Electroforesis en Gel de Agarosa

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Diagnóstico

Diagnóstico Molecular Molecular Página Página 11

Resumen Resumen

La electroforesis consiste en la separación de moléculas a través de una matriz. La La electroforesis consiste en la separación de moléculas a través de una matriz. La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. Para el caso de los ácidos nucleicos, el acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. Para el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis.

electroforesis. Palabras claves:

Palabras claves: ADN, Bacteriófago Lambda, Red Gel, Gel Agarosa. TBE.ADN, Bacteriófago Lambda, Red Gel, Gel Agarosa. TBE.

Introducción Introducción

La electroforesis es un proceso que se La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en utiliza para separar macromoléculas en una solución. La electroforesis en gel de una solución. La electroforesis en gel de agarosa es el método más común y más agarosa es el método más común y más utilizado.

utilizado.

Una molécula de DNA cortada con Una molécula de DNA cortada con enzimas de restricción genera diferentes enzimas de restricción genera diferentes fragmentos.

fragmentos. Estos Estos pueden pueden ser ser separadosseparados en base a su tamaño utilizando un gel de en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis en agarosa.

electroforesis en agarosa. Existen

Existen algunos algunos otros otros tipos tipos dede electroforesis en gel de agarosa, pero la electroforesis en gel de agarosa, pero la electroforesis horizontal es el más electroforesis horizontal es el más utilizado para separar moléculas de utilizado para separar moléculas de ADN

ADN en en agarosa. Cuando agarosa. Cuando el el ADN ADN eses sometido a un campo eléctrico y sometido a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta.

neta. Hay Hay dos fuerzas de dos fuerzas de acción opuestaacción opuesta que determinan la velocidad de la que determinan la velocidad de la partícula.

partícula. Primero, Primero, la la fuerza fuerza eléctricaeléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. directamente proporcional a la carga.

Segundo, la fuerza de rozamiento se Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la depende del tamaño y la forma de la partícula.

partícula.

La tinción más conveniente y más La tinción más conveniente y más comúnmente usada para visualizar ADN comúnmente usada para visualizar ADN en geles de agarosa es la molécula en geles de agarosa es la molécula fluorescente bromuro de etidio, ésta fluorescente bromuro de etidio, ésta molécula plana se intercala en el ADN molécula plana se intercala en el ADN doble hebra entre las bases nitrogenadas doble hebra entre las bases nitrogenadas apiladas a través de fuerzas de van der apiladas a través de fuerzas de van der Waals.

Waals.

En la actualidad hay nuevas moléculas En la actualidad hay nuevas moléculas intercalantes fluorescentes que no tienen intercalantes fluorescentes que no tienen estos potenciales efectos tóxicos para el estos potenciales efectos tóxicos para el ser humano, entre ellos: SYBR Safe, ser humano, entre ellos: SYBR Safe, SYBR Gold, Red Gel, Green Gel. En SYBR Gold, Red Gel, Green Gel. En nuestro práctico utilizaremos Red Gel el nuestro práctico utilizaremos Red Gel el cual además de no ser mutagénico ni cual además de no ser mutagénico ni citotóxico es amigable con el medio citotóxico es amigable con el medio ambiente.

ambiente.

Las enzimas (ó endonucleasas) de Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con restricción son unas proteínas con

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Universidad

Universidad Santo

Santo Tomás

Tomás

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acción catalítica que tienen la propiedad acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha puntos donde se encuentre dicha secuencia. Este lugar de corte se secuencia. Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad particular en el ADN. En la actualidad hay una amplísima cantidad de enzimas hay una amplísima cantidad de enzimas de restricción y los usos destinados son de restricción y los usos destinados son varios.

varios.

Materiales y Métodos Materiales y Métodos

Muestra: Se utilizó muestras de ADN Muestra: Se utilizó muestras de ADN genómico

genómico y y ADN ADN del del fago fago lambda.lambda. - Micropipetas de 0,1-20ul, de 20-200ul - Micropipetas de 0,1-20ul, de 20-200ul y 200-1000ul.

y 200-1000ul.

- Puntas de micropipetas estériles. - Puntas de micropipetas estériles. - Tubos eppendorf.

- Tubos eppendorf.

-Cámara de electroforesis horizontal -Cámara de electroforesis horizontal -Peines para las bandejas

-Peines para las bandejas

-Bandeja para la preparación del gel -Bandeja para la preparación del gel -Fuente de poder -Fuente de poder -1 matraz de Erlenmeyer de 100ml -1 matraz de Erlenmeyer de 100ml estéril. estéril. -Guantes de látex -Guantes de látex -Guantes para calor -Guantes para calor Reactivos.

Reactivos.

- Bromuro de etidio - Bromuro de etidio

-Agarosa grado molecular -Agarosa grado molecular -TAE 1 X -TAE 1 X -Red gel -Red gel - BSA - BSA - EcoRI - EcoRI - Baffer de carga. - Baffer de carga.

- Buffer de reacción enzimática. - Buffer de reacción enzimática. -Agua Destilada

-Agua Destilada

Procedimiento: Procedimiento:

Reacción de digestión del fago Reacción de digestión del fago lambda y ADN genómico con la lambda y ADN genómico con la enzima EcoRI.

enzima EcoRI.

1. Se realizó los cálculos de las 1. Se realizó los cálculos de las cantidades que se requerían en cada cantidades que se requerían en cada caso.

caso.

2. Se marcó 3 tubos eppendorf con los 2. Se marcó 3 tubos eppendorf con los números 1 (control), 2 (ADN fago números 1 (control), 2 (ADN fago lambda) y 3 (ADN genómico)

lambda) y 3 (ADN genómico)

3. Se agregó al tubo 1, usado como 3. Se agregó al tubo 1, usado como control, 1

control, 1µµgr (2ul) de ADN del Fago, 2gr (2ul) de ADN del Fago, 2 µ

µl de buffer de reacción 10X y 15,8ul del de buffer de reacción 10X y 15,8ul de

agua destilada. agua destilada.

4. Al tubo 2 se agrego, 1

4. Al tubo 2 se agrego, 1 µµgr (2ul) degr (2ul) de

ADN del fago lambda, 2

ADN del fago lambda, 2 µµl de buffer del de buffer de

reacción 10X, 0,2ul de BSA y 15,3ul de reacción 10X, 0,2ul de BSA y 15,3ul de agua destilada.

agua destilada.

5. Al tubo 3 se agrego, 0,6

5. Al tubo 3 se agrego, 0,6 µµgr (5ul) degr (5ul) de

ADN genómico, 2

ADN genómico, 2 µµl de buffer del de buffer de

reacción 10X, 0,2ul de BSA, 0,5ul de reacción 10X, 0,2ul de BSA, 0,5ul de enzima y 12,3ul de agua destilada.

enzima y 12,3ul de agua destilada. 6.

6. NotaNota 11: Se agrego 0,5ul de enzima: Se agrego 0,5ul de enzima EcoRI a los tubos 2 y 3 y se mezclo con EcoRI a los tubos 2 y 3 y se mezclo con la pipeta de 4 a 5 veces. Cuidando que la pipeta de 4 a 5 veces. Cuidando que al agregar la enzima no quedara en las al agregar la enzima no quedara en las paredes del ependorf.

paredes del ependorf. Nota 2:

Nota 2: El tubo 1 no lleva enzimaEl tubo 1 no lleva enzima EcoRI y se usa como control ADN EcoRI y se usa como control ADN Fago.

Fago.

7. Se incubo los eppendorf en baño 7. Se incubo los eppendorf en baño termoregulador a 37ºC por 1 hora.

termoregulador a 37ºC por 1 hora.

8. Finalmente se procedió a correr el 8. Finalmente se procedió a correr el ADN digerido mediante una ADN digerido mediante una electroforesis de gel de agarosa al 1%. electroforesis de gel de agarosa al 1%. Preparac

Preparación gel de ión gel de agarosa al 1%agarosa al 1% 1. Realizar un gel de agarosa a una 1. Realizar un gel de agarosa a una concentración de 1%. Para la cámara de concentración de 1%. Para la cámara de electroforesis pequeña pesar 0.2 gr. de electroforesis pequeña pesar 0.2 gr. de agarosa para 20 ml de buffer de corrida. agarosa para 20 ml de buffer de corrida.

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3. Disolver la agarosa por agitación 3. Disolver la agarosa por agitación suave y posterior incubación a 100ºC en suave y posterior incubación a 100ºC en microondas por unos segundos.

microondas por unos segundos.

4. Se sacó el matraz del microondas con 4. Se sacó el matraz del microondas con mucho cuidado y se agito suavemente. mucho cuidado y se agito suavemente. La agarosa debe estar totalmente La agarosa debe estar totalmente disuelta y verse una solución disuelta y verse una solución transparente, de no ser así se debe transparente, de no ser así se debe volver a incubar unos segundos más. volver a incubar unos segundos más. (Paso peligroso, máxima precaución). (Paso peligroso, máxima precaución). 5. Se deja enfriar la agarosa hasta 5. Se deja enfriar la agarosa hasta aproximadamente 50 ºC y se agrega 2 aproximadamente 50 ºC y se agrega 2µµll

de Red Gel concentrado 10.000X. de Red Gel concentrado 10.000X.

6. Se mezcló hasta que estuvo bien 6. Se mezcló hasta que estuvo bien homogenizado.

homogenizado.

7. Mientras se enfría la agarosa, se 7. Mientras se enfría la agarosa, se preparó el molde para verter la solución. preparó el molde para verter la solución. Se sellan con “masking tape” los Se sellan con “masking tape” los extremos abiertos del molde y se coloca extremos abiertos del molde y se coloca el peine.

el peine.

8. Se añadió la agarosa suavemente y 8. Se añadió la agarosa suavemente y con mucho cuidado al molde y se con mucho cuidado al molde y se espero a que solidificará.

espero a que solidificará.

Preparación de muestras de ADN Preparación de muestras de ADN para cargar al gel.

para cargar al gel.

En un trozo de parafilm se coloco 3 En un trozo de parafilm se coloco 3 gotas de 5ul de buffer de carga gotas de 5ul de buffer de carga separadamente. Se tomo con una punta separadamente. Se tomo con una punta nueva 10ul de la muestras de ADN nueva 10ul de la muestras de ADN (ADN genómico, ADN control y ADN (ADN genómico, ADN control y ADN Fago lambda) y se deposito sobre una Fago lambda) y se deposito sobre una de las gotas de buffer de carga. Se de las gotas de buffer de carga. Se mezclo con la misma punta y se mezclo con la misma punta y se depositaron 14ul en el gel de agarosa. depositaron 14ul en el gel de agarosa. Se repitió lo mismo con las otras dos Se repitió lo mismo con las otras dos muestras.

muestras.

Tapar

Tapar conectar conectar la cámara la cámara a la a la fuentefuente de poder.

de poder.

Imagen 1. Cámara de electroforesis con las Imagen 1. Cámara de electroforesis con las muestras corriendo.

muestras corriendo.

1. Se tapó la cámara con cuidado y se 1. Se tapó la cámara con cuidado y se conecto los cables (rojo con rojo y conecto los cables (rojo con rojo y negro con negro). El electrodo negro negro con negro). El electrodo negro debe ir al lado donde se cargan las debe ir al lado donde se cargan las muestras.

muestras.

2. los cables se conectaron a la fuente 2. los cables se conectaron a la fuente de poder con ésta APAGADA

de poder con ésta APAGADA..

3. Se ajusta la fuente de poder a 80 3. Se ajusta la fuente de poder a 80 volts.

volts.

4. Luego se encendió la fuente de poder. 4. Luego se encendió la fuente de poder. Visualización del gel de agarosa

Visualización del gel de agarosa 1. Se colocó el gel en el

1. Se colocó el gel en el transiluminadortransiluminador y se observó las bandas que se ven por y se observó las bandas que se ven por la excitación de la sonda intercalante la excitación de la sonda intercalante Red Gel.

Red Gel.

2. Finalmente se fotografió el 2. Finalmente se fotografió el gel.gel. Resultados

Resultados

Los resultados obtenidos al final del Los resultados obtenidos al final del laboratorio, se pudo visualizar y laboratorio, se pudo visualizar y

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Tomás

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1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

Imagen 2.

Imagen 2. Gel de Gel de Agarosa con Agarosa con las muestraslas muestras de ADN corridas.

de ADN corridas.

Orden de las muestras cargadas. Orden de las muestras cargadas.

1-1- ControlControl

2-2- ADN genómicoADN genómico

3-3- ADN fago.ADN fago.

5-5- ADN fagoADN fago

Discusión Discusión

En el gel de electroforesis el ADN En el gel de electroforesis el ADN genómico digerido con EcoRI, se genómico digerido con EcoRI, se observa como un chorreado, ya que observa como un chorreado, ya que EcoRI tiene cientos de sitios de EcoRI tiene cientos de sitios de restricción en el ADN genómico y por restricción en el ADN genómico y por lo tanto da origen a cientos de lo tanto da origen a cientos de fragmentos de distintos pesos fragmentos de distintos pesos moleculares. Es por eso que se observan moleculares. Es por eso que se observan

En la imagen 2. Se observan Bandas En la imagen 2. Se observan Bandas borrosas extendidas (pocillos 4, 6 y 8). borrosas extendidas (pocillos 4, 6 y 8). Esto podría indicar que el ADN estaba Esto podría indicar que el ADN estaba contaminado por la presencia de contaminado por la presencia de algunos inhibidores que interfieren en la algunos inhibidores que interfieren en la actividad de la enzima EcoRI sobre los actividad de la enzima EcoRI sobre los sitios de restricción.

sitios de restricción.

Se observan escasas diferencias en la Se observan escasas diferencias en la intensidad de las bandas, esto en intensidad de las bandas, esto en relación con la concentración de ADN. relación con la concentración de ADN. Nuestro

Nuestro gel gel tuvimos tuvimos que que teñirlo teñirlo concon bromuro de etidio tras la electroforesis bromuro de etidio tras la electroforesis debido a

debido a que sin que sin él, él, las bandas las bandas no seno se observaban fácilmente. Por lo tanto para observaban fácilmente. Por lo tanto para aumentar la diferencia en intensidad de aumentar la diferencia en intensidad de las bandas, se incluyó el bromuro de las bandas, se incluyó el bromuro de etidio en el gel.

etidio en el gel.

La movilidad de las moléculas de ADN La movilidad de las moléculas de ADN durante la electroforesis también se durante la electroforesis también se puede ver influenciada por la puede ver influenciada por la concentración del gel de agarosa, ya que concentración del gel de agarosa, ya que a menor concentración de agarosa la a menor concentración de agarosa la electroforesis presenta una mayor electroforesis presenta una mayor migración de las moléculas.

migración de las moléculas.

La presencia de bandas de tamaño La presencia de bandas de tamaño molecular similar puede haberse debido molecular similar puede haberse debido a que la muestra de ADN no se hubo a que la muestra de ADN no se hubo digerido bien, independiente del tiempo digerido bien, independiente del tiempo de

de incubación. incubación. Esto Esto podría podría habersehaberse debido a la presencia de contaminantes debido a la presencia de contaminantes presente en la alícuota de ADN que presente en la alícuota de ADN que inhiben el proceso de digestión inhiben el proceso de digestión enzimático por las enzimas de enzimático por las enzimas de restricciones. Tales contaminantes restricciones. Tales contaminantes podrían ser removidos mediante otra podrían ser removidos mediante otra precipitación con etanol o filtración. precipitación con etanol o filtración.

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tiempo de la electroforesis, y a la vez tiempo de la electroforesis, y a la vez verificar que la concentración de verificar que la concentración de agarosa en el gel es la adecuada para la agarosa en el gel es la adecuada para la obtención de los resultados deseados. obtención de los resultados deseados. Bibliografía

Bibliografía

-- Luque, J. y Herráez, A. (2003) TextoLuque, J. y Herráez, A. (2003) Texto ilustrado de biologia Molecular e ilustrado de biologia Molecular e Ingeniería Genética: conceptos, Ingeniería Genética: conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Harcourt. Pág. 137.

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Instituto Nacional Nacional de de Salud, Salud, Lima-

Lima-Perú, Año 2003

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