1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“RESPUESTA DE OVULACIÓN MÚLTIPLE Y TASA DE
COLECCIÓN DE EMBRIONES EN HEMBRAS Bos taurus Y
Bos indicus A TRAVÉS DEL USO DE PROSTAGLANDINA
F2α Y PROGESTERONA NATURAL”
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
VICENTE APREZA BAHENA
ASESORES:
DR. FELIPE MONTIEL PALACIOS PhD. RODOLFO CANSECO SEDANO MC. BERTHA CLEMENTINA HERNÁNDEZ CRUZ
2 DEDICATORIA
A mis padres:
Sr. Inocente Apreza Ayala y Sra. Bertha Bahena Corbala, quienes con su esfuerzo y apoyo incondicional me dieron la oportunidad de superarme y culminar esta meta anhelada.
A mis hermanas:
Martha Hilda Apreza Bahena, Nydia Margari Apreza Bahena y Eliacim María Apreza Bahena, por compartir juntos esos momentos hermosos y amargos de la vida.
A mis sobrinos:
Por regalarme esos momentos de felicidad y ternura.
Sr. Jorge Rodriguez Garcia y Sra. Elsy Rodriguez Gonzalez.
Por haberme brindado su apoyo y confianza durante el tiempo en el que viví bajo su resguardo, darme buenos ejemplos y enseñarme a salir adelante en cualquier tipo de circunstancia.
A mis amigos:
Aquelllos que estuvieron en la buenas y en las malas experiencias apoyándome a seguir adelante en especial a Chalo(†) que se nos adelanto en el camino.
3 AGRADECIMIENTOS
A Dios por brindarme esta vida.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana por albergarme durante estos años de formación profesional.
Al Dr. Felipe Montiel Palacios por su amistad, por compartir sus conocimientos y brindarme parte de su tiempo en mi formación profesional.
A la MPA. Bertha Clementina Hernández Cruz, por su orientación y apoyo profesional dedicado a este trabajo.
Al Dr. Rodolfo Canseco Sedano, por su apoyo en la realización de esta tesis. Al honorable jurado por ser parte de este proyecto final.
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ÍNDICE Pág.
INTRODUCCIÓN 1
ANTECEDENTES 4
I. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES 4
II. OVULACIÓN MÚLTIPLE 5
III. MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE EMBRIONES 7
A). MÉTODOS QUIRÚRGICOS 7
B). MÉTODOS NO QUIRÚRGICOS 8
IIII. FACTORES QUE DETERMINAN EL RESULTADO DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES 10 A). EMBRIÓN 10 B). MICROMANIPULACIÓN 13 C). RAZA 15 D). EDAD 15
E). ESTADO NUTRICIONAL 17
JUSTIFICACIÓN 18
OBJETIVOS 19
HIPÓTESIS 19
MATERIAL Y MÉTODOS 20
A). LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA 20
MANEJO DE ANIMALES 20
B). CARACTERÍSTICAS Y MANEJO DE LOS ANIMALES EXPERIMENTALES
20
INDUCCIÓN A LA OVULACIÓN MÚLTIPLE 21
ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN 28
RESULTADOS 29
RESPUESTA A LA OVULACIÖN MULTIPLE (OM) Y PRODUCCIÓN DE EMBRIONES
29
DISCUSIÓN 32
CONCLUSIÓN 34
5
INTRODUCCIÓN
El conocimiento de la fisiología del ciclo estrual, permite la utilización sistemática de hormonas para mejorar la reproducción y la eficiencia reproductiva de los animales (Cruz, 2003). De esta manera, es posible utilizar tratamientos hormonales para inducir la ovulación múltiple (OM) cuando se emplean programas de transferencia de embriones (TE), los que permiten utilizar de manera intensiva a hembras genéticamente superiores.
La tecnología de la TE en bovinos requiere de la selección y el manejo, tanto físico como farmacológico, de las donadoras y las receptoras, así como de la recolección y transferencia de los embriones dentro de un periodo de tiempo especifico después del estro (Mapletoft, 2002). En la actualidad, las investigaciones están orientadas al estudio de la reducción de la alta variabilidad reproductiva de la TE, especialmente en lo que se refiere a la respuesta individual a los tratamientos para la OM, fertilización, factores embrionarios y maternos, pues aunque existen diversos protocolos de tratamientos hormonales para inducir la OM, basados en gonadotropinas, no se ha podido disminuir la amplia variabilidad que se presenta en el número de ovulaciones entre animales (Cushman et al., 1999).
La variación en el número de folículos presentes en el ovario capaces de responder al inicio del tratamiento de OM señala la diferencia en la respuesta. Estudios in vitro han demostrado que la FSH puede acelerar el rango de desarrollo de los folículos preantrales (Hulshof et al., 1995; Gutiérrez et al., 2000), permitiendo mejorar la fertilidad e incrementar la respuesta a la OM (Lucy et al., 1992).
Las hembras sometidas a inducción de OM son sincronizadas antes del tratamiento. Tanto la sincronización de los celos como la OM son componentes críticos de un programa de TE (Wiltbank, 1997). La clave del éxito en cuanto a la sincronización de celos consiste en lograr sincronizar estrechamente la rápida caída de los niveles de progesterona por debajo de 1 ng/ml y el crecimiento sincrónico y la ovulación de un folículo viable (Adams, 1994, 1998).
Los tratamientos para la inducción de OM en algunos casos causan un dramático aumento en el número de folículos ováricos que se desarrollan, así como en el número de óvulos
6 disponibles para ser liberados al momento de la ovulación (Mapletoft et al., 2002). Esto podría deberse al número de folículos en crecimiento que se encuentran en el ovario al momento de la ovulación. Se ha reportado también que la raza influye en los resultados (Betteridge, 1977).
La variabilidad en la respuesta ovárica ha sido relacionada a diferencias en los tratamientos de OM, tales como la preparación de gonadotropina utilizada, la dosis total, la duración y tiempo del tratamiento, y el uso de hormonas adicionales en el esquema de tratamiento. Sin embargo, existen factores adicionales que pueden ser fuente importante de la variabilidad y que son inherentes al animal y a su medio ambiente, e incluyen estatus nutricional, historia reproductiva, edad, estación del año, raza y estado ovárico al momento de aplicar el tratamiento, así como el efecto de ovulaciones múltiples repetidas, entre otros (Mapletoft et
al., 2002). La variabilidad individual ha sido un factor prevalente en todos los estudios de OM,
demostrándose que la raza puede ser otro factor a considerar (Alkemade et al., 1993). Por otro lado, se ha demostrado que las temperaturas del invierno pueden se factores de estrés para el ganado Bos indicus (Mapletoft et al., 2002).
Por muchos años, los esfuerzos de los criadores de animales han sido dirigidos hacia el mejoramiento de rasgos relacionados con una mayor producción, y durante los últimos años, el mejoramiento genético ha aumentado la eficiencia económica de muchos animales domésticos; la investigación genética ha impulsado la descripción de valores particulares de animales élite para rasgos específicos, respaldados por métodos estadísticos apropiados para optimizar la manipulación genética (Pérez et al., 2005).
En el trópico, la fertilidad variable que exhiben los genotipos Bos indicus y las condiciones de manejo extensivo de muchos hatos, dificultan la implementación de los programas de TE, además de que las diferencias fisiológicas y de comportamiento entre animales Bos indicus y
Bos taurus influyen decisivamente en el éxito de estos programas. En la mayoría de los
países tropicales existen todavía un elevado porcentaje de programas reproductivos basados en monta natural. Sin embargo, debido a la necesidad de contar con una mayor producción de carne para satisfacer las necesidades de la población, se han implementado técnicas reproductivas como la TE, la cual brinda a la industria bovina la oportunidad de utilizar
7 material genético de alta calidad, dependiendo de las necesidades y objetivos de cada explotación (Richards et al., 1988).
Con base en lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar la respuesta de OM y la tasa de colección de embriones en hembras Bos taurus y Bos indicus sincronizadas con prostaglandina F2α o progesterona natural.
8 ANTECEDENTES
I. Transferencia de embriones (TE)
Existen herramientas reproductivas como la inseminación artificial (IA) y la TE que se implementan con la finalidad de mejorar genética y productivamente los hatos ganaderos (Butler y Biggers, 1989). Sin embargo, existen grandes diferencias entre cada una de estas técnicas, ya que con el uso de la IA tendrían que pasar varios años para obtener resultados en cuestión de progreso genético del hato (Seidel, 1981), mientras que con la TE se obtienen resultados en un intervalo de tiempo relativamente corto (Christensen, 1991), por lo que ésta sería la mejor opción después de la IA (Lohuis, 1995). El principal uso de la TE es ampliar los porcentajes reproductivos de animales con alto valor genético; su uso es principalmente en ganado, ya que en estos animales los porcentajes reproductivos son bajos y el intervalo generacional es largo (Seidel, 1991).
Aunque esta biotecnología reproductiva no es nueva, pues la primer transferencia embrionaria la llevó a cabo Heape en 1891 en conejos, tuvieron que transcurrir varios años para que, en 1951, se informara del primer éxito de TE en bovinos por el método quirúrgico (Betteridge, 1981). No fue hasta los años 70´s cuando esta tecnología creció y se desarrolló hasta convertirse en una herramienta de mejoramiento genético, experimentando un auge comercial (Hasler, 2006).
La TE a través del cérvix en bovinos comenzó a ser utilizada en trabajos experimentales a finales de los años 40. Dificultades de distinta índole que se presentaron en el desarrollo del método hicieron que la técnica tuviera éxito hasta 1964, cuando se dio el nacimiento del primer becerro resultado de TE (Mutter et al., 1964). En las últimas décadas, los porcentajes de preñez se han incrementado de manera significativa, posibilitando actualmente obtener hasta 60%, aun con la transferencia de embriones congelados (Cutini et al., 1999).
La TE se desarrolló en sus inicios con la finalidad de optimizar los recursos genéticos y económicos de los hatos. En la actualidad existe la tendencia a llevar a cabo producciones masivas de embriones; de esta manera, las vacas de alto valor genético, productivo y comercial pueden producir en promedio de 10 a 15 crías por año, lo cual impulsa el mejoramiento genético de los hatos ganaderos. Sin embargo, a pesar de los avances para
9 mejorar la efectividad de la técnica y aumentar el porcentaje de gestación, no se han obtenido los mismos resultados en regiones tropicales que en zonas templadas, ya que las características del trópico, como son las variaciones en la temperatura, humedad, alimentación y manejo de los sistemas productivos, son muy diferentes entre sí, lo que conlleva a una variación muy amplia en la respuesta de inducción de OM de las donadoras, y resulta en un alto porcentaje de embriones con características indeseables y un mal desarrollo (Kafi y McGowan, 1997).
II. Ovulación múltiple (OM)
La TE cobra cada día mayor importancia en el área de reproducción. En los últimos años se ha conseguido superar muchas barreras en aspectos relacionados con el éxito en la utilización de esta técnica, como son los métodos de lavado, evaluación y transferencia de los embriones. Sin embargo, uno de los campos en el que no se ha avanzado mucho ha sido el del momento óptimo para iniciar el tratamiento de inducción de OM, con el fin de conseguir que un número mayor de animales tengan una respuesta más uniforme a la OM. Con respecto al momento de inicio del tratamiento, se ha comprobado la influencia determinante que tiene la presencia de un folículo dominante en la respuesta a la OM, ya que es mayor cuando el folículo no tiene capacidad de dominancia funcional sobre el resto de los folículos susceptibles a responder a hormonas exógenas al momento de iniciar el proceso de OM
(Bungartz y Nieman, 1994; Fricke et al., 1994). El comportamiento entre las oleadas
foliculares dentro de un ciclo estral es muy diferente entre todas las hembras, al igual que lo que ocurre en una misma vaca. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la atresia del primer folículo dominante y el inicio del crecimiento del segundo se produce entre el día 8 y 12 después de la ovulación en los ciclos estrales con dos oleadas foliculares, pudiéndose tomar como promedio un día antes de los mencionados para animales con tres oleadas (Ginther et al., 1989).
Cabe suponer que es más fácil que se encuentre presente un folículo funcionalmente dominante cuando se inicia el tratamiento de OM en el día 8 del ciclo que cuando se inicia en el día 12. Si bien muchos autores no hacen referencia a diferencias en la respuesta entre los distintos días de inicio del tratamiento (en el intervalo de los días 8 a 14 del ciclo estral), parece que sí existe una cierta tendencia a que aumente la tasa de ovulación cuanto más
10 tarde se empiece el tratamiento (Staigmiller et al., 1992), y a que los resultados sean superiores en el día 12 en términos de número de embriones transferibles recogidos (De Ruigh et al, 2003). Aunque algún autor ha situado la mejor respuesta al iniciar el tratamiento en el día 9 (Lindsell et al., 1986), la mayoría ha observado un incremento en los resultados a partir del día 10 (Lerner et al., 1986; Goulding et al., 1990; Staigmiller et al., 1992).
La necesidad de incrementar el número de hijos por donadora ha forzado a anular los mecanismos biológicos en la reproducción, implementando la OM conocida como MOET (Ovulación múltiple y transferencia de embriones). El objetivo de la OM en vacas es obtener un máximo número de embriones fertilizados y transferibles con una alta probabilidad de producir una gestación (Armstrong, 1993). Sin embargo, existen grandes diferencias en cuanto al tratamiento no sólo entre especies bovinas, sino entre animales de la misma especie y entre un mismo individuo, y es por esto que la respuesta al tratamiento es muy variable; el mayor problema que existe en la variabilidad a la respuesta de OM se da dependiendo del desarrollo de los folículos al momento de iniciar el programa, ya que es muy difícil predecir el inicio de la oleada folicular (Mapletoft et al., 2002).
Esta técnica puede afectar la calidad embrionaria, ya que estos embriones provienen de una esteroidogénesis folicular anormal, provocando maduración prematura y ovocitos no competentes para su desarrollo (Foote y Ellington, 1988). En un ciclo natural, después de la fertilización aproximadamente el 80% de los ovocitos ovulados llega a etapa de embrión, mientras que después de la OM el 60% de ellos se desarrollan hasta blastocisto (Merton, 2003).
La diferencia de calidad entre los embriones se puede deber a una respuesta de OM alta, incrementando la producción de embriones de mala calidad (Greve et al., 1995), mostrando las hembras Bos indicus una gran sensibilidad a las gonadotropinas, reclutando más folículos en una onda folicular que las Bos taurus, obteniendo una mayor respuesta a la OM (Baruselli
et al., 2006).
Una dosis elevada de gonadotropinas produce una sobreestimulación ovárica, donde muchos folículos comienzan a desarrollar pero pocos son capaces de ovular, y la mayoría
11 sufre luteinización o atresia. Asimismo, al aumentar la edad de la donante disminuye el número de ovulaciones, la tasa de fecundación y la calidad embrionaria (Baruselli et al., 2006). La disminución en el número de ovulaciones se debería a una menor disponibilidad de folículos capaces de responder a gonadotropinas exógenas. Al existir menos folículos en crecimiento, los niveles de inhibina bajan y aumenta la FSH endógena, lo que haría que en estos animales en cualquier momento del ciclo estral los folículos en crecimiento estuvieran en un estado de desarrollo más avanzado que aquellos folículos en animales mas jóvenes. Al comenzar el tratamiento con gonadotropinas, los folículos más maduros serían los primeros en producir grandes cantidades de estrógenos. Por lo tanto, los ovocitos dentro de estos folículos estarían expuestos a altas concentraciones de estrógenos por largos periodos antes de la ovulación, en comparación con los ovocitos dentro de los folículos menos desarrollados. Esta exposición a una alta concentración de estradiol podría ser la causa de la disminución en la tasa de fertilización y en la calidad embrionaria (Lerner et al., 1986).
III. Métodos de recolección de embriones
A) Métodos quirúrgicos
Hace dos décadas, la TE en bovinos se realizaba de manera quirúrgica, la cual requería de anestesia general, inducida por medio de barbitúricos y mantenida por medio de inhalación. Esta cirugía se realizaba mediante una incisión de 15 cm de longitud en la línea media, por delante de la glándula mamaria, y se extraían los cuernos uterinos con los ovarios; el lavado de los cuernos y los oviductos se realizaba entre los días 5 y 7 del ciclo estral, introduciendo catéteres de goma a través de la pared dorsal del cuerno uterino y en la ampolla del oviducto. Sin embargo, Surgie et al. (1972), con el afán de hacer más funcional y práctica la técnica, realizaron la recolección de los embriones por vía transcervical, evitando con esto posibles adherencias del útero, debido al procedimiento quirúrgico que se utilizaba.
12 B) Métodos no quirúrgicos
La posibilidad de realizar la recolección de los embriones por vía transcervical abrió una nueva ventaja a la técnica, simplificando con esto su procedimiento y disminuyendo el trauma uterino. Para ello, se probó con diferentes tipos de catéteres, entre los cuales se utilizaron los rígidos, semi-rígidos y flexibles (Newcomb et al., 1980). Éstos pueden tener dos vías, una de las cuales es para inflar un globo para inmovilizar el catéter dentro del útero, y la otra es para introducir y recolectar el medio del útero con los embriones. En 1976, Rasbech desarrolló un sistema semi-rígido para recolección de embriones; éste usaba una sonda Folley de dos vías, e introducía 12 a 15 ml de aire en el globo así como el medio con ayuda de una jeringa de 60 ml; con éste se obtuvo una relación entre el número de cuerpos lúteos encontrados en cada ovario y el número de embriones recolectados por cuerno uterino de entre 57 y 100%, y una relación entre el medio introducido y recolectado de 86 a 100%.
Con estos resultados se indicó el éxito de la técnica propuesta, la cual constituyó el punto de partida de los catéteres flexibles de dos vías, empleados actualmente. Sin embargo, al mismo tiempo de utilizar este tipo de catéter, algunos investigadores han tratado de facilitar la recolección de los embriones llegando a utilizar catéteres de tres vías, los cuales tienen la ventaja de que una vía permite inyectar el medio hacia el interior del útero mientras que la otra conduce el liquido hacia fuera de éste, y la tercer vía sirve para fijar el catéter al útero. En la actualidad se emplean catéteres rígidos y flexibles de 2 y 3 vías, y existen tres métodos de recuperación de los embriones (Palma et al, 1998), que son:
1°: Circuito cerrado con flujo continuo: con este método se emplearon catéteres de 3 vías, rígidos o flexibles (Elsden, 1987; Greve et al., 1995). Una vía destinada a la inyección del medio de recolección se conecta al depósito del medio; la solución puede entrar al útero por gravedad, colocando el frasco con el medio aproximadamente a 1 m sobre el filtro de los embriones, o bien, se puede introducir con una jeringa por la segunda vía del catéter, se inyecta medio o aire para inflar el globo del mismo y de este modo fijarlo al útero; por último, por la tercera vía se recolecta la solución introducida al útero con la finalidad de extraer los embriones, la cual debe estar conectada a un filtro de recolección.
13 2°: Circuito cerrado con flujo discontinuo: con este método se utiliza un catéter de 2 vías, una jeringa de 50 o 60 ml o un contenedor del medio, una manguera bifurcada con válvulas de control de entrada y salida de medio, y un filtro recolector de embriones. El catéter es introducido hasta el útero de la vaca; una vez colocado en la entrada de un cuerno o en el cuerpo del útero se infla el globo del catéter para fijarlo y proceder al llenado de los cuernos con el medio de lavado, el cual entra por gravedad; una vez llenados semejando una gestación de 45 días, se cierra la válvula de llenado y se procede a dar un suave masaje a los cuernos para desprender los embriones que pudieran estar pegados a la pared uterina; posteriormente, se abre la válvula de salida del medio con los embriones, los cuales caen al filtro recolector. Este procedimiento se puede repetir 10 veces aproximadamente, aunque en los primeros 3 lavados salen el 80% de los embriones.
3°: Circuito abierto con flujo discontinuo: esta técnica se emplea con los catéteres flexibles de dos vías y no se requiere de mangueras o conexiones extras. El medio se inyecta y recolecta por la misma vía con la misma jeringa; con ésta se descarga un volumen, el cual se determina palpando los cuernos uterinos al momento de llenarlos con medio para evitar desgarrar la pared uterina al excederse en la cantidad de medio introducido. Algunos autores recomiendan fijar y dar un suave masaje al útero durante la inyección del medio; esta operación es particularmente importante cuando el animal no está fijado con una elevación del tren anterior, para facilitar el retorno del medio de lavado (Palma, 1998). Cuando la donadora es fijada con una elevación anterior, algunos operadores no manipulan los cuernos uterinos, sólo verifican el llenado por primera vez, y posteriormente retiran el brazo del recto y continúan con la inyección de medio hasta completar el volumen establecido. La recolección de los embriones en esta posición facilita el lavado en vacas con múltiples partos, aun cuando se emplee el masaje del útero. Este método es aplicado en centros de TE donde se cuenta con la infraestructura necesaria; presenta la ventaja de que la manipulación no irrita al animal y facilita la operación; mientras se descarga el medio recuperado del útero en una caja de Petri cuadriculada el catéter debe ser cerrado con una pinza hemostática o un clamp.
14 IIII. Factores que determinan el resultado de la transferencia de embriones
A) Embrión
A partir del desarrollo de la técnica de TE se observó que tanto la calidad de los embriones como el estadío de desarrollo y su edad podían afectar el resultado de la aplicación de la misma. Además de los factores propios del embrión, con el surgimiento de técnicas tales como la criopreservación, micromanipulación y más recientemente producción in vitro de embriones, otros factores se fueron sumando a aquéllos que modificaban los resultados de preñez. Además, está demostrado que los resultados de preñez dependen no sólo de cada factor embrionario, sino de la interacción que pueda existir entre dos o más de ellos (Takeda
et al., 1986; Hasler et al., 1995; Bredbacka, 1998).
La realización de una minuciosa evaluación de la calidad embrionaria es de fundamental importancia para el éxito de la TE. Es así que embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad de alcanzar la preñez. No obstante, debe considerarse que, embriones calificados excelentes, luego de ser transferidos normalmente no terminan en preñez, mientras que embriones de buena calidad y transferidos con algún tipo de problema, resultan en preñeces y nacimientos normales (Elsden et al., 1987). Este hecho nos indica que si bien la calidad embrionaria puede determinar los resultados obtenidos, otros factores relacionados con la receptora o con la transferencia podrían modificar dichos resultados.
Resulta difícil comparar la información publicada por distintos autores dado que se utilizan diferentes escalas para evaluar la calidad embrionaria. Hasta mediados de la década de los 90’s, se utilizó principalmente una escala de 5 puntos, considerando a los embriones como excelentes, buenos, regulares, malos o degenerados. Actualmente muchos autores optan por la escala propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS por sus siglas en inglés), que agrupa a los embriones según su calidad en 4 grados: excelentes y buenos, regulares, malos o degenerados.
Se ha reportado una mayor incidencia de muerte embrionaria cuando se transfieren embriones de calidad pobre, que cuando los mismos son morfológicamente normales
15 (Markette et al., 1985). Por su parte, los resultados de preñez luego de transferir embriones congelados de calidad excelente pueden diferir de los de calidad buena. Con ambas calidades se obtienen mejores resultados que con aquéllos de calidad regular (Leibo, 1986; Munar et al., 1998; Arreseigor et al., 1998).
El efecto que puede llegar a tener el estadío de desarrollo embrionario sobre los porcentajes de preñez es un factor que ha sido estudiado por diversos investigadores con resultados variables. En algunos casos, blastocistos tempranos resultaron en mayores porcentajes de preñez que mórulas, blastocistos expandidos y blastocistos eclosionados (Hasler et al., 1987). Otros autores obtuvieron mejores resultados con blastocistos que con mórulas (Wright, 1981; Looney et al., 1984; Donaldson, 1985). Dochi et al. (1998), observaron que mórulas y blastocistos tempranos resultaron en porcentajes de preñez más elevados que blastocistos o blastocistos expandidos. Contrariamente, otros autores no han encontrado efecto del estadío de desarrollo (Lindner y Wright, 1983; Munar et al., 1988).
Los porcentajes de preñez para embriones frescos producidos in vivo y transferidos en estado de mórula han sido muy variados, oscilando entre 48 y 70%. Cuando los que se transfirieron han sido blastocistos, los porcentajes de preñez fueron de 65-70% (Wright, 1981; Hasler et al., 1987; Munar et al., 1988). Para embriones producidos in vivo y congelados, los porcentajes de preñez fueron del 40% para mórulas y blastocistos tempranos, disminuyendo a un 27% para blastocistos y blastocistos expandidos (Dochi et al., 1998). Para blastocistos eclosionados, se han obtenido resultados de preñez comparables a blastocistos tempranos y blastocistos (Donaldson, 1985; Munar et al., 1988). Otros autores han obtenido menores porcentajes de preñez con este estadío y lo atribuyen a daños mecánicos durante la recolección, inadecuados sistemas de cultivo, o a que sean menos viables por permanecer mayor tiempo en el útero de las donantes inducidas a OM (Hasler et
al., 1987).
Para embriones producidos in vitro, los mayores porcentajes de preñez (60%) resultaron con blastocistos tempranos, blastocistos y blastocistos eclosionados de 7 días de edad, que a su vez fueron significativamente mayores que para los mismos estadios pero para una edad de 8 días, lo cual estaría indicando que la edad embrionaria sería lo determinante del éxito de la
16 transferencia y no el estadio en sí (Hasler, 1995). Coincidentemente, Ling et al. (1995), comunicaron mejores resultados de preñez cuando se transfirieron mórulas de 5 a 6 días y blastocistos de 7 días que blastocistos 6 días y blastocistos expandidos de 7 a 8 días, corroborando una interacción entre estos dos factores embrionarios. A su vez, resultados de preñez del 80% fueron comunicados por Takeda et al. (1986), cuando se utilizaron embriones de alta calidad, independiente de que fueran mórulas, blastocistos tempranos, blastocistos o blastocistos expandidos, confirmando la interacción del estadio de desarrollo con otro factor embrionario, como es la calidad.
Muchos de los datos publicados sobre el efecto de la edad embrionaria y/o del estadio del desarrollo al momento de la transferencia sobre la tasa de supervivencia, derivan del análisis retrospectivo de transferencias, donde el factor edad se confunde con el grado de sincronía y el método de transferencia, entre otros. La mayoría de los embriones bovinos son recolectados y transferidos con una edad de 6 a 8 días, y no queda claro si realmente hay un efecto de la edad en días o del estadio de desarrollo (Donaldson, 1986). A su vez, distintos estudios han demostrado que no hubo diferencias en los porcentajes de preñez luego de la transferencia de embriones de estas edades (Newcomb y Rowson, 1980; Shea, 1981; Wright, 1981). Por otro lado, la transferencia de embriones de 9 días o más, prácticamente no se realiza, pues es difícil encontrar los embriones en el medio de lavado luego que los mismos han perdido la zona pelúcida. No obstante, cuando se realizaron transferencias con dichos embriones, los resultados fueron contradictorios, y mientras algunos autores no encontraron disminución en los porcentajes de preñez (Newcomb y Rowson, 1980), otros observaron menores valores que cuando utilizaron embriones de 6 a 8 días (Hasler et al., 1987).
Los resultados de preñez luego de transferir embriones frescos producidos in vitro, de 6 ó 7 días, no mostraron diferencias significativas, con valores de preñez al día 40 de gestación de 78 y 68%, respectivamente (Agca et al., 1998). Por su parte, Hasler et al. (1995) comunicaron resultados de preñez del 56% para embriones de 7 días, y de 43 y 41% para embriones de 8 y 9 días, respectivamente. No obstante, la transferencia de embriones clasificados como excelentes y buenos, ya sean de 7 u 8 días, resultó en mayores porcentajes de preñez que la de aquéllos de calidad regular. Ling et al. (1995), obtuvieron
17 mayores porcentajes de preñez con mórulas de 6 ó 7 días y blastocistos de 7 días, que con blastocistos de 6 días ó blastocistos expandidos de 7 u 8 días, quedando demostrada una vez más la interacción entre factores embrionarios.
El efecto de la criopreservación de los embriones sobre los resultados de preñez es muy variado, y ello se debe a que se producen interacciones con otros factores, tales como la edad embrionaria, la calidad embrionaria, el estado de desarrollo, y si los embriones han sido producidos in vivo o in vitro. Es importante considerar que los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección hasta el comienzo de la congelación (Wright, 1985), dado que la viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho período es mayor de 3 h (Pettit, 1985). A su vez, la calidad embrionaria pos-descongelación también afecta los porcentajes de preñez, con valores que oscilan entre 30 y 68% para embriones de calidad regular y excelente, respectivamente (Munar y Hasler, 1989).
Cuando los embriones no van a ser transferidos en fresco sino almacenados, hay que tener en cuenta el método de criopreservación utilizado; es decir, cuando los embriones son congelados convencionalmente, las tasas de preñez oscilan entre 50 y 60%, resultando levemente inferiores a las obtenidas con embriones frescos (Hill, 1996; Beal et al., 1998; Dochi et al., 1998; Cutini et al., 1999). Cuando se utiliza la vitrificación como método de conservación, los porcentajes de preñez oscilan entre 0 y 60% (Rall, 1992; Tachikawa, et al., 1993; Agca et al., 1994). Las bajas temperaturas a las que son sometidos los embriones, así como las altas concentraciones de crioprotectores utilizadas, serían la causa de la disminución en su viabilidad (Overstrom et al., 1993; Pollard y Leibo, 1994; Dobrinsky, 1996).
B) Micromanipulación
Actualmente, los embriones bovinos son micromanipulados con el fin de obtener algunas células y proceder a la identificación del sexo previo a su transferencia, o para ser divididos en dos partes iguales (bipartición) y producir mellizos idénticos, lo que permite la disponibilidad de animales idénticos en los programas de TE. Con referencia a aquellos embriones que son destinados a la identificación del sexo, los blastómeros son abordados
18 penetrando la zona pelúcida y aspirando 4 a 6 células, o cortando la zona y los blastómeros con una navaja. En trabajos realizados con embriones sexados y transferidos frescos, la tasa de preñez fue de alrededor de 45%, observándose además que los resultados dependieron de la calidad embrionaria (Thibier y Nibart, 1995; Bredbacka, 1998).
Con referencia a los embriones divididos, cuando son transferidos los porcentajes de preñez dependen de la calidad de los bipartidos, con resultados que van desde 76.2% de fetos para mitades de calidad muy buena, hasta 24.7% para aquéllas de calidad regular (Brem, 1986), lo cual sugiere la necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de excelente y buena calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida celular embrionaria de aproximadamente 10%, que posiblemente compromete la viabilidad de los embriones de calidad inferior (Mc Evoy y Sreenan, 1990). Las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de embriones bipartidos son muy variables, con una media que varía entre 50 y 60% (Takeda, 1986; Leibo y Rall, 1987;). A su vez, la ausencia de la zona pelúcida en los embriones bipartidos no afecta los porcentajes de preñez para embriones transferidos frescos (Mc Evoy y Sreenan, 1990; Kippax et al, 1991).
Un grupo especial de embriones a ser transferidos lo constituyen aquéllos que han sido micromanipulados y que posteriormente fueron sometidos a criopreservación. La supervivencia de estos embriones es menor que la de embriones intactos, y esta sensibilidad podría deberse a la perforación de la zona pelúcida y/o a la reducción del número de células que sufren estos embriones (Lucas-Hahn y Niemann, 1991). Para mejorar la tasa de supervivencia se implementaron distintas alternativas metodológicas, tales como sellar el orificio practicado en la zona pelúcida, cubriéndolo con una zona pelúcida adicional, o que el embrión micromanipulado sea embebido en agar, previniendo así la pérdida de blastómeros adicionales, simplemente por una mejor protección física durante el crecimiento de los cristales de hielo. También se ha intentado mejorar la viabilidad de estos embriones realizando cultivos de los mismos en células epiteliales del oviducto (Schmidt et al., 1992), o modificando los protocolos de congelación mediante el agregado de polivinilpirrolidona (Suzuki et al, 1995). Los resultados obtenidos han sido sin embargo muy variados (Shea, 1981; Rorie et al., 1986; Picard et al., 1988; Lucas-Hahn y Niemann, 1991).
19 Los porcentajes de preñez obtenidos luego de la transferencia de los embriones micromanipulados generalmente no superan el 30%, siendo a su vez muy variables según las condiciones de cultivo utilizadas, la calidad embrionaria, así como el protocolo de congelación empleado (Heyman y Chesné, 1984; Niemann et al., 1986; Chesne et al., 1987; SeiKe et al., 1991; Thibier y Nibart, 1995).
C) Raza
Las evidencias en la literatura sobre el efecto de la raza de la receptora sobre el resultado de la transferencia son escasas. Generalmente se prefiere razas cruzadas antes que las puras, posiblemente porque las primeras sean más fértiles (Broadbent et al., 1991). Según la opinión de estos autores, las cruzas entre las razas británicas y la Holstein son preferibles a las cruzas continentales porque son baratas, de tamaño medio y de buen potencial lechero, además, algunas cruzas continentales son consideradas temperamentales. Por otra parte, prefieren animales de origen lechero, particularmente si se trata de vaquillas o vacas jóvenes, antes que animales para carne con cría al pie. Argumentan su elección en que dichos animales son más dóciles y probablemente más fértiles. Además, generalmente ofrecen menos dificultades para llevar a cabo la TE. No obstante, otros autores, si bien transfirieron embriones congelados y vitrificados, no hallaron diferencias de preñez entre receptoras de razas lecheras (46%), productoras de carne (43.2%) o de doble propósito (43.9%) (Van Wagtendonk-de Leeuw et al., 1997).
D) Edad
Este es un aspecto importante, pero con criterios encontrados respecto a si es mejor utilizar vaquillas o vacas. Los investigadores que proponen el uso de vacas lo hacen argumentando que las mismas ya han parido alguna vez. Por otro lado, las vaquillas son seleccionadas principalmente como receptoras por razones económicas, logísticas y técnicas, entre ellas podemos mencionar que es menos probable que se encuentren bajo estrés nutricional o que tengan una historia de problemas sanitarios, además, el útero virgen es más apropiado para recibir un embrión transferido. Se considera que, así como en la IA, en la TE se obtiene mayor porcentaje de preñez en vaquillas que en vacas (Alberio, 1993). Sin embargo, muchos
20 autores no hallaron diferencias (Wright, 1981; Munar y Nigro, 1990; Broadbent et al., 1991; Callesen et al., 1994).
El porcentaje de receptoras que abortan después de que ha sido confirmada la preñez ronda el 5% (King et al., 1985; Callesen et al., 1995), resultando similar al reportado en hembras inseminadas. Munar et al. (1990), observaron mayor porcentaje de abortos cuando se utilizaron vaquillas como receptoras. Tales diferencias no fueron corroboradas por otros autores (Callesen et al., 1994; Callesen et al., 1996).
Wright (1981), observó que el estrés lactacional no tuvo efecto sobre la tasa de preñez, no encontrando diferencias entre las vacas con cría al pie y las vacas secas. Por otro lado, Van Wagtendonk-de Leeuw et al. (1997), no hallaron diferencias de preñez entre receptoras que tenían de 1 a 7 partos. Si bien las vacas pueden, en general, tener un porcentaje de preñez ligeramente inferior a las vaquillas, cuando también se tiene en cuenta la supervivencia y la viabilidad de sus crías, la tasa de éxito final es de la misma magnitud que cuando se emplean novillas (Alberio, 1993; Callesen, 1996). Además, el cérvix de las vaquillas es estrecho y durante la fase luteal se encuentra cerrado, lo cual dificulta en algunas ocasiones la inserción del instrumental de transferencia, requiriendo un tiempo adicional que actúa negativamente sobre el resultado final ( Kanawaga, 1993).
En las condiciones de manejo semi-intensivo o extensivo, Alberio (1993) recomienda la utilización de vacas jóvenes de primer y segundo parto, las que al tener menos problemas al parto permitirán obtener resultados superiores que con vaquillas. En síntesis, si bien existen razones biológicas, prácticas y técnicas que justifican la elección de vaquillas o vacas, tanto unas como otras pueden resultar muy buenas receptoras después de una adecuada selección. La elección de la categoría dependerá de las condiciones bajo las cuales se desarrolle el programa de TE (Callesen et al., 1994).
21 E) Estado nutricional
La nutrición es un factor importante en el manejo de las receptoras y afecta todos los aspectos de la reproducción. Por lo tanto, la receptora preñada no debe ser tratada como cualquier otra vaca, ya que gestará y amamantará a los terneros de mayor valor del establecimiento, resultando vital la alimentación de las mismas para el éxito final de la TE (Alberio, 1993).
La condición corporal de las receptoras y el contenido energético de la alimentación que éstas reciben son los factores más importantes. El cambio que se produce en la condición corporal entre el parto y la TE guarda estrecha relación con el contenido energético de la alimentación que la receptora recibe en dicho período. Si se produce una disminución marcada de la condición corporal se afectan el intervalo parto-celo y los porcentajes de preñez y parición. Tomando como referencia la escala 1-5, es necesario lograr una condición corporal de 2.5 al parto para que ésta no resulte inferior a 2 en el momento de la transferencia. Luego, el nivel energético debe seguir siendo correcto, sin llegar al exceso, y debe continuar hasta que la implantación del embrión haya finalizado, resultando determinante entre los días 21 y 45 de gestación (Pampillo, 1988). Mapletoft et al. (1986), obtuvieron mayor porcentaje de preñez con receptoras de condición corporal entre 2 y 3, que con aquéllas de <1 o > 4.
22 JUSTIFICACIÓN
La OM utilizando hormona folículo estimulante (FSH) en programas de TE ha crecido considerablemente, y en los últimos años ha incrementando la producción anual de embriones de vacas inducidas a OM.
Desafortunadamente, la respuesta ovárica necesaria para el éxito de estos tratamientos es muy variable, ya que puede verse afectada por perturbaciones entre la interacción de la FSH y su receptor, lo que debilita la gametogénesis y por ende el papel central de la FSH y sus receptores en la maduración fisiológica normal de ovocitos.
Sin embargo, el comportamiento reproductivo de las hembras Bos indicus y Bos taurus es diferente en cuanto a su producción y fisiología reproductiva. En el trópico, debido a las condiciones extremas de estas zonas, los animales Bos indicus son los más frecuentemente encontrados; es por ello que se plantean nuevas estrategias durante los procesos de OM para determinar si la aplicación de nuevos protocolos mejora la respuesta en animales Bos
23 OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la respuesta de ovulación múltiple y la tasa de colección de embriones en hembras Bos taurus y Bos indicus a través del uso de prostaglandina F2α y progesterona natural para sincronizar la ovulación.
Objetivos Específicos
1. Evaluar el número de cuerpos lúteos formados en hembras Bos taurus y Bos indicus 2. Determinar el grado de desarrollo y calidad embrionaria del total de embriones
colectados.
HIPÓTESIS
La respuesta de ovulación múltiple y la tasa de colección de embriones varia en hembras
Bos taurus y Bos indicus a través del uso de prostaglandina F2α y progesterona natural
24 MATERIALES Y MÉTODOS
A) Localización geográfica
El presente trabajo se realizó en la “Finca Oluta”, explotación comercial de bovinos productores de carne (Bos indicus y Bos taurus), ubicada en el municipio de Veracruz, Ver., localizado a 19° 12' latitud norte y 19° 08' longitud oeste, a una altura de 10 msnm, con clima tropical húmedo, temperatura media anual de 25.3°C, y precipitación pluvial media anual de 1,500 mm.
MANEJO DE ANIMALES
B) Características y manejo de los animales experimentales
Se utilizaron 20 hembras bovinas, concentradas en dos grupos de la siguiente manera: Grupo 1): vacas cebú (n=10), y Grupo 2: vacas Suizo Europeo (n=10). Estas hembras presentaron las siguientes características: 5 a 7 años de edad, 1 a 7 partos, mínimo 90 días posparto, al menos 2 celos con intervalo normal de tiempo, intervalos entre partos de 60 a 90 días, y 1.5 a 2 servicios por concepción.
En este rancho, los animales desde que nacen cuentan con su tarjeta de registro. Las hembras se inseminan por primera vez a los 2 años de edad ó después del periodo posparto. Se analizaron los registros de 193 hembras cebuínas y 80 hembras Suizo Europeo. Las hembras fueron seleccionadas conforme a los registros existentes en el propio rancho. Posteriormente, se identificaron con numeración progresiva de acuerdo con el orden de inclusión en el estudio; además, se examinaron a través de palpación rectal durante los primeros meses previos al estudio a fin de evaluar que se encontraran libres de patologías clínicas en el aparato genital, verificar la presencia de estructuras ováricas y posteriormente, por medio de ultrasonografía, se confirmo la evaluación inicial. El manejo reproductivo de la explotación es a través de IA durante los meses de julio a diciembre, y monta natural controlada con empadre continuo durante el año.
25 Asimismo, se mantuvo bajo el manejo constante de la explotación, con respecto a las condiciones de alimentación (pastoreo) y sanidad (desparasitación externa cada 21 días e interna cada 120 días y vacunaciones contra enfermedades comunes como derriengue, fiebre carbonosa, carbón sintomático, complejo respiratorio bovino y brucelosis). El sistema de amamantamiento empleado en el rancho es continuo, consistente en que el becerro permanece con la madre desde que nace hasta su destete a los siete meses de vida.
Las vacas se manejaron en pastoreo en aproximadamente 300 ha sembradas con pasto estrella de África (Cynodon plectostachyus), estrella Santo Domingo (Cynodon nlemfuensis), Pangola (Digitaria decumbens), Privilegio (Panicum Maximum), estando presentes algunos pastos nativos como el Paspalum spp. y Axonopus spp., predominando las praderas mixtas en el rancho.
Inducción de ovulación múltiple (OM)
A la hora de realizar el tratamiento de inducción de OM, se confirmó que cada animal hubiera superado el periodo posparto, con un mínimo de 60 días y al menos dos celos consecutivos con un intervalo normal de tiempo, así como que estuviera en un plano de nutrición adecuado.En general, la selección de una donadora se basa en el siguiente criterio (Seidel y Moore 1991):
Debe de tener al menos 15 meses de edad Presentar ciclos estruales normales y regulares No tener historia de dos servicios por concepción
No haber presentado problemas reproductivos o problemas al parto Debe estar libre de enfermedades
26 Grupo experimental utilizando prostaglandina F2α
A la mitad de las hembras de los Grupos 1 y 2 se les aplicó una dosis de 25 mg de Dinoprost trometamina (Lutalyse®, Pfizer, México) vía Intramuscular, observándose la manifestación de celos durante los dos siguientes días (Cuadro 1).
Cuadro 1. Cronograma de actividades del grupo con prostaglandina F2α
Aplicar 25 mg de Lutalyse a donadoras Detectar celo de donadoras Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin + 25 mg de Lutalyse a donadoras Detectar celo de donadoras IA donadora Colectar embriones AM AM AM AM AM AM AM AM AM Detectar celo de donadoras Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin + 25 mg de Lutalyse a donadoras Detectar celo de donadoras IA donadora PM PM PM PM PM PM PM PM
Dïa 0 Día 2 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 Día 16 Día 17 Día 24
Para el tratamiento de inducción de OM se utilizó FSH (Folltropin®-V, [400 mg de NIH-FSH-P1/por cada 20 mL] Bioniche Animal Health, Canada), considerada como una de las preparaciónes con mayor depuración y con la que se obtienen mejores resultados (González
et al., 1990, Nassek et al., 1991), y que permite manipular la ovulación y el crecimiento de un
número variable de folículos de los que se obtienen óvulos y posteriormente embriones transferible de diferente calidad. La sincronización previa de las vacas donantes permitió que el grupo de animales entrara en celo al mismo tiempo, y por lo tanto que las recolecciones embrionarias se realizaran a lo largo de un día.
27 El tratamiento de inducción de OM inicio con inyecciones en el día 10 del ciclo estrual, aplicadas en forma decreciente a lo largo de cuatro días, con dos administraciones diarias. Todos los animales recibieron en el cuarto día del tratamiento dos dosis de prostaglandina F2α con el propósito de inducir la lisis del cuerpo lúteo.
El tratamiento se inició en la fase lútea, para aprovechar la segunda onda de maduración folicular. El efecto luteolítico de las prostaglandinas determinó la aparición del celo de las donadoras entre las 12 y 24 h, y la mayoría entre las 40 y 48 h. Las inseminaciones se realizaron a las 12 y 24 h de las primeras manifestaciones del celo detectado (Orihuela et al., 1988).
El semen utilizado para la IA fue previamente evaluado teniendo los siguientes valores mínimos: motilidad en masa 30%, motilidad individual progresiva rectilínea 50%, vigor 3, porcentaje de vivos 70%, porcentaje de espermatozoides normales 70%, concentración 500.000 espermatozoides/mm3. El semen a descongelar antes de la IA se almacenó en termos criogénicos con nitrógeno líquido a -196º C. La pajilla seleccionada fue retirada del termo y colocada en baño maría por 45 seg a temperatura de 37-38º C. Una vez que el semen se descongeló, se cortó la punta de la pajilla y se colocó en la pistola de Cassou, cubriéndose con la funda de plástico (Glenn, 2002).
Las vacas con celo detectado 12 h antes se colocaron en las mangas de trabajo; el área perineal y los labios vulvares se limpiaron hasta dejarlos libres de cualquier residuo de excremento. Posteriormente, se introdujo la pistola de Cassou vía vaginal hasta atravesar los tres anillos del cérvix y llegar al cuerpo del útero, donde se depositó el semen (Figura 1a).
La recolección embrionaria se realizó a los siete días de la IA, cuando la mayoría de los embriones alcanzan la cavidad uterina y conservan la zona pelúcida intacta, lo que facilita la recuperación, aislamiento y transferencia. La vaca donadora fue colocada en la manga de trabajo y por palpación rectal se evacuaron las heces del recto. El número de CL’s se estimó en este momento, antes de realizar la recolección. El área perineal, los labios vulvares y la zona de anestesia epidural fueron lavados y desinfectados con una solución de benzal (Benzal® tópico al 0.125%, Productos Hemobiológicos, México), secados muy bien y la cola
28 fue sostenida a un lado. Una vez realizado el examen rectal de la donadora y constatada la presencia de CL’s se inyectó anestesia epidural baja utilizando Xilocaina® (Solución de xilocaína al 2%, [Lidocaina] AZTRAZENECA, México).
Para la recolección de los embriones se utilizó el método no quirúrgico (Curtis, 1992), el cual se efectuó utilizando el sistema abierto, en el cual hay entrada de líquido y salida por gravedad y por la propia elasticidad de las paredes uterinas. Para la recolección, se introdujo una sonda Foley No. 20 (Sonda Foley Silicón® TYCO-KENDAL, México) a través de la vagina y cuello de la matriz hasta llegar al tercio medio de cada cuerno uterino. Para fijar la sonda en el lugar adecuado se introdujeron 20 ml de aire para inflar el globo, y por palpación se comprobó su ubicación, cuidando de no distender demasiado el globo, ya que el endometrio se podría desgarrar y los embriones y el medio de recolección se podrían perder (Figura 1b).
a b
Figura 1. a) Anatomía del tracto reproductivo de la hembra bovina y b) Introducción de la sonda Foley al cuerno uterino
Para conectar la sonda Foley a la vía de salida se utilizó una sonda Foley modificada, y para contener la entrada y salida de líquido se utilizaron pinzas de hemostasis. Una vez que el catéter se encontró en la posición adecuada, se introdujo el medio de cultivo de embriones BIOLIFETM Advantage® (Embryo Collection Medium, Agtech, Inc. USA) con jeringas de 60 ml, para dilatar el cuerno uterino hasta llegar al tamaño de una gestación de 30-35 días; después del masaje se abrió la vía de salida conectada al filtro para recolectar los embriones. La vía de salida se conectó con un filtro millipore desechable de 0.22 μm antes de ser usado
29 (Em-Con®, Inmuno Systems, Inc. Sure Flush, USA). Los primeros 4-5 ml fueron descartados, ya que su uso pudo afectar la supervivencia embrionaria.
El filtro posee en la base una malla con poros de 50 micras que impide el paso de los embriones. La maniobra se repitió 7 veces utilizando de 450 a 500 ml de medio por cuerno uterino, dejando correr el medio a través del filtro después de cada lavado, y finalizando con la introducción de 50 a 100 ml de aire para evitar que quedara líquido. Una vez terminado el procedimiento, éste se repitió en el otro cuerno.
El medio colectado en el filtro fue colocado en cajas de Petri de 100 y 50 mm de diámetro, para proceder a identificar sí las células estaban fertilizadas o no, y a su clasificación de acuerdo a la calidad presentada. La evaluación de los embriones se realizó en un estereomicroscopio, con aumento de 50-100 X, con el embrión en caja de Petri de 50 mm, de acuerdo con el siguiente criterio:
Estadíos embrionarios (Mapletoff, 2002):
Mórula: Una masa de al menos 16 células. Los blastómeros individuales son difíciles de distinguir uno de otro. La masa celular del embrión ocupa la mayoría del espacio. Mórula compacta: Los blastómeros se han agrupado formando una masa compacta. La masa del embrión ocupa 60-70% del espacio perivitelino.
Blastocisto temprano: Un embrión que ha formado una cavidad con fluido o blastocele, y que tiene la apariencia general de un anillo de sello. El embrión ocupa el 70-80% del espacio perivitelino. Al inicio de este estado de desarrollo el embrión puede tener una apariencia de calidad cuestionable.
Blastocisto: Se ven evidentes cambios de diferenciación de la capa externa o trofoblasto, y la masa celular interna más oscura y compacta. El blastocele es más prominente y el embrión ocupa casi todo el espacio perivitelino. En este estado es posible diferenciar visualmente el trofoblasto y la masa celular interna.
Blastocisto expandido: El diámetro general del embrión se incrementa drásticamente, mientras que la zona pelúcida se adelgaza aproximadamente hasta un tercio de su grosor original.
Blastocisto eclosionado: Los embriones recolectados en este estado de desarrollo pueden haber iniciado su proceso de eclosión o pueden haber perdido completamente la zona pelúcida. Los blastocistos eclosionados pueden ser esféricos, con el blastocele muy bien definido, o pueden estar colapsados. La identificación de embriones en este estado puede ser difícil a menos que se re-expandan.
30 De acuerdo a lo establecido por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones, se utilizaron los siguientes códigos para clasificar la calidad embrionaria:
Código 1: Excelente o bueno. Embriones simétricos y esféricos con una masa embrionaria de blastómeros (células) que son uniformes en tamaño, color y densidad. Este embrión presenta el estado de desarrollo esperado. Se pueden ver irregularidades menores y al menos 85% del material celular debe ser una masa embrionaria viable e intacta. Esta evaluación debe basarse en el porcentaje de células del embrión representado por material extruído en el espacio perivitelino. La zona pelúcida debe ser lisa y no tener superficies cóncavas o aplanadas que puedan ocasionar que el embrión se adhiera a la pajilla o a la caja de Petri.
Código 2: Regular. Irregularidades moderadas en la forma general de la masa embrionaria, o en el tamaño, color y densidad de las células individuales. Al menos 50% del material celular debe representar una masa embrionaria viable y estar intacta.
Código 3: Pobre: Marcadas irregularidades en la forma de la masa embrionaria, o en el tamaño, color y densidad de las células individuales. Al menos 25% del material celular debe ser una masa embrionaria intacta y viable.
Código 4: Muerto o degenerado. Embriones degenerados, ovocitos o embriones de 1 célula; no son viables.
Los embriones, una vez clasificados, fueron colocados en pajillas para ser congelados utilizando una congeladora de embriones (Criocell 5500®, USA), hasta su posterior transferencia.
Grupo experimental utilizando progesterona natural (CIDR)
Este grupo se formó con el resto de las hembras de los grupos 1 y 2 utilizando el siguiente protocolo de actividades (Cuadro 2):
31 Cuadro 2. Cronograma de actividades del grupo con progesterona natural (CIDR):
Colocar CIDR a donadora Retirar CIDR a Donadora y detectar celo Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin + 25 mg de Lutalyse a donadoras Detectar celo de donadoras IA donadora Colectar embriones AM AM AM AM AM AM AM AM AM Detectar celo de donadoras Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 40 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin Aplicar 20 mg de Folltropin + 25 mg de Lutalyse a donadoras Detectar celo de donadoras IA donadora PM PM PM PM PM PM PM PM
Dïa 0 Día 7 Día 17 Día 18 Día 19 Día 20 Día 21 Día 22 Día 29
A este grupo se le aplicó un dispositivo CIDR® (Pfizer, México) con 1.9 g de progesterona natural, de aplicación intravaginal.
Se aplicó un primer CIDR® mediante un aplicador, el cual fue previamente lavado con agua simple y luego desinfectado en agua con cloro. El día de aplicación del CIDR se inyectó ECP® (Cipionato de estradiol, Pfizer, México) para ayudar a regresar a los animales a su ciclo reproductivo normal. El CIDR® se retiró 7 días después. Con base en la respuesta de la primera aplicación de CIDR, un segundo dispositivo fue colocado 15 días después del retiro del primero por un período de 7 días, observándose los celos durante los tres días siguientes, e iniciándose el tratamiento de OM en el día 10 después de iniciado el ciclo estrual con el mismo protocolo del primer grupo (Cuadro 3).
32 Cuadro 3. Protocolo de aplicación de CIDR
Inicio Inducción OM (AM,PM) Día 57 Día 38 Día 23 Detección de celos Retiro de 2º CIDR® Colocación 2o CIDR® Retiro de 1er CIDR® Colocación 1er CIDR® Día 45, 46,47 Día 7 Día 1
El día de colocación del CIDR ® se aplicó:
ECP® (Solución Estéril, Cipionato de estradiol) Ayuda a regresar a los animales su ciclo reproductivo normal.
PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN DE CIDR®/OM
Al terminó del tratamiento descrito se les aplicó la metodología descrita en el primer grupo de trabajo.
Análisis de la información
Los resultados obtenidos fueron analizados a través de estadística descriptiva y Xi2, disponible en el paquete estadístico SAS.
33 RESULTADOS
Respuesta a la ovulación múltiple (OM) y producción de embriones
Durante el proceso de inducción a la OM, con respecto a la formación de cuerpos lúteos en las hembras Bos taurus y Bos indicus, se encontraron por palpación rectal un total de 127 y 69 cuerpos lúteos, respectivamente (Gráficas 1 a 4). Asimismo, en cuanto a la producción de embriones en hembras Bos taurus y Bos indicus, se encontró un total de 67 y 19 embriones, respectivamente (Gráficas 1 a 4).
Gráfica 1. Respuesta a la ovulación múltiple en donadoras Bos taurus tratadas con progesterona natural.
34 Gráfica 2. Respuesta a la ovulación múltiple en donadoras Bos taurus tratadas con prostaglandinas. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5
VACAS SUIZAS CON PGF2a
C U ER P O S LU TE O S (C L) Y E M B R IO N ES (E M B ) O B TE N ID O S CL EMB
Gráfica 3. Respuesta a la ovulación múltiple en donadoras Bos indicus tratadas con progesterona natural. 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5
VACAS CEBÚ CON PROGESTERONA
C U ER P O S LU TE O S (C L) Y E M B R IO N ES (E M B ) O B TE N ID O S CL EMB
35 Gráfica 4. Respuesta a la ovulación múltiple en donadoras Bos indicus tratadas con prostaglandinas. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5
VACAS CEBÚ CON PGF2a
C U ER P O S LU TE O S (C L) Y E M B R IO N ES (E M B ) O B TE N ID O S CL EMB
No hubo diferencia en la respuesta a la inducción de la OM y en el número de embriones viables por efecto del tratamiento con prostaglandinas o progesterona natural, tanto en las donadoras Bos taurus como en las Bos indicus.
En cuanto a la respuesta al tratamiento de OM, el 100% de las hembras Bos taurus respondió al mismo, mientras que en las Bos indicus fue sólo el 30%. Asimismo, no se encontró diferencia entre genotipos en la respuesta a la inducción de la OM en el tratamiento con progesterona (P<0.05), pero sí en el tratamiento con prostaglandina, siendo mayor la respuesta en las donadoras Bos taurus (P<0.05).
Por otra parte, el 58% de las donadoras Bos taurus que respondieron al tratamiento produjeron embriones viables. Por otro lado, del total de donadoras Bos indicus que respondieron al tratamiento, el 47.3% produjeron embriones viables (P>0.05). El promedio global de embriones transferibles por donadora Bos taurus y Bos indicus fue de 3.9 y 0.9, respectivamente (P<0.05), mientras que el promedio calculado solamente en vacas en las que se colectaron embriones transferibles fue de 3.7.
36 DISCUSIÓN
De acuerdo a la respuesta de inducción a la OM obtenida en el presente trabajo, los resultados indican que existe una alta variabilidad de las donadoras en la respuesta a la FSH, encontrando que en las donadoras Bos indicus el 30% produjo aproximadamente el 47.3% de los embriones viables a la congelación, lo que coincide con lo reportado por Mapletof et al. (2002), quienes demostraron que existe una alta variabilidad en la respuesta de inducción a la OM, mencionando que el 24% de los animales inducidos a la OM produjeron embriones no viables, el 64% de las donadoras produjeron un promedio bajo de embriones transferibles, y el 30% produjeron el 70% de los embriones. En el ganado Bos
taurus del presente trabajo se encontró que el 100% de las donadoras produjeron el 58% de
embriones viables para congelar. Estos resultados son muy similares a los encontrados por Lerner et al. (1986), utilizando vacas productoras de leche. Lo anterior demuestra que sin importar el genotipo utilizado para producir embriones, aproximadamente entre el 20 y 30% de las donadoras no producirán embriones de ningún tipo (Baruselli et al, 2006).
Una explicación a esta variabilidad podría ser la raza de la donadora, ya que ésta afecta directamente la transferencia embrionaria, incidiendo en el desarrollo y número de embriones con viabilidad para ser transferidos (Callesen et al., 1995). Otra posible explicación para esta variabilidad podrían ser las diferencias en la dinámica folicular entre razas (Bó, 2003). Se ha demostrado que las hembras Bos indicus son mas susceptibles a las gonadotropinas que las
Bos taurus, por lo que en cada oleada folicular hay un mayor reclutamiento de folículos en las
primeras (Baruselli, 2006). Sin embargo, si la administración de FSH exógena es elevada, esto provocaría una respuesta exagerada, lo que provocaría un incremento en el número de embriones de mala calidad. (Greve et al., 1995). Dosis elevadas de gonadotropinas producen una sobre estimulación ovárica donde muchos folículos comienzan a desarrollar pero pocos son capaces de ovular, y la mayoría sufre luteinización o atresia (Greve et al., 1995).
Además, se ha observado que al aumentar la edad de la donadora disminuye el número de ovulaciones, la tasa de fecundación y la calidad embrionaria. La disminución en el número de ovulaciones se debería a una menor disponibilidad de folículos capaces de responder a gonadotropinas exógenas. Al existir menos folículos en crecimiento, los niveles de inhibina
37 bajan y aumenta la FSH endógena; esto traería como consecuencia que en cualquier momento del ciclo estral los folículos en crecimiento estuvieran en un estado de desarrollo más avanzado que las estructuras correspondientes en los animales mas jóvenes. Al comenzar el tratamiento con gonadotropinas, los folículos más maduros serían los primeros en producir grandes cantidades de estrógenos por mayor tiempo antes de la ovulación; comparándolos con los ovocitos dentro de los folículos menos desarrollados. Esta exposición a una alta concentración de estradiol podría ser la causa de la disminución en la tasa de fertilización y en la calidad embrionaria (Lerner et al 1986).
Looney et al. (1986), en colecciones realizadas en ganado de carne encontraron 11.5 estructuras embrionarias en promedio, con 6.2 embriones transferibles, mientras que en el presente estudio en donadoras Bos indicus se obtuvieron 23 estructuras en promedio, de las cuales 0.9 fueron embriones de calidad 1. Con respecto a los embriones producidos en vacas Bos taurus, Lerner et al. (1986) en colecciones de donadoras productoras de leche encontraron resultados iguales a los de Looney et al. (1986). Sin embargo, Barrios et al. (1982), obtuvieron de 12 vacas lecheras colectadas únicamente 13 embriones de buena calidad, contrastando con los resultados obtenidos en el presente trabajo, en el cual se obtuvieron 46 embriones de la misma calidad utilizando 20 donadoras productoras de carne.
38 CONCLUSIONES
La respuesta de ovulación múltiple y la tasa de colección de embriones no varió en hembras
Bos taurus a través del uso de prostaglandina F2α y progesterona natural durante la
sincronización del estro.
La respuesta de ovulación múltiple y la tasa de colección de embriones no varió en hembras
Bos indicus a través del uso de prostaglandina F2α y progesterona natural durante la
sincronización del estro.
La respuesta de ovulación múltiple no varió entre hembras Bos taurus y Bos indicus a través progesterona natural durante la sincronización del estro, mientras que varió a través del uso de prostaglandinas, siendo mayor en las donadoras Bos taurus.
