FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, INGENIERÍA Y MEDICINA
PROGRAMAS MULTIDISCIPLINARIOS DE POSGRADO EN CIENCIAS
AMBIENTALES
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS AMBIENTALES
Análisis de asociación de los polimorfismos E155del, A140D y E208K de la
glutatión S transferasa Ω 1-1(GSTO1-1) con los perfiles de expresión de
mediadores inflamatorios y apoptóticos en individuos expuestos a arsénico
PRESENTA:
DIANA MARÍA ESCOBAR GARCÍA
DIRECTOR DE TESIS:
Dra. CLAUDIA ESCUDERO LOURDES
ASESORES:
Dra. LUZ MARÍA DEL RAZO JIMÉNEZ
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, INGENIERÍA Y MEDICINA
PROGRAMAS MULTIDISCIPLINARIOS DE POSGRADO EN CIENCIAS
AMBIENTALES
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS AMBIENTALES
Análisis de asociación de los polimorfismos E155del, A140D y E208K de la
glutatión S transferasa Ω 1-1 (GSTO1-1) con los perfiles de expresión de
mediadores inflamatorios y apoptóticos en individuos expuestos a arsénico
PRESENTA:
M. en C. DIANA MARÍA ESCOBAR GARCÍA
COMITÉ TUTELAR:
DIRECTORA: Dra. Claudia Escudero Lourdes _______________________________
ASESORA: Dra. Luz María Del Razo Jiménez_____________________________________
SINODALES:
PRESIDENTE: Dra. Claudia Escudero Lourdes _______________________________________
SECRETARIO: Dra. Luz María Del Razo Jiménez ________________________________________
VOCAL: Dra. Jaqueline Calderón Hernández _________________________________________
VOCAL: Dra.Ana Cristina Cubillas Tejada _________________________________________
2
PROYECTO REALIZADO EN:
Laboratorio de Inmunología y Biología Molecular, CIEP.
Facultad de Ciencias Químicas
CON FINANCIAMIENTO DE:
Proyecto SECTORIAL SEP-CONACYT No. M-44051
Responsable: Dra. Claudia Escudero Lourdes
A TRAVÉS DEL PROYECTO DENOMINADO:
“Análisis de los mecanismos involucrados en el efecto tóxico del As sobre
los procesos inflamatorios en un modelo murino de intoxicación con
arsenito de sodio”
AGRADEZCO A CONACyT EL OTORGAMIENTO DE LA BECA-TESIS
Becario No
198477
AGRADECIMIENTOS
Doy especial gracias a mi familia, Alexander Mateo
y Simón quienes constantemente son un ejemplo de
tenacidad y constancia, ellos son mi motivación para
seguir adelante.
Agradezco a la Dra Elizabeth Reynaga Hernández por
su excelente asesoría técnica, su contribución fue
invaluable para la realización de este trabajo;
igualmente agradezco a la Dra Lina Raquel Riego Ruiz
ya que gracias a sus enseñanzas desinteresadas hizo
posible la interpretación de las bases de datos de los
polimorfismos
secuenciados
y
la
resolución
de
múltiples problemas en técnicas de biología molecular.
Gracias a todas las personas que tuvieron que ver de
algún modo en la realización y culminación de este
4 RESUMEN
La exposición humana a arsénico (As) se ha asociado con el desarrollo de un
sinnúmero de enfermedades relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios
y apoptóticos que pueden incluir tanto diferentes tipos de cáncer como enfermedades
no cancerosas, dentro de esta últimas podemos mencionar principalmente
enfermedades neurodegenerativas, aterosclerosis, hipertensión y diabetes mellitus
tipo 2. También es conocido que existe una gran susceptibilidad interindividual al
desarrollo de éstas enfermedades en el contexto de poblaciones expuestas a As ya
sea en el agua de bebido a por cualquier otra vía de exposición, dicha
susceptibilidad está dada principalmente por la presencia de polimorfismos en
enzimas metabólicas encargadas de la bio-transformación del arsénico inorgánico
(iAs ) como lo es la glutatión S transferasa omega 1-1 (GSTO1-1). La GSTO1-1, se
ha asociadas no solo con el metabolismo del iAs , sino también con las respuestas
ante procesos inflamatorios y apoptóticos de las células. Dentro de los polimorfismos
de la GSTO1-1, el polimorfismo A140D a ha sido asociado con alteraciones del perfil
de los metabolitos de arsénico excretados en orina en poblaciones crónicamente
expuestas a iAs por medio del agua de bebida, además, también ha sido asociado
con un mayor riesgo para el desarrollo de leucemia infantil y enfermedad pulmonar
obstructiva crónica (EPOC) en poblaciones no expuestas, sugiriendo que esta
enzima pudiera participar de manera muy importante en otros procesos fisiológicos
5 En este trabajo se evaluó la asociación de la presencia de los polimorfismos
A140D y E208K del gen de la GSTO1-1 con la expresión de genes que codifican
para proteínas implicadas en la respuesta inflamatoria y apoptótica en una población
humana expuesta crónicamente a iAs a través del agua de consumo. Se encontró
que el polimorfismo A140D está asociado con la expresión de genes que codifican
principalmente para la IL-8 y Apaf-1 en individuos heterocigotos, mientras que E208K se asoció con mayor expresión de IL-8 y TGF-β; en ambos casos, la asociación fue
independiente de los niveles de exposición a iAs. Estos resultados sugieren una
importante participación de la GSTO1-1 en la respuesta inflamatoria y el proceso de
apoptosis e indican que la presencia de los polimorfismos A140D y E208K en
población expuesta, podría incrementar el riesgo a desarrollar enfermedades
relacionadas con procesos inflamatorios y apoptóticos que podrían incluir cáncer y
Tabla de contenido
ANTECEDENTES ... 8
GLUTATIÓN STRANSFERASA (GST) ... 8
Glutatión s transferasa Ω (gsto) ... 9
ARSÉNICO ... 14
Arsénico y salud ... 15
Metabolismo del arsénico ... 19
Mecanismos de toxicidad del arsénico ... 23
Arsénico: inflamación y apoptosis ... 27
JUSTIFICACIÓN ... 31
HIPÓTESIS ... 33
OBJETIVOS ... 34
OBJETIVO GENERAL ... 34
Objetivos particulares ... 34
METODOLOGÍA ... 36
SITIO DE ESTUDIO Y SELECCIÓN DE LOS PARTICIPANTES ... 36
COLECCIÓN DE AGUA Y ORINA ... 37
DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE ARSÉNICO ... 38
COLECCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA ... 39
AISLAMIENTO DE DNA ... 40
DETECCIÓN DE LOS POLIMORFISMOS ... 42
POLIMORFISMO A140D Y E155 DEL DE LA GSTO1-1 ... 42
POLIMORFISMO E208K DE LA GSTO1-1 ... 45
SECUENCIACIÓN ... 46
Purificación de productos de PCR ... 46
AISLAMIENTO DE RNA ... 47
7
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS... 48
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES ... 49
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ... 51
RESULTADOS ... 54
CARACTERÍSTICAS DE LA POBLACIÓN ... 54
CONCENTRACIÓN DE AS TOTAL EN EL AGUA DE BEBIDA ... 54
DISTRIBUCIÓN DE LOS POLIMORFISMOS A140D,E155DEL Y E208K Y SU COMBINACIÓN EN LA POBLACIÓN DE ESTUDIO: ... 55
CONCENTRACIÓN DE AS TOTAL (AST) EN ORINA... 57
CONCENTRACIONES DE IAS Y ESPECIES DE ARSÉNICO EN ORINA ... 58
ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS CON LA CONCENTRACIÓN URINARIA DE ESPECIES DE ARSÉNICO EN ORINA. ... 60
EFICIENCIA DEL PRIMER Y SEGUNDO PASO METABÓLICO. ... 65
ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS CON EXPRESIÓN GENÉTICA. ... 66
PROCESO APOPTÓTICO ... 67
RESPUESTA INFLAMATORIA ... 69
8
ANTECEDENTES
G
LUTATIÓNS
T
RANSFERASA(GST)
Las glutatión S transferasas (GSTs) son una gran familia de enzimas
citosólicas de fase II que desempeñan una gran variedad de funciones que van
desde la conjugación de xenobióticos hasta la modulación de vías de señales de
transducción y la formación y modulación de canales iónicos. Estas enzimas
participan en la síntesis de sustancias endógenas como las prostaglandinas y
hormonas esteroideas (Oakley, 2005) y en el metabolismo de xenobióticos tales
como el arsénico (As). Por otro lado, son de particular significancia en la biología del
cáncer debido a una intrínseca capacidad para desintoxicar un gran número de
compuestos carcinógenos (Mohr et al., 2003).
Se han descrito siete subfamilias de la GST: , , , , , , y (Stanulla et
al., 2000; Marahatta et al., 2006). Dentro de cada una de estas subfamilias existe un
número variable de isoformas, cada una codificada por diferente locus genético. En
los genes que codifican para estas enzimas se han descrito diferentes polimorfismos
algunos de los cuales han demostrado que pueden aumentar el riesgo para el
desarrollo de enfermedad de Parkinson y Alzheimer como es el caso de sujetos que
presentan el polimorfismo N142D en GSTO1-1-2 y están expuestos a pesticidas (Li
9 sido más estudiados de esta familia son la GST del grupo (GSTM) y las GST del
grupo (GSTT); en estos grupos de familias de la GST se han descrito polimorfismos
nulos, en donde una deleción en el gen impide que se produzca una enzima
funcional dejando a los individuos que presentan éste polimorfismo en desventaja
para metabolizar una cantidad importante de carcinógenos, como los encontrados en
el humo del cigarrillo, lo que se traduce en una mayor susceptibilidad al desarrollo de
cáncer de pulmón (Mohr et al., 2003; Bolt & Thier, 2006).
G
LUTATIÓN S TRANSFERASAΩ
(
GSTO)
Esta proteína es producida por un amplio rango de especies, entre las que se
pueden mencionar la humana, rata, ratón, Drosophila melanogaster y
Caenorhabdetis elegans (Whitbread, et al., 2003; Aposhian. et al., 2004). En
humanos, se expresa en diversos tejidos incluyendo hígado, macrófagos, células
gliales y células endócrinas (Tanaka-Kagawa et al., 2003). Esta enzima es expresada
por 2 genes: hgsto1 y hgsto2 que codifican para las proteínas GSTO1-1 y GSTO1-2,
respectivamente. Ambos genes están localizados en el brazo largo del cromosoma
10 en la fracción 24.3 (Figura 1) y están separados por 7.5 kb (Schmuck et al., 2005).
El gen que codifica para GSTO1-1 llamado hgsto1-1 está constituido por 6 exones
10
Figura 1 Cromosoma 10. Localización de la GSTO.
Esta proteína presenta grandes diferencias con otras enzimas del grupo de las
GST como tener un residuo de cisteína en lugar de residuos de serina en el sitio
activo; además, contar con un residuo adicional de 19 aminoácidos en el extremo N
Terminal (Figura 2). La GSTO exhibe dos actividades que no están asociadas con
otras GSTs, como tener una actividad tioltransferasa y una actividad catalítica de
reducción de dehidroascorbato, ambas dependiente de glutatión (Board et al., 2000,
2007). Esta enzima muestra mínima actividad catalítica con muchos compuestos que
son sustratos para otros miembros de las otras clases de GSTs (Schmuck et al.,
2005). Concretamente la GSTO1-1 presenta una actividad de monometilarsenato
(MMAV) reductasa y está considerada como una enzima limitante en las vías de
biometilación del As inorgánico (iAs), pues muestra una Km para el sustrato que se
encuentra en el rango milimolar a diferencia de otras GSTs cuya Km se encuentran
11
Figura 2. Estructura de la GSTO1-1 humana.
Diferentes polimorfismos en el gen que codifica para GSTO1-1 han sido
identificados en diversos grupos étnicos como europeos y aborígenes americanos
(Figura 3) (Yu et al., 2003; Mukherjee et al., 2006); uno de ellos corresponde al
polimorfismo denominado A140D, en donde una mutación puntual en el exón 4 (C/A)
da lugar a la sustitución en la proteína, de una alanina por un ácido aspártico
produciendo una disminución del 25% en la actividad de tioltransferasa con relación
a la enzima silvestre (Tanaka-Kagawa et al., 2003). La presencia de este
polimorfismo A140D ha sido asociado con riesgo para desarrollar diferentes
enfermedades que incluyen enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)
(Yanbaeva et al., 2009) así como leucemia linfoblástica aguda de la infancia
(Pongstaporn et al., 2009); sin embargo, no existen estudios que evalúen los factores
o mecanismos asociados. El polimorfismo E155del que consiste en una deleción de
12 de ácido glutámico de la enzima. Esta modificación causa una disminución en
estabilidad de la enzima al calor y está relacionado con una eliminación subnormal
de las formas metiladas del iAs presentes en la orina (Marnell et al., 2003). Otro
polimorfismo descrito es el E208K, se encuentra en el exón 6 (G/A) y corresponde a
un cambio de un residuo de un ácido glutámico por una lisina en la enzima (Marnell
et al., 2003). Este polimorfismo se asocia a modificaciones en la disposición de
metabolítos del iAs en orina (Marnell et al., 2003).
Figura 3 Mapa del hGSTO1-1. El mapa del gen muestra las características del gen así como los diferentes polimorfismos identificados.
Es importante mencionar que adicionalmente a las actividades enzimáticas
referidas en el metabolismo del As, la GSTO1-1 modula la función del receptor de
rianodina (RyRs) de los canales de liberación de calcio del retículo sarcoplásmico de
células esqueléticas y cardíacas, por lo que se ha propuesto que esta enzima juega
un papel importante en la protección de células en contra de la apoptosis inducida
por la movilización de Ca++ a partir de depósitos intracelulares (Lima et al., 2008;
13 Board et al., 2004; Dulhunty et al., 2001; Tanaka-Kagawa et al., 2003), ya que un
desequilibrio en la homeostasis de su liberación está implicada en el desarrollo de
varios desórdenes esqueléticos y cardíacos debido a procesos de envenenamiento
celular y apoptosis (Lemasters et al., 2009; Beard et al., 2009). Los RyRs también se
expresan en linfocitos T y B (Guse et al., 1999; Sei et al., 1999). Estas observaciones
inducen a asumir que alteraciones en la funcionalidad de esta enzima pueda verse
reflejado en un aumento en el grado de apoptosis celular. Otra función poco
documentada de esta enzima es su posible papel en el procesamiento
postraduccional y la liberación de la interleucina 1 beta (IL-1) de los monocitos (Li et
al., 2006). Como soporte a esta observación se ha descrito que GSTO1-1 es uno de
los principales blancos de los fármacos que inhiben la liberación de citocinas
(Laliberte et al., 2005). Tomando en cuenta que la IL-1 es un mediador
proinflamatorio producido abundantemente por los monocitos activados y macrófagos
es posible asumir que una alteración en la funcionalidad o en la expresión de
GSTO1-1 afectará asimismo la producción de IL-1 y, por consiguiente, las
respuestas inflamatorias, proliferación y diferenciación celular y, finalmente, la
El As es un elemento ampliamente distribuido en la naturaleza. Se obtiene
como producto secundario de desecho en los procesos de extracción y refinación de
minerales y metales como el cobre, plomo, zinc y estaño en forma de arsenopirita
(FeAsS), rejalgar (As2S2), oropimente (As2S3) y trióxido de As (As2O3).
Adicionalmente, el As puede ser liberado al ambiente por actividad volcánica y
erosión de depósitos minerales o actividad minera con mala disposición de los
desechos dejados por esta actividad. Antiguamente se empleó en el tratamiento de la
sífilis, disentería amebiana y tripanosomiasis. En la actualidad, la utilización de este
metaloide se ha reservado a la fabricación de insecticidas, herbicidas y fungicidas; en
la producción de algunos colorantes; en tratamientos de enfermedades de la piel
como la psoriasis; en la disección de animales y conservación de pieles; en la
industria de la peletería y curtiduría, en la industria vidriera y microelectrónica y como
sellador de maderas. Aunque por razones geológicas naturales, el As se encuentra
por encima de las normas oficiales establecidas en el agua para beber en diferentes
países del mundo (0.01-3.7 mg/l), la mayor parte del As que se encuentra como
Es bien reconocido que la exposición crónica al iAs es causa de efectos en
salud a diferentes niveles como el gastrointestinal, hepático, renal, cardiovascular,
neurológico, dermatológico, respiratorio, hematopoyético, reproductivo y
endocrinológico (De BK et al., 2004). El As es considerado un agente carcinogénico
según diferentes autoridades en salud mundial como la Agencia para Sustancias
Tóxicas y Riesgo de Enfermedades (ATSDR), la Agencia Internacional para la
Investigación en Cáncer (IARC), El Departamento de Salud y Servicios Humanos
(DHHS), la Agencia de Protección Ambiental (EPA) y el Programa Nacional de
Toxicología (NTP). A través de estudios epidemiológicos se ha establecido una
relación entre la exposición a iAs y enfermedades cardiovasculares, pero los
mecanismos involucrados en este fenómeno no se han esclarecido aún (Bunderson
et al., 2004; Cheng et al., 2011). Por estos motivos, la presencia de iAs como
contaminante ambiental es actualmente considerado como uno de los mayores
problemas en salud pública a nivel mundial, ya que millones de personas en
diferentes países como Bangladesh, Estados Unidos, Argentina, Chile, China,
Ghana, Grecia, Hungría, India y México, están en riesgo de padecer cáncer de piel,
pulmón, bazo, hígado y riñón; enfermedades del corazón, diabetes y otros
16 al., 2007) las cuales pueden variar de un país a otro.
Dado que las principales rutas de exposición en el humano son la vía oral y
respiratoria, la intoxicación crónica se ha asociado con cáncer broncogénico y a
cáncer de piel, hígado, vejiga y riñón (Chiou et al., 2001; Smith et al., 1998;
Steinmaus et al., 2000; Shi et al., 2004a). Adicionalmente a estos efectos, se ha
establecido una relación epidemiológica entre la exposición crónica a As y la
enfermedad del pie negro, diabetes mellitus tipo II y enfermedades cardiovasculares
(Bunderson et al., 2004; Tseng et al., 1996).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda que el As en el agua para consumo humano no deba exceder las concentraciones de 10 ppb (μg/l).
Mientras que en México, la Norma Oficial Mexicana, NOM 127 SSA-1994 modificada,
estipula que para el 2005, la concentración máxima permisible de As en el agua para uso y consumo humano no debe rebasar los 25 ppb (μg/l).
En México, el Primer Diagnóstico Nacional de Salud Ambiental y Ocupacional
que publicó en 2002 la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos
Sanitarios, indicó que el hidroarsenicismo puede afectar a poblaciones grandes como
el caso de la Comarca Lagunera, que abarca comunidades de los estados de
17 algunas de las localidades más afectadas por altas concentraciones de iAs en el
agua para uso y consumo humano son los municipios de Matamoros, Francisco I.
Madero y San Pedro. Figura 4. En Zimapán (Hidalgo) las concentraciones reportadas van de 370 a 1,000 μg/l (Fuentes, 2004). Otro estado que reporta concentraciones de
As en agua para uso y consumo humano por encima de la norma es Sonora
(Roberge et al., 2012). La zona de estudio ( La comarca Lagunera) también presenta
una alta contaminación del agua de uso y consumo con flúor; este contamínate ha
sido claramente identificado como causal de efectos adversos a la salud (Pei et
al.,2012, Inkielewicz-Stepniak et al ., 2012)como fluorosis dental, y esquelética,
además, es bien conocido que el flúor pasa la barrera hemato-encefálica y produce
daños en el hipocampo y altos niveles de flúor en el agua de bebida (3-11 ppm)
afectan el sistema nervioso central, además diversos estudios argumentan que la
fluorosis puede ser causa del decremento de la inteligencia en niños de áreas
endémicas (Pei et al.,2012, Inkielewicz-Stepniak et al ., 2012).Las concentraciones
reportadas de este elemento químico en territorio mexicano son de 0.5 a 3.7 mg/l
(Armienta y Segovia 2008).
Adicional al problema del agua contaminada con estos dos elementos (As y F)
la zona de estudio (Torreón, Coahuila) esta reportada como una de las ciudades más
contaminadas del mundo debido a las emisiones derivadas de los procesos de
M
ETABOLISMO DEL ARSÉNICOLa toxicidad relativa del iAs depende de varios factores que incluyen
principalmente la vía y tiempo de exposición, estado de oxidación (III o V), de la
forma orgánica o inorgánica y de manera muy importante, de la variabilidad
interindividual de la población expuesta.
El iAs es metabolizado por reacciones de óxido-reducción y metilación (Figura
5). Las enzimas que participan en este proceso son la purina nucleótido fosforilasa
(PNP), también llamada arsenato reductasa, encargada de realizar la reducción del
arsenato a arsenito; la arsenito metiltransferasa (AS3MT), encargada de la adición de
grupos metilo (Marnel et al., 2003) usando como cofactor a la S-adenosilmetionina y,
la monometil As reductasa, actualmente conocida como Glutatión S Transferasa
Omega (GSTO), que participa en la reducción de los metabolitos pentavalentes de
As (MMAV) a trivalentes (MMAIII) (Marnell et al 2003; Agusa et al., 2010; Cáceres et
al., 2010; Aposhian et al., 2004; Schläwicke-Engström et al., 2007). Aunque también
se ha documentado que factores endógenos como el ácido lipoico y el GSH son
excelentes reductores de los arsenicales pentavalentes, previo a su metilación
oxidativa (Waters et al., 2000). Una vez que el As entra a la célula vía
acuagliceroporinas, transportadores de glucosa en el hígado (GLUT2), en corazón y
20 et al., 2010), se lleva a cabo la metilación en dos fases consecutivas, dando lugar al
metabolito monometilado III y V (MMA) y al metabolito dimetilado III y V (DMA).
La mayor parte del As que ingresa al organismo es principalmente excretado
en orina por la acción conjunta de estas enzimas en forma de DMA en un 60-80%,
MMA en un 10-15% y iAs en un 10-20% (Raml et al., 2007). Los metabolitos
metilados existen en forma trivalentes y pentavalentes. La determinación de especies
de As en orina ha sido usado como biomarcador de habilidad individual de metilación
de As (Chen et al., 2003 a-b).
Las diferencias en la susceptibilidad a desarrollar enfermedades puede
deberse a la variabilidad interindividual en la biotransformación del As y de igual
manera, a la presencia de los polimorfismos en genes que codifican enzimas
involucradas en procesos metabólicos (Loffredo et al., 2003); ya que la metilación del
As parece afectar su toxicidad; por lo tanto, es esencial identificar los factores que
afectan la capacidad de metilación para entender mejor el riesgo a padecer algún
tipo de enfermedad relacionada con el contacto con este contaminante a través de
cualquier vía de ingreso al organismo.
En estudios previos, se consideraba la metilación como un mecanismo de
desintoxicación; sin embargo, recientes estudios in vitro indican que las formas
metiladas del As pueden servir como cocarcinógenos o promotores de tumores y
21 arsenato es un análogo de los fosfatos, por estas características es capaz de
interferir con reacciones de fosforilación compitiendo con el fosfato en el transporte
(Habib, 2009); mientras que el arsenito es una molécula que reacciona con grupos
sulfiidrilo de las proteínas pudiendo inhibir diferentes rutas bioquímicas (Teixeira et
al., 2007).
Tanto el AsIII como el AsV pueden tener efectos similares in vivo, ya que el
arsenato absorbido es rápidamente reducido a arsenito en sangre (Shi et al., 2004 b).
Adicionalmente, se ha reconocido que los metabolitos MMAIII y DMAIII son potentes
inductores de apoptosis; poseen la capacidad de unirse a diferentes proteínas
citosólicas y se les asocia al desarrollo de hiperplasia epitelial en exposiciones in
vitro de células del epitelio humano de tráquea fetal a concentración de 1µM
(Yamanaka et al., 2000; Hughes et al., 2000; Dong et al., 1995; Zhoux et al., 2003).
De igual manera, se ha documentado que el DMAIII reacciona con el oxígeno
molecular generando un radical peróxido, el cual induce rupturas en la cadena de
DNA (Yu et al., 2003).
Dada la gran variabilidad interindividual reportada en el metabolismo del As,
se ha sugerido que ésta puede ser un determinante de la susceptibilidad humana
para el desarrollo de enfermedades asociadas a la exposición a este tóxico.
Estudios recientes revelan una agregación familiar en los perfiles metabólicos de
22 esta variación. Otros trabajos sobre polimorfismos de esta enzima se han realizado
para evaluar su relación con el riesgo en el desarrollo de diferentes tipos de cáncer
como carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma, entre otros (Marahatta et al.,
2006). Asimismo, alteraciones en los niveles de expresión del gen que codifica
para GSTO1-1 se han asociado con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer
(Li et al., 2004). Debido a que esta enzima está involucrada en procesos
inflamatorios y apoptóticos, así como en el en el metabolismo del As, representa un
interés especial estudiar la posible asociación de los polimorfismos de la GSTO1-1
con alteración en la expresión de genes apoptóticos e inflamatorios en individuos
expuestos a altas concentraciones de As.
23 Independientemente de los mecanismos involucrados en el desarrollo de
enfermedades por exposición crónica al iAs, ha sido reconocido que la
susceptibilidad a la toxicidad de As y la gravedad en las manifestaciones varía entre
los individuos. La variabilidad interindividual en la biotransformación del As parece
ser un factor clave en tales diferencias (Schläwicke-Engström et al., 2007). Los
metabolitos formados durante la biotransformación del As poseen diferente grado de
citotoxicidad siendo los derivados trivalentes del As los más tóxicos (Wang et al.,
2007). Además, diferentes estudios epidemiológicos han encontrado asociaciones
entre la biotransformación del As y efectos de salud relacionados con este tóxico
(Kile et al., 2009). Por ejemplo, se ha descrito que un aumento de los niveles
relativos de las formas monometiladas del As (MMA III o V) y una disminución en los
niveles relativos de las formas dimetiladas (DMA III o V) en la orina de individuos
expuestos, se ha asociado con el desarrollo de enfermedades periféricas vasculares
(Tseng et al., 2006), carcinomas de vejiga [Chen et al., 2003 a] y cánceres de la piel
[Chen et al., 2003(b)].
M
ECANISMOS DE TOXICIDAD DEL ARSÉNICOEl As puede existir en el ambiente y los sistemas biológicos formando
compuestos orgánicos o bien, puede encontrarse en forma inorgánica, siendo ésta
última la forma que ha demostrado ser más tóxica tanto para humanos como para
24 oxidación 0); As (III) (estado trivalente o arsenito); y, As (V) (estado pentavalente o
arsenato). Las formas trivalentes y pentavalentes (metabolitos) son respectivamente
más tóxicas que el propio iAs (Shi et al., 2004 b); ATSDR, 2003; Styblo et al., 2000).
La amplia variedad de efectos en la salud observados por exposición al As es
debida a la inducción de estrés oxidante, condición que provoca una disfunción de
enzimas críticas y daño celular. La principal causa de estrés oxidativo durante una
exposición al As se debe a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)
(Kumagai & Sumi, 2007; Wnek et al., 2009). Importantes enzimas flavin como la
NAD(P)H oxidasa y las isoenzimas de la óxido nítrico sintetasa (NOS) están
involucradas en la generación de ROS asociada a la exposición al As. Se ha
demostrado que el As activa NAD(P)H oxidasa a través de la activación de Cdc42 en
células endoteliales murinas (Kumagai & Sumi, 2007); sin embargo, se ha indicado
que el As también subregula la expresión de NAD(P)H oxidasa a nivel de la
expresión de p22 phox, translocación de Rac1, aumentando así la producción de O2.
-sin embargo, ROS también pueden ser generadas por monometil arsénico (MMA), el
cual es generado por la unión covalente del As al grupo tiol de la óxido nítrico
sintetasa endotelial (Kumagai & Sumi, 2007). ROS juegan un papel muy importante
en la alteración de las vías de transducción de señales y la regulación de los factores
de transcripción, por activación o inactivación de varias señales en las cascadas de
25 Por otro lado, bajo condiciones normales las enzimas de la NOS generan altos
niveles de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina, con una mínima formación de ion
superóxido. Sin embargo, en condiciones inusuales, el desacoplamiento de las
isoenzimas de la NOS resultan en un decremento de la producción de NO y en la
consecuente reducción de oxígeno molecular a superóxido. Éste a su vez puede
reaccionar rápidamente con NO produciendo peroxinitritos y dando lugar a una
disminución importante de esta molécula, lo cual se ve reflejado en la disminución del
tono vascular (Lee et al., 2003). Consistente con esta noción se ha observado que
animales y humanos expuestos al As muestran una disminución en los niveles
corporales de NO (Kumagai & Sumi, 2007). El arsénico no sólo genera ROS, también
está demostrado que participa en la generación de especies reactivas de nitrógeno
(RNS) en sistemas biológicos. La producción de óxido nítrico (NO) a partir del
metabolismo del As es controversial, ya que el NO es una molécula mensajera que
juega un importante papel en el desarrollo de la respuesta inmune; además de ser un
importante neurotransmisor y vasodilatador. Parece ser que la estimulación de la
producción de NO por As es por activación de la óxido nítrico sintetasa endógena
(Kumagai & Sumi, 2007).
Autores como Kumagai y Sumi 2007 han demostrado que la exposición al As
desencadena la generación de ROS en varios sistemas celulares producidos
principalmente pero no de manera exclusiva por la mitocondria, ya que ROS puede
26 arsina peroxil (CH3)2As0·), el cual juega un papel muy importante en el daño al DNA
y en la producción de ion superóxido. De igual manera, las especies de metilarsénico
pueden liberar hierro activo de la ferritina y este hierro libre puede jugar un papel en
la generación de ROS y finalmente estas pueden también ser formadas durante la
oxidación del arsenito a arsenato.
La exposición a iAs puede provocar una disminución en los niveles de
moléculas antioxidantes como la glutatión S reductasa (GSR), encargada de
mantener el estado redox en la célula, lo cual desencadena un aumento de estrés
oxidativo, obedeciendo a la teoría de que el estrés oxidativo es una falta de balance
entre la generación de radicales libres y la cantidad de moléculas de antioxidantes en
los organismos vivos.
Se ha propuesto que la disminución celular de GSH en presencia de As puede
deberse a tres razones: (1) la GSH actúa como un posible donador de electrones
para la reducción del As pentavalente a As trivalente; (2) el As presenta una alta
afinidad por la GSH y, (3) la oxidación de GSH por generación de radicales libres
inducidos por As (Han et al., 2008).
La generación de ROS, alteraciones en las cascadas de señales y el
desbalance en los niveles de antioxidantes, activan de manera alternante la
27
A
RSÉNICO:
INFLAMACIÓN Y APOPTOSISDiferentes estudios demuestran que el consumo crónico de agua contaminada
con iAs a concentraciones superiores a las recomendadas por la OMS se asocia con
la prevalencia de procesos inflamatorios crónicos como la arterosclerosis y el asma
(Sakurai et al., 2004) y se apoya en los hallazgos de estudios in vitro donde se
muestra que el As estimula la expresión de las ciclooxigenasas 1 y 2 (COXs 1 y 2) en
células del endotelio (Bunderson et al., 2002, 2004). Estas enzimas catalizan la
síntesis de prostaglandinas que son importantes mediadores proinflamatorios y
además, se han encontrado sobreexpresadas en procesos neoplásicos tanto en
modelos experimentales como en humanos expuestos. (Raspollini & Taddei, 2007).
Adicionalmente, se ha reportado que el aumento en la expresión COX-2 se
asocia a un incremento en la apoptosis en células mono nucleares (CMN), aumento
en el potencial metastásico de células endoteliales y promoción de la angiogénesis,
la cual está directamente relacionada con una de las patologías más claramente
asociadas al consumo de agua contaminada con iAs, como la enfermedad del pie
negro (Sales et al., 2002; Corsini et al., 1999), que se ha relacionado además con la
iniciación de enfermedades hiperplásicas inflamatorias cutáneas (Huang et al., 2004).
El As es capaz de modular la expresión de genes por medio de la activación
28 factor nuclear kB (NF-kβ), la proteína p53 y a las clásicas proteínas kinasa activadas
por mitógenos (MAPKs) (Shi et al., 2004 b), las cuales juegan un papel importante en
la proliferación, transformación, diferenciación celular y mantenimiento de la
integridad del genoma (Huang et al., 2004), así como en la respuesta inflamatoria y
la regulación de la apoptosis celular. Por otro lado, la presencia de ROS es crítica
para la respuesta de citocinas, factores de crecimiento y para la activación o
inactivación de diferentes factores de transcripción (Lee, 1993). Existen evidencias
que asocian un estado inflamatorio crónico con el desarrollo de enfermedades como
diferentes tipos de cáncer (Balkwill, 2001; Mantovani, 2001; Balkwill, 2003);
aterosclerosis y diabetes (Guha-Mazumder, 2008); asma, alergias y parasitosis
(Soto-Peña et al., 2006). La respuesta inflamatoria juega un papel importante en la
patogenia de estas enfermedades, ya que las diferentes citocinas proinflamatorias
presentes en el tejido tumoral y sus alrededores, inducen la infiltración de leucocitos,
la angiogénesis, el crecimiento y migración de células tumorales así como la
metástasis (Balkwill, 2006). Es de especial interés el hecho de que la exposición a As
induce un aumento en la respuesta inflamatoria tanto in vivo como in vitro en
diferentes modelos experimentales (Simeonova et al., 2003; Bunderson et al., 2004;
Trouba & Germolec, 2004; Lantz & Hays, 2006; Aguirre-Bañuelos et al., 2008; Wu et
al., 2008; Escudero-Lourdes et al., 2010).
Por otro lado, la producción de ROS inducida por la exposición al iAs también
29 aumento o disminución de NO, el cual participa de una manera directa en la
inducción del proceso apoptótico (Florea et al., 2005). Otro de los mecanismos
reportados a través del cual el As puede inducir muerte celular programada, involucra
la disminución de la expresión de la proteína securin, la cual es un proto-oncogen
que participa en la regulación de la proliferación celular y la tumorigénesis. (Chao et
al., 2005).
En lo que respecta al efecto de la exposición al iAs sobre los mecanismos
apoptóticos, se ha demostrado que la forma por la cual el As induce apoptosis es
compleja, siendo el peróxido de hidrógeno (H2O2) la molécula más involucrada en
este proceso (Dong, 2002). El H2O2 cumple un papel de mediador para inducir
apoptosis a través de la liberación de citocromo “c” al citosol, activa la proteasa
CPP32 (Caspasa 3) que es el paso previo a la apoptosis final y la degradación de
PARP [poly (ADP-ribosa) polimerasa] que es una proteína que promueve e inicia la
reparación del DNA (Jing et al., 1999; Qin et al., 2008). Por otro lado, el estrés
oxidativo resultante de la exposición al iAs puede también afectar los niveles y la
función de moléculas redox sensibles tales como: p53, NF:kB y AP-1, alterando la
señalización celular y el sistema de expresión genética e inducir de apoptosis.
Los genes p53 y NF-kB son considerados factores de transcripción de
respuesta a estrés que controlan la expresión de una gran variedad de genes
30 53) es un importante gen supresor de tumores que juegan un importante papel en el
control del ciclo celular, apoptosis y en el control de la reparación de ADN. Las
moléculas AP-1 y NF-KB son expresadas en diferentes tipos de células expuestas al
As (Peng et al., 2007)
A concentracionesbajas, el As puede inducir apoptosis directa a través de la
regulación de puntos de restricción (check point), mientras que a altas
concentraciones induce apoptosis directa por vías diferentes a las que involucra la
JUSTIFICACIÓN
La exposición humana a compuestos arsenicales se relaciona con una mayor
prevalencia de enfermedades cuyo común denominador es un estado inflamatorio
crónico como la aterosclerosis, la diabetes y el cáncer; adicionalmente, existen
evidencias de que tanto en individuos como en modelos experimentales se presenta
un mayor índice de apoptosis en CMN tras la exposición al iAs. Sin embargo, en el
humano, el riesgo de padecer alguna enfermedad como las mencionadas, así como
el grado del daño observado a nivel celular, parece depender de manera importante
de varios factores como son la respuesta interindividual, la dosis y la vía de
exposición al tóxico. Se ha sugerido que esta respuesta interindividual es debida a la
existencia de diferencias en genes que codifican para enzimas involucradas en el
metabolismo del As como la GSTO1-1. Dado que la GSTO1-1 es una enzima
limitante en el proceso de la bioactivación del As y presenta polimorfismos asociados
a alteraciones en el metabolismo de este tóxico, es posible que polimorfismos
genéticos en esta enzima pudieran ser un factor importante en la variación
interindividual de la respuesta al As. Otros estudios indican que el polimorfismo
E208K está asociado a una incapacidad para metabolizar el AsV, lo que se ve
reflejado en una disposición anormal de iAs y sus metabolitos en orina. Además, la
eficiencia de la actividad enzimática para GSTO1-1 que portan los individuos que
32 actividad de tioltransferasa en la enzima respecto a la enzima normal. Las
observaciones anteriores sugieren que la presencia de los polimorfismos de la
GSTO1-1 en las diferentes poblaciones humanas puede jugar un papel importante
como factor de riesgo a desarrollar efectos adversos a la salud, ya que estos
polimorfismos pueden modificar su papel: en el metabolismo de tóxicos, en su
función dentro de procesos fisiológicos, en su papel dentro de la respuesta
inflamatoria y el proceso apoptótico.
En este trabajo se evaluó la asociación entre la presencia de los polimorfismos
A140D y E208K del gen que codifica para GSTO1-1 con la expresión de genes que
codifican para proteínas involucradas en la respuesta inflamatoria y apoptótica en
HIPÓTESIS
La presencia de polimorfismos del gen hgsto1-1 (E155del, A140D y E208K) en
población expuesta al iAs se asocia con una modificación en la expresión de genes
inflamatorios y apoptóticos y con la disposición anormal de iAs y sus metabolitos en
34
OBJETIVOS
O
BJETIVO GENERALDeterminar si existe asociación entre la presencia de polimorfismos del gen
hgsto1-1 (A140D, E155del y E208K) y sus combinaciones, con la expresión de genes
involucrados en los procesos apoptóticos e inflamatorios y con alteraciones en la
disposición de iAs y sus metabolitos en individuos expuestos a este tóxico.
O
BJETIVOS PARTICULARES1- Determinar la frecuencia de los polimorfismos E155del A140D y
E208K de la GSTO1-1 y sus combinaciones en individuos expuestos a iAs en
una población de Coahuila.
2- Evaluar los niveles de expresión de genes apoptóticos (p53, bcl-2, c-myc, ICE3, ICE5, ICE8, ICE9 y ApaF-1,) e inflamatorios (TNF-α,IL-1β IL-6,
IL-8, GM-CSF y TGF-β.), mediante amplificación por PCR Multiplex (MPCR).
3- Realizar la secuenciación de aminoácidos de regiones
35 4- Determinar los patrones de excresión del iAs y sus metabolitos
en individuos expuestos, mediante espectrofotometría de absorción atónica con
generación de hidruros (HG-AAS).
5- Buscar asociación entre los polimorfismos de GSTO1-1 y sus
combinaciones con la expresión de genes inflamatorios y apoptóticos y con la
36
METODOLOGÍA
S
ITIO DE ESTUDIO Y SELECCIÓN DE LOS PARTICIPANTESEl presente estudio fue desarrollado con un total de 128 sujetos con promedio
de edad de 17.1 años (rango 5-55), que habitan los municipios de Matamoros y Francisco I. Madero (ejido “El Lequeitio”) en el estado de Coahuila, ubicado al norte
de México. Esta zona ha sido históricamente identificada como una región con altos
niveles de As en el agua potable (Del Razo et al., 1993; García-Vargas, 2004;
Méndez-Gómez et al., 2008). En esta región las concentraciones de iAs en el agua
de beber han sido previamente reportadas en el rango de 10 a 620 µg/l en un gran
número de pozos que son utilizados para obtener agua para el consumo humano;
mientras que en nuestro estudio, la concentración promedio de As fue de 70 µg /l con
un rango de 20-130 µg/l.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Mexicano del
Seguro Social (IMSS). Miembros de Departamento de Epidemiología del IMSS y de
la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Coahuila (Torreón),
realizaron una campaña informativa con algunos directores de escuela que se
encuentran ubicadas en zonas donde hasta esos momentos, la concentración de As
en el agua de bebida era superior al valor de referencia que indica la NOM 127; los
37 dirigida a los padres de familia que tenían niños entre 5 y 15 años y que vivieran en
la zona de interés para asistir a una plática donde se les informó generalidades del
proyecto y en qué consistía la participación en el mismo; así como los criterios
generales que debían cumplir para poder participar. Antes de la obtención de las
muestras se firmarmó un consentimiento informado por cada participante. La
colección de las muestras se realizó de acuerdo a los estándares éticos. Tras una
breve revisión médica y la aplicación de un cuestionario conteniendo información
demográfica general, se determinó que todos los participantes del estudio fueran
sanos en el momento de su inclusión en el estudio. Los sujetos incluidos cumplieron
los siguientes criterios: (i)vivir en la región elegida por un periodo superior a 4 años; (ii)
beber y cocinar con agua de la red municipal; (iii) tener un buen estado general de
salud; (iv) no tener antecedentes de enfermedades crónicas ni recibir medicación; y,
(v)
excluir los mariscos de su dieta durante 7 días anteriores a la recolección de
muestras biológicas.
C
OLECCIÓN DE AGUA Y ORINATodos los participantes donaron muestras de la primera orina de la mañana en
ayunas (~ 100 ml). Se tomaron 80 muestras de agua que los participantes utilizan
normalmente para beber; las muestras de agua y orina fueron recogidas en
38 10% durante toda la noche y enjuagados con agua desionizada. Tras su colección,
todas las muestras fueron almacenadas a -70 °C hasta su análisis.
D
ETERMINACIÓN DE ESPECIES DE ARSÉNICOLa determinación de las especies de As en orina se realizó por la generación
de arsinas volátiles, seguida por la separación cromatográfica y la detección final de
estas especies por medio de un espectrofotómetro de absorción atómica (Perkin
Elmer. Analyst 400) acoplado a un generador de hidruros (HG-AAS) (Del Razo et al.,
2001; Valenzuela et al., 2005). Los arsenicales se separaron en una sola corrida (iAs,
MMA, y DMA), los cuales se identificaron por su tiempo de retención. Este método
genera arsinas arsenicales tri y pentavalentes, separándolas por estructura y no por
su estado de oxidación. De esta manera se determina el iAs incluyendo al iAsIII y
iAsV, MMA que incluye MMAIII y MMAV, y el DMA que incluye al DMAIII y DMAV. Todo el proceso es llevado a cabo en una reacción a ≤ pH2 de la siguiente manera: a 1 ml
de orina se le adicionó 5 ml de agua desionizada y 1 ml de HCl 6M. Esta mezcla se
hizo en una cápsula hermética equipada con una válvula que permite controlar tanto
la salida de las arsinas como la adición de soluciones; el pH final de la mezcla debe
de estar entre 1-2; se deja reposar por 1 minuto al término del cual se inyecta 1 ml de
una solución de NaBH4 al 4% en NaOH 0.02M para que se generen las arsinas
39 El equipo debe estar acoplado a una trampa de vidrio en forma de ”U” que en
el interior cuenta con una resistencia conectada a un termostato. Inicialmente, la
trampa de vidrio se debe mantener sumergida en nitrógeno líquido. Las arsinas atrapadas son liberadas del tubo en “U”, el cual debe ser removido inmediatamente
de la trampa de nitrógeno líquido, a la cual se le debe aplicar calor para que
finalmente se separen las arsinas por medio de un gradiente de temperatura. Para
validar el análisis se usó un NIST que tiene valor de referencia de As total de 60 µg/l
cuyas réplicas dieron valores de 64±5 µg/l. El porcentaje de recuperación estuvo
entre 90-110% con un coeficiente de variación de <10%.
La determinación de As total (Ast) se consideró como la suma de iAs y de los
metabolitos MMA y DMA y la proporción relativa de cada especie arsenical fue
calculada considerando la suma del Ast como el 100%.
Para normalización de los valores de As en orina, se determinó creatinina
urinaria mediante la reacción de Jaffe, utilizando un sistema comercial (Randox).
C
OLECCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICAPersonal capacitado, tomó 10 ml de sangre venosa periférica utilizando tubos
vacutainer ® con EDTA como anticoagulante. Los tubos fueron codificados y
mantenidos en refrigeración hasta su procesamiento en el laboratorio. El paquete
40 el aislamiento de RNA (esta porción se mezcló con RNAlater (Ambion) en proporción
1:5).
A
ISLAMIENTO DEDNA
El DNA fue extraído de las muestras de sangre periférica usando una técnica
convencional de fenol-cloroformo como se describe a continuación.
Partiendo de un volumen de paquete celular de 400 µl en un tubo eppendorf
nuevo y estéril, se agregó 1 ml de solución de lisis de eritrocitos, se tapó el microtubo
y se mezcló por inversión durante 10 minutos; al cabo de este tiempo se centrifugó a
6,000 rpm/5 minutos y se descartó el sobrenadante. Nuevamente se agregó 1 ml de
solución de lisis de eritrocitos, se tapó el microtubo y se mezcló por inversión, se
centrifugó a 6,000 rpm/5 minutos se descartó nuevamente el sobrenadante.
Posteriormente se agregaron 400 µl de TE 1X y se resuspendió la pastilla
(golpeando con la uña la base del tubo), se centrifugó a 6,000 rpm/5 minutos y se
descartó el sobrenadante. Nuevamente se agregó 400 µl de TE 1X y se resuspendió
la pastilla como se indicó anteriormente; subsecuentemente se agregaron 400 µl de
solución de lisis total, se mezcló por inversión durante 1 minuto y se agregó 10 µl de
proteinasa K en concentración de 10 mg/ml; se homogeneizó suavemente la mezcla
y se incubó a 55ºC durante 3 horas. Pasado este tiempo se dejó enfriar la digestión a
41 µl de SEVAG; se mezcló fuertemente con vortex durante 15 segundos y se centrifugó
a 10,000 rpm durante 10 minutos. Inmediatamente se recuperó cuidadosamente el
sobrenadante (fase superior) y se reservó en un tubo nuevo y estéril. Nuevamente se
agregaron 200 µl de fenol saturado y 200 µl de SEVAG, se mezcló fuertemente con
vortex durante 15 segundos, se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 minutos, se
recuperó cuidadosamente el sobrenadante (fase superior) y se reservó en un tubo
nuevo y estéril. Con el fin de purificar el DNA se agregó 200 µl de acetato de amonio
7.5 M, se mezcló fuertemente y se dejó reposar en congelador por un periodo de 20
minutos. A continuación, se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 minutos y se rescató
el sobrenadante en un tubo nuevo y estéril. Posteriormente, se procedió a precipitar
el DNA con etanol, agregando 2 volúmenes de etanol absoluto a temperatura
ambiente y se mezcló por inversión e incubó por 30 minutos en hielo. Transcurrido
este tiempo, las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 minutos y se
descartó el sobrenadante. Se lavó el DNA agregando a la pastilla resultante 1 ml de
etanol al 70% previamente helado, se mezcló por inversión durante 1 minuto y se
centrifugó a 14,000 rpm durante 10 minutos, descartándose el sobrenadante. El
botón de DNA se dejó secar durante 10 minutos manteniendo el tubo invertido en
ambiente de mechero o campana. Finalmente, el botón de DNA se resuspendió en
D
ETECCIÓN DE LOS POLIMORFISMOSLas características generales de los polimorfismos estudiados en este trabajo
se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. Características generales de los polimorfismos que fueron evaluados.
Gen Hgsto1-1
Localización cromosomal 10q 25.1
SNIP ID rs4925 rs11509437 rs7077635
Polimorfismo CTATGC/ATGGCC AGAGGAGG/-TAATT AACACG/ATTTTC
Aminoácido cambiado A140D E155del E208K
Oligonucleótidos forward
5’-3’ GACCAAGCCAGCATTTTAGGC
GACCAAGCCAGCATTTT AGGC
CTGTGATGTCATCCT AGTTG
Oligonucleótidos reverse 5’-3’
CTTGTGGAAACGTCCCT ACAATTTC
CTTGTGGAAACGTCCCT ACAATTTC
CATGCAACCTGAAC CTTGGT
Producto de PCR 586 pb 586 pb 308 pb
Número de ciclos 35 35 35
Exón 4 4 6
Temperatura de alineamiento 50°C 50°C 63.5°C
P
OLIMORFISMOA140D
YE155
DEL DE LAGSTO1-1
Para los polimorfismos A140D y E155del se amplificó el exón 4 del gen de la
GSTO1-1 mediante el uso de oligonucleótidos que amplifican una región de 586
pares de bases y el producto de PCR se usó para hacer ensayos de secuenciación.
Las secuencias del par de oligonucleótidos usados en la detección de este
Tabla 2 Oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los polimorfismos de interés y sus características
Para realizar los ensayos de amplificación por PCR se usó una mezcla de los
oligonucleótidos con los diferentes reactivos a concentraciones necesarias para
amplificar el fragmento deseado, de la manera que se indica en la Tabla 3.
Tabla 3. Concentración de reactivos necesarios para hacer la amplificación por PCR.
DNA 50ng/µl 100 ng 2 µl
Buffer Tris-HCL 20mM
KCl 50 mM
5 µl
Oligonucleótidos 1 µM Forward 1µl
Reverse 1µl
dNTP’s 10 mM 1µl
MgCl2 1.5 mM 1.5 µl
taq DNA polimerasa 1 U/µl (invitrogen life Technologies).
0.8µl
Agua ultrapura 37.7 µl
Volumen final 50 µl
De igual manera, para amplificar los diferentes segmentos se optimizaron las
condiciones para cada primer.
Las condiciones de amplificación para el exón 4 del gen de la GSTO1-1 se
reportan en la Tabla 4.
Polimorfismos A140D E155del E208K
Oligonucleótidos forward
5’-3’ GACCAAGCCAGCATTTTAGGC
GACCAAGCCAGCATTTT AGGC
CTGTGATGTCATCCT AGTTG
Oligonucleótidos reverse 5’-3’ CTTGTGGAAACGTCCCT ACAATTTC CTTGTGGAAACGTCCCT ACAATTTC CATGCAACCTGAAC CTTGGT
Producto de PCR 586 pb 586 pb 308 pb
Número de ciclos 35 35 35
Exón 4 4 6
44
Número de ciclos Temperatura Tiempo
Primer paso (D) 1 95°C 2(min)
Segundo paso (D, A, E) 35 94° C 30 (sec)
66.3° C 30 (sec)
a 72° C 30 (sec)
Tercer paso (E) 1 72°C 10 (min)
P
OLIMORFISMOE208K
DE LAGSTO1-1
Para el polimorfismo E208K se amplificó el exón 6 del gen de la GSTO1-1
mediante el uso de oligonucleótidos que amplifican una región de 308 pares de
bases y el producto de PCR se usó para hacer ensayos de secuenciación. Las
secuencias del par de oligonucleótidos usados en la detección de este polimorfismo
se pueden observar en la Tabla 2.
Las condiciones de amplificación para el exón 6 del gen de la GSTO1-1, se
reportan en la tabla 5.
Tabla 5. Condiciones de corrida para amplificar el exón 6. Número de ciclos
Temperatura Tiempo
Primer paso (D) 1 95°C 5 (min)
Segundo paso (D, A, E) 35 95° C 1 minuto
50° C 30 (sec)
a 72° C 1 (min).
Tercer paso (E) 1 72°C 10 (min)
Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Techne
de 25 pozos y los resultados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al
1.5% a 90 volts por un periodo de 40 minutos y se analizaron en un
fotodocumentador Gel-Doc 2000 BIO-RAD mediante el uso del programa Quantity
S
ECUENCIACIÓNP
URIFICACIÓN DE PRODUCTOS DEPCR
Previo a la secuenciación fue necesario purificar los productos de PCR para lo
cual se usó el kit QIAquick PCR Purification Kit Protocolo de QIAGEN®. Este kit está
diseñado para purificar fragmentos de DNA tanto de cadena sencilla como de cadena
doble, obtenidos como producto de PCR con el objetivo de remover todo exceso de
oligonucleótidos, nucleótidos, polimerasas y sales mediante el uso de columnas,
dejando solamente disponibles el fragmento de DNA de nuestro interés que en este
caso es de 308 y 586 pares de bases según el polimorfismo.
El protocolo de purificación se realizó siguiendo las instrucciones del
proveedor. Subsecuentemente el producto purificado se cuantificó con el fin de
asegurar que la concentración de ácidos nucleicos fuera superior a 40 ng
(concentración mínima requerida para los ensayos de secuenciación). Por último, las
muestras se dispensaron en placas de 96 pozos y se pusieron a secar a no más de
60°C.
Por último, los productos de PCR purificados fueron enviados para su
secuenciación en ambas direcciones, junto con 200 µl de cada uno de los
oligonucleótidos al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del
47 por medio del uso del editor de secuencias BioEdit (http://bioeditor.sdsc.edu).
A
ISLAMIENTO DERNA
El RNA genómico fue extraído de paquete celular de sangre periférica el cual
fue conservado en RNAlater® en proporción de 1:5. Para proteger el RNA en
muestras frescas o así, se eliminó la necesidad de procesar las muestras
inmediatamente. Las muestras son sumergidas en el RNAlater® y almacenadas para
su posterior extracción lo cual facilita el trabajo en campo. La posterior extracción de
RNA se realizo con el uso del kit RiboPureTM-Blood. Finalmente, se hicieron
alícuotas de 33 µl y se cuantificó el ARN.
S
ÍNTESIS DE CDNA
El cDNA se obtuvo por medio de RT-PCR usando un sistema de transcripción
reversa SuperScript II (Accesolab). En un microtubo de 200 µl se puso 1 µl del buffer
DNasa 10X, 1 µl de DNasa 1 (1 U/ µl), 1 µl de agua DEPC al 0.1%, 0.5 µg de RNA y
finalmente se agregó la cantidad necesaria de agua DEPC 0.1% hasta completar 10
µl. De esta manera, se obtuvo un ARN libre de ADN. Esta mezcla se incubó por un
periodo de 15 minutos a temperatura ambiente, se le agregó 1 µl de EDTA 25mM, se
calentó a 65°C por un periodo de 10 minutos (en el Termociclador), al cabo de los
48 Termociclador). Al término de este periodo, los tubos se pusieron en hielo inmediatamente y se les adicionó 1 µl de dNTP’s 10mM, 4 µl de buffer RT 5X, 2 µl de
DTT 100mM y 1 µl de RNAsa out (40 U/µl). Esta mezcla se homogeneizó
cuidadosamente y se incubó a temperatura ambiente por un periodo de 2 minutos.
Posteriormente, se le adicionó 1 µl de transcriptasa reversa superscript II y se llevó al
Termociclador bajo las condiciones que se especifican en la Tabla 6.
Tabla 6. Condiciones para síntesis de cDNA.
Número de ciclos
Tiempo en minutos
Temperatura en °C
1 10 25
1 50 42
1 15 70
C
UANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOSSe hizo una dilución de la muestra con agua ultrapura a una concentración de
1:100 ó 1:50 y se registraron lecturas en espectrofotómetro Spectronic genesis 8:
una a 260 nm (que es donde se registra el máximo pico de absorción para ácidos
nucleícos) y otra a 280 nm (que es donde se detecta el máximo pico de absorción
para proteínas). Se anotaron ambas lecturas y se sacó la concentración y la relación
ácidos nucleícos/proteínas.
Relación ácidos nucleicos/proteínas= Absorbancia a 260
49
Esta relación debe ser superior a 1.5 lo cual representa la pureza del material genético.
La concentración de ácidos nucleicos se determinó multiplicando la
absorbancia registrada a 260 nm por una constante que en el caso de cDNA y DNA
tiene un valor de 50 y en el caso de RNA el valor de la constante es 40. La
concentración final de ácidos nucleicos se expresó en ng/µl ó µg/ml. Finalmente, la
concentración de las muestras se ajustó a 50 ó 100 ng/µl con agua ultrapura, y
fueron almacenadas a -70°C hasta su uso en la amplificación de genes que
participan tanto en procesos apoptóticos como inflamatorios y de igual manera en la amplificación de genes endógenos llamados housekeeping (β-actina) como controles
de carga y de expresión.
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES
Con el cDNA obtenido se evaluó la expresión de genes implicados en
procesos de apoptosis como p53, bcl-2, c-myc ICE3, ICE5, ICE8, ICE9 y ApaF-1 y genes implicados en procesos inflamatorios como TNF-α,IL-1β IL-6, IL-8, GM-CSF y
TGF-β, por medio del uso de un sistema comercial de PCR multiplex (MPCR, Maxim
Biotech, Inc). En la evaluación de la expresión de los genes mencionados se
establecieron las concentraciones de reactivos y material genético como se describe
Buffer 2X de PCR multiplex
25 µl
Mezcla de
oligonucleótidos 10X
5.0 µl
taq DNA polimerasa
(5U/ µl).
0.5 µl
cDNA (0.5ng/µl) 10.0 µl
agua ultrapura 9.5 µl
Volumen final 50µl
Las condiciones de corrida para la amplificación del MPCR donde se evalúa la
expresión de genes apoptóticos, se reportan en la Tabla 8.
Tabla 8. Condiciones de corrida para la determinación de genes apoptóticos.
Número de ciclos Temperatura Tiempo
Primer paso (D) 2 96°C 1 minutos
60°C 4 minutos
Segundo paso (D, A) 35 94° C 1 minuto
60° C 2 minutos
Tercer paso (E) 1 70°C 10 minutos
Las condiciones de corrida para la amplificación del MPCR donde se evalúa la
Número de ciclos
Temperatura Tiempo
Primer paso (D) 2 96°C 1 minuto
64°C 4 minutos
Segundo paso (D, A) 35 94° C 1 minuto
64° C 2 minutos
Tercer paso (E) 1 70°C 10 minutos
Una vez finalizada la reacción, los productos de PCR se sometieron a
electroforesis horizontal en geles de agarosa ultra pura (Invitrogen) al 2 %, a no más
de 90 volts por un periodo de 2.5 horas en amortiguador TBE 0.5X. Finalmente, se calculó la expresión genética relativa teniendo en cuenta la relación expresión de β
actina como gen endógeno y se comparó con el gen de interés. Los análisis fueron
realizados en un sistema de documentación Quantity one (Bio-Rad).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para determinar si la presencia de los polimorfismos, y disposición de
metabolitos de iAs se asocia a la expresión de genes inflamatorios y apoptóticos, los
datos obtenidos del análisis de expresión de estos genes fueron establecidos como
variables de respuesta, mientras que las variables de sexo, edad, polimorfismos y
concentración de las especies de As y la suma de las especies (Ast) en orina se
establecieron como variables explicativas. Dado que las variables de respuesta
fueron continuas, se utilizó regresión múltiple con el coeficiente de determinación
múltiple para medir la importancia de las variables explicativas. Para determinar el
52 DMA y iAs, las proporciones o porcentajes de los mismos excretados en orina, fueron
establecidos como variables de respuesta; mientras que la presencia de los
polimorfismos fue establecida como variable explicativa. Los datos faltantes en la
base de datos fueron asignados mediante imputación múltiple cuando fue posible. Se
establecieron los mejores modelos para el análisis basado en los objetivos del
trabajo; la dependencia entre las variables fue determinada mediante pruebas de
ANOVA. Todas las pruebas de significancia se llevaron al 95% nivel de confianza.
Para los modelos que resultaron significativos se efectuó simplificación mediante
pruebas de razón de verosimilitud hasta que todos los términos resultaron
significativos. Si la variable explicativa que resultó significativa es discreta, entonces
se utilizó la prueba de Turkey HSD (Honestly Significant Difference) usando el
paquete computacional Multcomp (Bretz & Westfall, 2011). Diferencias y
correlaciones fueron consideradas significativas con un valor <0.05.
Para el análisis de la expresión de los genes que participan tanto en procesos
apoptóticos como inflamatorios se comparó cada uno de ellos con las variables que
se describen en la tabla 10. Para la obtención de los índices de variabilidad genética,
se utilizó la prueba de equilibrio Hardy Weinberg (HW) mediante el uso de la formula
Tabla 10. Genes evaluados y variables comparativas empleadas en el estudio.
Genes evaluados Variables comparativas
Apoptóticos inflamatorios Edad
p53 bcl-2 c-myc ApaF-1
TGF-beta IL8 IL6 CMS-CF
Sexo
Combinación de polimorfismos
Concentración de iAs Concentración de MMA
Concentración de DMA
Concentración de As Total
Relación MMA/iAs
Relación DMA/MMA
% iAsV
%MMAV