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EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO in vitro DEL FRIJOL ARBUSTIVO (Phaseolus vulgaris) TOLERANTE AL ESTRÉS HÍDRICO MEDIANTE LA TÉCNICA DE
ORGANOGÉNESIS.
KAREN ANGARITA GUZMÁN
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA 2017
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EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO in vitro DEL FRIJOL ARBUSTIVO (Phaseolus vulgaris) TOLERANTE AL ESTRÉS HÍDRICO MEDIANTE LA TÉCNICA DE
ORGANOGÉNESIS.
KAREN ANGARITA GUZMÁN
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director
CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO Ing. MSc en Biotecnología Microbiana
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA 2017
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DEDICATORIA
A mi madre Nelly Guzmán por su entrega compromiso y dedicación; por entregarme todo de ella para poder triunfar; a mi hija Sara Sofía por ser mi fortaleza, mi motivación, el amor de mi vida y a Rafael por su apoyo incondicional y su constante amor.
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la vida, sabiduría y fortaleza en este camino de aprendizaje.
A mi mamá por darme la oportunidad de estudiar, por ser siempre mi apoyo, por sus palabras de aliento y por su infinito amor.
A mi hija por ser mi centro, mi motor y mi inspiración.
A mi familia en especial a mi abuela Elvira Díaz (QEPD) por ser mi compañera de vida, mi segunda madre y siempre estar presente en sus oraciones.
A mi Tutor Christian Chacín y María Cañas por guiarme en este proceso, gracias por sus enseñanzas, por hacerme parte de este proyecto por brindarme todo su apoyo y comprensión. Al SENA Tecnoparque por brindarnos el apoyo financiero para el desarrollo de este proyecto.
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TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS ... 7
LISTA DE TABLAS ... 9
1. INTRODUCCIÓN... 13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 15
3. JUSTIFICACIÓN ... 16 4. HIPÓTESIS ... 17 5. OBJETIVOS ... 18 6. MARCO TEÓRICO ... 19 7. MARCO REFERENCIAL ... 27 8. METODOLOGÍA ... 29 8.1 Localización de la investigación ... 29 8.3 Fases de la investigación ... 29
8.4.1.1 Obtención del material vegetal ... 29
8.4.1.2 Desinfección de los explantes (embriones de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris). ... 30
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ... 33
10. CONCLUSIONES... 43
11. RECOMENDACIONES ... 44
12. BIBLIOGRAFÍA ... 45
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desarrollo vegetativo y reproductivo del frijol arbustivo desde la siembra hasta la obtención del fruto maduro.. ... 19 Figura 2.Características morfológicas de frijol arbustivo. Entre ellas se encuentra la raíz (A); tallo (B); hojas (C) y estructuras internas de la semilla (D). ... 22 Figura 3. Porcentaje de contaminación de los embriones de frijol. ... 33 Figura Nº4. Porcentaje de oxidación de los explantes. ... 35 Figura Nº 5. Oxidación parcial de embriones. (A) Medio Ms al 100% de sales con carbón activado. (B) Transferencia de embriones con oxidación parcial a medio MS al 100% de sales libre de carbón activado. (C) Oxidación totales de embriones por prolongación de iluminación artificial... 35 Figura 6. Porcentaje de explantes prósperos de frijol. ... 36 Figura 7.Explantes prósperos luego de 3 semanas de siembra en el medio Ms al 100% de sales sin carbón activado. (A) Embriones con dos semanas de estudios, su estructura se encuentra en hinchadas. (B) Embriones con 3 semanas de siembra donde se puede observar formación de brotes de hojas. ... 37 Figura 8. Seguimiento de los explantes durante 9 semanas de estudio. Me1: Medio MS al 100% de sales + 100 uL de 6-BAP + 1000 uL de 2,4D. Me2: Medio MS al 100% de sales + 100 uL de 6-BAP + 1500 uL de 2,4D. Me3: eMedio MS al 100% de sales + 100 uL de 6-BAP + 2000 u uL de 2,4D. Me4: Medio MS al 100% de sales + 500 uL de BAP + 1500 uL de 2,4D. Me5: Medio MS al 100% de sales + 500 uL de 6-BAP + 2500 uL de 2,4D. ... 37 Figura 9.Evolución de inducción de callos para la fase multiplicación de Phaseolus vulgaris. (A) Embriones con 3 semanas de estudios, hinchados, color crema – verde; con brotes de hojas. (B) Inicio de inducción de formación de callos. (C) Masa amorfas de células callogénicas con 6 semanas de estudio. ... 40 Figura 10. Formación de raíces a partir de los diferentes tratamientos de multiplicación.. El medio que tuve mejor comportamiento fue el medio 6 y 7 con un 93,4% y 86,8 % respectivamente. ... 41 Figura 11. Formación de raíces a partir de callos de embriones de Phaseolus vulgaris. ... 42
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LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Formulación de medios de cultivos. (Quintero Jaimes, Espinosa Huerta , Acosta , Guzmán
Maldonado, & Mora Aviles , 2010) ... 52
Anexo 2. Análisis de varianza del porcentaje de contaminación. ... 53
Anexo 3. Análisis de varianza de la variable oxidación... 54
Anexo 4.Análisis de varianza de la variable prósperos. ... 55
Anexo 5. Seguimiento de formación de callos. ... 56
Anexo 6. Análisis de varianza de la variable formación de callos. ... 57
Anexo 7. Embriones en medio de cultivo MS al 100% de sales con carbón activado ... 58
Anexo 8. Diferencia de tamaños de callos de los medios Me4 y Me5. ... 59
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1.Componentes del tratamiento 1 de desinfección para explantes de frijol (Gómez Gutiérrez, 2014) ... 30 Tabla 2. Compuestos del tratamiento 2 de desinfección para explantes de frijol (Cárdenas Ávila, 2017) 30 Tabla 3. Compuestos del tratamiento 3 de desinfección para explantes de frijol (Martínez Castillo, 2014). ... 31 Tabla 4. Fórmula de los porcentajes de protocolos de desinfección (Braun & Zucari , 2014)... 31 Tabla 5. Descripción de las características del microorganismo contaminante en los explantes de
10 RESUMEN
Título: Evaluación del crecimiento in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis.
Autor: Karen Angarita Guzmán.
Palabras clave: Phaseolus vulgaris, frijol arbustivo, propagación in vitro, estrés hídrico. Descripción:
El frijol arbustivo en Colombia es de gran importancia en el sector agrícola y comercial (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007), por su gran contenido de proteinas y vitaminas como base nutricional de la población. Sin embargo se ha visto afectada su producción por malas prácticas agrícolas trayendo problemas fitosanitarios del cultivo en el departamento de Santander (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007).
El objetivo de este trabajo de investigación fue establecer la propagación in vitro de Phaseolus vulgaris tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis, por esta razón se seleccionó un protocolo de desinfección a partir de tres tratamientos con diferentes tipos de desinfectantes a distintas concentraciones y tiempos de exposición de los embriones.
Los resultados mostraron que el tratamiento T3 tuvo una mejor actividad de remoción de impurezas y eliminación de microorganismos (Solución jabonosa, Alcohol al 70%, Hipoclorito de sodio al 5% por un tiempo de 5 minutos), de la misma manera el medio de cultivo en el que se presentó una mayor formación de callos fue el medio MS modificado N°6 (con una diferencia significativa de p>0.005). Concluyendo así que el empleo de hormonas de regulación como AIA, 2,4D y 6-BAP en los medios de cultivo, indujo el proceso de la organogénesis indirecta en todas las
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concentraciones evaluadas, lográndose un 100% de formación en Me6 a concentraciones de 500 uL; 2000 uL 500 uL respectivamente.
12 ABSTRACT
Title: Evaluation of growth in vitro of bushy bean (Phaseolus vulgaris) tolerant to water stress by the technique of organogenesis.
Author: Karen Angarita Guzman
Key words: Phaseolus vulgaris, bean shrub, propagation in vitro hydric stress. Description:
The shrub-like beans in Colombia is of great importance in the agricultural and commercial sectors (Arias Restrepo, Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007), by its high content of proteins and vitamins as a nutritional basis for the population. However its production has been affected by poor agricultural practices bringing phytosanitary problems of culture in the Department of Santander (Arias Restrepo, Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007).
The objective of this research was to establish the propagation in vitro of Phaseolus vulgaris tolerant to water stress by the technique of organogenesis, for this reason was selected from three disinfection Protocol treatments with different types of disinfectants at different concentrations and times of exposure of embryos.
Results showed that T3 treatment had a best activity of removal of impurities and elimination of microorganisms (soapy, Alcohol), 70%, sodium hypochlorite 5% for a period of 5 minutes in the same way the culture medium in whicharose a more callus formation was the modified MS medium N ° 6 (with a significant difference p > 0.005). So in conclusion the use of hormones for regulation as AIA, 2, 4 d and 6-BAP in the culture media, induced the process of indirect organogenesis in all concentrations evaluated, achieving 100% Me6 training at concentrations of 500 uL; 2000 uL 500 uL respectively
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1. INTRODUCCIÓN.
El cultivo de frijol hace parte de las actividades primordiales de la economía de campesinos y empresarios agrícolas (cultivadores de frijol), siendo este generador de empleo e ingresos debido a que este producto hace parte de la alimentación básica de la población por sus nutrientes. (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007) .
El frijol, según la FAO se produce en 129 países. La mayor producción en el mundo se encuentra la India con un 16.4%, Myanmar con un 14.9 %; Brasil con un 13.1%. Estados Unidos y México con un 5.3% y por último China y Tanzania con un 4.1 % (Fidecomisos Institutivos en Relación con la Agricu, 2016). Colombia solo el 1.3% de la producción mundial (FENALCE, Federación nacional de cultivadores de cereales y leguminosas, 2016)
En Colombia, esta actividad agrícola la emplean alrededor de 120.000 productores teniendo una producción de 110.579 toneladas anuales; las cuales no alcanzan a abastecer la demanda interna del país (Fenalce, 2011). El departamento de Santander es el primer productor en Colombia con un 17,8% de producción; seguido del Huila (17.2%); Antioquia y Cundinamarca (16.3%); Tolima (12.6%); entre otros (FENALCE, Federación nacional de cultivadores de cereales y leguminosas, 2016). La producción de frijol se encuentra demarcada en 51 municipios departamentales en áreas agroecológicas de clima medio para fríjol arbustivo y clima frio para fríjol voluble. El 54% del área total de la producción de frijol arbustivo se encuentra en la provincia de Guanentá y comunera con 21 municipios entre los cuales se encuentra Barichara, Mogotes, San Gil, Socorro, Curití; seguido
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por la provincia de García Rovira aporta el 29.7% y un 16.3% la Provincia de Soto (Cárdenas Mateus, 2016).
Dada las características que presentan las zonas agroecológicas del departamento de Santander donde se encuentra el cultivo de fríjol arbustivo, se ha encontrado que las condiciones extremas de sequías han desarrollado en estos cultivos la capacidad de ser tolerantes al estrés hídrico.
Evidenciando la importancia económica de este cultivo en Santander, se desarrolló este proyecto con el fin de evaluar el crecimiento in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis.
Este trabajo aborda la siguiente información:
Un planteamiento del problema y pregunta de investigación, una justificación, hipótesis donde se enmarca la hipótesis nula y altera. Así mismo, objetivos, marco teórico, marco referencial y metodología para el desarrolló el proceso de investigación; resultados y discusión del cada uno de las fases, conclusiones, recomendaciones, bibliografía y anexos.
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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El frijol es un cultivo que requiere grandes volúmenes de agua durante su ciclo vegetativo, la demanda de agua dependerá de su fase de desarrollo, siendo el cultivo exigente en la fase de germinación y de diferenciación floral, fructificación y llenado del grano (Polón, Miranda, Lázaro, & Ramírez, 2013); gastándose alrededor de 500 mm3/ ciclo, debido a que la planta no es tolerante a su déficit ni a su exceso de este. (Cámara de Comercio de Bogotá, 2015).
Uno de los principales problemas que presenta el departamento de Santander, se basan en las altas radiaciones solares y ausentes precipitaciones de esta zona causando estrés hídrico; la cual ha traído como consecuencia alteraciones en el suelo como el agrietamiento en cultivos de frijol, toxicidad en las raíces por acumulación de aluminio, pH bajos, déficit de fijación de nitrógeno; entre otros(Cárdenas Mateus, 2016). Al estar sometido a estas condiciones climáticas, la planta
Phaseolus vulgaris, aumenta los problemas morfológicos y fisiológicos, tales como el retardo en
la floración, el crecimiento de hojas, la producción de las vainas, el desarrollo de tallos, y la altura de la planta, entre otros (Albino, Turret , Cortés , Livera, & Mendoza , 2015) trayendo con esto la baja calidad del fruto e impactando en el tiempo de desarrollo de la planta en un 15% (2semanas). Como consecuencia de esta problemática el cultivo de frijol arbustivo se ve impactado por presencia de patógenos debido a condiciones desfavorables para el desarrollo vegetativo de la planta.
Entre las plagas y enfermedades encontramos la antracnosis (95% de pérdida) y Conchuela de frijol (80% de pérdida). (Cámara de Comercio de Bogotá, 2015)
Pregunta Problema
¿Es posible la propagación in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico a partir de embriones mediante la técnica de organogénesis?
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3. JUSTIFICACIÓN
Observando esta situación, se realizó este trabajo de investigación con el fin de establecer la propagación in vitro de explantes de frijol arbustivo con capacidad de tolerancia al estrés hídrico, para la obtención de plantas libres de patógenos, a su vez la construcción de un banco de germoplasma de diferentes plántulas, ubicado en la Universidad de Santander- Laboratorio de tejidos vegetales de la mano con el SENA Bucaramanga, sirviendo de espacio para el almacenamiento y preservación de especies de interés industrial como es el frijol arbustivo, a su vez la realización de protocolos de desinfección óptimos en respuesta de ataque de patógenos.
Es importante mencionar que es la primera investigación in vitro en frijol arbustivo realizada en Santander la cual queda como referente para futuros estudios sobre este producto agrícola, el cual va de la mano con el programa departamental de desarrollo “Santander nos une”, que a su vez dará a los agricultores, tecnología e innovación en pro al mejoramiento de la producción agrícola y por último me ayudará a la obtención de mi título como microbióloga industrial.
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4. HIPÓTESIS 4.1 Hipótesis nula
No existen diferencias significativas en los tratamientos establecidos para la fase de establecimiento y multiplicación in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis.
4.2 Hipótesis alterna
Existen diferencias significativas en los tratamientos establecidos para la fase de establecimiento y multiplicación in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis.
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5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Evaluar el crecimiento in vitro del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante al estrés hídrico mediante la técnica de organogénesis.
5.2 Objetivos específicos
Seleccionar el proceso de desinfección de explantes de Phaseolus vulgaris con el fin de obtener explantes libres de contaminación.
Determinar la fase de establecimiento de los explantes para la inducción de callos
Phaseolus vulgaris.
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6. MARCO TEÓRICO
6.1 Fenología de frijol arbustivo.
Las etapas de desarrollo del frijol arbustivo se dividen en dos la fase vegetativa y la fase reproductiva. La primera permite que la semilla germine hasta el momento de aparecer los primeros botones florales. La fase reproductiva empieza desde la aparición racimos florales, terminando con los frutos maduros de frijol. (Fernández C., Gepts, & López , 1986).
Figura 1. Desarrollo vegetativo y reproductivo del frijol arbustivo desde la siembra hasta la obtención del fruto
maduro. Fuente: (Cámara de Comercio de Bogotá, 2015)
6.2 Taxonomía de Phaseolus vulgaris.
Su nombre se atribuye al investigador Linneo en 1753 (Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz, & Ulloa Rangel, 2011). El cultivo de frijol es considerado uno de los más antiguos, entre los primeros estudios arqueológicos se manifiesta que se descubrió hace unos 5000 años A.C; en México y Sudamérica (Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz, & Ulloa Rangel, 2011).
20 Reino: Plantae Subclase: Rosidae Orden: Rosales Familia: Leguminosa Subfamilia: Faboideae Tribu: Phaseoleae Subtribu: Phaseolinae Género: Phaseolus
Especie: Phaseolus vulgaris
Fuente: (Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz, & Ulloa Rangel, 2011).
6.3 Morfología del frijol arbustivo.
6.3.1 Raíz
Las raíces de la planta de frijol son de tipo fibrosa las cuales se puede evidenciar su presencia desde los primeros días de germinación ubicándose en la parte inferior del tallo; las raíces secundarias se pueden observar incluso desde el tercer día. Como se observa en la figura 3A el sistema radial es superficial el cual le proporciona un volumen mayor, por lo general la longitud de las raíces en la etapa de germinación es de 20 centímetros a profundidad del suelo(Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz, & Ulloa Rangel, 2011); algunas veces se pueden presentar nódulos por la presencia de microorganismos como Rhizobium sp ubicándose en la parte superior en presencia de raíces
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terciarias. (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007). Las diferentes estructuras y formas de la raíz dependen de condiciones endoclimáticas como suplencia de nutrientes, composición del suelo, radiación solar entre otros(Fernández C., Gepts, & López , 1986).
6.3.2 Tallo
El tallo que constituye la planta de frijol es herbáceo con secciones cilíndricas por la conformación de la epidermis. Su iniciación se da en la parte superior de la raíz, de forma ascendente se observa las diferentes ramificaciones para la formación de los nudos de los cotiledones para la formación de las hojas. Entre las coloraciones que esta estructura presenta se encuentra el verde, rosa o morado, respecto a la variedad. La altura del tallo es aproximadamente de 80 cm para Phaseolus
vulgaris (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007). (Ver figura 3B).
6.3.3 Hojas
En cuanto a la morfología de las hojas de la planta de frijol, se clasifican en dos: sencillas y en complejas o trifoliadas (Tres hojas). Las hojas simples se observan en las primeras etapas de germinación y se eliminan de la planta cuando está totalmente desarrollada o madura. Las complejas son las hojas características de la planta de frijol, las cuales tienen pecíolo y un raquis. En la inserción de las hojas trifoliadas hay un par de estípulas de forma triangular que siempre son visibles(Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007). (Ver figura 3C).
6.3.4 Semilla
Entre las formas más comunes de la semilla se encuentran cilíndrica, ovalada, redonda y arriñonada. Sus colores son diversos de acuerdo a la variedad; la gama de colores varía entre
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blanco, crema, amarillo, rojo café y morado. También se pueden encontrar semillas con combinaciones de colores en forma de manchas. Se compone de plúmula, cotiledón, hojas primarias, hipocotilo, radícula hilum y rafe (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007).
Figura 2.Características morfológicas de frijol arbustivo. Entre ellas se encuentra la raíz (A); tallo (B); hojas (C) y
estructuras internas de la semilla (D). Fuente: (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007)
6.4 Micropropagación
Villamizar en el 2005 mencionó en su trabajo de investigación que el significado de organogénesis siendo este:
“La organogénesis es un proceso morfológico y genético el cual se basa en la formación de un tejido vegetal primario unipolar a partir de una explante ya maduro. Los brotes como hojas, raíces o callos se puede presentar de dos maneras: por organogénesis directa u organogénesis indirecta para el caso de las estructuras callogénicas” (Villamizar Galvis, 2005)
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A partir de estos explantes se forman estructuras con capacidad totipotente generando una planta idéntica al tejido vegetal patrón.
6.4.1 Etapas de la micropropagación.
Las etapas para la propagación in vitro en tejidos vegetales son selección del explante, protocolo de desinfección, medios de cultivo, climatización y salida a campo, descritas a continuación:
6.4.1.1 Selección del explante
La selección del explante es el paso más importante para el éxito en la micropropagación debido que esta dependerá el cumplimiento del objetivo trazado, es decir, si no se realiza la selección del explante que se quiere propagar o no proviene de la misma planta que se desea trabajar, no se podrá analizar los resultados adecuadamente.
El explante debe encontrarse bajo condiciones fitosanitarias adecuadas sin ningún tipo de lesión epitelial, maltrato o enfermedad causada por patógenos (Mroginski, ., & Roca, 1991).
Los explantes utilizados para la propagación in vitro de plantas son embriones, meristemos, tallos, raíces, anteras, protoplastos, entre otros (Pérez Pérez, 2006)
6.4.1.2 Protocolo de desinfección
Los procesos de desinfección son seleccionados a partir del explante que se desea trabajar; existen productos asépticos que su mecanismo de acción puede comprometer algunas tejidos del explante; como la oxidación (Villamizar Galvis, 2005).
Existe varios compuestos químicos que son utilizados en tejidos vegetales en protocolos de desinfección, los más utilizados son Etanol al 70%, Hipoclorito de Sodio y Soluciones jabonosas. Entre los menos utilizados se encuentran Cloruro de Mercurio al 1-1.5% o hipoclorito de Calcio 6- 12%, el nitrato de plata, peróxido de hidrógeno y por último el uso de tenso activos como el Tween
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80 o soluciones yodadas. Como complemento en el protocolo de desinfección, se adicionan diferentes antibióticos y anti fúngicos para garantizar la asepsia de los explantes durante el proceso de propagación (Mroginski, ., & Roca, 1991).
6.4.1.3 Medios de cultivo
La composición de los medios de cultivos para la propagación in vitro depende exclusivamente del objetivo trazado y el tipo de planta se quiere trabajar, existen plantas que necesitan de otros requerimientos nutricionales adicionales para su micropropagación, como es el ejemplo de las plantas tipo leñosas o maderables (Torrescano De Labra, 2014).
Ente los componentes que debe tener un medio de cultivo se encuentra los macronutrientes (C, H, O, P, K, O, S, Ca y Mg); los micronutrientes (Zn, Cu, Mo, etc); las vitaminas y los reguladores de crecimiento. El medio de cultivo más utilizado es el medio basal MS (Murashige & Skoog), en el cual se puede trabajar con la mayoría de explantes, modificándose según su necesidad (Villamizar Galvis, 2005).
Torrescano (2014) en su trabajo investigativo, mencionó que dependiendo de la relación que exista entre auxinas y citoquinas en el medio y la planta, el tejido puede diferenciarse en raíces, brotes o la formación de callo, dando como resultado células desdiferenciales (Torrescano De Labra, 2014).
6.4.1.3.1 Reguladores de crecimiento
Los reguladores de crecimiento se pueden presentar de dos formas, naturales o sintéticas. Las auxinas son un grupo de hormonas que ayudan a la estimulación de la división celular (Mroginski, ., & Roca, 1991). Las auxinas más utilizadas son ANA, AIA, AIB, 2,4D. En el caso de las citoquinas la Kinetina, 6-BAP y Zeatina son utilizadas para romper la dominancia apical y
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estimular la brotación de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas. Las giberelinas por su parte son utilizadas para la estimulación fisiológica, algunas de ellas ayudan al alargamiento celular de una forma que normalmente no se observaría en un crecimiento de la planta tratada (Villamizar Galvis, 2005).
6.4.1.3.2 Vitaminas
Existen varias vitaminas utilizadas en procesos de micropropagación, entre las cuales la más utilizada es la vitamina C o ácido cítrico por su acción antioxidante en los explantes (Benítez Zequeira, 2006).
6.4.1.4 Climatización
La incubación se da luego de la siembra de los explantes, las plantas tiene fotoperiodos diferentes, los cuales se regulan en el laboratorio, algunos explantes utilizan siembre oscuridad o semioscuridad debido a que la luz artificial les causa oxidación en sus estructuras superficiales.
6.4.2 Aplicaciones del cultivo in vitro.
La técnica de cultivo vegetales, permite la conservación de las especies, sin ninguna modificación genética, a si vez el aumento de la reproducción de los cultivos y el rescate de especies en vía de extinción (Ramos Amaya, 2012).
Salazar 2010 mencionó algunas de las aplicaciones que se presentan en cultivos in vitro (Salazar, 2010).
Multiplicación de plantas de difícil propagación. Germinación.
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Clonación de individuos de características agronómicas especiales. Rescatar especies en vía de extinción.
Plantas libres de enfermedades
Producción de metabolitos secundarios. Estudios morfológicos y fisiológicos. Producción de haploides.
Plantas libres de patógenos. 6.5 Estrés hídrico
El agua es el recurso natural principal en los cultivos, el cual interviene en todas las etapas de desarrollo de las plantas. Cuando se presenta estrés hídrico en estas estructuras vegetales (tallos, hojas, raíces, frutos, entre otros) por la ausencia de las precipitaciones o por la coordinación en los riegos, comienza a observar respuestas de esta problemática en las plantas.
Las plantas demandan una cantidad de agua necesaria dependiendo de la etapa en la que se encuentra. Si se presenta en los primeros días de desarrollo puede afectar a la madurez de las vainas y el número de granos en estas (Miranda & Belmar, 1977), a su vez afecta el alargamiento y el tamaño final de las hojas, incrementa la senescencia foliar y la pérdida de follaje, trayendo como consecuencia la limitación de la intercepción de la energía solar como la tasa de fotosíntesis y finalmente la producción de materia seca en la planta (Nuñez Barrios, Ritchie, & Smucker, 1998). La marchitez en las hojas de las plantas de frijol también se presenta como consecuencia de la ausencia hídrica la cual no alcanza a llegar a estas partes superior de la planta (Kohashi Shibata, y otros, 2002).
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7. MARCO REFERENCIAL
En los últimos años la biotecnología vegetal ha sido de gran importancia para inducción de material vegetativo libre de patógenos y de alta calidad. Dichas investigaciones se han realizado en busca de respuesta a las necesidades de las personas según la planta que se evalúe, sin embargo se ha tratado de abarcar todas las posibilidades de respuesta por medio de la organogénesis directa e indirecta.
En la Universidad del Central de Cuba. El investigador Jorge Pérez (Pérez Pérez, 2006), realizó embriogénesis en embriones cigóticos germinados en plantas de Phaseolus acutifolicus utilizando la técnica de embriogénesis somática, estos resultados alcanzaron un 14% de rendimiento en medio sólido.
A su vez en esta misma universidad un grupo de investigadores a cargo de Lourdes García en el 2008, trabajaron Frijol (Phaseolus tepari) donde se evaluó la necesidad de inducir a los explantes en un pre tratamiento en medio líquido para así garantizar brotes apicales, encontrándose diferencias entre los tratamientos con el uso de TDZ.
En el 2010, Anareli Quintero, Elisa Acosta, Alberto Guzmán y Alejandra Mora, extrajeron embriones de diferentes variedades, se cultivaron en MS y GM con 6-BAP y adenina. El medio de cultivo 1 (GM) aumento la formación de yemas hasta un 100% del rendimiento, mientras que el medio de cultivo MS, solo logró un 93% de rendimiento en la regeneración completa de la planta. Tiempo después, en México, Matamoros, Jenaro; Martínez, David; Rueda, Rolando y Rodríguez, Tobías, en el 2014, demostraron que algunas condiciones en el invernadero, causaban estrés hídrico en los productos, mostrando consecuencias negativas en los tejidos externos; sin
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embrago en las estructuras reproductivas no se veía ningún cambio. Los tratamientos donde se utilizaron porcentajes altos de agua entre un 50 y 70% aumentaron el área foliar de los explantes.
Este mismo año, establecieron la regeneración de plantas por organogénesis directa con ejes embrionales en medio de cultivo MS con 100% de sales, suplementación con vitaminas y diferentes concentraciones de citoquininas (6-BAP). Cuando se aumentó la concentración de la citoquinina se redujo la formación de nudos. Este trabajo se realizó también en México, en Universidad Autónoma de Chipango por (Martínez Castillo, 2014).
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8. METODOLOGÍA
8.1 Localización de la investigación
Esta investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales ubicado en la Universidad de Santander, Campus Lagos del Cacique – Bucaramanga, Colombia.
8.2 Tipo de investigación: Investigación experimental.
8.3 Fases de la investigación
Para la ejecución del trabajo se establecieron 3 (tres) fases: Protocolo de desinfección
Formulación de medios de cultivo Multiplicación
8.4 Selección del proceso de desinfección de explantes de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris)
8.4.1.1 Obtención del material vegetal
Como material vegetal se trabajó con semillas de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris), la cual posee una capacidad de tolerancia al estrés hídrico. Dicha planta fue suministrada por el Centro Agroturístico del Sena ubicado en el municipio de San Gil con una altura de 1117 msnm y temperatura de 24°C, los cuales se encontraron sanos, sin ningún tipo de daño en el tejido y con alta calidad fitosanitaria. Estas semillas fueron transportadas al laboratorio de tejidos vegetales en bolsas Ziploc a una temperatura de 10°C y almacenadas en nevera hasta la obtención de los embriones.
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Los embriones de obtuvieron realizando una pre –desinfección a las semillas con alcohol al 90% en 30 segundos para evitar la oxidación externa, luego de esto se realizó un enjuague con agua destilada estéril; con un bisturí se realizó un incisión en la parte media de la semilla, para así liberar el embrión del frijol arbustivo.
8.4.1.2 Desinfección de los explantes (embriones de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris).
Se evaluaron tres tratamientos de desinfección, los cuales tenían unas sustancias químicas a diferentes concentraciones para determinar el mejor protocolo respecto a los resultados.
Tratamiento (T1):
Compuesto Tiempo(min)
Alcohol 70% 0.3
Hipoclorito de Sodio 5% 10
20 gotas de Tween 80 10
Tabla 1.Componentes del tratamiento 1 de desinfección para explantes de frijol (Gómez Gutiérrez, 2014)
Tratamiento (T2): Compuesto Tiempo(min) Alcohol 70% 1 100 ml de Hipoclorito de Sodio 5% + 3 gotas de Tween 80 2 Yodopolividona (Isodine) 5
31 Tratamiento (T3): Compuesto Tiempo(min) Solución jabonosa 3% 3 Alcohol al 70 % 3 Hipoclorito de Sodio 5% 5
Tabla 3. Compuestos del tratamiento 3 de desinfección para explantes de frijol (Martínez Castillo, 2014).
Nota: Se realizaron tres lavados de agua destilada estéril en cada paso del proceso con el fin de eliminar residuos de las soluciones desinfectantes.
Para determinar el mejor tratamiento de desinfección se establecieron tres variables de medición: Porcentaje de explantes prósperos, porcentaje de explantes oxidados y finalmente porcentaje de explantes contaminados. (Ver tabla 4).
Porcentaje de explantes oxidados (%E0)
%𝐸𝑂 =#Explantos Oxidados
#𝐸𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗ 100
Porcentaje de explantes contaminados (%EC)
%𝐸𝐶 =#Explantos contaminados
#𝐸𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗ 100
Porcentaje de explantes sanos o prósperos (%ES).
%𝐸𝑆 = #Explantos sanos #𝐸𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠∗ 10
Tabla 4. Fórmula de los porcentajes de protocolos de desinfección (Braun & Zucari , 2014)
8.4.1.3 Determinación de la fase de establecimiento
Para esta fase, se establecieron cinco (5) medios de cultivo (ME1, ME2, ME3, ME4, ME5) los cuales se le proporcionaron diferentes concentraciones de soluciones propias, estos medios fueron formulados por el laboratorio de tejidos vegetales a partir del medio basal MS (Murashige y Skoog
32
1969) (Ver anexo 1). La siembra de los embriones se realizó bajo condiciones de asepsia empleando una cámara de flujo laminar y fueron llevados al área de incubación en condiciones de luz artificial proporcionado por lámparas fluorescentes con fotoperiodos de 16 horas luz a una temperatura de 21 ± 2 °C y una humedad relativa promedio de 46 %. A partir de este medio se midió el tiempo y la formación de callos a partir de la siguiente formula:
𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑜𝑠 =N° de formación de callos
N° total de explantes 𝑥 100
(Braun & Zucari , 2014)
8.4.1.4 Fase de multiplicación
Para la fase de multiplicación se utilizaron los callos formados de los embriones que tuvieran un diámetro de 1 -1.5 centímetros. Se utilizaron medios siete (7) de cultivos los cuales se describen en el anexo N°1. Estos medios se le adicionaron unos reguladores de crecimiento con el fin de establecer las óptimas condiciones para la fase de multiplicación. Todos los explantes fueron esterilizados en autoclave durante 15 minutos a 121º de temperatura. Luego de esto se sembraron y llevados al cuarto de incubación con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad.
En esta fase se midieron la formación de raíces. 8.4.2 Análisis estadístico.
El estudio se realizó un diseño estadístico completamente al azar donde cada tratamiento se realizó por triplicado, para un total de 15 unidades experimentales por cada tratamiento. Se realizó un análisis estadístico posterior sobre las variables medidas, a partir de un ANOVA. Para la comparación de resultados se utilizó el método múltiple Tukey.
33
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
De acuerdo a la metodología desarrollada se generaron los siguientes resultados.
9.1 Selección del proceso de desinfección de explantes de Phaseolus vulgaris.
Figura 3. Porcentaje de contaminación de los embriones de frijol.
De acuerdo a la figura Nº 3, se presentan diferencias significativas entre los tratamientos (p<0.05), donde se evidencia que el tratamiento T3 obtuvo un 7,6% de explantes contaminados en comparación con los tratamientos T1 con 60,4% y T2 73.6%.
Es posible que la combinación de los compuestos como el caso del tratamiento T2 dieran una respuesta negativa al no lograr combatir todos los microorganismos presentes, por parte del tiempo de exposición tanto en los dos primeros tratamientos no fueron lo suficiente para que no presentaran contaminación. 60,4 73,6 7,6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 PO R CE N TA JE DE CO N TA MIN A CIÓ N TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN
34
El tratamiento 3, posee en sus componentes solución jabonosa, la cual es el compuesto diferenciador en relación con el tratamiento N°1 y N°2. Este compuesto está conformado por diferentes compuestos tenso activos biodegradables, siendo el Alquilbenceno sulfonado el compuesto de mayor proporción (20%) (Dersa Ltda, 2017)
El mecanismo de acción de Alquilbenceno sulfonado es de carácter anfipático: el grupo SO3– ionizado, tiene carga negativa dándole solubilidad en agua, mientras la cadena hidrocarbonada (alquílica) se encarga de la insolubilidad del compuesto. Al mezclarse estos compuestos, disminuyen la tensión superficial del embrión y favorece la desinfección del material vegetal, por medio del mecanismo de formación de micelas (Del Valle Esparza, 2006).
De acuerdo a la contaminación presentada en los embriones del frijol arbustivo, el microorganismo prevalente en esta primera fase fue de tipo fúngico, presuntivamente Penicillum
spp (Figura 3). Las estructuras representativas del microorganismo se observan en la tabla 5, las
características macroscópicas y microscópicas pertenecientes al hongo ascomiceto Penicillum spp.
Descripción macroscópica Descripción microscópica
Colonia redonda, aterciopeladas, elevada, color verde-gris con borde diferenciado color blanco, plegada (Antioquía, 2016).
Conidióforos rectos, hialinos, con fialides que nacen sobre métulas. Conidias producidas en cadena, de forma esférica, hialinas de pared delgada.
Tabla 5. (A) Descripción de las características del microorganismo contaminante en los explantes de Phaseolus
vulgaris. (B.) Tinción azul de lactofenol a 40X.
A
aA
B
35
Figura Nº4. Porcentaje de oxidación de los explantes.
De acuerdo a la figura Nº 4, se evidenciaron diferencias significativas entre los tratamientos (p< 0.05), donde el tratamiento Nº 3, presentó un porcentaje de oxidación del 1%, seguido por el tratamientoNº 1 con 47,2% y el tratamiento Nº 2 con un 60,4%; este resultado obtenido en el tratamiento N°3 es debido al uso del carbón activado reduciendo positivamente la formación de oxidación en el material vegetal por necrosis.
P
Figura Nº 5. Oxidación parcial de embriones. (A) Medio Ms al 100% de sales con carbón activado. (B)
Transferencia de embriones con oxidación parcial a medio MS al 100% de sales libre de carbón activado. (C) Oxidación totales de embriones por prolongación de iluminación artificial.
47,2 60,4 1 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 PO R CE N TA JE DE O XIDA CIÓ N TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN A B C
36
Este resultado coincide con el trabajo de investigación de Pedroza Manrique en el 2009, para el desarrollo de protocormos de Epidendrum elongatum Jacq, donde evidenció que el uso de carbón activado generaba un efecto inhibidor de la oxidación, debido a que al carbón podía absorber sustancias en los medios de cultivo que alteraran la capa superficial del material vegetal, como los radicales libres; también este autor manifestó que el carbón activado aumentaba formación de raíces geotrópicas, como se puede observar en figura N°5-A.
.
Figura 6. Porcentaje de explantes prósperos de frijol.
De acuerdo a la figura Nº 6, se evidencia una diferencia significativa entre los tratamientos (p<0,05), donde el tratamiento Nº 3, presentó un 93,4% de explantes prósperos, seguido por, el tratamiento Nº 1 con un 7,6% y el tratamiento Nº 2 con 34%. La coloración de los embriones prósperos se encontraba desde un color beige claro hasta llegar a café claro luego de 30 días de estudio en la primera fase de seguimientos de los explantes como se observa en la figura N°7.
7,6 34 93,4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 PO R CE N TA JE DE E XP LA N TE S P R Ó PE R O S TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN
37
Figura 7.Explantes prósperos luego de 3 semanas de siembra en el medio Ms al 100% de sales sin carbón activado.
(A) Embriones con dos semanas de estudios, su estructura se encuentra en hinchadas. (B) Embriones con 3 semanas de siembra donde se puede observar formación de brotes de hojas.
9.2 Fase de establecimiento de explantes de Phaseolus vulgaris.
Figura 8. Seguimiento de los explantes durante 9 semanas de estudio. Me1: Medio MS al 100% de sales + 100 uL
de 6-BAP + 1000 uL de 2,4D. Me2: Medio MS al 100% de sales + 100 uL de 6-BAP + 1500 uL de 2,4D. Me3: eMedio MS al 100% de sales + 100 uL de 6-BAP + 2000 u uL de 2,4D. Me4: Medio MS al 100% de sales + 500 uL
de 6-BAP + 1500 uL de 2,4D. Me5: Medio MS al 100% de sales + 500 uL de 6-BAP + 2500 uL de 2,4D. 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Semanas pr oc en ta je d e fo rmac ió n
Me1 Me2 Me3 Me4 Me5
38
En la figura 8, se evidencia los resultados de la variable tiempo de formación de los callos a partir de los embriones de fríjol (Phaseolus vulgaris) durante nueve (9) semanas.
En las dos primeras semanas se percibió un tiempo determinado de preparación de los explantes para la absorción de los nutrientes en el medio, a la tercera semana de seguimiento se observó el aumento de los embriones hasta un 40% de formación de estructuras callosas; a partir de la 5 semana se logró inferir cual era el medio MS N°5 modificado era el más óptimo en la inducción de callos con un 100%.
Es importante mencionar que en la semana 8 algunos embriones detuvieron su actividad, entrando en retroceso y disminuyendo el tamaño que ya habían adquirido por los suplementos; por el contrario, algunos de otros embriones aceleraron su proceso, induciendo callosidad en menos de una semana. Este fenómeno puede deberse a la técnica de extracción de los embriones debido a que se realizaron de manera húmeda el cual provocaba deslizamiento de las semillas y posibles lesiones en el tejido tierno de los embriones.
Las concentraciones ideales para la inducción de callosidad las proporcionaron los medios Me5 y Me4 con un 100 y 80 % respectivamente. Al aumentar las dosis de 6-BAP y 2,4D aumentaban el número de embriones hinchados. Esto puede estar asociado al aumento de la capacidad morfogenética o “rejuvenecimiento” que presentan ciertos tejidos, Sánchez et al en el 2004 en su investigación con Corylus avellana I, afirmó que los brotes de esta planta incrementaban de manera parcial o total en presencia de BAP (Sánchez Olate, Ríos, Rodríguez, Materán, & Pereira, 2004).
39 9.3 Fase de multiplicación.
A los embriones prósperos se les realizó una resiembra en 7 medios MS (Murashige y Skoog, 1969) suplementados con AIA, 2,4D y 6-BAP (M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7); las concentraciones de observan en la tabla N°1 del Anexo 1, con el fin de observar estructuras diferenciadas. Durante 3 semanas el callo aumento de tamaño de forma rápida, teniendo 7 a 10 veces más el volumen del explante.
En la figura 9, se observa la evolución de la fase de multiplicación en una relación 1:15, por callosidad presente, es decir por cada callo se formaban 15 estructuras diferenciadas más. Los callos tenían una coloración color caramelo en el principio del estudio con una capa de color beige, la cual se tornaba color marrón luego de 4 semanas de estudio (C). Los primeros brotes de los explantes a medida que transcurría el tiempo también lograba alcanzar la forma irregular de la masa.
Pérez en el 2006, expuso que la presencia de combinaciones entre suplementos como auxinas y/o citoquinas en los medios de cultivo, inducían a la formación de tejidos a partir del proceso de desdiferenciación, donde las células proliferan hasta tener como resultado una masa de explante irregular o amorfa.
Este fenómeno vegetal lo afirmó Artiaga en el 2012, donde menciona que las combinaciones óptimas de citoquinas y/o auxinas inducen de manera progresiva la formación de tejido callogénico en Moringa oleífera (Artiaga Suarez, 2012).
40
Figura 9.Evolución de inducción de callos para la fase multiplicación de Phaseolus vulgaris. (A) Embriones con 3
semanas de estudios, hinchados, color crema – verde; con brotes de hojas. (B) Inicio de inducción de formación de callos. (C) Masa amorfas de células callogénicas con 6 semanas de estudio.
En la etapa final del seguimiento se obtuvieron callos de coloración café claro, con sitios traslucidos y de consistencia acuosa (Figura 9), indicando características favorables para la morfogénesis, lo cual sugiere que las características de los callos son las que determinan su capacidad morfogénica (Cantliffe, 1993)
El análisis de varianza de los resultados de la formación de callos, arrojaron un valor de p>0,001, manifestando diferencias significativas la conformación de los medios con diferentes concentraciones de auxinas y citoquinas (Figura 10), Me6, fue el medio que le proporcionó las dosis óptimas para su desarrollo. No obstante (García R, y otros, 2008) manifestó que altas concentraciones de 6-BAP afectan a la diferenciación de los brotes en explantes de Phaseolus
vulgaris.
A B
41
El medio Me6 con concentraciones de 500 uL/L de 6-BAP, 2500 uL/L y 550 uL/L, presentó un 93,4% de formación de raíces, en un tiempo de 8 a 15 días, pero a diferencia de los demás tratamientos, este medio Me6, no presentó respuesta de contaminación ni oxidación (Figura 10). El comportamiento del Me4 y Me5, fueron similares en formación de raíces, (Anexo 9), teniendo un 60,4 % en su rendimiento con concentraciones de 1500 uL 2,4D/ 500 uL 6-BAP/ 300 uL y 1000 uL 2,4D/ 500 uL7400 uL; respectivamente.
Figura 10. Formación de raíces a partir de los diferentes tratamientos de multiplicación.
Entre los resultados de formación de raíces a partir de callos ya maduros (Coloración café- oscuro) se observa raíces en diferentes explantes con distintas longitudes desde 15 cm a 53 cm de largo (Ver anexo N° 9). Este resultado se puede observar en la figura N° 11 donde a partir de material callogénico brotaban de 2 a 3 raíces primarias de Phaseolus vulgaris.
7,6 27,4 73,6 60,4 60,4 93,4 86,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 PO R CE N TA JE DE F O R MA CIÓ N DE CA LL O S TRATAMIENTOS
42
Figura 11. Formación de raíces a partir de callos de embriones de Phaseolus vulgaris.
En consecuencia esta formación se evidencia por las altas concentraciones de auxinas que aumentan la formación de raíces, mientras que una baja concentración de la misma ayuda es a la formación de brotes de hojas en los explantes sembrados en los medios de cultivos anteriormente evaluados, esta teoría la expresa Cárdenas Hernández et al en el 2010, cuando utilizaron diferentes concentraciones de AIA y ácido giberélico en el desarrollo de raíces en injertos de caca (Theobroma cacao L) (Cárdenas Hernández , Álvarez Herrera , Barrangan , & Rivera, 2010).
43
10. CONCLUSIONES
Se logró evidenciar la capacidad morfogenética de explantes de Phaseolus vulgaris a partir de embriones somáticos, de un protocolo de propagación in vitro.
El tratamiento de desinfección que mostró mejor efecto sobre los explantes fue el número 3, el cual contenía solución jabonosa al 3%, alcohol al 70% e hipoclorito de sodio 5% con un tiempo de inmersión de 3 minutos los dos primeros componentes y 5 minutos el tercero respectivamente. En la fase de multiplicación se observó que el medio ME6, que contenía 0,5 mg/L de 6-BAP, 2,5 mg/L de 2,4D y 0,55 mg/L de AIA, generó una mayor respuesta en la maduración de los callos y así mismo, en la producción de raíces con un 93,4% con respecto a los tratamientos.
44
11. RECOMENDACIONES
Se sugiere aumentar las concentraciones o tiempos de exposición de los protocolos de desinfección T1 y T2 por la contaminación fúngica presentada.
Implementar otros reguladores de crecimiento a diferentes concentraciones para observación de germinación y brotación de hojas.
45
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52
Anexo 1.
Anexo 1. Formulación de medios de cultivos. (Quintero Jaimes, Espinosa Huerta , Acosta , Guzmán Maldonado, &
Mora Aviles , 2010)
Composición Fase de establecimiento Fase de multiplicación Me 1 Me 2 Me 3 Me 4 Me 5 Me 1 Me 2 Me 3 Me 4 Me 5 Me 6 Me 7 Solución A 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 3.3 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 3.3 mL 2.5 mL 3.3 mL 3.3 mL Solución B 1 mL 1 mL 1 mL 1.35 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1.35 mL 1.35 mL Solución C 280 uL 280 uL 280 uL 378 uL 280 uL 280 uL 280 uL 280 uL 280 uL 280 uL 378 uL 378 uL Solución D 100 uL 100 uL 100 uL 135 uL 100 uL 100 uL 100 uL 100 uL 100 uL 100 uL 135 uL 135 uL Solución E 1 mL 1 mL 1 mL 1.35 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1.35 mL 1.35 mL Azúcar 3 g 3 g 3 g 4.05 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 4.05 g 4.05 g Agar 1.5 g 1.5 g 1.5 g 2.02 g 1.5 g 1.5 g 1.5 g 1.5 g 1.5 g 1.5 g 2.02 g 2.02 g 6-BAP 500 uL 500 uL 500 uL 500 uL 500 uL 100 uL 100 uL 100 uL 500 uL 500 uL 500 uL 250uL 2.4 D 1000 uL 1500 uL 1000 uL 2000 uL 2500 uL- 1000 uL 2000 uL 2500 uL 1000 uL 1500 uL 2500 uL 2000 uL AIA 250 uL 300 uL 400 uL 500 uL 500 uL 300 uL 250 uL 450 uL 250 uL 300 uL 550 uL 500 uL Tiamina 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL 90 uL Amoxicilina 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g Orthocide 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g 0.08 g Carbón activado - - - - pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
53
Anexo 2.
54
Anexo 3.
55 Anexo 4.
56 Anexo 5.
Anexo 5. Seguimiento de formación de callos.
Semanas Tratamientos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Me1 0 0 0 0 1 1 2 2 2 Me2 0 1 1 1 1 1 2 1 2 Me3 0 1 1 1 3 1 3 3 4 Me4 0 1 4 4 7 10 10 10 12 Me5 0 2 7 7 11 12 15 15 15 Total 75 Embriones .
57 Anexo 6.
58 Anexo 7
59 Anexo 8
60 Anexo 9
