Fisiología bacteriana
Luis A. Merino Fisiología bacteriana
Las bacterias son capaces de realizar una serie de transformaciones químicas mediante reac-ciones enzimáticas que se traducen en síntesis de nuevos productos, transporte, movimiento y duplicación celular
Se considera crecimiento bacteriano al aumento ordenado de todos los componentes celula-res con el consiguiente aumento del número de células bacterianas, o sea que el celula-resultado final del crecimiento bacteriano es la duplicación celular.
El crecimiento bacteriano se inicia con la captación de nutrientes a partir del medio ambiente y los pasos intermedios entre la captación de nutrientes y la división celular constituyen el
meta-bolismo bacteriano. El metameta-bolismo bacteriano está compuesto de dos etapas: una de sínte-sis o Anabolismo y una de destrucción o Catabolismo.
Durante el anabolismo o fase anabólica las sustancias simples se convierten en sustancias complejas y durante el catabolismo o fase catabólica las sustancias complejas se convierten en sustancias simples.
El conocimiento de los requerimientos metabólicos y de las condiciones de crecimiento de las bacterias es útil para predecir la forma correcta de obtención, remisión y conservación de muestras clínicas, para seleccionar los medios de cultivo que se utilizarán en el diagnóstico y para estimar el tiempo necesario para que la bacteria alcance un número suficiente como para que su desarrollo se haga visible.
Nutrición bacteriana
Las bacterias deben obtener del medio ambiente los sustratos que serán utilizados para su crecimiento. Nutrición bacteriana es el proceso mediante el cual las bacterias captan nutrien-tes a partir del medio que las rodea. Dichos nutriennutrien-tes deben estar en solución, aún aquellos que son gaseosos. Si bien los constituyentes generales de las bacterias son muy similares, la capacidad de captación de nutrientes y de síntesis de nuevos productos es muy variable entre distintas especies bacterianas Todas las bacterias necesitan para desarrollar ciertos elementos básicos como ser C, P, S, N y agua.
Aunque muchas bacterias sólo requieren adicionalmente algunas moléculas simples para cre-cer (como ser aminoácidos y azúcares) y son consideradas nutricionalmente no exigentes (Pseudomonas, Escherichia, Staphylococcus), existen otras consideradas nutricionalmente
exigentes que requieren además compuestos más complejos como vitaminas y cofactores para
poder desarrollar (Haemophilus, Neisseria). Ciertas bacterias son incapaces de producir y al-macenar su propia energía por lo que deben tomarla a partir de la célula que se encuentran infectando y se denominan bacterias energéticamente exigentes (Chlamydias y Rickettsias). Los dos primeros grupos mencionados son capaces de desarrollar en medios fabricados artifi-cialmente en el laboratorio (in vitro) mientras que el último grupo sólo desarrolla en medios de cultivos que contengan células vivas.
Absorción de nutrientes
La encargada de la absorción selectiva de nutrientes es la membrana citoplasmática ya que la pared es porosa e impide solo el paso de elementos de gran tamaño insolubles o particulados.
A través de la membrana no sólo ingresan sustancias sino que muchas son eliminadas a través de ellas, tanto en procesos activos como pasivos.
Transporte a través de la membrana plasmática
La absorción de nutrientes se realiza a través de la membrana plasmática mediante los siguien-tes mecanismos de transporte:
Difusión pasiva: se produce por diferencia de concentraciones de los nutrientes entre el interior celular y el medio ambiente (glicerol, agua, O2, CO2)
Difusión facilitada: participan aquí ciertas proteínas de la membrana denominadas
permea-sas que permiten el paso de moléculas desde el exterior al interior celular (aminoácidos,
azúcares).
Transporte activo:. Este
mecanismo implica un gasto de energía y constituyen las
denominadas bombas de
transporte, por ejemplo
bombas de sodio, calcio, oxígeno, etc.
Translocación de grupo: impli-can que la sustancia que ingre-sa pierde un grupo químico en el exterior y gana otro en el in-terior celular, es decir existe una
alteración molecular (lípidos)
Captación de hierro: debi-do a la alta carga que posee el ión Fe3+, éste debe unirse primero a ciertas proteínas denominadas
sideróforos y recién así puede
ser introducida a la célula bacte-riana.
En la figura de la izquierda se presentan ejemplos de los mecanismos de transporte transmembrana mencionados.
Ciertas moléculas de gran tamaño deben ser previamente digeridas mediante enzimas que libera la bacteria (exoenzimas) para que recién puedan ser absorbidas las moléculas más pequeñas. Se mencionan ejemplos de moléculas de gran tamaño y las exoenzimas que las digieren: Almidón - amilasas, Proteínas - proteasas, ADN - Desoxirribonucleasas, Gelatina - gelatinasas, Lípidos - lipasas y fosfolipasas.
No todas las especies bacterianas son capaces de producir todas las exoenzimas, por lo que el estudio de la producción de algunas de ellas es útil en la identificación de los géneros y espe-cies.
Requerimientos de O2 y CO2
En función de los requerimientos de O2 y CO2, las bacterias pueden clasificarse en:
Bacterias aerobios estrictas: necesitan una concentración de alrededor del 21% de oxígeno para poder desarrollar. (Pseudomonas, Mycobacterium, Corynebacterium)
Bacterias microaerófilas: sólo necesitan alrededor de un 5% de oxígeno para desarrollar. Mayores concentraciones inhiben su desarrollo. (Campylobacter, Helicobacter)
Bacterias anaerobios obligadas o estrictas: son incapaces de sobrevivir en presencia de oxígeno, es decir requieren un 0% de oxígeno (Fusobacterium, Clostridium)
Bacterias anaerobias aerotolerantes: pueden sobrevivir, aunque no crecer, en presencia de hasta un 0,5% de oxígeno. (Actinomyces, Propionibacterium)
Bacterias anaerobias facultativas: son capaces de crecer en una atmósfera tanto con o sin oxígeno. (Streptococcus, Staphylococcus, Enterobacteriaceae)
Bacterias capnófilas: son bacterias aerobias que necesitan además para crecer un 5-10% de CO2. (Neisseria, Haemophilus)
Para estudiar en el laboratorio los requerimientos de oxígeno de las bacterias, se coloca la bac-teria en un medio de cultivo en un tubo profundo (Tubo 1) y se lo incuba durante 24 horas a 37ºC. Al cabo de ese tiempo se observa el sitio en el cual desarrolló la bacteria.
Si la bacteria desarrolló sólo en la superficie o sea en contacto con el oxígeno, la bacteria es aerobia estricta (Tubo A). Si en cambio sólo se verifica desarrollo en la profundidad del medio e cultivo, la bacteria es anaerobia estricta (Tubo B). Una bacteria microaerófila desarrollará a cier-ta discier-tancia de la superficie, donde la concentración de oxígeno es baja (Tubo C) y una bacteria anaerobia facultativa desarrollará en todo el volumen del medio de cultivo (Tubo D)
24 hs 37 ºC
Tubo 1 A B C D
Temperatura óptima de crecimiento
Las bacterias requieren diferentes temperaturas para desarrollar y sobrevivir. Esta característica es importante para comprender ciertas características patógenas de las bacteria, para entender sobre la forma en que las bacterias pueden transmitirse desde el medio ambiente al hombre y para mantener las muestras clínicas a la temperatura adecuada hasta su procesamiento en el laboratorio.
En base a su temperatura óptima de desarrollo y sobrevida, las bacterias se clasifican en:
Bacterias Psicrófilas: soportan bajas temperaturas, entre 0 - 20ºC (Pseudomonas, Listeria)
Bacterias Mesófilas: desarrollan mejor a temperaturas intermedias, entre 20 - 45ºC
(Staphy-lococcus, Streptococcus)
Bacterias Termófilas: son capaces de soportar altas temperaturas, de 55ºC o más (Bacterias no patógenas)
Bacterias Estenotérmicas, son mesófilas pero sólo desarrollan y sobreviven en rangos es-trechos de temperatura, entre 35 - 36ºC (Neisseria)
Bacterias Euritérmicas: son capaces de sobrevivir en amplios rangos de temperatura, entre 0- 44ºC. (Enterococcus)
Requerimientos de pH
La concentración de iones hidrógeno en el medio condiciona el crecimiento de las bacterias. En función de su capacidad para desarrollar a diferentes pH, las bacterias pueden clasificarse en:
Neutrófilas: entre 5,5 - 8,0 (Staphylococcus, enterobacterias)
Acidófilas: entre 0,0 - 5,5 (Lactobacillus)
Alcalófilas: entre 8,0 - 11,5 (Vibrio)
El conocimiento del pH óptimo para el desarrollo de las bacterias permite conocer los equilibrios y cambios posibles dentro de los diferentes ecosistemas bacterianos existentes en el organis-mo, ya que existen bacterias que se aseguran un ambiente ácido para impedir el desarrollo de bacterias neutrófilas y alcalófilas.
Obtención de energía
Para poder desempeñar los procesos metabólicos, las bacterias, como todos los seres vivos deben producir y almacenar energía para luego poder reutilizarla. Sólo el grupo mencionado más arriba (energéticamente exigentes) es incapaz de obtener energía por sí solos.
El proceso general de obtención y consumo de energía puede sintetizarse como sigue: Moléculas complejas
Degradación producción de Energía Metabolitos intermedios
Síntesis consumo de Energía Moléculas complejas
Para obtener energía, las bacterias pueden valerse de diferentes mecanismos:
A) Respiración aeróbica (Oxidación): Ocurre en presencia de oxígeno, es decir en aerobiosis. El sustrato es la glucosa u otro azúcar y el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular.
Glucosa + O2 CO2 + H2 O+ 38 ATP
La respiración aeróbica involucra los siguientes pasos: 1. Glucólisis
2. Decarboxilación oxidativa 3. Ciclo de Krebs
4. Transporte de electrones
Durante el proceso de forman productos tóxicos (O2- y H2 O2) que deben ser transformados
por la bacteria productora en O2 y agua mediante enzimas como la peroxidasa y la
superóxido-dismutasa.Este mecanismo es utilizado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
en aerobiosis.
B) Respiración anaeróbica: Ocurre en ausencia de oxígeno. El sustrato es la glucosa u otros azúcares y los aceptores finales de electrones son iones inorgánicos.
Glucosa + S CO2 + SH2 + 34 ATP
La respiración anaeróbica involucra los siguientes pasos: 1. Glucólisis
2. Decarboxilación oxidativa 3. Ciclo de Krebs
4. Transporte de electrones
Durante el proceso no se liberan productos tóxicos. Este mecanismo es utilizado por las bacte-rias anaerobias obligadas y las anaerobias facultativas en anaerobiosis.
C) Fermentación: es un proceso que ocurre en ausencia de oxígeno. El sustrato es la glucosa u otros azúcares y los aceptores finales de electrones son moléculas orgánicas.
Glucosa + NADH Piruvato + NAD+ + ATP
La fermentación involucra los siguientes pasos: 1. Glucólisis
2. Degradación del piruvato
3. Productos con alta energía: ácido láctico, propiónico, butírico, acético, alcohol etílico, etc.
Este mecanismo es utilizado por las bacterias anaerobias estrictas y anaerobias facultativas
en anaerobiosis.
Para estudiar el metabolismo energético de las bacterias, se siembran con la bacteria en estu-dio dos tubos conteniendo glucosa y un indicador de pH, uno de los cuales se cubre con vaseli-na líquida de manera tal de impedir que el medio de cultivo se ponga en contacto con el oxíge-no ambiental (Tubos 1 y 2). Luego de 24 hs. de incubación a 37 ºC se observa lo ocurrido en ambos tubos. Un cambio de color de verde a amarillo en el medio de cultivo indica que la
bacte-ria a desarrollado y utilizado la glucosa como fuente de energía, produciendo una acidificación del medio con el consiguiente cambio en el color del indicador de pH.
Si el cambio de color se evidencia en el medio expuesto al aire, significa que la bacteria utilizó la glucosa en presencia de oxígeno, es decir tubo lugar una oxidación (Tubo A) y la bacteria es
oxidadora. Si el cambio de color ocurre en el medio tapado con vaselina, la utilización de la
glucosa se realizó en ausencia de oxígeno, es decir ocurrió una fermentación (Tubo B) y la bac-teria es fermentadora. Si no se registra cambio en ninguno de los tubos, significa que la bacte-ria es no glucidolítica, es decir, no es capaz de utilizar la glucosa como fuente de energía.
24 hs a 37ºC
Tubos 1 y 2 A B C
Medios de Cultivo
Se denomina medio de cultivo al conjunto de sustancias que permiten el crecimiento de los microorganismos bajo determinadas condiciones de incubación (Tiempo, temperatura y oxíge-no). Éstos deben reunir los nutrientes mínimos indispensables para que las bacterias puedan sobrevivir y desarrollarse.
Los medios de cultivo cumplen un papel fundamental en el aislamiento de bacterias a partir de muestras clínicas y en la obtención de grandes cantidades de microorganismos para fabricar vacunas.
Los medios de cultivo pueden clasificarse según su consistencia, su composición y la finalidad de uso.
Según su consistencia
Medios líquidos, también denominados caldos
Medios sólidos, poseen una sustancia solidificante que generalmente es agar-agar, una sustancia que solidifica a temperatura ambiente y sólo sirve de soporte para los nutrientes. Al inicio de la Microbiología como ciencia sólo se podía obtener las bacterias en medios líquidos pero era muy difícil y a veces hasta imposible obtener en forma aislada dos bacterias que se encontraban juntas en una muestra. El desarrollo de medios de cultivos sólidos marca un hito importante dentro de la ciencia médica debido a que a partir de su aplicación en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas se ha podido recuperar a las bacterias en forma aislada para
poder realizarle las pruebas de identificación, sensibilidad a antimicrobianos e inoculación en animales (2º, 3º y 4º postulados de Koch)
Según su composición
Medios sintéticos o simples, poseen composición exactamente conocida, sólo contienen sustancias orgánicas e inorgánicas conocidas. Por ejemplo: agar glucosa, indicador de pH.
Medios complejos: poseen una composición que sólo se conoce en parte ya que algunos de los ingredientes posee una composición variable Por ejemplo: medios con sangre, suero equino, yema de huevo, extracto de carne, etc. También se denominan medios enriqueci-dos.
Según su finalidad
Medios para aislamiento primario: son medios sólidos que se usan para obtener bacterias aisladas a partir de una muestra clínica. Son ejemplos de medios de aislamiento primario los siguientes: Agar nutritivo, Agar sangre, Agar chocolate, Agar Eosina-Azul de Metileno (E.M.B.), Agar Salmonella-Shigella (S.S.), Agar Manitol Salado, etc.
Medios de enriquecimiento: son medios líquidos en los cuales se siembra inicialmente la muestra para aumentar el número de bacterias antes de ser subcultivado a un medio sólido. Son ejemplos de medios de enriquecimiento los siguientes: Caldo selenito, Caldo Cerebro-Corazón, Caldo Tioglicolato
Medios de identificación: son medios líquidos o sólidos que permiten estudiar alguna carac-terística metabólica de la bacteria como ser producción de enzimas. Son ejemplos de me-dios de identificación los siguientes: Agar triple azúcar hierro (TSI), Agar citrato, Agar urea, etc.
Según sus propiedades
Medios generales: Permiten el crecimiento de la mayoría de las bacterias presentes en la muestra. Por ejemplo: agar sangre, agar chocolate, agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo cerebro corazón.
Medios selectivos: Permiten el crecimiento de sólo determinado tipo de bacteria presente en la muestra, impidiendo el desarrollo de otras debido a que contienen sustancias (antibióti-cos, colorantes, sales, etc.) que inhiben el desarrollo de ciertas bacterias. Por ejemplo: agar manitol salado (alta concentración de ClNa), Agar Thayer-Martin (presencia de antibióticos), agar EMB (contiene eosina y azul de metileno que inhiben a las bacterias grampositivas), etc.
Medios diferenciales: Poseen sustancias que permiten diferenciar entre grupos bacterianos según determinadas características biológicas (hemólisis, fermentación de azúcares, preci-pitación de sales, etc) y permiten realizar una identificación presuntiva inicial de las bacte-rias presentes en la muestra. Son ejemplos: agar sangre (hemólisis), agar EMB (fermenta-ción de lactosa), etc.
Aislamiento primario
Una vez obtenida la muestra clínica, para realizar el diagnóstico etiológico de la enfermedad infecciosa, o sea, para aislar al agente causal de la misma, es necesario sembrar (inocular) la muestra en medios de cultivo sólidos (y eventualmente líquidos si se desea realizar un enrique-cimiento previo) (Ver figura inferior)
Muestras clínicas
Medios de cultivo Sólido Líquido
El objetivo de este paso es obtener colonias bacterianas aisladas. Se denomina colonia al conjunto de bacterias que provienen de una misma célula madre y en los medios de cultivo apa-recen como acúmulos de miles de bacterias que pueden observarse a simple vista. Las colonias aisladas se obtienen diseminando la muestra sobre la superficie del agar con ayuda de un ansa bacteriológica. Las figuras siguientes muestran un esquema de cómo se disemina la muestra sobre la superficie del agar y una fotografía de colonias aisladas sobre una placa de agar EMB luego de 24 horas de incubación a 37ºC.
Final de la siembra Inicio de la siembra Incubar 24 hs a 37ºC Duplicación bacteriana
En organismos multicelulares la multiplicación celular se traduce en aumento del tamaño del individuo pero en organismos unicelulares el crecimiento se traduce en aumento del número de individuos. La duplicación bacteriana se produce por fisión binaria en la que la división del ADN y la división celular se llevan a cabo simultáneamente.
El tiempo necesario para que se observen las colonias en un medio de cultivo adecuado y bajo condiciones de temperatura y atmósfera correctas dependerá del tiempo de duplicación celu-lar de la bacteria en estudio. En la figura siguiente se esquematiza un proceso de duplicación bacteriano.
A continuación se presentan ejemplos de tiempos de división y del tiempo mínimo que debe esperarse para observar colonias en los medios de cultivo.
Escherichia coli - División: 20 minutos - Colonias: 24 horas
Clostridium botulinum - División: 35 minutos - Colonias: 48 horas
Mycobacterium tuberculosis - División: 12 horas - Colonias: 30 días
Cinética del crecimiento bacteriano
Debido a que las bacterias se duplican en cada generación, la población bacteriana a través del tiempo aumentará en forma exponencial de 2.
Si se presenta el número de bacterias en función del tiempo, tendremos una curva exponencial pero si representáramos el ciclo vital de un grupo de bacterias tendríamos cuatro fases (Ver figura siguiente): Nú mer o de bacterias Tiempo
1
2
3
4
1. Fase de latencia: las bacterias se adaptan al medio en el que se encuentran, en este perío-do el número de células no varía. El tiempo de adaptación es variable para las diferentes
bacterias. En esta etapa, por ejemplo, las esporas bacterianas se transforman en células vegetativas.
2. Fase exponencial: es aquí donde se inicia la multiplicación bacteriana, el número de
bacte-rias aumenta exponencialmente y es aquí donde se liberan las enzimas y toxinas. 3. Fase estacionaria: llega un momento en que existe una competencia por los nutrientes ya
que estos van disminuyendo en su concentración y las bacterias dejan de crecer. En este período las bacterias esporuladas comienzan a esporular. Algunas bacterias mueren pero otras se dividen por lo que el número de células se mantiene sin variaciones. 4. Fase de muerte: el número de bacterias comienza a disminuir debido a que las bacterias
que mueren supera al número de bacterias que se dividen.
En la práctica, este modelo de crecimiento bacteriano nos sirve para conocer cuánto tiempo deberá ser incubado un medio de cultivo con el objeto de que las bacterias en estudio siempre se encuentren en la fase de crecimiento exponencial, ya que es allí cuando se manifiestan
