Caracterización molecular de pacientes con diagnostico de Linfoma de
Burkitt
Anne Marie Senz1, María Mercedes Torres2, Adriana Plata3 Rafael Andrade4
1 Estudiante de Biología y Microbiología, con opción en Psicobiología, en la Universidad de los Andes. [email protected]; 2
Ph. D Profesora asociada de la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes. [email protected]; 3 Microbióloga.
Laboratorio de Biología Molecular, Fundación Santa Fe de Bogotá. [email protected]; 4 MD. Profesor clínico de la Facultad de
medicina de la Universidad de los Andes. [email protected].
Palabras clave:
Linfoma de Burkitt, Translocación c-Myc, Hibridación in Situ Fluorescente (FISH), virus de Epstein-Barr (EBV), Hibridación in Situ (ISH), Sonda “break apart”, micro-arreglos tisulares.
Resumen:
El linfoma de Burkitt (LB), es una neoplasia de célula B altamente agresiva, que representa el tercer tipo de cáncer más común en pacientes pediátricos. La característica molecular que lo define es la translocación entre el cromosoma 8, que contiene el oncogén MYC, y los cromosomas que contienen la información para las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas. Esta translocación es necesaria mas no suficiente para la transformación celular. Otro factor que contribuye muy probablemente al desarrollo de la neoplasia es la coinfección con el virus de Epstein Barr (EBV). Este virus, considerado como un carcinógeno clase I infecta cerca del 95% de la población mundial, y las circunstancias por las cuales en algunas personas contribuye al desarrollo de patologías como el LB es aun enigmática. En este estudio se analizan 48 biopsias de pacientes diagnosticados con LB desde el 2003 al 2013. Estas muestras se organizaron en micro-arreglos tisulares y se les practico una técnica de Hibridación in Situ Fluorescente (FISH), para identificar la translocación del oncogén Myc, y una Hibridación in Situ estandarizada para identificar coinfección con el virus de EBV. Los datos obtenidos fueron contrastados con variables demográficas donde se encontró una alta prevalencia en la coinfección con el virus de EBV, una positividad en la translocación del MYC del 83%; en el 48% no se obtuvo un resultado satisfactorio. Este último hallazgo es muy importante pues resalta la importancia del control de los factores preanaliticos en la preservación de los tejidos fijados en parafina a la luz de la utilización de las herramientas moleculares en el apoyo diagnóstico de muchos procesos neoplásicos y en la determinación de factores de valor pronóstico y predictivo. Por otro lado en este estudio se discute los valores de corte en le determinación de la positividad en los estudios de FISH dirigidos a la determinación de la presencia de translocaciones del oncogén c-Myc.
Introducción:
El linfoma de Burkitt (LB) es una neoplasia que afecta los linfocitos B maduros, generando células caracterizadas por ser monomórficas y de tamaño mediano, con núcleos redondeados y poco irregulares que presentan en el análisis histológico un patrón de crecimiento conocido como “cielo estrellado” que refleja la alta actividad proliferativa y la apoptosis celular (11). Corresponde al proceso neoplásico humano de más rápido
crecimiento y de mayor actividad proliferativa, duplicando sus células en un periodo de 24 a 48 horas (23), es una neoplasia altamente agresiva que puede llevar a la muerte de los pacientes si no se aplica un tratamiento rápido y adecuado. Estadísticamente hablando el LB es la tercera patología neoplásica más frecuente en población infantil (7). Conceptualmente se puede dividir en tres subtipos que comparten características morfológicas, inmunofenotípicas y genéticas pero difieren en su distribución, presentación clínica y epidemiologia (15). El primer subtipo corresponde al denominado “subtipo endémico” que esta casi restringido geográficamente a la zona ecuatorial de África y Nueva Guinea (24), el 95% de los pacientes presentan infección por el virus de Epstein Barr (EBV), clínicamente los tumores se desarrollan preferiblemente en la mandíbula, huesos faciales y orbita (11). El segundo subtipo es conocida como el subtipo “esporádico” ya que se presenta en una distribución global generalizada, en estos pacientes se ha reportado coinfección con el EBV en el 20%(3); los tumores de estos pacientes se desarrollan más frecuentemente en el abdomen, especialmente en la región ileocecal (24). Finalmente la OMS ha reconocido recientemente un subtipo asociada a pacientes con inmunodeficiencia, particularmente aquellos infectados con el virus de VIH; estas neoplasias frecuentemente están asociadas al virus EBV y se desarrollan a nivel ganglionar y extranodal (1).
El virus del Epstein Barr se ha clasificado como un carcinógeno clase I; sin embargo, su contribución exacta en el desarrollo del LB es aun enigmática. Este virus está ampliamente distribuido en la población general, un gran porcentaje de los individuos presentan infecciones latentes sin desarrollar la enfermedad. Este virus se ha relacionado con varias neoplasias que comprometen el tejido linfoide de diversos linajes así como neoplasias de origen epitelial, muy probablemente la infección de las células B contribuye al crecimiento y transformación linfoblastoide; esta transformación usualmente requiere de la expresión de al menos 6 de los genes virales que codifican para antígenos nucleares; sin embargo, en el LB hay expresión casi restringida a la proteína EBNA-1 y algunos RNA no codificantes conocidos en general como programa de expresión génica tipo I (19). Un porcentaje reducido de LB con infección EBV puede presentar el programa denominado “latencia restringida Wp” que implica la expresión un mayor numero de proteínas virales como el EBNA-3A, 3B y 3C además de RNAs y otros componentes (14). La contribución de esta expresión en la transformación celular está muy probablemente relacionada con la adquisición de propiedades anti apoptóticas, silenciamiento de promotores, y alteraciones en el funcionamiento de la enzima AID (Activation Induced Deaminase) durante la fase de hipermutación somática (16).
La característica molecular que identifica el LB es la translocación del oncogén c-Myc. En el 80% de los casos la translocación se sucede entre la región que codifica para la proteína myc (8q24) y la región correspondiente a las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (IgH) localizada en el cromosoma 14 en la banda q32(10). En el 20 % restante la translocación se lleva a cabo entre la región myc (8q24) y los cromosomas 2 y 22 que codifican para las cadenas livianas de las inmunoglobulinas Kappa y lambda (15). Estas translocaciones se atribuyen a la acción aberrante de la enzima AID quien normalmente está involucrada en la generación de anticuerpos por un mecanismo de hipermutación somática; y traen como consecuencia la sobreexpresión de la proteína myc, promoviendo un estimulo constante de proliferación y detención en la diferenciación celular.
Este estudio retrospectivo hace parte de un estudio que se realiza en el momento en pacientes pediátricos de 1 a 15 años con diagnóstico de LB tratados desde el 2003 al 2013 en el Hospital Fundación la Misericordia de Bogotá que analiza además de los aspectos mencionados, los hallazgos clínicos y fenotípicos de esta enfermedad.
Metodología:
1. Construcción de micro-arreglos tisulares
Se construyeron en el Departamento de Patología del Hospital Universitario de la Fundación Santa Fe de Bogotá un total de 9 micro-arreglos tisulares de 48 muestras de pacientes diagnosticados como LB. Se generaron mapas en Excel para los primeros 6 micro-arreglos de tal manera que el primero incluyera 17 pacientes y 3 controles negativos organizados en 5 columnas y 4 filas. El resto de los micro-arreglos se componían de 4 columnas y 3 filas cada uno con sus respectivos 3 controles. Los últimos 3 micro-arreglos se hicieron como repetición de algunas muestra de las que no se obtuvo resultado en los primero cortes, para estos también se generaron mapas en Excel y los primero dos tenían 4 columnas y 3 filas con 3 controles cada uno y el ultimo 3 columnas y 3 filas con 2 controles.
2. Corte de micro-arreglos de aproximadamente 3ųm realizado con un microtomo y fijación del tejido cortado en laminas cargadas positivamente. Se sacaron un total de 4 laminas por micro-arreglo, una de ellas para tinción con hematoxilina, una para el ensayo ISH (EBV), otra para el FISH (c-Myc) y por ultimo una de reserva en caso de cualquier eventualidad.
3. Hibridación in Situ (ISH)
Se implemento un protocolo estandarizado de ISH para detección de RNA no codificantes del virus de Epstein Barr mediante la utilización del equipo BenchMark GX de la compañía Ventana Medical Systems. La lectura de estas muestras se realizó en microscopio de luz donde células de tonalidad morada eran consideradas positivas y células de tonalidad rosa eran negativas (Imagen 2).
4. Hibridación in Situ Fluorescente (FISH)
Se implemento el protocolo descrito en el kit Pathvision que incluye Desparafinización, Pre-tratamiento, Digestión, Fijación, Desnaturalización, Hibridación, Post-hibridación y Contraste. Dentro del proceso de digestión se extendió el tiempo a 50 minutos para lograr la penetración optima de la sonda Vysis MYC Break Apart FISH Probe. La lectura de las laminas se realizo en microscopio de fluorescencia donde se compararon las señales visibles en el filtro triple, verde y rojo. Un caso positivo debía presentar mas del 5% de células con una señal verde suelta en un campo de 100 células en total (Imagen 1). Se tomo registro fotográfico de todas las muestras para corroborar el conteo y las laminas se conservaron en congelador a -20ºC.
Resultados:
De los 48 pacientes que se incluyeron en los micro-arreglos, dos se descartaron para el análisis de resultados puesto que el tejido se desprendió de la lámina. La información correspondiente a la translocación c-MYC y coinfección con virus de EBV para los 46 pacientes restantes se representa en la tabla 1. Todos los pacientes, 14 mujeres y 32 hombres tenían un diagnostico histológico confirmado de Linfoma de Burkitt con una edad media de 6 años (Rango: 1 -15 años). En 24 de las 46 muestras (52%) las pruebas para la detección de la translocación c-MYC dieron resultado satisfactorio; en el 35% no se obtuvo central centromérica y en el 13% no se obtuvo ninguna señal. En lo que respecta las pruebas para detección de EBV, se obtuvo resultados satisfactorios en 43 de 46 muestras (93%) en las 3 restantes muestras no se obtuvo señal
Tabla 1. Datos de translocación c-Myc e infección con EBV en pacientes con linfoma de Burkitt.
Abreviación: SSC, Sin Señal Centromerica; NT, No tejido.
Imagen1: Paciente 2136-13 con translocación positiva para c-Myc
Flechas rojas indican presencia de señal verde suelta.
Imagen 2. Resultado negativo y positivo respectivamente para prueba EBER
Numero de Pacientes Translocación c-Myc EBV
Mujeres Hombres Positivo 20 Positivo 29
14 13 Negativo 4 Negativo 14
SSC/NT 22 SSC/NT 3
TOTAL 46
400x 400x 400x
De las 43 muestras que se analizaron par la presencia del EBV, 29 fueron positivas (68%) La gran mayoría de las lesiones observadas se encontraron a nivel de la cavidad abdominal y en especial el sistema digestivo incluyendo la región ileocecal, retroperitoneo, epiplón y duodeno entre otras. En el 83.7% de ellas se demostró la presencia RNA no codificante del EBV. El segundo lugar en frecuencia correspondió a ganglios linfáticos y amígdala; en ellos el 11.6 % mostro presencia del EBV. Finalmente un paciente presento lesiones a nivel de mandíbula y otro a nivel de Sistema Nervioso Central mostrando la presencia del virus. (Grafica 1).
Grafica 1. Análisis sitio anatómico de lesión tumoral vs frecuencia de infección con EBV
Abreviatura: SNC, Sistema Nervioso Central.
Se demostró translocación del oncogén c-Myc en 20 muestras (83%). Con respecto a la relación entre la translocación del oncogén c-MYC y la infección con EBV (Grafica 2). Se observa que la mayoría de las muestras que presentan la translocación del oncogén son positivas para la presencia del EBV (62.5%). Hay un porcentaje de muestras que aunque Myc positivos no presentan infección con EBV (20.83%). Y aquellas muestras con resultado para re arreglo Myc negativo fueron positivos para EBV en el 12.5% de los casos y negativo para EBV en el 4.16%.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Abdomen y Sistema digestivo
Cuello/ Ganglios Mandíbula SNC 0.279
0.837
0.047 0.116
0.023 0.023
Positivo
Negativo Análisis sitio anatómico del tumor y presencia del virus
EBV
Sitio anatómico Frecuencia Relativa
Grafica 2. Relación entre translocación c-Myc e infección con EBV.
Grafica 3. Relación entre sitio anatómico del tumor y translocación c-Myc e infección con EBV
62.5
20.83
12.5
4.16
Myc (+) / EBV (+)
Myc (+) / EBV (-)
Myc (-) / EBV (+)
Myc (-) / EBV (-) Relación entre translocacion c-myc e infección con
Discusión:
Translocación del oncogén Myc:
Mas del 80% de las muestras que mostraron resultados con el FISH fueron positivas para la translocación de c-Myc. Esto es clave para entender la vía oncogénica del tumor.
La proteína Myc es un factor de transcripción tipo bHLH que esta relacionada con la activación y regulación de 10 al 15% de los genes humanos (24). Entre los procesos que regula se encuentra el crecimiento celular, síntesis proteica, angiogénesis, apoptosis y progresión del ciclo celular particularmente en el paso de G1 a S (15).
Cuando esta proteína esta haciendo las veces de activador génico forma un heterodímero con una molécula conocida como MAX (21). Este heterodímero puede unirse al ADN en regiones identificadas como cajas E, reclutando acetiltransferasas y proteínas remodeladoras de cromatina que activan la transcripción. Por otro lado la interacción entre el heterodímero y proteínas tipo MIZ- 1 y P300 contribuyendo al reclutamiento de DNA metiltransferasas que reprimen la transcripción (20).
Varios estudios de secuenciación han demostrado que la proteína MYC translocada en LB lleva consigo mutaciones puntales que también afectan el funcionamiento proteico. Algunas de ellas ocurren en la zona conocida como caja 1. En esta zona el residuo Thr58 es el que usualmente se fosforila para dar la señal al sistema de ubiquitinación que degrade la proteína. Una vez se muta este residuo el sistema no reconoce la proteína MYC aumentando su vida media. Este aumento en la vida media proteica de MYC induce la producción de ciclinas D y E que regulan la fosforilación de pRB e inhiben la función de p21 y p27 contribuyendo a la progresión en el ciclo celular (24). La señal apoptotica que podría ser generada por la presencia de proteína MYC se compensa con alteraciones y desregulaciones a nivel de mutaciones en p53 que ocurren en 30% de los casos de LB (24). O alteraciones en su regulador MDM2 e incluso en p14ARF que se encarga de estabilizar p53 por medio de la moderación de MDM2 (24).
En el 20% de las muestras que se obtuvo resultados satisfactorios de FISH no se identificó presencia de la translocación del oncogén c-Myc. Este hallazgo es importante pues todos los pacientes incluidos en el estudio tenían un diagnostico histológico compatible con el linfoma de Burkitt, y por tanto debían presentar la translocación; podría explicarse desde dos puntos de vista, el primero es que no se trate verdaderamente de Linfomas de Burkitt; durante los últimos años a partir de la ultima clasificación de la OMS para los linfomas publicada en el año 2008 se han definido criterios mas precisos para la clasificación de los de estos procesos neoplásicos, identificándose un grupo importante de pacientes tanto en la población adulta como infantil que comparten características entre el LB y el linfoma difuso de célula grande (LBDCG) , ambos corresponden a linfomas de células B maduras de alto grado y se confunden por tener características morfológicas o inmunofenotípicas similares. De hecho algunos autores consideran, que en la clasificación de los linfomas se debe considerar un área gris entre estas dos patologías y se han denominado como linfomas con características intermedias entre linfoma de Burkitt y Linfoma Difuso de Célula grande, categorizados actualmente en un grupo temporal pendiente de definirse en el futuro, algunos se asemejan al LB pero no portan la translocación MYC, otros semejan LBDCG y presentan translocaciones del oncogén c-Myc (10). Para caracterizar estas muestras que asemejan un Burkitt se requiere la aplicación de pruebas de expresión génica y marcadores
moleculares que incluyan CD38, GCET2 y expresión de NF-k β entre otras cosas (9)(12) para saber si corresponden a esta zona gris de clasificación, y por otro lado requieren la caracterización fenotípica con marcadores inmunohistoquímicos propios del LB como son CD20, Pax5, CD79a, CD10 y BCL6 y la ausencia de la expresión del bcl-2 (13).Esta situación se analizará dentro del proyecto mencionado anteriormente.
La segunda opción que podría explicar la ausencia de la translocación del c-Myc podría ser un factor mas relacionado con el aspecto analítico que tiene que ver mas precisamente con el puno de corte o “cut-off” utilizado para determinar la positividad por la metodología del FISH.
Para establecer este valor nos basamos tanto en los datos obtenidos en los controles negativos montados durante el desarrollo de las pruebas como controles usados en el laboratorio de Patología de la Fundación Santafé y los valores de referencia encontrados en la literatura.
Dentro de los controles negativos evaluados se tuvieron en cuenta cinco muestras de Riñón pertenecientes a los micro-arreglos montados. Además, cinco muestras de Amígdalas usadas como controles para pruebas FISH. En ambos casos se contaron al menos 7 campos de 100 células cada uno por muestra. El promedio de señales positivas encontradas en los campos esta entre 0 y 1, con excepción de una muestra de amígdala en la que se encontraron 2 señales positivas en un campo. Por otro lado en la literatura los valores encontrados para un protocolo FISH con una sonda “Break-apart” oscilan entre 4-5% (22) (17).
Es así como en el estudio se estableció un valor de cut-off del 5% como un valor adecuado y además conservador en tanto que se esta trabajando con muestras embebidas en parafina (3D) que al ser cortadas pasan a un plano de dos dimensiones en las que se puede dejar por fuera secciones del núcleo donde se contengan las secuencias diana deseadas (5); sin embargo, varios autores han sugerido que para determinar el “cut-off” se requiere el uso de cálculos estadísticos que pueden brindar mayor precisión como son el tratamiento Gausiano, la función inversa β (25) (6), e incluso la consideración del promedio de falsos positivos mas la desviación estándar (22). Existe entonces la posibilidad de que al aplicar estas funciones el valor del “cut-off” varié afectando la cantidad de muestras positivas y negativas para la translocación. Tentativamente hablando si se consideran los valores encontrados en los controles negativos como el punto de partida para determinar el “cut-off”, hablaríamos de que este valor seria correspondiente al 1%. En este caso todas las muestras que arrojaron resultado para la translocación c-Myc serian positivas y por tanto estarían de acuerdo con la clasificación histológica de que son Linfomas de Bukitt. Sin embargo confirmación con estudios de tipo inmunohistoquímicos son indispensables para confirmar esta aseveración y serán analizados en conjunto con el resto de la información.
Recientemente se han venido estudiando otras vías de alteración molecular que son características en los linfomas de Burkitt. Un ejemplo de estas son las mutaciones a nivel de ID3 y TCF3. La actividad incrementada de TCF3 conlleva a un aumento de PI3K que junto con el MYC contribuyen a la progresión y supervivencia de células tumorales (8). Valdría la pena evaluar estas alteraciones moleculares accesorias en estudios futuros para tener un entendimiento mas global sobre la red de alteraciones que conllevan al Linfoma de Burkitt.
Determinación de la presencia del Virus de Epstein Barr:
En cuanto a la infección con le virus de Epstein Barr es de resaltar que su contribución molecular a la patología del LB es aún enigmática. Se cree que la expresión de sus proteínas y RNA no codificantes, ya sea bajo la clasificación de expresión tipo I o de latencia contribuye con la resistencia a la apoptosis en las células infectadas por interacciones entre el EBNA-1 y la proteína SAP (16).
Esta infección es uno de los parámetros a considerar en la subclasificación de los LB. El linfoma tipo endémico, de distribución geográfica tropical en África y Nueva Guinea esta asociado al virus en el 95% de los casos (24). Particularmente este subtipo presenta un sitio de corte que se encuentra bastante alejado del gen MYC en el cromosoma 8, mientras que el corte en el cromosoma 14 es justo en la región VDJ de las inmunoglobulinas. Esto sugiere que la translocación podría estar pasando durante el re arreglo de VDJ que sufren las células B (10). Y de alguna forma podría estar relacionada con la presencia latente del virus. En el caso del linfoma tipo esporádico, el corte dentro del cromosoma 8 ocurre en el primer exón o intrón del gen MYC o en dirección 5’ del locus. Y en el locus de inmunoglobulinas ocurre en la región “switch” sugiriendo entonces que la translocación ocurre durante el “Class switch” de las inmunoglobulinas (10).
El sitio anatómico donde se presentan los tumores también pueden asociarse al subtipo de linfoma. Sin embargo no es un carácter excluyente. Por tanto se podría decir que en general los linfomas analizados en este estudio tienen una presentación predominante de tipo esporádico por presentarse principalmente a nivel de abdomen e intestino (Grafica 1) y (Grafica 3). Con la excepción del tumor localizado en mandíbula que al ser positivo para EBV correspondería con una localización típicamente asociada al subtipo endémico. Las muestras obtenidas a nivel de ganglios y cuello son extrañas. La asociación con ganglios en general se da en pacientes inmunocomprometidos o es mas bien una presentación extra focal del tumor particularmente en pacientes pediátricos. Por tanto no proporciona información sobre un subtipo tentativo. Por ultimo el paciente con infiltración tumoral en Sistema Nervioso Central corresponde a un estadio muy avanzado y no implica que este sea necesariamente el lugar de origen de la lesión. Es de resaltar que tanto la muestra correspondiente a mandíbula como la de SNC no obtuvieron resultado para la translocación del MYC probablemente por la antigüedad de la muestra entre otros factores discutidos mas adelante. Esta correlación clínica se expenderá con el análisis detallado de la información clínica y paraclínica recopilados en la base de datos.
De todas las muestras adecuadas para los estudios de FISH, la gran mayoría fueron positivas tanto para el MYC como para el EBER positivas (62.5%) y en general el 75% de las muestras con resultado para MYC ya sea positivo o negativo tenían secuencias del EBV con la técnica del EBER . Esto hallazgos concuerdan con la prevalencia de infección por parte del EBV en la población que incluso no presenta la patología (Grafica 2).
En el 47,8% de las muestras no se obtuvo adecuada hibridización para el c-Myc determinado por la ausencia de la señal centromérica indicativo de pobre preservación tisular.
Este alto porcentaje puede explicarse por varios factores asociados al procesamiento de los tejidos embebidos en parafina. A pesar de que los tejidos procesados en parafina son hasta ahora los mas usados en estudios retrospectivos el resultado obtenido depende mucho del
procesamiento de la muestra. Los procesos de fijación, deshidratación, inclusión y cortes indispensables en la preparación de este material introducen márgenes de error al alterar la arquitectura y enlaces intracelulares (4).
El proceso de fijación es indispensable pues evita la degeneración auto lítica de los tejidos, conservando así la estructura celular original. En el caso de estudios de FISH se prefiere el uso de formaldehido al 10% para la desnaturalización y fijación de las proteínas. Este reactivo hidratado interactúa con casi todos los enlaces químicos formando puentes metílicos entre las moléculas proteicas que son reversibles excepto en los casos de los aminoácidos aromáticos como la tirosina donde el cambio es permanente (4). La generación de estos puentes es la responsable de la conservación del tejido y la obtención de una buena tinción (18). Sin embargo este entrelazamiento proteico también dificulta la penetración de la sonda y por tanto la hibridación con el ADN. Es por esto que dentro del protocolo de FISH se incluye un pre-tratamiento y digestión que por medio de calor y un agente químico rompe la asociación entre ADN y proteínas y se eliminen los restos para permitir la penetración de la sonda (4). En el presente estudio se aumentaron los tiempos de digestión acorde con los protocolos internos del laboratorio para mejorar la obtención de señales de hibridación. Sin embargo un grupo importante de tejidos como se menciono, aunque fueron sometidos al mismo procedimiento mencionado, no mostraron señales de hibridización indicando que el tejido muy probablemente no se encontraba en optimas condiciones. Este hallazgo podría relacionarse directamente con la antigüedad de la muestra pues la mayoría de resultados sin señal correspondían a biopsias tomadas antes del 2009. Se reconoce que el tiempo de conservación optimo para muestras en parafina que se les pretende hacer un análisis de ADN es de 5 años o menos. Por otro lado el tiempo de conservación optimo para muestras que requieren ARN es de 1 año (2), lo cual es curioso porque en nuestro caso particular todas las muestras sometidas a análisis de ARN dieron resultado a pesar de llevar en parafina mas de 10 años. Es importante anotar al respecto, que la cantidad de ARN mensajero correspondiente al EBV es muy alto en las células infectadas y posiblemente a pesar del tiempo de fijación cantidades residuales intracelulares pueden detectarse con el tiempo.
Finalmente, otros factores que pueden afectar los tejidos para ensayos moleculares que deben tenerse en cuenta son: (i) el tiempo de fijación con formaldehido que no debe exceder las 24 horas para evitar la alteración del ADN, además la temperatura debe mantenerse en menos de 60ºC a lo largo del proceso de inclusión para evitar inactivación génica (4) y (ii) la calidad de los reactivo que también esta relacionada con problemas en la fijación que pueden traducirse en ausencia de resultados. Por otro lado se ha visto que tejidos sometidos a un tiempo de isquemia fria superior a una hora antes de la preservación pueden relacionarse con ausencia de señal en protocolos FISH (2).
Conclusiones:
Es claro que el Linfoma de Burkitt como la gran mayoría de tipos de cáncer esta compuesto por una red de alteraciones moleculares complejas. La característica principal de estas alteraciones es la translocación c-Myc, en este estudio se confirmo la translocación en el 83% de las muestras. El 17% restante cuyo resultado fue negativo abren la posibilidad de que las biopsias analizadas no sean realmente un LB o sea necesario un ajuste en el punto de corte de la prueba para su correcto diagnostico molecular.
En cuanto a la infección con el virus de EBV se encontró una alta prevalencia del mismo en la población de estudio. Estos resultados de re-arreglo en el MYC junto con los obtenidos sobre el virus proporcionan una idea sobre las desregulaciones moleculares de la patología, además permiten tener una representación tentativa sobre el subtipo de LB que se observa. Teniendo en cuenta estas características con la presencia de tumores en su mayoría abdominales se puede hablar de que los subtipos observados podrían ser de tipo esporádico. Sin embargo la alta prevalencia de infección con EBV no es muy común en estos subtipos. Esto sugiere que la infección en nuestra población ha de explicarse debido a otros cofactores aun desconocidos, posiblemente asociados a inmunosupresión en los niños por desnutrición.
Finalmente el alto porcentaje de muestras que no obtuvieron resultados ejemplifica la importancia de un buen tratamiento de las muestras embebidas en parafina para conservar el tejido viable para ensayos moleculares.
Perspectivas:
Es de resaltar que este es uno de los primeros estudios realizados sobre esta patología en Colombia, es importante continuar su complementación con investigaciones que analicen características inmunihistoquimicas además de otras vías moleculares que recientemente se han visto involucradas en el desarrollo de LB como es ID3/TCF3. Por otro lado seria interesante plantear un proyecto donde se identifique el punto de corte de las translocaciones para tener una idea mas precisa del subtipo observado.
Agradecimientos:
Fundación Santa Fe de Bogotá Laboratorio de Patología
Fundación Hospital la Misericordia Dra. Karen Galvis
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