El objetivo del presente trabajo fue proporcionar información acerca del mecanismo de

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RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue proporcionar información acerca del mecanismo de relajación de la Rosuvastatina en anillos de arteria aorta torácica. Con este fin se realizaron curvas concentración respuesta a Rosuvastatina en anillos (previamente contraídos con fenilefrina) en ausencia y presencia de L-NAME (inhibidor de la síntesis de oxido nítrico), indometacina (inhibidor de la ciclooxigenasa), clotrimazol (inhibidor de la síntesis del FHDE), tetraetilamonio (bloqueador inespecífico de canales de K), apamin (bloqueador de canales de K de baja conductancia), carbidotoxina (bloqueador de canales de K de alta conductancia), glibenclamida (bloqueador de canales de K sensibles al ATP) y mevalonato. Nuestros resultados indican que la relajación inducida por esta estatina, en anillos de aorta con endotelio, se inhibía de forma parcial con L-NAME, pero no era afectada por indometacina ni clotrimazol. El TEA también inhibió en forma parcial dicha relajación. La combinación de L-NAME y TEA inhibió en forma completa la relajación inducida por rosuvastatina. Por otra parte, el apamin o la carbidotoxina no modificaron el efecto relajante de esta estatina, pero al combinarse inhibieron parcialmente la relajación, por otro lado la glibenclamida no tuvo ningún efecto. En anillos aórticos sin endotelio la rosuvastatina también es capaz de inducir relajación pero el efecto es menor en comparación con la producida en anillos con endotelio, dicho efecto es parcialmente inhibido por L-NAME o TEA y completamente inhibido por la combinación de L-NAME y TEA. En anillos con y sin endotelio el mevalonato es capaz de inhibir el efecto de la rosuvastatina. En conclusión la relajación inducida por la rosuvastatina en aorta con endotelio es mediada parcialmente por oxido nítrico (descartando la posible participación de prostaglandinas y el FHDE) y en mayor medida por apertura de canales de K+ (principalmente del tipo baja y alta conductancia), en dicha relajación pudieran estar participando algunos isoprenoides involucrados en la

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vía de síntesis del colesterol. En anillos sin endotelio la relajación parece ser inducida por hiperpolarizar al músculo liso vascular, vía canales de potasio de alta y baja conductancia.

INTRODUCCIÓN

El endotelio participa de forma importante en la conservación de la homeostasis vascular mediante la secreción y liberación de diversas sustancias vasodilatadoras y vasocontráctiles, moléculas de adhesión y otra serie de sustancias biológicamente activas. Por este motivo, cuando existe una alteración en su estructura o función, el lecho vascular es incapaz de responder de forma fisiológica frente a los diferentes estímulos y condiciones que se producen en el organismo. La disfunción endotelial representa la pérdida de la capacidad del endotelio para modular el tono vascular y para inhibir los procesos de agregación plaquetaria, adherencia de neutrófilos y de proliferación celular. Además constituye un episodio temprano de la aterosclerosis que precede a la formación de la placa ateromatosa y se halla presente en individuos con factores de riesgo cardiovascular como la hipertensión arterial, la diabetes, la dislipidemia, etc. La evidente relación entre la disfunción endotelial y trastornos cardiovasculares, los cuales en conjunto constituyen las principales causas de muerte en el humano, explica el interés en identificar fármacos que sean capaces de estimular la actividad del endotelio vascular e idealmente corregir la disfunción endotelial. Dentro de ese grupo de fármacos pueden encontrarse las estatinas ya que algunos datos en la literatura sugieren que ejercen efecto benéfico sobre el endotelio vascular. Con la intención de aportar información adicional al respecto, se desarrollo el presente trabajo en el cual se pretende aportar información acerca de los efectos directos agudos de las rosuvastatina sobre el endotelio vascular.

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MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar con un peso entre 250 y 280 g (el correspondiente a una edad entre 12 y 16 semanas), las cuales fueron mantenidas en el bioterio de la Escuela Superior de Medicina, con un ciclo de luz/oscuridad de 12h/12h, con agua y alimento ad libitum.

Preparación de los anillos aórticos.

Después de sacrificar al animal por dislocación cervical, se extrajo la aorta torácica Inmediatamente después, se colocó en solución Krebs (ver composición adelante) y bajo oxigenación constante con carbógeno (5% CO2 y 95% O2) se eliminó el tejido conectivo circundante. Tomando como referencia el diafragma se separan los segmentos torácico y abdominal de la aorta y cada uno de ellos se corta en anillos de aproximadamente 5mm de ancho. A continuación se les retira el endotelio a los anillos, frotándolos sobre la punta de unas pinzas de disección, se montan en dos ganchos de acero inoxidable en forma de L y después se colocan en una cámara para órgano aislado de 10 ml que contiene solución Krebs, con la siguiente composición (en mM): NaCl 118, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 7H2O 1.2, CaCl2 2H2O 2.5, NaHCO3 25, dextrosa 11.7 y edetato disódico y cálcico 0.026. En todos los casos la solución se mantuvo constante a 37º C, pH 7.4 y burbujeada con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2. Uno de los ganchos que sostiene la preparación se fija al fondo de la cámara y el otro a un transductor de tensión modelo 1030 de UFI conectado a un modulo MP100 de Biopac Systems Inc. que convierte la señal analógica a digital para ser capturada y graficada en tiempo real a través de una computadora personal mediante el programa ACQKnowledge bajo ambiente Windows®. Esto permitió registrar los cambios de tensión en la preparación. A cada anillo se le da una tensión inicial de 2 gramos y se le deja estabilizar por dos

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horas antes de iniciar el experimento. Durante ese periodo se realizan las pruebas de viabilidad con fenilefrina (10-6 M) y se corroboró la ausencia de endotelio por la falta de respuesta relajante a acetilcolina (10-6 M).

Diseño Experimental

1. Para determinar si la Rosuvastatina tiene efecto relajante sobre anillos de aorta, se realizaron curvas concentración-respuesta a Rosuvastatina (10-9 a 10-5 M) en anillos torácicos con o sin endotelio, previamente contraídos con fenilefrina (10-6 M) o con KCl (80 mM).

2. Con el objeto de determinar el posible mecanismo de acción de la Rosuvastatina al inducir relajación en anillos con endotelio se realizaron curvas concentración-respuesta a Rosuvastatina en ausencia y presencia de L-NAME (10-5 M; inhibidor de la ONS), Indometacina (10-5 M; inhibidor de las ciclooxigenasas), Clotrimazol (10-5 M; inhibidor de la síntesis del FHDE) y TEA (10 mM; bloqueador de canales de potasio)

3. Para determinar el posible mecanismo de acción de la Rosuvastatina al inducir relajación en anillos sin endotelio se realizaron curvas concentración-respuesta a Rosuvastatina en ausencia y presencia de L-NAME (10-5 M; inhibidor de la ONS), TEA (10 mM; bloqueador de canales de potasio).

4. En el caso de que la evidencia indique que los canales de K participan en el efecto relajante de la estatina y con el objeto de determinar el tipo de canal involucrado se emplearán apamin (bloqueador de canales de K de baja conductancia), carbidotoxina (bloqueador de canales de K de alta conductancia) y glibenclamida (bloqueador de canales de K sensibles a ATP).

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5. Con la intención de determinar si en la relajación inducida por rosuvastatina pudieran estar participando algunos intermediarios isoprenoides involucrados con la síntesis de colesterol, se evaluó la capacidad del mevalonato (1 mM) de afectar dicha relajación en anillos con y sin endotelio.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos con rosuvastatina (10-9 a 10-5 M) en anillos torácicos con endotelio después de haber precontraído con fenilefrina (1 M) muestran que la estatina ocasiono relajación en forma dependiente de la concentración con una concentración inhibitoria 50 (CI50) de -6.17 M y un efecto máximo de 82.7 %. Bajo las mismas condiciones experimentales se aprecio que la rosuvastatina también relajó anillos aórticos sin endotelio pero las concentraciones requeridas fueron mayores (CI50 de -6.10 M) y el efecto máximo fue menor (47.17 %).

EVALUACION DE LA PARTICIPACION DE LOS FACTORES RELAJANTES ENDOTELIALES EN EL EFECTO DE LA ROSUVASTATINA.

En este sentido los resultados obtenidos con rosuvastatina en anillos torácicos con endotelio en ausencia y presencia del inhibidor de la síntesis de ON (L-NAME, 10 µM) produjo un desplazamiento significativo a la derecha (CI50 de rosuvastatina de -5.64 M), con reducción del efecto máximo (58.32 %). Por otra parte, ni el inhibidor de la síntesis de prostaglandinas (indometacina, 10 M) ni el inhibidor de la síntesis del FHDE (clotrimazol, 10 M) modificaron la relajación ocasiona por la rosuvastatina.

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EVALUACION DE LA PARTICIPACION DE PROSTAGLANDINAS, PRODUCTOS DEL CITOCROMO P450 Y DEL ON EN LA RELAJACION INDUCIDA POR ROSUVASTATINA EN ANILLOS SIN ENDOTELIO

De acuerdo con los resultados obtenidos con rosuvastatina en anillos torácicos sin endotelio en ausencia y presencia de L-NAME (10 µM) Se pudo observar que este compuesto inhibió parcialmente el efecto relajante de la estatina (CI50 de -5.04 M y de -4.62 M mientras que el Emax fue de 38.32 y de 20.35 %, antes y después del L-NAME, respectivamente). Por otra parte, ni la indometacina ni el clotrimazol (inhibidor del citocromo P450) fueron capaces de afectar la relajación por rosuvastatina.

DETERMINACION DE LA PARTICIPACION DE CANALES DE POTASIO EN LA RELAJACION INDUCIDA POR ROSUVASTATINA.

Para descartar la participación de canales de potasio en la relajación inducida por rosuvastatina se evaluó el efecto de ésta en anillos precontraídos con KCl. Adicionalmente, en anillos precontraídos con fenilefrina se determinó el efecto de la rosuvastatina en ausencia y presencia de tetraetilamonio (TEA 10 mM, bloqueador no selectivo de canales de potasio). Se pudo apreciar que en anillos precontraídos con KCl, la rosuvastatina no fue capaz de ocasionar relajación del vaso ya sea en presencia o en ausencia de endotelio. Por otra parte, el TEA bloqueó en forma significativa pero no completa la relación inducida por rosuvastatina tanto en anillos con y sin endotelio. Adicionalmente se pudo apreciar que la administración simultánea de TEA y L-NAME (10 µM) condujo a un bloqueo total de la relajación ocasionada por rosuvastatina tanto en presencia como en ausencia del endotelio.

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EXPLORACION DEL TIPO DE CANAL DE POTASIO INVOLUCRADO EN LA RELAJACION INDUCIDA POR ROSUVASTATINA

La participación de canales de K sensibles a ATP en la relajación inducida por rosuvastatina se exploró utilizando glibenclamida. Se pudo apreciar que el pretratamiento con glibenclamida (1 µM) no modificó la relajación por rosuvastatina en anillos con endotelio. Por otra parte la participación de canales de K dependientes de Ca 2+

se valoró utilizando carbidotoxina (inhibidor de canales de K de alta conductancia) y apamin (canales de baja conductancia), ninguno de los dos (por separado) modifico la respuesta relajante a rosuvastatina. Sin embargo la combinación de estos dos compuestos modificó dicha relajación.

EVALUACIÓN DE LA PARTICIPACIÓN DE ISOPRENOIDES EN LA RESPUESTA A ROSUVASTATINA.

La participación de isoprenoides en la respuesta a la rosuvastatina se valoró empleando mevalonato (1mM). Se encontró que el mevalonato inhibió significativamente la relajación a rosuvastatina en anillos con y sin endotelio.

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