipase der Staemme von Pseudomonas analysiert, wobei als Kohlenstoff-und

Energiequelle die schon genannten Verbindungen verwendet wurden. Es geht prinzipiell um die Wirkung der Konzentration, das Vorhandensein und die Konzentration einer alternativen Energiequelle (Saccharose), die Präsenz eines nicht-ionischen Tensid (Triton X-100) sowie um den bestimmten pH-Wert.

Während der ersten Phase wurde die Induktion des lipolytischen Systems bewertet, wobei nur bei 4 Verbindungen eine Enzymaktivität festgestellt werden konnte (Butylbenzol, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin, n-Hexan und Benzol), woraus sich schliessen lässt, dass die Konzentration unter der sich der Kohlenwasserstoff befindet, ausschlaggebend für die Expression des Enzyms während des Abbauprozesses ist.

Während der zweiten Phase wurde die Wirkung des pH-Wertes (7,8,9), die Konzentration von Saccharose (0,8,0,9,1,0%), der Kohlenwasserstoffe (1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin [1170, 1950, 2730 ppm] , Butyl-benzol [860, 1550, 2240 ppm] und n-Hexan [1300,1570, 1830 ppm]) mit Hilfe der "Kinetik des Wachstums" sowie des "Box-Behnken-Designs" festgestellt.

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Wirkung von pH-Wert beeinflusst deutlich beobachtet. Mit n-Hexan,sowohl Saccharose-Konzentration und pH-Wert signifikant beeinflusst die erhaltene Antwort Oberflächen. Lipase-Enzym-Aktivität scheint eine gewisse Spezifität für die Art von Kohlenwasserstoff zu haben. Auch Saccharose-Konzentration und der Anwesenheit von Tensid scheinen eine positive Wirkung auf die Induktion der

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN……….. 1

1.1 Problemática por contaminación por hidrocarburos……… 1

1.2 Biomarcadores……….. 2

1.2.1 Enzimas como biomarcadores……… 3

1.3 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs)………. 4

1.3.1 Origen y toxicidad………. 4

1.3.2 Degradación de HAPs………. 6

1.3.3 Participación de enzimas en la degradación de HAPs……….. 8

1.4 Alcanos……… 9

1.4.1 Características y toxicidad ………...9

1.4.2 Participación de enzimas en la degradación de alcanos. ……….10

1.5 Lipasas ……….12

1.5.1 Características ……….12

1.5.2 Actividad de lipasas y la degradación de hidrocarburos………... 13

2. OBJETIVOS……… 16

2.1 Objetivo general……….. 16

2.2 Objetivos específicos………..16

3. JUSTIFICACION……… 17

4. HIPÓTESIS………. 18

5. MATERIALES Y METODOS……… 19

5.1 FASE I. Evaluación de la inducción del sistema lipolítico de Pseudomonas sp. a través de compuestos aromáticos y alcanos……….. 19

5.1.1 Cepa utilizada……….. 19

(13)

5.1.3 Efecto de compuestos aromáticos y alcanos en la inducción del sistema

de lipasas de Pseudomonas sp……….. 20

5.1.4 Evaluación de la actividad de lipasa……… 22

5.2 FASE II. Cinéticas de producción de las lipasas de Pseudomonas sp y

evaluación del efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de hidrocarburos……….. 23

5.2.1 Cinéticas de producción de lipasas de Pseudomonas sp………. 23

5.2.2 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración del

hidrocarburo en la producción de lipasas de Pseudomonas sp a través del

diseño experimental de Box-Behnken……… 25

5.2.3 Análisis estadístico………. 26

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 27

6.1 FASE I. Evaluación de la inducción del sistema lipolítico de Pseudomonas

sp. mediante compuestos aromáticos y alifáticos……… 27

6.2 FASE II. Cinéticas de producción de las lipasas de Pseudomonas sp. y

evaluación del efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de hidrocarburos………. 33

6.2.1 Cinéticas de crecimiento y de producción de lipasa de

Pseudomonas sp……… 33

6.2.1 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración del

hidrocarburo sobre la producción de lipasas de Pseudomonas sp………. 41

6.2.1.1 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de

1,2,3,4-tetrahidronaftaleno en la producción de lipasas de Pseudomonas sp………….. 41

6.2.2.1 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de

butil-benceno en la producción de lipasas de Pseudomonas sp……… 44

6.2.2.3 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de n-hexano

en la producción de lipasas de Pseudomonas sp……….46

(14)

7.1 Conclusiones……… 50

7.2 Recomendaciones………...50

8. BIBLIOGRAFÍA………. 52

ANEXO 1. HIDROCARBUROS UTILIZADOS………. 67

(15)

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Descripción de series experimentales para la evaluación de la inducción

de lipasas de Pseudomonas sp……….. 21

Tabla 2. Concentraciones de indeno y n-hexano utilizadas para evaluar la

inducción de las lipasas de Pseudomonas sp………... 22

Tabla 3. Fuentes de carbono utilizadas en las cinéticas de producción de enzima lipasa………..……… 24

Tabla 4. Diseño experimental de Box-Behnken………. 25

Tabla 5. Valores de cada variable independiente y los valores máximo y mínimo de actividad de enzima lipasa observados para los tres hidrocarburos analizados……….. 49

(16)

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de A) butil-benceno, B) 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, C) 9,10-dimetilantraceno, D) n-hexano y E) benceno……….……. 29

Figura 2. Actividad de enzima lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de A) n-Hexano y n-n-Hexano y sacarosa, B) indeno e indeno y sacarosa…… 32

Figura 3. Curvas de crecimiento y actividad de lipasa de Pseudomonas sp. durante 15 días de incubación a 30° C y 180 rpm, cultivada en 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno de acuerdo a la Tabla 3, cinéticas 1, 2, 3 y 4…… 35

Figura 4. Curvas de crecimiento y actividad de lipasa de Pseudomonas sp. durante 15 días de incubación a 30° C y 180 rpm cultivada en Triton X-100 y sacarosa de acuerdo a la Tabla 3, cinéticas 11 y 12………..……….. 36

Figura 5. Curvas de crecimiento y actividad de lipasa de Pseudomonas sp. durante 15 días de incubación a 30° C y 180 rpm cultivada en butil-benceno de acuerdo a la Tabla 3, cinéticas 5, 6, 7 y 8………. 38

Figura 6. Curvas de crecimiento y actividad de lipasa de Pseudomonas sp. durante 15 días de incubación a 30° C y 180 rpm de cultivada en n-hexano acuerdo a la Tabla 3, cinéticas 9 y 10………40

Figura 7. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno con relación a la concentración de sacarosa (%) y pH después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………. 42

Figura 8. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno con relación a la concentración del hidrocarburo (ppm) y pH, después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………. 43

(17)

Figura 10. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de butil-benceno con relación a la concentración de sacarosa (%) y pH, después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………..……. 44

Figura 11. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de butil-benceno con relación a la concentración del hidrocarburo (ppm) y pH, después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………... 45

Figura 12. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de butil-benceno con relación a la concentración de sacarosa (%) y del hidrocarburo (ppm), después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28°C……….. 45

Figura 13. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de n-hexano con relación a la concentración de sacarosa (%) y pH, después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………... 46

Figura 14. Superficie de respuesta para actividad de lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de n-hexano con relación a la concentración del hidrocarburo (ppm) y pH, después de cinco días de incubación en obscuridad a 180 rmp y 28° C………... 47

(18)

1 1. INTRODUCCIÓN

1.1 Problemática por contaminación por hidrocarburos

La presencia de sustancias con características nocivas o perjudiciales en el ambiente, producto de actividades humanas o por procesos naturales, afectan el desarrollo y bienestar de los organismos (Fraume, 2007). Como consecuencia de procedimientos y manejos deficientes dentro de la industria del petróleo en todas sus etapas: explotación, refinación, distribución y almacenaje, diversos procesos fisicoquímicos se desencadenan afectando a los diversos componentes del ambiente (suelo, agua, aire, biota), por ende, también repercute en las aspectos

económicos, sociales y de salud (Ferrera-Cerrato et al., 2006; Benavides, 2006;

Pardo, 2004). Sin embargo, esta situación no es exclusiva de países productores

de petróleo, ya que este recurso y sus derivados son precursores de diversos procesos industriales alrededor del planeta. Como ejemplo de esto es el caso de México, que es uno de los mayores productores de petróleo a nivel mundial y para 2004 el volumen calculado de derrames accidentales de petróleo y sus derivados fue de 1.5 millones de T /año, afectando suelo, agua y atmósfera (Ferrera-Cerrato

et al., 2006).

Como respuesta a la creciente necesidad de atender la contaminación ambiental, se han desarrollados diversas tecnologías para tratar suelos, sedimentos, aguas residuales y aguas subterráneas de varios contaminantes,

incluyendo métodos in situ y ex situ (Khan et al., 2004). Entre más preciso sea el

conocimiento de la problemática ambiental, más eficaces serán las soluciones que se propongan además de que sean económicamente viables y que gocen de

aceptación social (Cabrera-Cruz et al., 2003).

(19)

2

Por otro lado, es importante apoyar las tecnologías de remediación en herramientas de monitoreo alternativas; así lo expresan Maila & Cloete (2005) basándose en el hecho de que el análisis y monitoreo de suelos contaminados por hidrocarburos regularmente se realiza con instrumentos analíticos, cuya utilización suele generar altos costos. Es por eso que se ha impulsado el uso de las actividades biológicas, como bioindicadores, para hacerse de información relevante que permita evaluar sitios contaminados con desechos químicos dañinos.

1.2 Biomarcadores

Los biomarcadores se definen como las respuestas o alteraciones bioquímicas, fisiológicas, morfológicas e histopatológicas de los organismos ocasionadas por la exposición a contaminantes (US NCR, 1989. En Vázquez, 2005). Suelen ser respuestas rápidas, sensibles y hasta específicas de los organismos a los contaminantes. Los biomarcadores potenciales en monitoreos ambientales son: alteraciones en el ADN o ARN, respuestas proteicas, productos del metabolismo, biomarcadores histo-patológicos, inmunológicos, fisiológicos y de comportamiento. Conti (2008) afirma que toda respuesta, a cualquier nivel de complejidad (bioquímica, fisiológica, etc.) puede considerarse un biomarcador.

Entre algunas de las ventajas del uso de los bioindicadores, se enlistan las siguientes (Maila & Cloete, 2005):

• Pueden detectar tanto la toxicidad de los compuestos parentales, como de

los metabolitos.

• Requieren de materiales fácilmente disponibles para su evaluación.

• Su evaluación puede hacerse in situ o ex situ.

• En la mayoría de casos, el tiempo de evaluación es corto.

(20)

3

También habrá que señalar algunas de sus desventajas:

• No se puede detectar toxicidad resultado de compuestos parentales y

metabolitos.

• La respuesta del bioindicador no siempre corresponde con la concentración

del contaminante.

• Diferentes pruebas responde de forma diferente a tóxicos individuales.

• La sensibilidad depende del contaminante y del suelo.

1.2.1 Enzimas como biomarcadores

Las enzimas, y en específico su actividad en suelos, tienen gran relevancia por ser catalizadoras de procesos metabólicos, incluyendo la descomposición de flujos orgánicos y la detoxificación de xenobióticos. La degradación de hidrocarburos a moléculas más simples, como agua y dióxido de carbono, involucra varias reacciones químicas en las cuales proteínas catalíticas se ven involucradas. Debido al rol que desempeñan en la degradación de hidrocarburos, es por lo que se han convertido en importantes herramientas de monitoreo durante el proceso de biorremediación. Las respuestas o reacciones de proteínas que se registran en un organismo después de una exposición a diversas clases de contaminantes, son caracterizadas para determinar si la actividad de las proteínas funcionales se induce o inhibe. Este tipo de reacciones comprende los mecanismos de adaptación o protección relacionados con la detoxificación de compuestos xenobióticos (sistema mixto de función oxigenasa [MFO, por sus siglas en inglés], enzimas conjugadas) y mecanismos de detoxificación de metales pesados.

(21)

4

deshidrogenasas, catalasas y ureasas (Malia & Cloete, 2005). Para el caso específico de lipasas, su actividad en suelos se considera un indicador valioso en los procesos de degradación biológica de petróleo, tanto en suelos atenuados naturalmente y en aquellos que con algún proceso de remediación biológica (fertilizados). Se describe una correlación negativa de la concentración residual de hidrocarburos en suelo con la actividad de lipasa en suelo y el número de microorganismos degradadores de hidrocarburos, independientemente del hecho de haber sido tratados (fertilizados) o no (Chauhan & Varma, 2009).

1.3 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs)

1.3.1 Origen y toxicidad

Estos compuestos se caracterizan por contener dos o más anillos de benceno unidos entre sí. La mayoría solo contiene carbono e hidrógeno y son siempre estructuras polinucleares de tipo aromático. También se les conoce como hidrocarburos polinucleares. Son sustancias inestables fotoquímicamente (fotooxidación). Generalmente son incoloros o blanquecinos (Albers, 1995).

Los HAPs se encuentran de forma natural en el petróleo a concentraciones muy bajas (alrededor del 1%); sin embargo, la principal fuente de generación es la combustión incompleta a altas temperaturas del petróleo, de sus derivados (500-800 °C) o de materia orgánica (100-300 °C) en periodos prolongados (Albers, 1995; Haritash & Kaushik, 2009). Esto es, por un proceso de pirolisis de compuestos orgánicos, en el que se descomponen por la acción del calor, y esto se puede observar en diferentes actividades cotidiana, como las que describen Wilson & Jones (1993):

- Gasificación/licuefacción de combustibles fósiles

- Generación de energía en base al uso de combustibles fósiles - Producción de coque

(22)

5

- Producción y uso de asfalto

- Refinación y destilación de crudo y sus derivados - Producción y uso de alquitrán

- Procesos de tratamiento para madera

- Producción de preservativos para madera (creosote/antraceno en aceite) - Almacenaje, transportación, procesamiento, uso y eliminación de combustibles y aceite

- Vertederos, tiraderos

- Quema a cielo abierto (llantas, carbón, desperdicios) - Incineración

Esto explica el por qué los HAP se pueden localizar en diversos componentes del ecosistema (aire, suelo, agua, sedimentos, tejidos biológicos), así como en

alimentos. (Vives et al., 2001). Las fuentes naturales de estos compuestos son los

incendios de bosques y pastizales.

Aunque se han llegado a identificar más de 100 de estos compuestos, los que destacan por sus características físico-químicas y toxicológicas, son los

siguientes:

• Acenafteno (Ace)

• Acenaftileno (Acy)

• Antraceno (Ant)

• Benzo[a]antraceno (BaA)

• Benzo[a]pireno (BaP)

• Benzo[e]pireno

• Benzo[b]fluoranteno (BbF)

• Benzo[g,h,i]perileno (Bghi)

• Benzo[j]fluoranteno

• Benzo[k]fluoranteno (BkF)

• Criseno (Cry)

(23)

6

• Fluoranteno (Fla)

• Fluoreno (Flu)

• Indeno[1,2,3-c,d]pireno (Ind)

• Fenantreno (Fen)

• Naftaleno (Nap)

• Pireno (Pyr)

Cabe destacar que los compuestos aromáticos fueron, tal vez, los primeros en ser considerados como carcinógenos ambientales.

Se distinguen 2 clases de HAP: los de bajo peso molecular que son aquellos que tienen de 2 a 3 anillos aromáticos (naftaleno, fluoreno, antraceno), y los de alto peso molecular, que tienen de 4 a 7 anillos aromáticos, como el criseno. Sus características físicas y químicas varían de acuerdo a su peso molecular, influyendo en su persistencia en el ambiente y sus efectos en los sistemas biológicos, ya que se distinguen por tener una baja volatilidad y solubilidad.

Las condicionantes de transporte, distribución y biodisponibilidad de estos compuestas están dadas por su partición entre el agua, la materia orgánica

disuelta y el suelo o la materia orgánica en el sedimento (Mastrangelo et al.,

2005).

Estos compuestos tienen estructuras moleculares complejas y una baja solubilidad en agua y tienden a sorberse fuertemente a sólidos bajo la superficie (NRC, 2002).

1.3.2 Degradación de HAPs

(24)

7

microbiana de HAP de bajo peso molecular puede llevarse a cabo en condiciones nitrato y sulfato reductoras (NRC, 2002). Debido a esta característica, la biorremediación es una opción de tratamiento atractiva para sitios contaminados. Sin embargo, existe un gran número de trabajos de investigación enfocados en la degradación de HAP de cuatro, cinco y seis anillos de benceno; no siendo así para los compuestos de mayor peso molecular (Powell, 2008).

El número de cepas descritas en los últimos años que utilizan HAPs de cuatro anillos como única fuente de carbono y energía, aún en ausencia de co-factores o surfactantes, y de aquellas identificadas por cometabolizar HAPs con más de cuatro anillos ha aumentado significativamente. Aunado a esto, numerosas rutas metabólicas han sido propuestas, para una vasta variedad de HAPs de alto peso

molecular en bacterias (Kämpfer et al., 1993). Además, se han descrito diversas

capacidades de diferentes cepas para degradar HAPs (de bajo y alto peso molecular y metilados) que pueden ser atribuidas a la laxa especificidad enzimática inicial para estos compuestos, a la presencia de múltiples oxigenasas y de rutas metabólicas y genes que comparten capacidades degradadoras tanto

para alcanos y aromáticos. (Budzinski et al., 2000; Chen & Aitken, 1999; Dutta &

Haramaya, 2001; Goyal & Zylstra, 1996; Kim & Zylstra, 1999; Maeda et al., 2001;

Mahajan et al., 1994; McLellan, 2002; Moody et al., 2001; Romine et al., 1999;

Romine et al.,1999b; Sabaté et al., 1999; Vila et al., 2001; Yang et al., 1994.).

(25)

8

reacción enzimática no-específica, donde un sustrato compite con otro de

estructura primaria similar por el sitio activo de las enzimas. (Johnsen et al., 2005).

Se han descrito que tanto la baja solubilidad en agua y la alta capacidad de sorción de los HAPs son las características que entorpecen en gran medida al proceso de biodegradación. Igualmente intervienen la producción de metabolitos tóxicos, represión de metabolitos, la presencia de otros sustratos, ausencia de

sustratos inductores y falta de cometabolismo (Molina et al., 1999; Juhasz et al.,

2002). En suelos, las bacterias suelen no utilizar una fuente de carbono en particular, sino que utilizan un número de los compuestos de carbono disponibles. Por lo que la expresión de enzimas que catalizan la degradación de contaminantes orgánicos (HAPs) puede verse restringida, aunque el nivel de expresión mínimo es comúnmente suficiente para el consumo inmediato del xenobiótico, cuando éste se vuelve disponible en pequeñas cantidades (Egli, 1995, 2002). Como consecuencia, cuando las células cuentan con diversas fuentes de carbono que les permite mantener su biomasa, el proceso de biodegradación se verá interrumpido. Hay que recalcar que el beneficio a largo plazo para la célula de mantener un nivel base de enzimas degradadoras de HAPs debe ser más alto que el costo de producir a dichas enzimas, por la característica para ser

evolutivamente estable (Johnsen et al., 2005).

1.3.3 Participación de enzimas en la degradación de HAPs

En años recientes de han descrito cuáles son las enzimas que participan en el proceso de biodegradación de compuestos aromáticos y son oxigenasas (di y monooxigenasas), deshidrogenasas y enzimas lignolíticas. Este último grupo lo componen las lignina-peroxidasas, lacasas y manganeso-peroxidasa (Haritash & Kaushik, 2009; Kanaly & Harayami, 2000).

(26)

9

lipooxigenasas, y peroxidasas tienen un gran potencial para las conversiones enantio-específicas donde están involucrados sustratos petroquímicos y sus

derivados (Cheng et al., 2002; Holland, 2000).

Un escenario de inhibición en la producción de enzimas en el proceso de biodegradación es cuando hay competencia entre las aquellas enzimas involucradas en la oxidación o transporte, acumulación de subproductos derivando

en cotoxicidad, y el bloqueo de inducción de enzimas (Bouchez et al., 1995;

Juhasz et al., 2002, Stingfellow & Aitken, 1995; Shuttleworth & Cerniglia, 1996).

Determinar cuál mecanismo es el que interviene en cada situación puede resultar

complicado por la presencia de metabolitos de diferentes HAPs (Van Hamme et

al., 2003).

1.4 Alcanos

1.4.1 Características y toxicidad

Se les conoce también como hidrocarburos saturados alifáticos, y como parafinas, por su poca afinidad química hacia otras sustancias; su fórmula general

es CnH2n+2. Están constituidos por enlaces simples - C – C, y C – H. Estos

(27)

10

Los alcanos lineales tienden a ser biodegradables debido a la simplicidad de su estructura molecular. Sin embargo, altas concentraciones de alcanos, de 5 a 10 carbonos, inhiben la biodegradación, ya que actúan como solventes de la capa

lipídica de los microorganismos. Aquellos alcanos de C20 a C40 generalmente

tienen muy baja solubilidad en agua, lo que interfiere con la degradación biológica. En general, la degradación de alcanos origina productos muy oxidados, los cuales son menos volátiles que sus compuestos parentales (Pellini, 2006).

Los hidrocarburos alifáticos son introducidos en el ambiente tanto por actividades humanas como por procesos naturales, por lo que no son calificados, en sí, como compuestos xenobióticos, aunque muchos casos de contaminación con altos niveles de alcanos en suelos son causados por procesos industriales

relacionados con petróleo (Janssen et al., 2005).

1.4.2 Participación de enzimas en la degradación de alcanos

Los microorganismos cuentan con una compleja maquinaria metabólica que les permite utilizar petróleo como fuente de carbono y energía. Los alcanos son una excelente fuente de carbono y energía, por lo que muchos organismos han desarrollado mecanismos que les permiten explotar este recurso. Estos compuestos requieren de ciertos procesos previos antes de que sean degradados y usados como fuente de carbono.

Desde un punto de vista genético, la ruta de degradación de alcanos mejor

descrita es la del plásmido OCT de Pseudomonas putida Gpo1 (conocida

anteriormente como Pseudomonas oleovorans), que degrada alcanos con 5 y

hasta 12 carbonos (Janssen et al., 2005). Dicha ruta se basa en una

monooxigenasa ligada a membrana, una rubredoxina soluble y una enzima rubredoxina-reductasa que permiten el traslado de electrones por la vía NADH hacia las hidrolasas, que convierten los alcanos en alcohol. Estos pueden ser oxidados más adelante a aldehídos y en ácidos antes de proceder con los ciclos

(28)

11

2001). Se especula que un factor primordial para que se pueda manifestar la enzima lipasa en los procesos de biodegradación, es el tipo de hidrocarburo, ya que la degradación microbiológica de hidrocarburos alifáticos generalmente desencadena la formación de acil-CoA, producto de la degradación de grasas, el cual es finalmente metabolizado en la célula para la formación de energía y crecimiento celular (Singer M.E. & Finnerty W.R., 1984).

El primer paso en la degradación aerobia de los alcanos es la introducción de átomos de oxígeno derivados del oxígeno molecular del sustrato, el cual es llevado a cabo por oxigenasas, enzimas de alto interés en biorremediación y en procesos biocatalíticos. Típicamente, los alcanos son hidrolizados al correspondiente alcohol primario y posteriormente oxidados por alcohol y aldehído- deshidrogenasas. Los alcanos de cadena corta son metabolizados vía oxidación terminal y subterminal. Los ácidos grasos resultantes se integran al ciclo ß-oxidación o son incorporados como lípidos celulares. En algunos casos, ambos extremos de los sustratos de alcanos son oxidadas, lo que ha sido explotado para

la producción de ácidos dicarboxílicos (Van Beilen & Witholt, 2005; Fujita et al.,

2007).

Otras de las enzimas involucradas en la degradación de alcanos son: las alcano-hidroxilasas, las desahologenasas (haloalcano deshalogenasas), las cuales poseen una α/β-hidrolasa principal como uno de sus dominios plegados y en ocasiones se ha encontrado en lipasas, acetilcolinesterasas, esterasas, lactonasas, epóxido hidrolasas y otras más, por lo que se considera que las haloalcano deshalogenasas pertenecen a una super familia de proteínas, cuyos miembros pueden llevar a cabo varias reacciones, la mayoría con compuestos no

(29)

12 1.5 Lipasas

1.5.1 Características

Las lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.13) se desempeñan como catalizadoras en reacciones lipolíticas, a través de la hidrólisis de los enlaces éster en la interfase entre el sustrato de fase insoluble y la fase acuosa. Los sustratos naturales de las lipasas son triacilgliceroles de cadena larga, los cuales tienen muy poca solubilidad en agua. Sin embargo, existen un sin fin de lípidos simples y compuestos que son degradados por la acción de las lipasas, tales como ceras, terpenos, lipopolisacáridos, etc. Las lipasas se emplean para aplicaciones industriales diversas, tales como la producción de farmacéuticos, cosméticos, pieles, detergentes, alimentos, perfumes, diagnósticos médicos, etc. Son producidas por varias plantas, animales, de las grasas mismas, de forma sintética

o generadas por diversos microorganismos: bacterias (Pseudomonas sp.,

Burkholderia sp., Enterobacter sp., Staphylococcus, Streptococcus, entre otras) y algunas levaduras. La temperatura óptima de producción de lipasas depende de la temperatura de crecimiento del respectivo microorganismo, sin embargo, se ha

observado que en general, las lipasas son producidas entre 20 y 45 °C. Su periodo

de producción llega a variar de pocas horas hasta algunos días (Des Abbayes et

al., 1989; Gupta et al., 2004; Sinhg et al., 2006).

Otra característica que hacen de las lipasas una enzima muy atractiva para la

industria es que en el caso de aquellas producidas por Pseudomonas

pseudomallei, se ha mostrado que llegan a tener una actividad máxima en pH 10, y en otros casos se ha detectado que llegan a mantener casi el 80 % de su actividad en pH 11 y mantenerse altamente estables en un intervalo de pH 7 a

10.5. (Watanabe et al., 1977). Este género tiene una amplia capacidad enzimática

para utilizar compuestos de diferente naturaleza química, incluyendo hidrocarburos alifáticos, como lo reportan Kanwar & Goswami, (2002), en donde

describen la producción de enzima lipasa de P. pseudomallei 12Sm en un medio

(30)

13 1.5.2 Actividad de lipasas y la degradación de hidrocarburos

Los trabajos precursores en el uso de compuestos derivados del petróleo y

producción de lipasas lo son Breuil et al. (1977) quienes describen los altos

niveles de producción de lipasa en Acinetobacter lwoffi O16 en presencia de

petróleo crudo, hexadecano, octadecano y otros alcanos como única fuente de carbono a 20°C, e igualmente mencionan que hay una relación positiva entre la

producción de lipasas y la utilización de hexadecano en Pseudomonas

aeruginosa.

Según Margesin et al. (2007) la actividad de las lipasas en suelos se ve

favorecida en altas concentraciones de diesel, lo que indica una inducción en la actividad de estas con la contaminación en suelos. Esta inducción es atribuida a la aparición de productos derivados de la biodegradación de hidrocarburos, el cual es el sustrato para las hidrolasas, incluyendo esterasas-lipasas. Se reporta que algunos factores de interferencia, como la composición del contaminante y el nivel de compuestos recalcitrantes, puede influenciar la actividad de las lipasas en suelos cuando la contaminación lleva algunos años, ya que dicha actividad es más fácilmente detectable en suelos recién contaminados por derivados del petróleo, debido al alto contenido de compuestos alifáticos (Margesin & Schinner, 2001;

Margesin et al., 2003). Además el tipo de suelo y la composición cualitativa y

cuantitativa de los hidrocarburos puede ser una limitante para la actividad enzimática de las lipasas, llegando a inhibir su actividad (Margesin & Schinner, 2001).

Así también se ha detectado que los suelos contaminados con petróleo contienen cantidades importantes de sustancias solubles en mezclas alcohol-benceno (bitumen), las cuales son retenidas en las porciones poco profundas de los suelos, y dichas sustancias son probables estimuladores de la actividad de

lipasas en el suelo (Kireeva et al., 2006).

(31)

14

microorganismos mesófilos o termófilos, los cuales muestran poca o nula actividad en bajas temperaturas. Esas lipasas han desarrollados un amplia gama de características estructurales que les confieren un alto nivel de flexibilidad, particularmente se convierten en activación de baja entalpía sobre el sitio activo, tienen una baja afinidad por sustratos y cuentan con una alta actividad específica a bajas temperaturas. Por otra parte, el máximo nivel de actividad de estas enzimas es desplazado hacia bajas temperaturas con un concomitante

decremento en la estabilidad térmica (Joseph et al., 2008).

El potencial de las lipasas adaptadas a bajas temperaturas es de gran importancia en el rubro ambiental, particularmente en el campo de tratamiento de aguas residuales, biorremediación en ambientes de bajas temperaturas contaminados con grasas y en la síntesis de compuestos en condiciones frías

(Buchon et al., 2000). Se ha observado degradación máxima de resina de etanol

por Pseudomonas sp., al igual que de Rhodococcus sp. en aceites de petróleo y resinas de benceno por parte de lipasas producidas por microorganismos psicrotróficos. Además, estas enzimas han establecido un punto de partida para el uso de dichos microorganismos degradadores de aceites y sus derivados en ambientes templados.

De acuerdo con Margesin et al. (1999), la actividad de las lipasas en suelo se

(32)

15

lipasas en suelo se incrementó con un aumento inicial de las concentraciones de

petróleo (Margesin et al., 1999).

En otros estudios, como en el de Del rio et al. (1990) se hizo una

caracterización más detallada de la inhibición en la producción de lipasas en

Pseudomonas sp. utilizando como única fuente de carbono n-hexadecano y se reportó que subproductos, como gliceroles y ácidos grasos son capaces de inhibir

la actividad enzimática. Así también, se conoce según Makhzoum et al. (1995) que

varios azúcares y sustratos más complejos, igualmente inhiben la actividad

enzimática de P. fluorescens. Otro estudio más reciente describe la capacidad de

la cepa de P. aureginosa, la PTz-5, capaz de utilizar benceno, tolueno e

igualmente hexadecano como única fuente de carbono y capaz de producir lipasa

extracelular que cataliza triglicéridos a ácidos grasos libre y glicerol (Mukherlee et

al., 2010)

Se ha señalado que el método más efectivo para evaluar la eficiencia de biorremediación de hidrocarburos es el monitoreo de las tasas de degradación.

Margesin (et al., 1999) propone evaluar la actividad de enzima lipasa para medir la

degradación de derivados de petróleo en suelos. En este trabajo se recurre a dicha propuesta para evaluar la respuesta enzimática de lipasa en una cepa

(33)

16 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Investigar la factibilidad de utilizar la actividad lipolítica como biomarcador en la biodegradación de compuestos aromáticos y alcanos del petróleo en sistemas en

medio líquido mediante Pseudomonas sp.

2.2 Objetivos específicos

• Determinar el efecto de diversos compuestos aromáticos y alcanos sobre la

expresión del sistema lipolítico de Pseudomonas sp.

• Determinar el efecto de la concentración de hidrocarburos aromáticos y

alcanos, pH y fuentes de carbono adicionales sobre la expresión del

(34)

17 3. JUSTIFICACION

(35)

18 4. HIPÓTESIS

Los hidrocarburos están clasificados como lípidos simples, pudiendo ser siendo entonces, degradados por enzimas lipolíticas (lipasas). La actividad de enzima lipasa puede ser utilizada como marcador biológico para establecer la reducción en la concentración de compuestos derivados del petróleo (aromáticos y alcanos) en los sistemas de biorremediación.

(36)

19 5. MATERIALES Y METODOS

5.1 FASE I. Evaluación de la inducción del sistema lipolítico de Pseudomonas sp. a través de compuestos aromáticos y alcanos.

Para el desarrollo de esta fase experimental se utilizaron como fuente de carbono 12 compuestos derivados del petróleo entre aromáticos y alifáticos; cuatro de ellos identificados como parte de la fracción del queroseno: n-Hexano, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, indeno, 9,10-dimetilantraceno, (Chilcott, 2006); siete más seleccionados por ser monoaromáticos y heteroaromáticos: dioctilftalato, butil benceno, butil benzoato, benceno, ácido benzoico, tolueno y piridina; y un último compuesto(s) más que fue la misma fracción de queroseno, (Todos los compuestos fueron de la marca Sigma-Aldrich, Co. con excepción del queroseno). Las características físico-químicas y toxicológicas de cada uno se describen en el Anexo 1.

5.1.1 Cepa utilizada

La bacteria utilizada fue Pseudomonas sp. previamente aislada del campo

petrolero “Paredón 31”, del estado de Tabasco, México (Cervantes- González et

al., 2008).

5.1.2 Preparación del inoculo

El inoculo se preparó en matraces Erlenmeyer de 125 ml, utilizando 25 ml de

medio mineral (MM): 0.30 KNO3, 0.0332 FeCl3 6H2O, 0.2 MgSO4 7H2O, 0.1 CaCl2

y 1 K2HPO4 (g/l), pH 6.8. Se adicionó queroseno a una concentración de 20,000

mg/l. Finalmente el medio de cultivo se inoculó con una asada de la cepa

(37)

20 5.1.3 Efecto de compuestos aromáticos y alcanos en la inducción del sistema de lipasas de Pseudomonas sp.

Se prepararon seis series experimentales para evaluar el efecto de cada

hidrocarburo sobre la expresión de las lipasas de Pseudomonas sp. Para esto se

(38)

21 Tabla 1. Descripción de series experimentales para la evaluación de la inducción de lipasas de Pseudomonas sp.

Compuesto Serie experimental No. 1

Serie experimental No. 2

Serie experimental No. 3

Serie experimental No. 4

Serie experimental No. 5

Serie experimental No. 6 n-Hexano [5000 ppm] [5000 ppm] + 500

ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100

1,2,3,4-tetrahidro-naftaleno

[5000 ppm] [5000 ppm] + 500 ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5%

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Butil-benceno [5000 ppm] [5000 ppm] + 500

ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Butil-benzoato [5000 ppm] [5000 ppm] + 500

ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Indeno [5000 ppm] [5000 ppm] + 500

ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100

9,10-dimetilantraceno

[5000 ppm] [5000 ppm] + 500 ppm Triton X-100

[3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Glucosa [5000 ppm] [5000 ppm] + 500

ppm Triton X-100

ND ND ND ND

Queroseno ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100

Benceno ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Dioctilftalato ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100

Tolueno ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100 Acido benzoico ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 % + 1000 ppm Triton X-100

Piridina ND ND [3000 ppm] [3000 ppm] + 1000 ppm

Triton X-100

[3000 ppm] + sacarosa 0.5 %

(39)

22

De acuerdo a los resultados que más adelante se detallan, se evaluaron otras tres concentraciones adicionales de indeno y n-hexano y se realizó la comparación con la actividad de lipasa al utilizar al mismo tiempo sacarosa al 0.8 % como fuente adicional de carbono (Tabla 2).

Tabla 2. Concentraciones de indeno y n-hexano utilizadas para evaluar la inducción de las lipasas de Pseudomonas sp.

5.1.4 Evaluación de la actividad de lipasa

La evaluación de la actividad de lipasa se realizó en base a la técnica reportada

por Margesin et al. (2002) con algunas modificaciones. Se tomaron 2 ml de cada

medio de cultivo en el que se evaluaría la enzima y se centrifugaron en tubos de polipropileno a 13,000 rpm a 4 °C por 8 min., se tomó 1.0 ml de extracto libre de células y se colocó en un tubo de vidrio al que se le adicionó 2.0 ml de regulador

0.1 M KH2PO4/NaOH pH 7.2. Los tubos se sometieron a preincubación en un baño

térmico de agua durante 10 min a 37 °C. Pasado este lapso de tiempo se

adicionaron 20 µl del sustrato [100 mM p-nitrofenol butirato (pNPB) diluido en

2-Compuesto Concentración utilizada como única fuente

de carbono

Concentración del compuesto + Fuente de carbono adicional

Indeno

800 ppm 800 ppm + sacarosa 0.8 %

1200 ppm 1200 ppm + sacarosa 0.8%

1600 ppm 1600 ppm + sacarosa 0.8%

n-hexano

800 ppm 800 ppm + sacarosa 0.8 %

1050 ppm 1050 ppm + sacarosa 0.8 %

(40)

23

propanol y almacenado a -20 °C], el contenido se mezcló perfectamente y se mantuvo la reacción durante 15 minutos. El proceso de reacción de la enzima se

detuvo introduciendo los tubos en un baño de hielo, la liberación del p-nitrofenol

(pNP) fue medida espectrofotométricamente a 400 nm. La absorbancia fue extrapolada en una curva tipo de 0 a 100 µg pNP. La actividad de enzima lipasa se expresó en µg pNP/ml.

5.2 FASE II. Cinéticas de producción de las lipasas de Pseudomonas sp y evaluación del efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración de hidrocarburos.

En esta fase se realizaron cinéticas de producción de la enzima utilizando como fuente de carbono los compuestos que mostraron mayor actividad en la inducción de la enzima (Fase I) y posteriormente se evaluó mediante el diseño experimental de Box-Behnken el efecto de la concentración de sacarosa, pH y concentración del hidrocarburo en la producción de la enzima y en la degradación del hidrocarburo utilizado.

5.2.1 Cinéticas de producción de lipasas dePseudomonas sp.

(41)

24

Tabla 3. Fuentes de carbono utilizadas en las cinéticas de producción de enzima lipasa.

(Si)-adición de la fuente de carbono, (-): no adición de la fuente de carbono

Los matraces fueron incubados durante 15 días a 30 °C y 180 rpm. Cada 24 h durante los primeros cuatro días de incubación y cada tres días durante los siguientes 11 días se retiró un matraz para evaluar crecimiento microbiano por dilución en placa; se midió el pH mediante el uso de un potenciómetro (PHS-3C) y actividad de lipasa con la técnica antes descrita.

Cinética No.

Hidrocarburo Sacarosa 0.8 % Triton X-100 (2000 ppm)

1 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno - -

2 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno Si - 3 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno - si 4 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno Si si

5 Butil-benceno - -

6 Butil-benceno Si -

7 Butil-benceno - si

8 Butil-benceno Si si

9 n-hexano Si -

10 n-hexano Si si

11 - - si

(42)

25 5.2.2 Efecto del pH, concentración de sacarosa y concentración del hidrocarburo en la producción de lipasas de Pseudomonas sp a través del diseño experimental de Box-Behnken.

Se utilizo el diseño experimental de Box-Behnken para evaluar el efecto de tres variables independientes sobre la actividad enzimática y la remoción del hidrocarburo. El diseño consistió en 15 experimentos (Tabla 4) con tres variables y tres niveles cada una; concentración del hidrocarburo, pH y concentración de sacarosa.

Tabla 4. Diseño experimental de Box-Behnken

Matraz No.

Concentración del hidrocarburo (ppm)

pH Concentración de sacarosa %

1 -1 -1 0

2 -1 1 0

3 1 -1 0

4 1 1 0

5 -1 0 -1

6 -1 0 1

7 1 0 -1

8 1 0 1

9 0 -1 -1

10 0 -1 1

11 0 1 -1

12 0 1 1

13 0 0 0

14 0 0 0

15 0 0 0

pH: “1“corresponde a pH 9; “0” corresponde a pH 8 y “-1” corresponde a pH 7.

(43)

26

El diseño experimental se preparó por duplicado en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de MM y 2000 ppm de Triton X-100 acorde con los experimentos (Tabla 4), cada matraz fue posteriormente inoculado con 0.1 ml de inoculo fresco. Trascurridos cinco días de incubación en la oscuridad a 180 rpm y 28 °C, se evaluó la actividad enzimática de lipasa con la técnica antes descrita.

Además se prepararon tres controles sin inocular para cuantificar las pérdidas abióticas de los hidrocarburos. Este diseño se realizo utilizando 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, butil-benceno y n-hexano por separado.

5.2.3 Análisis estadístico

(44)

27 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 FASE I. Evaluación de la inducción del sistema lipolítico de Pseudomonas sp. mediante compuestos aromáticos y alifáticos.

Dentro de la primera etapa se analizó la inducción de lipasas por diversos hidrocarburos del petróleo. Los primeros resultados mostraron que ninguno de los compuestos fue capaz de inducir por si solo la actividad enzimática de

Pseudomonas sp. al utilizar 5000 ppm (Serie experimental No. 1). De tal manera que se analizó el efecto de la presencia del surfactante Triton X-100 al utilizar la misma concentración de hidrocarburos (Serie experimental No. 2), encontrándose que se favoreció la inducción de las lipasas pero solo al utilizar butil benceno, 9,10-dimetilantraceno y n-hexano, cuantificando como máximo 2.6 µg pNP/ml con el 9,10-dimetilantraceno (Figura 1). Posteriormente, al utilizar los hidrocarburos como única fuente de carbono a una concentración de 3000 ppm (Serie experimental No. 3) se registró actividad enzimática en cuatro ellos (butil-benceno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, n-hexano y benceno), lo anterior sugiere que la concentración a la que se encuentre el hidrocarburo es determinante para la expresión de la enzima durante el proceso de degradación. Además, también se observa que no todos los hidrocarburos ensayados fueron inductores de la lipasa de Pseudomonas sp. al menos no a la concentración de 3000 ó 5000 ppm. Lo anterior sugiere una alta especificidad de la enzima por el sustrato (hidrocarburo).

Adicionalmente, se analizó la expresión de la lipasa al utilizar el surfactante Triton X-100 adicionado a cada hidrocarburo a 3000 ppm (Serie experimental No. 4) y los resultados indicaron un incremento en la actividad enzimática en comparación con el uso de los diferentes hidrocarburos como únicas fuentes de carbono (Serie experimental No. 3).

(45)

28

El incremento de actividad enzimática por efecto del Triton X-100 en el cultivo, se especula que puede deberse a lo señalado por Li & Chen (2009) quienes mencionan que los surfactantes favorecen la solubilidad y disolución de hidrocarburos al disminuir la tensión superficial y con ello se incrementa el contacto entre los microorganismos y el hidrocarburo, conllevando a una mayor degradación del mismo. De tal manera que de acuerdo a los resultados una mayor degradación del hidrocarburo podría estar asociada a una mayor actividad de lipasa. Las actividades más altas que se produjeron fueron al utilizar

1,2,3,4-tetrahidronaftaleno con 12.17 y con benceno con 12.33 µg pNP/ml (Serie

experimental No.4, Figura 1). Al respecto, Lin (et al., 1995) describen que la

adición de Triton X-100 a un medio de cultivo conteniendo como fuente de

carbono aceite de oliva fue capaz de incrementar la producción de lipasa en P.

pseudoalcaligenes F-111 hasta en 50 veces.

Conjuntamente se encontró que el uso del Triton X-100 como única fuente de

carbono por Pseudomonas sp. indujo la actividad de lipasa, cuantificándose una

actividad de 14 µg pNP/ml a los cinco días de incubación; lo anterior sugiere la

(46)

29

Figura 1. Actividad de lipasa de

Pseudomonas sp. en presencia de A)

butil-benceno, B) 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, C)

9,10-dimetilantraceno, D) n-hexano y E) benceno. 0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6

A ct iv id a d ( μ g p N P /m L) Series Experimentales 0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6

A ct iv id a d ( μ g p N P /m L) Series Experimentales 0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6

A ct iv id a d ( μ g p N P /m L) Series Experimentales 0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6

A ct iv id a d ( μ g p N P /m L) Series Experimentales 0 5 10 15 20 25

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A ct iv id a d ( μ g p N P /m L) Series Experimetales

A) B)

C) D)

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En el caso de la utilización de ácido benzoico y tolueno no se presentó crecimiento de la cepa aun en presencia de Triton X-100, lo cual indica una nula tolerancia a éstos hidrocarburos.

Adicionalmente, se evaluó el efecto del uso de una fuente de carbono de fácil asimilación como lo es la sacarosa en la inducción del sistema lipolítico de

Pseudomonas sp. Los resultados mostraron que sólo en dos compuestos la actividad se incrementó en comparación con el uso del hidrocarburo como única fuente de carbono: 9,10-dimetilantraceno y 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, de 0.04 a

5.24 µg pNP/ml y 1.57 a 3.84 µg pNP/ml, respectivamente, (serie experimental

No. 5, Figura 1). En el caso del uso del butil-benceno, n-hexano y benceno la

actividad disminuyó de 2.22 a 0.38, de 0.74 a 0.0 y de 1.01 a 0 µg pNP/ml,

respectivamente por efecto de la presencia de sacarosa (Figura 1), esto sugiere que la expresión de la lipasa es propensa a represión catabólica. Los restantes seis hidrocarburos evaluados no presentaron actividad aunque si crecimiento, lo cual corrobora la no participación de las lipasas extracelulares en el metabolismo

de degradación. Al respecto, Boekema et al., (2007) indican que la presencia de

una fuente adicional de carbono como lo es la sacarosa favorece la actividad de las lipasas, no así la presencia de glucosa, esto en el sistema de degradación de

aceite de oliva mediante Burkholderia glumae. Por el contrario Joseph et al.

(2011) mencionan que Micrococcus roseus produce mayor actividad lipolítica

teniendo como fuente de carbono alternativa glucosa en comparación con sacarosa, lactosa y maltosa. Es decir, que cada microorganismo presenta represión catabólica por carbono de acuerdo a su sistema de transporte de carbohidratos a diferentes niveles (transcripción, procesamiento de RNA, traducción y modificación de proteínas).

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9,10-dimetilantraceno y hasta 21.7 µg pNP/ml para el 1, 2, 3,

4-tetrahidronaftaleno; no así para el uso del hexano y benceno, en donde no se observó actividad enzimática de lipasa. Estos resultados confirman que la degradación de cada hidrocarburo es llevada a cabo mediante rutas diversas y que la presencia de surfactantes y fuentes de carbono adicionales tienen efectos diversos, de tal manera que el uso de la actividad de lipasa como marcador de la degradación de hidrocarburos es limitada. Estos resultados concuerdan con lo

reportado por Boekema et al., (2007) quienes mencionan que la presencia del

surfactante Triton X-100 no incrementa la actividad de la lipasa cuando la sacarosa o la glucosa se ha utilizado como fuente de carbono en una cepa de Burkholderia glumae, pero el uso de otro surfactante como lo es el Tween 80 si estimula la producción de lipasa cuando la sacarosa se utiliza como fuente de carbono.

Por otro lado, se estudió la actividad de lipasa de Pseudomonas sp. utilizando

n-hexano como fuente de carbono a concentraciones menores que las dos evaluadas previamente (5000 y 3000 ppm), lo anterior debido a que se ha descrito que algunos n- alcanos como hexadecano y octadecano, inducen las lipasas

(Breuil, et al., 1978; Kanwar & Goswami, 2002; Boekema et al., 2007) y en la

presente investigación la actividad de lipasa fue nula al utilizar 5000 ppm y 0.74 µg pNP/ml al utilizar 3000 ppm. De tal manera que se evaluaron concentraciones de 800, 1050 y 1300 ppm como se indica en la Tabla 2, las actividades obtenidas cuando se utilizó este compuesto como única fuente de carbono fueron similares

en las tres concentraciones (1 µg pNP/ml) (Figura 2A), de tal manera que no

tuvo efecto la concentración, pero que tampoco se trata de una elevada actividad y tampoco tuvo diferencia con la cuantificada al usar la concentración de 3000 ppm de n-hexano. En los casos donde se adicionó sacarosa, las respuestas en las actividades de enzima lipasa fueron más altas, desde 2.35 para la concentración

de 800 ppm y hasta 3.79 µg pNP/mlcon 1300 ppm del hidrocarburo, lo cual indica

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caso de la utilización del n-hexano a 3000 ppm el efecto de la sacarosa fue inhibitorio para la enzima.

Figura 2. Actividad de enzima lipasa de Pseudomonas sp. en presencia de A) n-Hexano y

n-Hexano y sacarosa, B) indeno e indeno y sacarosa.

A: Serie experimental 1: 800 ppm n-hexano; Serie 2: 800 ppm n-hexano + sacarosa 0.8 %; Serie 3: 1050 ppm n-hexano; Serie 4: 1050 ppm n-hexano + sacarosa 0.8 %; Serie 5: 1300 ppm n-hexano; Serie 6: 1300 ppm n-hexano + sacarosa 0.8 %.

B: Serie experimental 1: 800 ppm indeno; Serie 2: 800 ppm indeno + sacarosa 0.8 %; Serie 3: 1200 ppm indeno; Serie 4: 1200 ppm indeno + sacarosa 0.8 %; Serie 5: 1600 ppm indeno; Serie 6: 1600 ppm indeno + sacarosa 0.8 %).

Otro caso particular fue el estudio del uso del indeno como fuente de carbono

para la inducción de la lipasa de Pseudomonas sp. por tratarse de un compuesto

monoaromático similar al 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, con la diferencia de tener unido un cicloalqueno en lugar de un cicloalcano. Como se menciono previamente el indeno fue uno de los hidrocarburos que no indujeron la enzima a 5000 ni a 3000 ppm, de tal forma que se evaluó posteriormente a 800, 1200 y 1600 ppm

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 A ct iv id a d ( μ g p N P /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

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