Efecto del lindano y diazinon en el rotífero marino Brachionus ibericus.

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Efecto del lindano y diazinon en el rotífero marino

Brachionus ibericus.

Jesús D. Moha-León1, Ignacio A. Pérez-Legaspi1,+, Ana L., Sepúlveda-Cuellar1,*, Luis A. Ortega-Clemente1.

1

División de Estudios de Posgrado e Investigación. Instituto Tecnológico de Boca del Río. Km. 12 Carr. Veracruz-Córdoba, Boca del Rio, Veracruz. 94290. México. Tel. 01(229) 9860189. Ext. 29.

*

Autor que presentará el trabajo. Ana Laura Sepúlveda-Cuellar

+

Autor por correspondencia; Dr. Ignacio Alejandro Pérez Legaspi. Tel.: +1(229) 9 86 01 89 ext. 129;

Fax: +1-(229) 9 86 18 94.

Instituto Tecnológico de Boca del Río, División de Estudios de Posgrado e Investigación. Carr. Veracruz-Córdoba Km 12. Boca del Río, Veracruz. C.P. 94290.

E-mail: ialegaspi@yahoo.com

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Resumen en Español: Pesticidas como lindano y diazinon alteran el funcionamiento del sistema nervioso, siendo sustancias de riesgo para la salud y el ambiente. Este estudio evaluó el efecto agudo y crónico (potencial reproductivo) de lindano y diazinon en el rotífero marino Brachionus ibericus. El experimento comprendió la exposición al tóxico de neonatos < 2 h de edad, por tratamiento. Las pruebas de toxicidad consideraron un control negativo (sin tóxico), un control solvente y distintas concentraciones de lindano y diazinon, respectivamente. La exposición a los pesticidas fue por 48 horas, a 25º C y salinidad de 15 ppm. Las pruebas letales fueron sin alimento y las crónicas con Nannochloropsis occulata (3x106cel/ml) como alimento. Los valores estimados de CL50 y EC50 fueron para lindano de 4.82 mg/l (3.52 - 6.59) y 5.15 mg/l (2.44 -7.86), respectivamente. Mientras que para diazinon 27.27 mg/l (18.17-40.94) y 37.18 mg/l (12.29 - 62.15). Estos valores demuestran que el lindano tiene mayor toxicidad a niveles agudos y crónicos (inhibiendo la reproducción) que el diazinon. Los resultados sugieren mayor sensibilidad en Brachionus

ibericus a estos pesticidas que lo reportado para Brachionus plicatilis. Incluso a nivel de género hay grandes diferencias de sensibilidad entre especies. Es necesario utilizar diversas especies para evaluar los efectos potenciales de las sustancias tóxicas en el medio acuático. Palabras Clave: Toxicidad letal, Potencial reproductivo, organofosforados, organoclorados.

Resumen en inglés: Pesticides such as lindane and diazinon alter the functioning of the nervous system, being substances of risk for human health and the environment. This study assessed the acute and chronic (reproductive potential) effect of lindane and diazinon on the marine Rotifer Brachionus ibericus. The experiment included exposure to the toxicants of neonates less than 2 h old, per treatment. Toxicity tests were considered a negative control (without toxic), a solvent control and different concentrations of lindane and diazinon, respectively. Exposure to pesticides was for 48 hours at 25° C and salinity of 15 ppm. Lethal tests were without food whereas chronic tests including the algae Nannochloropsis

occulata (3x106 cel/ml) as food. The estimated LC50 and EC50 values for lindane were 4.82 mg/l (confidence limits: 3.52 - 6.59) and 5.15 mg/l (confidence limits: 2.44 - 7.86), respectively. While for diazinon were 27.27 mg/l (18.17-40.94) and 37.18 mg/l (12.29 - 62.15). These values showing that lindane has more acute and chronic toxic levels (by inhibiting the reproduction) than diazinon. These results suggest the Brachionus ibericus has greater sensitivity than Brachionus plicatilis reported for these pesticides. Even at genus level there are large differences in sensitivity among species. It is necessary to use several species to assess the potential effects of toxic substances in the aquatic environment.

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1. Introducción

El lindano es un plaguicida organoclorado liposoluble, relativamente estable, persistente y con capacidad de bioacumularse. Se ha utilizado ampliamente en la agricultura como insecticida del suelo, como fumigante, y para el recubrimiento de semillas almacenadas 1. Según la Agencia de Protección Ambiental (EPA), el lindano está entre los compuestos de toxicidad moderada clase II. Por su parte, el diazinon pertenece a la clase de los plaguicidas organofosforados inhibidores de la acetilcolinesterasa. Se utiliza mundialmente para eliminar plagas en agricultura, hogares y jardines. Sin embargo, ha sido restringido por su alto riesgo ambiental y a la salud 2. Se ha reportado la concentración letal media (CL50) para lindano con diferentes especies acuáticas como Daphnia magna , Lepomis

macrochirus , Palaemonetes pugio, Cyprinodon variegatus, y Lagodon romboides 3,4. Además, se han desarrollado pruebas agudas y crónicas de lindano y diazinon en rotíferos como Brachionus plicatilis y Brachionus calyciflorus 5-7. Los cuales muestran diferencias en los valores de CL50 debido a la sensibilidad de cada especie.

En el caso de los rotíferos se consideran ideales para pruebas de toxicidad por su tamaño pequeño, tiempo de generación corto, facilidad para manipular y cultivar, así como por su relevancia ecológica, gran susceptibilidad y disponibilidad de neonatos 7-9. Entre los estudios que se han realizado involucran diferentes parámetros para evaluar tóxicos. Donde la mayoría consideran las pruebas de toxicidad agudas o letales utilizando la mortalidad como un parámetro por un período de exposición de 24 o 48 horas para muchos tóxicos diferentes, utilizando rotíferos planctónicos como Brachionus calyciflorus 8 B. plicatilis

10, y el rotífero litoral del género Lecane 11 incluso para diez especies diferentes 12. Otras pruebas de toxicidad con rotíferos son las de tipo crónico, las cuales involucran la tasa instantánea de crecimiento "r" como un parámetro, esta representa una alta relevancia ecológica y estima el potencial crecimiento de una población. Además, comprende una considerable parte del ciclo de vida del rotífero e incluyen alimento 13.

Por lo anterior, es conveniente utilizar rotíferos para estimar la toxicidad de sustancias químicas en ecosistemas acuáticos susceptibles de recibir el impacto. Por tanto, este estudio tiene como objetivo evaluar el efecto agudo y crónico (potencial reproductivo) de los pesticias lindano y diazinon con el rotífero marino Brachionus ibericus.

2. Metodología

El rotífero Brachionus ibericus fue colectado de la laguna costera de Alvarado del Sistema Lagunar de Alvarado, al suroccidente del Golfo de México, y sureste del estado de Veracruz (18º 39’ latitud Norte y 95º 51’ longitud oeste) 14. El cultivo de B. ibericus se ha mantenido por más de dos años a 25 ± 2° C en luz continua y en matraces Erlenmeyer de 3 litro con medio marino sintético al 15 ‰ de salinidad a un pH entre 8.2–8.4, utilizando agua potable purificada de garrafón y sal para acuario (calcio 400-420 ppm y magnesio 1,070-1,100 ppm) según especificaciones del fabricante (Oceanic, GAL aquarium. E.U.A.). Se utilizó la clorofita Nannochloropsis oculata (cepario CICESE, NNO1) cultivada en medio Guillard F/2 al 15 ‰ de salinidad 15 como alimento para los rotíferos.

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Se evaluaron tóxicos de la más alta pureza disponible siendo el pesticida organoclorado lindano (97% pureza, Sigma-Aldrich, Co.) y el organofosforado diazinon grado GC (98.3% pureza, Sigma-Aldrich Co.). El lindano se disolvió en acetona (99.8% pureza, Baker) para incorporarlo en agua, debido a su baja toxicidad (CL50 > 7 g/l) reportada previamente para el rotífero dulceacuícola L. quadridentata 11. Los pesticidas fueron evaluados a sus concentraciones nominales y no se analizaron químicamente.

Para las pruebas de toxicidad letal y crónica, se utilizaron hembras amicticas del rotífero marino B. ibericus menores de 2 horas de edad (neonatos), eclosionados a partir de huevos partenogenéticos.

Pruebas de toxicidad letal.

Estas pruebas se realizaron de acuerdo al protocolo de Ferrando y Andreu- Moliner 5 para el rotífero marino Brachionus plicatilis y dulceacuícola B. calyciflorus; quienes evalúan como parámetro la mortalidad o inmovilidad. Previamente, se consideró la búsqueda de los rangos de toxicidad del pesticida a evaluar, involucrando un control negativo (agua marina sintética sin tóxico), un control solvente (concentración máxima de acetona usada en la concentración más alta de cada pesticida evaluado, monitoreando así la toxicidad del solvente) y cinco concentraciones logarítmicas del pesticida. Para el control negativo se toleró menos del 10% de mortalidad, además se consideró una concentración máxima del tóxico sin mortalidad, una concentración mínima con el 100 % de mortalidad, y tres concentraciones intermedias. Estableciendo así, los rangos de toxicidad letal definitivos para lindano (1.0, 2.0, 3.0, 5.0, y 10.0 mg/l) y diazinon (10, 25, 50, 75, y 100 mg/l); respectivamente.

Las pruebas de toxicidad letal iniciaron colocando 10 neonatos por poza (cinco réplicas) en una placa nueva de 24 pozas de poliestireno (Costar, Co.), usando una pipeta de transferencia de plástico y un microscopio estereoscópico. Incluyendo un control negativo, un control solvente, y las concentraciones del rango de toxicidad a evaluar para cada pesticida. Posteriormente, los organismos se expusieron al tóxico por 48 horas sin alimento, en un volumen total de prueba de 2 ml, al 15 ‰ de salinidad, a 25 ± 2° C en una incubadora marca ARSA en la oscuridad. Registrando a las 48 horas la mortalidad o inmovilidad de los rotíferos.

Cuadro 1. Condiciones de prueba de toxicidad aguda.

Factor Condición Temperatura 25 ± 2 ºC Fotoperiodo Oscuridad Salinidad pH 15 ‰ 8.2–8.4 Volumen de exposición 2 ml

Edad de organismos prueba Neonatos -2 h Nº de réplicas por concentración 5

Nº de concentraciones más control 6

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Organismos totales por concentración 50

Alimentación No requiere

Agua de dilución Destilada (J.T. Baker

Tiempo de exposición 48 h

Respuesta letal Mortalidad, inmovilidad

Pruebas de toxicidad crónica.

Se desarrollaron estas pruebas de acuerdo al protocolo de Snell & Moffat 13 con el rotífero dulceacuícola B. calyciflorus, evaluando como parámetro la inhibición de la reproducción o tasa intrínseca de incremento natural “r”. Realizando ligeras modificaciones para el rotífero marino B. ibericus. Estas pruebas iniciaron colocando 5 neonatos por poza (cinco réplicas) en placas nuevas de 24 pozas de poliestireno (Costar, Co.). Al igual que en las pruebas anteriores, se consideró un control negativo, un control solvente, y las concentraciones del rango de toxicidad para lindano (1.0, 2.0, 3.0, 4.0, y 5.0 mg/l) y diazinon (0.1, 1.0, 5.0, 10.0 y 25.0 mg/l); respectivamente. Solamente al inicio del experimento, se añadió como alimento el alga Nannochloropsis oculata obteniendo una concentración de 1 X 106 cel/ml por poza. La exposición de los rotíferos fue por 48 horas al pesticida en un volumen total de prueba de 2 ml, al 15 ‰ de salinidad, a 25 ± 2° C en una incubadora marca ARSA en la oscuridad. Registrando a las 48 horas el número total de individuos para cada tratamiento. Posteriormente, los datos se analizaron obteniendo la tasa intrínseca de incremento natural “r” mediante la siguiente ecuación: r = (ln Nt – ln No)/t, donde: r = tasa instantánea de crecimiento, Nt = número de individuos en 2 días, No = número inicial de individuos al inicio, ln = logaritmo natural, y t = tiempo en 2 días.

Cuadro 2. Condiciones de prueba de toxicidad crónica.

Factor Condición Temperatura 25 ± 2 ºC Fotoperíodo Oscuridad pH Salinidad 8.2–8.4 15 ‰ Volumen de exposición 2 ml

Edad de organismos prueba Neonatos - 2h

Nº de réplicas por concentración 5 Nº de concentraciones más control 6 Organismos totales por concentración 10

Renovación de solución test Ninguna

Alimentación N .oculata (1 X 106 cel/ml)

Agua de dilución Destilada (J.T. Baker)

Tiempo de exposición 48 h

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Análisis de resultados.

Los resultados de las pruebas letales se analizaron mediante el análisis Probit de los datos usando el programa de computación DL50 (S.B.I.-I.R.C.T. Montpellier, Fevrier, 1987), obteniendo los valores de CL50 (Concentración letal donde el 50 % de los individuos expuestos muere). Así mismo, se realizaron pruebas de Xi2 para validar la linealidad de la regresión (p < 0.05). También, los resultados obtenidos de las pruebas letales y crónicas se analizaron utilizando el paquete STATISTICA 7.0 StatSoft, Inc. (1984-2004); mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), así como la comparación entre tratamientos con la prueba de Tukey para estimar los valores de CNOE (Concentración donde No se observa un Efecto significativo), y CMOE (Concentración Mínima donde se Observa un Efecto significativo). La determinación del grado de correlación (R2) entre las variables se llevo a cabo el análisis de regresión lineal simple. Al igual que para las pruebas reproductivas para estimar el valor de CE50 (Concentración Efectiva en el 50 % de los individuos expuestos),

3. Resultados

Cuadro 3. Resultados de las pruebas de toxicidad agudas y crónicas (reproductivas) a 48 horas con el rotífero marino Brachionus ibericus expuesto a los pesticidas lindano y diazinon.

Pruebas letales 48-h Pruebas crónicas 2-d

Parámetro CL50 CNOE CMOE EC50 CNOE CMOE

Lindano mg/l 4.82 2.0 3.0 5.15 3.0 4.0 LC (3.52 – 6.59) (2.44 – 7.86) CV (%) 134,81 24.34 R2 0.9693 0.7057 Diazinon mg/l 27.27 10.0 25.0 37.18 5.0 10.0 LC (18.17 – 40.94) (12.2 – 62.15) CV (%) 79.92 13.96 R2 0.7928 0.7515

Abreviaciones: CL50 = concentración letal donde el 50% de los individuos expuestos muertos. EC50 = Concentración efectiva donde el 50% de la reducción en la reproducción es observada. CNOE = Concentración donde No se Observa un Efecto significativo. CMOE= Concentración Mínima donde se Observa un Efecto Significativo. LC = Limites de Confianza. CV = Coeficiente de Variación. R2= Coeficiente de correlación entre las variables.

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Figura 1. Comparación de los valores de CL50 y EC50 obtenidos para el rotífero marino

B. ibericus al estar expuesto a los plaguicidas lindano y diazinon.

0 10 20 30 40

Lindano Diazinon Lindano Diazinon

4.82 CL50

27.27 CL50

5.15 EC50

37.18 EC50 Pruebas de toxicidad agudas y crónicas en B. ibericus

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Figura 2. Gráficas que muestran el efecto de los dos pesticidas evaluados a distintas concentraciones en el rotífero marino B. ibericus. En pruebas agudas, mostrando la dinámica en el porcentaje de mortalidad en lindano (a) y diazinon (b); así como en la disminución de la reproducción en lindano (c) y diazinon (d).

4. Discusiones

Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que el rotífero marino Brachionus

ibericus, tiene mayor sensibilidad al lindano (4.82 mg/l) que al diazinon (27.27 mg/l),

teniendo mayor sensibilidad las pruebas crónicas que las letales, probablemente por la presencia de la microalga N. oculata utilizada como alimento. Asimismo, al comparar nuestros valores de CL50 a 48 h obtenidos para lindano con otras especies de rotíferos se observan diferencias en la sensibilidad. Donde para lindano a 24 h, el rotífero marino B.

plicatilis tiene un valor de 33.9 mg/l, mientras que para el rotífero dulceacuícola B. calyciflorus muestra un valor de 22.5 mg/l (Ferrando and Andreu-Moliner 1991) 11. Mientras que para el diazinon los valores obtenidos de CL50 a 48 h con B. ibericus son muy similares a los valores de CL50 reportados a 24-h con Brachionus plicatilis (26.9 – 28 mg/l) 6,7, y Brachionus calyciflorus (29.2 mg/l) 16.

En las pruebas crónicas, los valores obtenidos de CE50 a 48 h que estiman la inhibición en el potencial reproductivo o tasa de incremento natural “r” para B. ibericus expuesto a lindano (5.15mg/l) muestran mayor sensibilidad para B. calyciflorus a 5 h (8.5 mg/l) donde estiman la tasa de ingestión 17. Mientras que en B. ibericus los valores de CL50 a 48 h para diazinon (37.18 mg/l) es menos sensible que B. calyciflorus (11 mg/l) 13. Sugiriendo que B. ibericus es buen candidato para evaluar cualquiera de los dos pesticidas usados. Por otro lado, al comparar los valores de CL50 y CE50 para lindano obtenidos con

B. ibericus usado en este estudio muestran que es menos sensible que otras especies como Daphnia magna a 48 h (485 µg/l), Lepomis macrochirus (30 µg/l); Palaemonetes pugio

(4.4 µg/l); Cyprinodon variegatus (104 µg/l), y a 96 h Lagodon romboides (30µg/l) 3,4. No obstante, probablemente estas pruebas no son las más apropiadas para evaluar con rotíferos la toxicidad de pesticidas organofosforados 18 como el diazinon y organoclorados como el lindano con respecto a otros organismos, a pesar de su relevancia ecológica y sensibilidad. Sin embargo, es conveniente considerarlos para monitorear la presencia de contaminantes en ecosistemas acuáticos.

5. Conclusiones

El rotífero marino Brachionus ibericus usado en este estudio tiene mayor sensibilidad al lindano que al diazinon. Los valores de CL50 a 48 h obtenidos para lindano con B. ibericus muestra mayor sensibilidad que los rotíferos B. plicatilis y B. calyciflorus. Mientras que los valores de CL50 con diazinon son muy similares. Sin embargo al comparar la sensibilidad de B.ibericus para lindano no supera otras especies. Posiblemente, los rotíferos no son los

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organismos adecuados para monitorear pesticidas a pesar de sus ventajas como organismos de prueba. Sin embargo, pueden usarse para evaluar otro tipo de contaminantes.

Agradecimientos

La realización de este proyecto fue gracias al apoyo otorgado por el Sistema Nacional de Investigadores del Conacyt (Expedientes: 49351 y 45526).

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