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Laboratorio de Principios de Química Orgánica
Grupo 6
Cromatografía en capa fina.
Becerra Pedraza Mónica. Cárdenas Torres Laura.
Departamento de Química, Universidad Nacional de Colombia. Bogotá-Colombia.
Resumen
En ésta práctica de laboratorio se llevó a cabo la cromatografía de capa fina, mediante el uso de diferentes eluyentes con el fin de separar una muestra problema, indicando el solvente más apropiado para la separación de la misma.
Palabras claves: Eluyente, fase estacionaria, fase móvil.
1. Introducción
La principal utilidad de la cromatografía en capa fina consiste en seguir el curso de reacciones químicas y biológicas, realizar análisis cualitativo de pequeñas cantidades de muestra y determinar las condiciones para la cromatografía en columna a presión atmosférica y a alta presión. Son de uso distintos tipos de placas cromatográficas, existen aquellas que traen consigo indicadores de fluorescencia que permiten una mejor visualización de las manchas arrastradas por la fase móvil por medio de la ayuda de la luz ultravioleta. Existen también aquellas de resolución de silicagel de un tamaño de partícula especial que permite realizar separaciones delicadas sembrando poca cantidad de muestra y cuyo desarrollo sea de sólo 3 o 4 cm y existen también placas de fase reversa o invertida donde la fase móvil es más polar que la fase estacionaria. (Alicia & Arturo, 1998)
En la cromatografía de capa fina un solido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de capa sobre una placa de vidrio o polietileno, de forma que la fase móvil fluya a través de ella. Dependiendo de las propiedades que el solido en cuestión presente, la separación cromatografica será consecuencia de sucesos de partición, intercambio iónico, exclusión o absorción. El suceso de interés trabajado será el de absorción, donde el sorbente empelado retiene algunos de los constituyentes de la fase móvil al desplazarse por el mismo, las fuerzas intermoleculares involucradas son en su mayoría de Van Der Waals.
Cuando se trata de fijar la eficacia y la resolución de la cromatografía en capa fina, se suele hablar como en cualquier otro tipo, del equilibrio de distribución de las fases con respecto al soluto, regido por la constante o relación de distribución:
Sin embargo cuando se estudian las relaciones de espacio en este tipo de cromatografías debe tenerse en cuenta que la muestra analizada nunca abandona el sistema correspondiente, por lo cual estas relaciones son una función del desplazamiento. En capa fina se define el RF (factor de retraso), cuya definición hace
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referencia a una relación entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la velocidad de desplazamiento de la fase móvil.
A un tiempo dado, la expresión anterior se transforma en:
Dicho factor es el que caracteriza el comportamiento de un soluto en un sistema cromatografico de capa fina, y se vera afectado por las condiciones experimentales, como temperatura, fase móvil y estacionaria, entre otros.(Valcarcel Cases, 1988)
2. Procedimientos experimentales
En la práctica de laboratorio llevada a cabo, se trabajo en base a una fase estacionaria (silicagel) y tres fases móviles (Tolueno, Metanoly Éter de Petróleo) en cámaras cromatográficas independientes.
Inicialmente se llevaron las tres cámaras cromatográficas y las placas de vidrio a un horno que se mantuvo en una temperatura de alrededor 87 - 93ºC con el fin de eliminar toda la humedad que podría encontrarse presente en cada uno de ellos y con esto asegurar una cromatografía de tipo adsorción resorción mediante la activación de las placas de sílicagel. En éste proceso es inevitable eliminar toda la humedad existente en las placas puesto que como es conocido, se pueden formar sales hidratas y para eliminar dicha humedad acumulada en éstos sitios se hace necesario llegar hasta el punto de ebullición de dichas sales y de éste modo liberar éstas últimas moléculas de agua.
En cada cámara se dispusieron dos placas las cuales estaban conformadas por: la primera de ellas constaba de una aplicación de la muestra problema y una aplicación de dos patrones diferentes (las tres manchas se ubicaron equidistantes entre sí y a una distancia de 1cm de la base de la placa como lo indica la Figura 2). Los patrones que se trabajaron fueron: Amarillo de Sudán, m-nitroanilina, rojo de metilo y sudan amarillo.
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Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento experimental
3. Cálculos y Resultados
Figura 2. Fotografía de los resultados obtenidos en las seis láminas cromatográficas, todas las distancias están en
centímetros. M= Muestra, P1:Rojo de metilo, P2:Sudan III, P3: m-nitroanilina, P4: Sudan Amarillo.
Organizar los solventes en orden de polaridad
Elegir tres de ellos, (asignados)
Llenar tres cámaras con 1,0 cm del solvente
correspondiente
Sembrar tres placas con los tres patrones correspondientes y la
muestra
Introducir una placa en cada cámara Permitir el ascenso del
solvente Retirar la placa de la cámara, cuando el solvente
este aproximadamente a 1,0cm del borde superior
de la placa Determinar las distancias desde el punto de siembra
hasta el puntofinal
Determinar frente del solvente
Escoger la mejor combinación de solventes
para realizar una nueva separación
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Tabla 1. Distancia recorrida por cada solvente (todas las distancias están en centímetros), datos ilustrados en la Figura 2.
Tabla 2. Medida de la velociddad para cada patrón con cada uno de los eluyentes.
Rf Éter Tolueno Metanol
Rojo de metilo 0 0 0.854 Sudan III 0 0.44 0.909 m-nitroanilina 0 0.214 0 Sudan Amarillo 0.02 0.357 0.877
Tabla 3. Medidas de velocidad expresadas como Rst.
Rst Éter Tolueno Metanol
Rojo de metilo 0 0 1,17 Sudan III 0 1,14 1,1 m-nitroanilina 0 1,66 0 Sudan Amarillo 1 1 1,1 Solvente Patrón
Éter de petróleo Tolueno Metanol
Rojo de Metilo 0 0 4.7 Sudan III 0 2.2 5 m- nitroanilina 0 1.5 0 Sudan Amarillo 0.1 2.5 5 Muestra 0.1 2.5 5.5 Frente Solvente 5 7 5.7
5 Muestra de cálculo
Para el patrón 2 (Sudán III) con tolueno como eluyente se tiene:
4. Análisis de resultados
La cromatografía en capa fina es un método muy efectivo para la determinación de los componentes que tiene una sustancia desconocida; la efectividad de este procedimiento depende directamente de la polaridad o apolaridad de la muestra y del eluyente que se utiliza, ya que esta operación se basa únicamente en las fuerzas intermoleculares existentes entre dichas sustancias.
Durante la práctica se utilizaron tres eluyentes, cada uno con características diferentes, por lo tanto es importante analizar el efecto de cada uno de ellos:
En una primera cámara la cual contenía éter de petróleo como eluyente presento desplazamiento tanto para la muestra como para el patrón 4. Lo cual indica que el éter de petróleo presenta una polaridad menor respecto a los patrones y la muestra al punto de no permitir el desplazamiento.
La segunda cámara, la cual contenía tolueno como eluyente, presento desplazamiento tanto de la muestra, como de los patrones 2,3 y 4. En la figura 2 se observa que el desplazamiento esta aproximadamente a la mitad de la placa, lo cual representa que la muestra y los patrones tienen una polaridad menor con el tolueno en comparación con el desplazamiento en la placa con etér de petróleo. En la Figura 2 se observa que el patrón 2 se desplazo a una distancia de 2.2cm desde su aplicación, a esta misma altura se observa una mancha nítida roja de la muestra. El patrón 3 recorrió una distancia de 1.5cm, la muestra presenta una coloración amarilla a esta altura, por lo cual se puede concluir que estos dos patrones están presentes en la muestra.
El patrón 4 tuvo un desplazamiento de 2.5cm con una coloración naranja, pero al comparar con el desplazamiento de la muestra a esta misma distancia se puede notar que a esta altura se encuentra la mancha roja correspondiente a la identificación del patrón 2 por eso se concluye que los patrones 1 y 4 no se encuentran presentes en la muestra.
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En la última cámara, la cual contenía metanol como eluyente, se observó un mayor desplazamiento tanto de la muestra como de los patrones, esto evidencia una mayor polaridad del metanol siendo este más afín respecto a la muestra y los patrones. Siendo así esta diferencia mucho menor en comparación con el tolueno, lo que permite que haya un gran desplazamiento a través de la placa.
Para este ensayo el patrón 1 tuvo un desplazamiento de 4.7cm, el patrón 2 un desplazamiento de 5cm al igual que para el patrón 4. A partir de la figura 2 se concluye que para este eluyente se encuentran presentes en la muestra los patrones 2 y 4.
Las valores calculados de velocidad para las placas con el eluyente tolueno son mucho menores que los valores para las placas con metanol como eluyente, lo cual ratifica el análisis presentado con anterioridad, en el cual se explica la influencia de la polaridad en cada uno de los ensayos. A menor Rf la sustancia queda más retenida en la fase estacionaria y a mayor Rf la sustancia no esta fuertemente unida con la fase estacionaria y es arrastrada por la fase móvil.
Para obtener un mejor resultado teniendo en cuenta la consideración que Rf debe encontrarse entre 0,2 y 0,8 se puede realizar una mezcla de eluyentes entre tolueno y metanol en una relación (1:1).
A partir de lo obtenido en las tres cámaras se evidenció que en la muestra se encontraban presentes tres patrones (P2,P3 y P4), lo cual no es consecuente con la información suministrada en el laboratorio ya que la muestra problema debía contener sólo dos patrones. Esto puede deberse a que la muestra se encontraba contaminada.
5. Conclusiones
Los patrones Sudán III y m-nitroanilina se encuentran presentes en la muestra.
La efectividad de la cromatografía en capa fina depende de la polaridad o apolaridad, tanto del eluyente que se utiliza, como de las muestras a analizar, ya que si el eluyente y los analitos son altamente polares, el eluyente al desplazarse en forma vertical “arrastraría” con él a los analitos y los dispondría a una misma distancia del punto de aplicación, con lo cual no se obtendría ningún resultado; si por el contrario el eluyente es apolar, y los analitos son polares, o viceversa, se atraerían mutuamente y los analitos no se desplazarían, teniendo en cuenta lo anterior, para realizar una buena cromatografía se debe equilibrar la polaridad del eluyente.
6. Cuestionario
Qué ocurre si al introducir la placa cromatográfica, el nivel del eluyente alcanza el sitio de aplicación de la mancha?
Si el eluyente alcanza el sitio de aplicación de la mancha, los componentes se disuelve, impidiéndose de esta forma la separación, ya que no se presentaría capilaridad y por consiguiente, no se llevaría a cabo el arrastre.
¿Cuál es el efecto de la polaridad en la cromatografía?
La polaridad en la cromatografía es muy importante, ya que de esta propiedad depende la velocidad de migración de las sustancias, por la relación entre la fase móvil y estas. Debido a esto, es necesario el
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establecimiento de series eluotrópicas que se encargan de clasificar los solventes teniendo en cuenta su polaridad, del menos al más polar. Los compuesto polares tienen afinidad con solventes polares, y los no polares con solventes no polares; del mismo modo aquellas sustancias que son menos afines a la fase móvil y presentan afinidad por la fase estacionaria se quedarán en el camino.
¿Cuáles son las consecuencias de una columna mal empacada?
La volatilidad es un parámetro de un gran número de sustancias analizadas por medio de procedimiento cromatográficos. Si la sustancias bajo análisis tiene una alta volatilidad, se dificultaría la adsorción en la fase móvil y por ende su ascenso por la placa. Adicionalmente, se podría presentar un ensanchamiento en la banda y por consiguiente baja resolución en la mancha, haciendo necesaria la determinación del número de platos teóricos de la placa y quizás aumentar dicho número.
¿Cuáles son las diferencias entre cromatografía de gases y líquidos?
La diferencia radica en que en la cromatografía de gases la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito, utiliza disolventes polares y la única función de este método es el transporte del analito por la columna, mientras que en la cromatografía de líquidos, la fase móvil es necesaria, participando en esta un solvente líquido que puede ser una sustancia pura o una mezcla de diferentes solventes caracterizando la velocidad de elución y la resolución de cada mancha para su análisis posterior.
Profundización sobre fluorescencia para sustancias incoloras.
Los indicadores para la luz ultravioleta permiten localizar algunos de los compuestos separados, evitando de ésta manera las reacciones de coloración que los altera químicamente.
Por lo anterior, existen placas que traen impregnadas un indicador de fluorescencia para facilitar la identificación de las muestras, de otro modo se haría necesario pasar la placa a una etapa de revelado que sustancialmente se hace bajo la influencia de la luz ultravioleta, para ello se puede utilizar una fase estacionaria que contenga un indicador de fluorescencia (F254 o F366) En los indicadores enunciados, el subíndice representa su longitud de onda de excitación. También podría accederse a la introducción de la placa en vapores de yodo o el rocío de launa solución de Agua – Ácido Sulfúrico.
El indicador que se adiciona a los sorbentes para que produzca una intensa fluorescencia cuando se exciten con luz U.V. de onda corta (234nm) es generalmente el silicato de zinc activado con magnesio, en una proporción del 2%. Los compuestos presentes en la placa que absorben esa longitud de onda contrastarán en forma de manchas oscuras sobre un fondo verde. De manera análoga, el indicador que permite el revelado con luz U.V. de longitud de onda larga (366nm) es generalmente fluoresceína sódica que emite una fluorescencia azul sobre la cual resaltarán las manchas oscuras, correspondientes a los compuestos que absorben a esa longitud de onda. También, pueden detectarse sustancias que no absorben a esas longitudes de onda porque se disminuye la fluorescencia en el sitio correspondiente, por ejemplo lípidos y esteroides saturados.(Torres de Young, 1994)
Parámetros de la Cromatografía líquida de alta eficiencia.
La cromatografía de alta eficiencia se fundamenta en impulsar mecánicamente el eluyente con ayuda de una bomba y de éste modo el procesó sucederá con una mayor velocidad a la presentada convencionalmente ya que en esencia, como el eluyente no asciende por capilaridad o no desciende por gravedad éste proceso se agiliza. [2]
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Éste tipo de cromatografía se lleva a cabo especialmente bajo las siguientes consideraciones: Alta sensibilidad, adaptación a determinaciones cuantitativas, separación de especies no volátiles, separación de especies termolábiles.
De igual manera, este tipo de cromatografía está basada en el descubrimiento de que las separaciones cromatográficas mejoran mucho si la fase estacionaria está formada por partículas esféricas de tamaño uniforme y muy pequeñas. El tamaño reducido de la partícula asegura tener una gran área superficial para adsorber mejor y una forma esférica permite un empacamiento estrecho y uniforme. En la práctica se suelen utilizar micro esferas recubiertas de sílice, de 10 a 25 de diámetro, preparadas especialmente. Sólo 15 g de estas micro esferas ocuparían una superficie igual a la de un campo de fútbol americano. Se requieren bombas de alta presión para hacer pasar el disolvente a través de una columna de cromatografía de alto rendimiento y se usan detectores electrónicos para monitorear la aparición de material eluído de la columna.(McCabe, 1991)
7. Bibliografía
Alicia, B. P., & Arturo, A. V. (1998). MÉTODOS EXPERIMENTALES DE LABORATORIO EN QUÍMICA ORGÁNICA. Washington: Eva V. Chesneau.
McCabe, W. L. (1991). Operaciones básicas en ingeniería química. Madrid: Mc Graw Hill. Torres de Young, S. (1994). Introducción a la cromatografía.
